Methodenartikel

Dissectie van Zebravis craniofaciale weefsels bij kleuring met Alcian Blue

2.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68900

⸱

12 september 2025

 , 
1Tata Institute of Fundamental Research

In dit artikel

Samenvatting

Het hier beschreven protocol presenteert een eenvoudige en gemakkelijk te volgen procedure voor het kleuren en ontleden van craniofaciale kraakbeenderen in een 5 dagen oude zebravislarve. Het kan worden gebruikt om de anatomie, vorm en grootte van deze structuren onder verschillende ontwikkelingsomstandigheden te bestuderen.

Samenvatting

Zebravissen zijn, gezien hun optische transparantie, een uitstekend model van gewervelde dieren om de mechanismen te bestuderen waarmee craniofaciale kraakbeenderen in het embryo worden gevormd. Craniofaciale kraakbeenderen kunnen grofweg worden ingedeeld in twee groepen, het neurocranium en het viscerocranium, die op hun beurt kunnen worden onderverdeeld in talrijke kraakbeengroepen die nodig zijn voor de ondersteuning van de hersenen en die onder andere het voedings- en ademhalingsapparaat vormen. Dit protocol beschrijft eerst een eenvoudige en gevestigde kleuringsprocedure in zebravissen om deze kraakbeengroepen zichtbaar te maken, gevolgd door een methodologie om het neuro- en het viscerocranium te ontleden en te scheiden. Uit deze dissecties kunnen eenvoudig vorm- en groottemetingen worden verkregen, en in dit protocol wordt dit aangetoond voor het gehemelte, dat deel uitmaakt van de voorste neurocranium, een weefsel dat vaak wordt aangetast bij de meeste craniofaciale aandoeningen bij mensen. Het protocol kan op een eenvoudige manier worden gerepliceerd, zelfs in omgevingen met beperkte middelen, en biedt zo een waardevol educatief hulpmiddel voor niet-gegradueerde studenten om kennis te maken met craniofaciale morfologie.

Inleiding

Het craniofaciale kraakbeen bij gewervelde dieren komt voort uit een multipotente celpopulatie die de craniale neurale lijstcellen1 wordt genoemd. Deze cellen worden eerst gespecificeerd in de dorsale randen van de neurale plaat in vroege embryo's, die vervolgens grote afstanden migreren om het craniofaciale gebied en de farynxbogen te bereiken voordat ze differentiëren 2,3. De signaalmechanismen die deze migratie en differentiatie aansturen, zijn grotendeels geconserveerd bij gewervelde dieren 4,5. Desondanks zijn de organisatie, grootte en vorm van individuele kraakbeenelementen verschillend tussen soorten, wat aanleiding geeft tot diverse craniofaciale morfologieën6. Met name zebravissen zijn naar voren gekomen als een krachtig modelsysteem om craniofaciale morfogenese te bestuderen, gezien de transparante aard van de embryo's tot larvale stadia. Met behulp van eenvoudige kleuringsprocedures voor het markeren van het kraakbeen, is de morfologie van veel craniofaciale structuren in zebravissen gekarakteriseerd onder verschillende verstoringen van signaalroutes 7,8,9 en wanneer embryo's of larven worden blootgesteld aan veel voorkomende verontreinigende stoffen die in het milieu aanwezig zijn10. De Alcian blauwe kleuring die hier wordt beschreven voor het markeren van het kraakbeen omvat het gebruik van niet-zure omstandigheden gestandaardiseerd door Walker en Kimmel11, die vervolgens is gebruikt door veel zebravislaboratoria die werken aan craniofaciale ontwikkeling 5,12,13,14,15,16,17,18,19 , inclusief de beschrijving van het gebruik op middelbare scholen20. Zuurvrije kleuring behoudt de benige structuren intact, waardoor kraakbeen en botten samen kunnen worden gekleurd met respectievelijk Alcian-blauw en alizarinerood. Een gedetailleerd protocol voor het kleuren en voor het uitvoeren van nauwkeurige dissectie van het craniofaciale kraakbeen, met name voor het helpen uitvoeren van dergelijke onderzoeken in omgevingen met beperkte middelen, ontbreekt.

Hoewel de skeletstructuur van het gezicht bij volwassen zebravissen vrij complex is, bestaande uit 43 van kraakbeen afgeleide botten21, is het craniofaciale kraakbeen in een larve 5 dagen na de bevruchting (dpf), die net het vermogen heeft gekregen om te eten, relatief eenvoudig en kan het grofweg worden onderverdeeld in een dorsaal neurocranium en een ventrale viscerocranium4. Deze structuren ondersteunen de hersenen, dragen bij aan het voedingsapparaat en geven aanleiding tot ondersteunend kraakbeen voor kieuwweefsels. Het hier beschreven protocol maakt het mogelijk om het kraakbeen van zebravissen te kleuren met Alcian-blauw, gevolgd door een gedetailleerde procedure voor het ontleden van het neuro- en het viscerocranium in afzonderlijke structuren, wat uiteindelijk een zorgvuldige karakterisering van de vorm en grootte van verschillende kraakbeensoorten in deze structuren mogelijk zal maken. Als voorbeeld meten we de afmetingen van het voorste deel van het gehemelte (gehemelte), de ethmoïde plaat genaamd, die deel uitmaakt van het neurocranium.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De onderhouds- en experimentele procedures voor zebravissen die in deze studie zijn gebruikt, zijn goedgekeurd door de institutionele ethische commissie voor dieren, zie referentie TIFR/IAEC/2023-1.

1. Bereiding van reagens

  1. E3-media:
    1. Bereid 50x bouillon 1 door 3,25 g natriumfosfaat dibasisch (0,458 mM Na2HPO4), 0,29 g kaliumdiwaterstoffosfaat (0,042 mM KH2PO4), 11,93 g natriumchloride (4,084 mM NaCl) en 0,48 g kaliumchloride (0,128 mM KCl) te mengen in 1 L gedestilleerd water.
    2. Bereid 50x bouillon 2 door 2,43 g calciumchloride (0,33 mM CaCl2) en 4,07 g magnesiumsulfaat (0,33 mM MgSO4) te mengen in 1 L gedestilleerd water.
    3. Om 500 ml 1x E3-media op 480 ml gedestilleerd water te bereiden, voegt u 10 ml bouillon 1 en 2 toe (pH = 7,4).
      OPMERKING: Draag handschoenen tijdens de bereiding van deze oplossingen.
  2. 4% paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing):
    1. Verwarm 100 ml 1x PBS voor op 68 °C. Voeg 4 g PFA toe en incubeer de oplossing bij 68 °C onder periodieke menging totdat de PFA volledig is opgelost.
      OPMERKING: Draag handschoenen en een masker tijdens het bereiden van dit reagens, bij voorkeur onder een zuurkast, aangezien PFA zeer giftig is.
  3. 0,05% MS-222 (algemeen bekend als tricaine) oplossing:
    1. Maak 4% tricaine bouillon in E3 en bewaar bij 4 °C. Om 10 ml tricaine bouillon te maken, voegt u 0,40 g MS-222 toe in 7 ml E3. Schud de tube met de oplossing voorzichtig om te mengen en vul het volume aan tot 10 ml. Om 50 ml 0,05% tricaïne-oplossing te maken, voegt u 625 μl van de 4% bouillon toe aan 49,375 ml E3.
      OPMERKING: Draag handschoenen en een masker tijdens het bereiden van dit reagens.
  4. 0,4% Alcian blauwe bouillonoplossing in 70% ethanol
    1. Om 2 ml van de stockoplossing te bereiden, lost u 8 mg Alcian-blauw op in 1 ml 50% ethanol. Verwarm de oplossing gedurende 15-20 minuten bij 37 °C en meng regelmatig om op te lossen. Zodra de vlek is opgelost, vult u de oplossing aan tot 70% ethanol door 900 μL 100% ethanol en 100 μL gedestilleerd water toe te voegen.
      OPMERKING: De voorraadoplossing kan maximaal 2 weken bij kamertemperatuur worden bewaard.
  5. Vlekoplossing -- 0,02% Alcianblauw, 200 mM magnesiumchloride (MgCl2) en 70% ethanol
    1. Om 5 ml Alcian blauwe kleuroplossing te bereiden, voegt u 1 ml 1 M MgCl2, 3,5 ml 100% ethanol en 250 μl 0,4% Alcian blauwe bouillon (8 mg Alcian blauw in 2 ml 70% ethanol) toe aan 250 μl water en mengt u goed.
      OPMERKING: Bereid de vlekoplossing vers voor de beste kleurresultaten.
  6. Bleekmiddel:
    1. Meng gelijke hoeveelheden 3% waterstofperoxide (H2O2) en 2% kaliumhydroxide (KOH). Om 2 ml bleekoplossing te maken, mengt u 1 ml 3% waterstofperoxide en 1 ml 2% kaliumhydroxide.
      NOTITIE: Bereid deze oplossing vers voor voordat u met deze stap begint. Aangezien H2O2 lichtgevoelig is, moet u het zoveel mogelijk beschermen tegen blootstelling aan licht. Draag handschoenen tijdens het hanteren van H2O2 en KOH.
  7. Oplossing I: 20% glycerol + 0,25% KOH
    OPMERKING: Aangezien glycerol zeer stroperig is, moet u voorzichtig pipetten. Draag handschoenen tijdens het bereiden van deze oplossingen.
    1. Om 5 ml oplossing I te bereiden, voegt u 2 ml 50% glycerol en 625 μl 2% KOH toe aan 2.375 ml water en mengt u goed.
  8. Oplossing II: 50% glycerol + 0,25% KOH
    1. Om 5 ml oplossing II te bereiden, voegt u 3.570 ml 70% glycerol en 625 μl 2% KOH toe aan 805 μl water en mengt u goed.
  9. Bewaaroplossing: 50% glycerol + 0,1% KOH
    1. Om 5 ml bewaaroplossing te bereiden, voegt u 3.570 ml 70% glycerol en 250 μl 2% KOH toe aan 1.180 ml water en mengt u goed.
  10. 3% agarose
    1. Los 3 g agarose op in 100 ml gedestilleerd water. Magnetron tot de oplossing helder wordt.
  11. 0.1% PBST (0.1% Tussen 20 in 1x PBS)
    1. Om 1 L 1x PBS te maken, voegt u 8 g NaCl, 0,20 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 en 0,24 g KH2PO4 toe aan 1.000 ml gedestilleerd water. Meng de oplossing en stel de pH in op 7,4. Om 500 ml 0.1% PBST te maken, voegt u 5 ml 10% toe tussen 20 en 495 ml 1x PBS.
  12. 0,50 μg/ml DAPI-oplossing
    1. Maak 10 mg/ml DAPI bouillon in 1x PBS. Om 10 ml 0,50 μg/ml DAPI-oplossing te maken, voegt u 0,50 μl van de bouillon toe aan 10 ml 1x PBS en schudt u krachtig om ervoor te zorgen dat DAPI volledig oplost.
      OPMERKING: Draag handschoenen tijdens het bereiden van deze oplossingen. Bescherm DAPI tegen licht omdat het lichtgevoelig is. De DAPI-voorraad kan meer dan een jaar bij 4 °C worden bewaard.

2. Embryo collectie

  1. Zet paren mannelijke en vrouwelijke zebravissen op in kweektanks de avond voordat embryo's nodig zijn, waarbij de mannelijke en vrouwelijke vissen gescheiden zijn door barrières.
  2. Verwijder de barrières de volgende ochtend en verzamel embryo's binnen 15-20 minuten na het verwijderen van de barrières.
    OPMERKING: De timing van het verwijderen van de barrière is nuttig bij de enscenering van zebravisembryo's en -larven.
  3. Til de embryo's op bij 28,5 °C tot ze 5 dpf bereiken.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u de E3-media eens in de 2 dagen vervangt door een nieuwe batch voorverwarmde E3 bij 28.5 °C.

3. Alcian blauwe kleuring

OPMERKING: Draag handschoenen tijdens het uitvoeren van dit experiment

  1. Verdoof 20-25 5 dagen oude zebravislarven met 0,05% tricaïne in een microcentrifugebuisje van 2 ml (MCT).
  2. Nadat de larven zijn gestopt met bewegen, wat meestal ~4-5 minuten duurt, verwijdert u de verdoving en fixeert u ze in 1,5 ml 4% PFA bij kamertemperatuur (RT) op een tuimelschakelaar bij 60 tpm gedurende 2 uur.
  3. Verwijder met een pipet zoveel mogelijk van het fixeermiddel en voeg 1,5 ml 50% ethanol toe aan het monster. Incubeer gedurende 10 minuten terwijl je schommelt met 60 tpm bij RT.
  4. Verwijder zoveel mogelijk van de ethanol met behulp van een pipet en voeg 1,5 ml van de Alcian blauwe vlekoplossing toe.
  5. Incubeer de gefixeerde larven gedurende 18-20 uur in de kleuroplossing op een tuimelschakelaar bij 60 tpm bij RT.
    OPMERKING: Incubatie voor een kortere of langere periode kan ertoe leiden dat bepaalde delen van het kraakbeen respectievelijk onderbevlekt of overgekleurd zijn. Hier leek 18-20 uur kleuring het beste te werken voor het duidelijk visualiseren van de neuro en het viscerocranium van een 5 dagen oude larve.
  6. Verwijder de vlekoplossing, voeg 1,5 ml gedestilleerd water toe en incubeer gedurende 1-2 minuten op een wip bij RT.
    OPMERKING: De kleuring kan bij deze stap worden gestopt om de celgrenzen in het ontlede kraakbeen zichtbaar te maken. Een nadeel van het stoppen van het kleuringsprotocol in deze stap zonder daaropvolgende opruimstappen uit te voeren, is echter dat de grenzen van de neuro en het viscerocranium nog steeds enigszins vervagen en het een grotere uitdaging wordt om de dissecties nauwkeurig uit te voeren.
  7. Voeg 1 ml bleekoplossing toe aan het monster en incubeer gedurende 20 minuten bij RT in de open lucht zonder enige afdekking over de plaat of putjes.
    OPMERKING: Dek de MCT's tijdens deze stap niet af, aangezien bij de reactie tussen waterstofperoxide en kaliumhydroxide zuurstofgas vrijkomt, waardoor het deksel eraf kan springen als het gesloten is.
  8. Verwijder de bleekoplossing en voer de volgende stappen uit voor het verwijderen van weefsel.
    1. Voeg 1,5 ml oplossing I toe aan het monster en houd op een tuimelschakelaar bij 60 tpm gedurende 40 minuten bij RT.
    2. Verwijder oplossing I en voeg 1,5 ml oplossing II toe aan het monster en bewaar op een tuimelschakelaar bij 60 omw/min gedurende 2 uur bij RT.
      OPMERKING: De verwijderingsstappen helpen de overtollige vlek te verwijderen, waardoor de optische helderheid van de monsters wordt verbeterd en zo wordt geholpen bij het efficiënt uitvoeren van de dissecties. Ga voorzichtig om met monsters bij het wisselen van oplossingen, aangezien eventuele schade de toekomstige analyse van hun morfologie kan beïnvloeden.
  9. Verwijder oplossing II en voeg 1,5-2 ml van de bewaaroplossing toe. Door de aanwezigheid van glycerol zinken gekleurde monsters binnen 10 minuten geleidelijk naar de bodem.
    OPMERKING: Gekleurde monsters kunnen langer dan een jaar bij 4 °C worden bewaard.

4. Dissectie van het craniofaciale skelet

  1. Smelt de 3% agarose-oplossing in een magnetron tot de oplossing helder wordt.
    OPMERKING: Niet oververhitten, omdat de oplossing uit de kolf kan borrelen. Controleer de oplossing zorgvuldig terwijl u deze stap uitvoert.
  2. Smeer een petrischaaltje van 90 mm in met 3% agarose door de gesmolten agarose te gieten tot een derde van de diepte van het petrischaaltje bedekt is en het te laten stollen. In deze petrischaal worden dissecties uitgevoerd.
    LET OP: De petrischaaltjes met agaroselaag kunnen een week van tevoren worden bereid en bij 4 °C worden bewaard. De agarose coating zorgt voor een zachtere ondergrond waarop de dissecties kunnen worden uitgevoerd zonder de tang te beschadigen.
  3. Reinig de te gebruiken tang met 70% ethanol en veeg ze af met een schoon stuk standaard laboratoriumtissuepapier.
  4. Breng met behulp van een pasteurpipet 3-4 gekleurde larven samen met 0,5 ml bewaaroplossing over naar de met agarose beklede petrischaal.
    OPMERKING: De opslagoplossing zorgt voor meer optische helderheid voor het uitvoeren van de dissecties in vergelijking met hetzelfde doen in E3.
  5. Oriënteer een bevlekte larve op de zijzijde (Figuur 1A) en schraap de dooier voorzichtig van het lichaam van de larve met behulp van de tang
    OPMERKING: Figuur 1B toont een embryo waarbij de dooier is verwijderd. Het is een goede gewoonte om het dooiergeschraapte embryo over te brengen naar een nieuw petrischaaltje voordat u doorgaat met verdere dissectiestappen, zodat de kleverige dooiermassa die rondzweeft de dissectie niet verstoort.
  6. Nadat de dooier is verwijderd, houdt u de larve met één tang bij zijn staartgebied vast en gebruikt u de andere om de ogen voorzichtig te verwijderen.
    OPMERKING: Figuur 1C toont een embryo waarvan de dooier en de ogen zijn verwijderd. Ogen moeten met voorzichtigheid worden verwijderd, omdat de nabijheid van het craniofaciale skelet hun dissectie kan verstoren.
  7. Gebruik de tang om de hersenen en andere weefsels voorzichtig dorsaal van het neurocranium af te trekken en af te knijpen. Houd de larve stil met een tang en gebruik de andere tang om een incisie in het midden te maken (Figuur 1C, rode pijl), gevolgd door het afknijpen van de weefsels (Figuur 1D).
    OPMERKING: Wees tijdens het uitvoeren van deze stap voorzichtig met het verwijderen van de weefsels dichter bij de voorste delen van het neurocranium, omdat het kraakbeen ermee kan loskomen.
  8. Scheid de kop van de larve van de rest van het lichaam. Het hoofdgebied na deze stap bevat voornamelijk het neurocranium en het viscerocranium dat op twee punten aan elkaar is bevestigd - aan de voorste en achterste uiteinden - samen met een paar kleine ongekleurde weefsels die aan deze craniofaciale structuren zijn bevestigd (Figuur 1E).
    OPMERKING: Het is moeilijk om de ongekleurde weefsels die direct aan het neurocranium en het viscerocranium zijn bevestigd, volledig te verwijderen. Hoewel er enkele resterende weefsels aanwezig zullen zijn, zal hun aanwezigheid geen invloed hebben op de stroomafwaartse vorm- of grootteanalyse omdat ze niet gekleurd zijn.
  9. Snijd voorzichtig de twee verbindingen tussen het neurocranium en het viscerocranium door om ze te scheiden (Figuur 1F, rode stippellijnen). Zie Figuur 2 voor afbeeldingen van het neurocranium en het viscerocranium, zowel in intacte als in ontlede embryo's.
  10. Voeg op een schoon glaasje een druppel of twee 100% glycerol toe. Breng met behulp van een tang het ontlede neurocranium of viscerocranium voorzichtig over naar dit objectglaasje. Gebruik een tang om voorzichtig een dekglaasje op deze tissues te plaatsen, zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan, en sluit het dekglaasje op alle dia's af met nagellak.
    LET OP: Deze objectglaasjes kunnen meer dan een jaar bij 4 °C worden bewaard zonder de vlek te verliezen.

5. Kwantificering van de afmetingen van de ethmoïde plaat

  1. Maak beelden van het gehemelte met behulp van een camera die aan de stereomicroscoop is bevestigd (Figuur 2D). Als er geen camera van wetenschappelijke kwaliteit is, sluit u een standaard smartphone aan op de stereomicroscoop om beelden te verkrijgen.
  2. Laad voor kwantificering het beeld van een gehemelte in FIJI22 en gebruik vervolgens het lijngereedschap om de breedte en hoogte van de ethmoïde plaat in microns te meten (zie figuur 3A-C) en bepaal de afmetingen met behulp van de pixelresolutie van de camera.
  3. Teken een omtrek rond de ethmoïde plaat en klik op Analyseren | Set Metingen | gebied om het gebied van de ethmoïde plaat te verkrijgen (Figuur 3D,E).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het craniofaciale skelet van de zebravis is 5 dagen na de bevruchting (dpf) volledig kraakbeenachtig en kan dus worden gekleurd met Alcian-blauw, een basische kleurstof die zich kan binden aan glycosaminoglycanen die overvloedig aanwezig zijn in kraakbeen23. Dit resulteert in een blauwe kleuring van het kraakbeen (Figuur 1), zodat het kan worden onderscheiden van andere weefsels die in de larve aanwezig zijn met behulp van een standaa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Craniofaciale misvormingen vormen de meerderheid van alle geboorteafwijkingen bij de mens, wat vaak leidt tot kindersterfte. De onderliggende etiologie bij de meeste craniofaciale anomalieën moet echter nog worden opgehelderd25. Craniofaciale structuren zijn complex bij een bepaald gewerveld dier, en vanuit het perspectief van een niet-gegradueerde omgeving is de eerste vereiste daarom om een educatief hulpmiddel te hebben dat studenten een algemeen overzicht geef...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen te verklaren.

Dankbetuigingen

We danken Dr. Kalidas Kohale en zijn team voor het onderhoud van de visfaciliteit. SRN erkent financiële steun van het Department of Atomic Energy (DAE), Govt. of India (Project Identification no. RTI4003, DAE OM nr. 1303/2/2019/R\&D-II/DAE/2079 d.d. 11.02.2020), het Max Planck Society Partner Group-programma (M.PG. A MOZG0010) en de Science and Engineering Research Board Start-up Research Grant (SRG/2023/001716). We danken Dr. Shweta Verma van het lab voor verhelderende opmerkingen. We danken Swetha Nagarajan en Upal Chatterjee voor hun hulp bij het maken van cijfers voor het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AgaroseLonza bioscience50004Voor het coaten van petrischalen
Alcian blue 8G Sigma-AldrichA3157Voor het kleuren van kraakbeen
Calcium Chloride dihydrateSigma-Aldrich12022Voor het maken van buffers
CameraOlympusDP28Voor het verwerven van beelden
DAPIRoche Life Sciences10236276001Voor het labelen van kernen
EthanolHoneywell32221Oplosmiddel voor alcian blue kleurstof
FIJIVersie: ImageJ 1.54f
ForcepsDumontDumontVoor het uitvoeren van dissecties
GlycerolMP biomedicals193996Voor het maken van wasbeurten en het monteren van monsters 
Hydrogen peroxideMP biomedicals194057Voor het maken van bleekoplossing
Magnesium chloride hexahydrateSARD BiosciencesSBRC0217Voor het maken van buffers
Magnesium sulfate heptahydrateSigma-AldrichM2773Voor het maken van buffers
MS-222 (Tricaine)Sigma-AldrichA5040Voor het verdoven van larven
Potassium ChlorideSigma-AldrichP9541Voor het maken van buffers
Potassium hydroxideSigma-Aldrich484016Voor het maken van buffers
Potassium phosphate monobasicSigma-AldrichP0662Voor het maken van buffers
Sodium ChlorideSigma-AldrichS3014Voor het maken van buffers
Sodium phosphate dibasicSigma-Aldrich71640Voor het maken van buffers
StereoscopeOlympusSZX61Voor het uitvoeren van dissecties
Tween-20HIMEDIATC287Detergens, gebruikt voor het doorlaatbaar maken van cellen

Referenties

  1. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Establishing neural crest identity: a gene regulatory recipe. Development. 142 (2), 242-257 (2015).
  2. Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Dev Dyn. 249 (1), 88-111 (2020).
  3. Hammond, N. L., Dixon, M. J. Revisiting the embryogenesis of lip and palate development. Oral Dis. 28 (5), 1306-1326 (2022).
  4. Mork, L., Crump, G. Zebrafish craniofacial development: a window into early patterning. Craniofacial development. Yang, C. , Academic Press. 235-269 (2015).
  5. Swartz, M. E., SheehanRooney, K., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).
  6. Selleri, L., Rijli, F. M. Shaping faces: genetic and epigenetic control of craniofacial morphogenesis. Nat Rev Genet. 24 (9), 610-626 (2023).
  7. Beaty, T. H., et al. Evidence for geneenvironment interaction in a genome wide study of nonsyndromic cleft palate. Genet Epidemiol. 35 (6), 469-478 (2011).
  8. Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nat Rev Genet. 12 (3), 167-178 (2011).
  9. Reynolds, K., Kumari, P., Sepulveda Rincon, L., Gu, R., Ji, Y., Kumar, S., Zhou, C. J. Wnt signaling in orofacial clefts: crosstalk, pathogenesis and models. Dis Model Mech. 12 (2), dmm037051(2019).
  10. Raterman, S. T., Metz, J. R., Wagener, F. A. D. T. G., Von den Hoff, J. W. Zebrafish models of craniofacial malformations: interactions of environmental factors. Front Cell Dev Biol. 8, 600926(2020).
  11. Walker, M., Kimmel, C. A twocolor acidfree cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotechnic Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).
  12. Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nat Genet. 40 (3), 290-298 (2008).
  13. Melvin, V. S., Feng, W., HernandezLagunas, L., Artinger, K. B., Williams, T. A morpholinobased screen to identify novel genes involved in craniofacial morphogenesis. Dev Dyn. 242 (7), 817-831 (2013).
  14. Spoorendonk, K. M., Hammond, C. L., Huitema, L. F. A., Vanoevelen, J., SchulteMerker, S. Zebrafish as a unique model system in bone research: the power of genetics and in vivo imaging. J Appl Ichthyol. 26, 219-224 (2010).
  15. Farmer, D. T., et al. A comprehensive series of Irx cluster mutants reveals diverse roles in facial cartilage development. Development. 148 (16), dev197244(2021).
  16. Rochard, L., Monica, S. D., Ling, I. T. C., Kong, Y., Roberson, S., Harland, R., Halpern, M., Liao, E. C. Roles of Wnt pathway genes wls, wnt9a, wnt5b, frzb and gpc4 in regulating convergentextension during palate morphogenesis. Development. 143 (14), 2541-2547 (2016).
  17. Liu, S., Narumi, R., Ikeda, N., Morita, O., Tasaki, J. Chemicalinduced craniofacial anomalies caused by disruption of neural crest cell development in a zebrafish model. Dev Dyn. 249 (7), 794-815 (2020).
  18. Zinck, N., FranzOdendaal, T. A. Accurate wholemount bone and cartilage staining requires acidfree conditions. Anat Rec. 304 (5), 958-960 (2021).
  19. Stenzel, A., et al. Distinct and redundant roles for zebrafish her genes during mineralization and craniofacial patterning. Front Endocrinol. 13, 1033843(2022).
  20. Tomasiewicz, H. G., Hesselbach, R., Carvan, M. J., Goldberg, B., Berg, C. A., Petering, D. H. Zebrafish as a model system for environmental health studies in the grad classroom. Zebrafish. 11 (4), 384-395 (2014).
  21. Cubbage, C. C., Mabee, P. M. Development of the cranium and paired fins in the zebrafish Danio rerio (Ostariophysi, Cyprinidae). J Morphol. 229 (2), 121-160 (1996).
  22. Schindelin, J. Fiji: an opensource platform for biologicalimage analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  23. Tuckett, F., MorrissKay, G. Alcian Blue staining of glycosaminoglycans in embryonic material: effect of different fixatives. Histochem J. 20 (3), 174-182 (1988).
  24. Dougherty, M., et al. Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis. Development. 140 (1), 76-81 (2013).
  25. Goodwin, A. F., et al. From bench to bedside and back: improving diagnosis and treatment of craniofacial malformations utilizing animal models. Craniofacial development. Yang, C. , Academic Press. 459-492 (2015).
  26. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196(2012).
  27. Ding, J., et al. Using alizarin Red staining to detect chemically induced bone loss in zebrafish larvae. J Vis Exp. (178), e63251(2021).
  28. Klingenberg, C. P., Barluenga, M., Meyer, A. Shape analysis of symmetric structures: quantifying variation among individuals and asymmetry. Evolution. 56 (10), 1909-1920 (2002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Craniofaciale dissectie van zebravissenAlcian Blue kleuringcraniofaciaal kraakbeendissectie van het neurocraniumdissectie van het viscerocraniumethmo dplaatpalatum morfogeneselight sheetmicroscopieweefselverhelderingbeeldanalyse

Gerelateerde artikelen