Deze studie onderzoekt circadiane variaties in de afgifte van groeifactoren uit bloedplaatjesrijk fibrine (PRF) en onderzoekt correlaties met cortisolspiegels, met als doel de timing van op PRF gebaseerde regeneratieve procedures te optimaliseren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
Evaluatie van circadiane variatie in groeifactoren van bloedplaatjesrijk fibrine: een pilotstudie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Bloedplaatjesrijk fibrine (PRF) heeft uitgebreide klinische toepassingen in de tandheelkunde, met name bij de regeneratie van zachte en harde weefsels, genezing van extractiekokers, behandeling van parodontale defecten, sinusvergroting en mucogingivale procedures. PRF is een van bloedplaatjes afgeleid, groeifactorrijk biomateriaal dat wordt bereid via een eenstaps centrifugatieprotocol. Deze studie was bedoeld om te evalueren of PRF-afgeleide groeifactoren circadiane variatie vertonen tussen ochtend- en avonduren. Twintig gezonde vrijwilligers namen deel, die elk zes veneuze bloedmonsters afgaven, drie om 08.00 uur en drie om 20.00 uur. Vanaf elk tijdstip werd één buis gebruikt voor het volledige bloedbeeld, één voor serumcortisolanalyse en één voor PRF-preparaat (gecentrifugeerd op 708 x ggedurende 12 minuten). Groeifactoren (IGF-1, PDGF, FGFR, VEGF, TGFβ-1) in PRF werden gemeten op 24 uur en 72 uur met behulp van ELISA. Hun niveaus werden vergeleken tussen tijdstippen en gecorreleerd met serumcortisolspiegels. FGFR-niveaus waren significant hoger na 72 uur dan na 24 uur in avondmonsters. Er werden echter geen significante verschillen gevonden voor IGF-1, PDGF, VEGF of TGFβ-1 tussen 's ochtends en 's avonds. Cortisolspiegels waren negatief gecorreleerd met PDGF om 72 uur in ochtendmonsters en met IGF-1 om 72 uur in avondmonsters; Er werden echter geen andere significante correlaties waargenomen. Deze bevindingen suggereren dat de timing van bloedafname geen significante invloed heeft op het gehalte aan PRF-groeifactoren, wat wijst op flexibiliteit in klinische protocollen met betrekking tot de timing van monsters.
Inleiding
Bloedplaatjesrijk fibrine (PRF) is een bloedplaatjesconcentraat van de tweede generatie dat vaak wordt gebruikt in de regeneratieve tandheelkunde vanwege zijn autologe oorsprong, gemakkelijke bereiding en biologisch actieve inhoud1. Gevormd door centrifugatie van volbloed zonder anticoagulantia, biedt PRF een fibrinematrix die rijk is aan bloedplaatjes en leukocyten die groeifactoren afscheiden zoals van bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF), transformerende groeifactor-bèta 1 (TGF-β1), insuline-achtige groeifactor-1 (IGF-1), vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) en fibroblastgroeifactorreceptor (FGFr). Deze biomoleculen spelen een centrale rol bij cellulaire proliferatie, angiogenese, extracellulaire matrixremodellering en weefselregeneratie2. Vergeleken met bloedplaatjesrijk plasma (PRP), waarvoor anticoagulantia en exogene activering nodig zijn, wordt PRF geproduceerd via een eenstaps, antistollingsvrij proces dat een fysiologische fibrine-steiger oplevert met ingesloten leukocyten en bloedplaatjes. Deze architectuur ondersteunt een langzamere, meer aanhoudende afgifte van groeifactoren en cytokines, waardoor de wondstabiliteit en vroegtijdig weefselherstel kunnen worden verbeterd, terwijl de complexiteit en kosten van de behandeling worden verminderd 1,2. Bovendien minimaliseert de afwezigheid van anticoagulantia en activatoren de variabiliteit in verband met manipulatie en kan het natuurlijke bloedplaatjesgedrag beter behouden blijven, wat praktische voordelen biedt voor gebruik aan de stoel en standaardisatie bij alle operators2.
Ondanks het wijdverbreide klinische gebruik, blijft de temporele dynamiek van de bioactieve componenten van PRF slecht begrepen. Het circadiane ritme, een intrinsieke biologische cyclus van 24 uur, beïnvloedt verschillende fysiologische systemen, waaronder de immuunfunctie, hormoonsecretie en hematologische parameters 3,4. Cortisol, het primaire circadiane hormoon, piekt in de vroege ochtend en neemt geleidelijk af gedurende de dag5. Belangrijk is dat studies hebben aangetoond dat de activiteit van bloedplaatjes, de aggregatiecapaciteit en het aantal bloedplaatjes ook kunnen worden gemoduleerd door circadiane mechanismen, met implicaties voor de stolling en wondgenezing6.
Aangezien PRF rechtstreeks is afgeleid van perifeer bloed, kan de circadiane timing van bloedafname mogelijk van invloed zijn op de activeringsstatus van bloedplaatjes en de daaropvolgende afgifte van groeifactoren tijdens fibrinepolymerisatie. Hoewel de dagelijkse variaties in het aantal bloedplaatjes en groeifactoren in bloedplaatjesrijk plasma eerder werden geanalyseerd door Aoto et al.7, zijn er geen studies die systematisch onderzoeken of PRF die op verschillende tijdstippen van de dag is bereid, meetbare verschillen vertoont in de samenstelling van de groeifactor. Daarom heeft deze pilotstudie tot doel de circadiane variatie van PRF-afgeleide groeifactoren te onderzoeken door monsters te vergelijken die 's ochtends en' s avonds zijn verzameld van gezonde personen. Daarnaast hebben we de serumcortisolspiegels op elk tijdstip geëvalueerd en hun correlaties met de afgifte van PRF-groeifactoren onderzocht. Inzicht in dergelijke temporele variabiliteit kan helpen bij het optimaliseren van klinische protocollen en bijdragen aan de standaardisatie van op PRF gebaseerde regeneratieve behandelingen. De nulhypothese van deze studie was dat de circadiane timing van bloedafname geen significante invloed heeft op de concentratie van groeifactoren die vrijkomen uit bloedplaatjesrijk fibrine (PRF); op basis van de bekende circadiane regulatie van bloedplaatjesactiviteit en hormoonsecretie, werd echter aanvankelijk verondersteld dat het tijdstip van bloedafname (ochtend versus avond) het PRF-groeifactorgehalte kan veranderen. Vanuit een klinisch perspectief is het belangrijk om te verduidelijken of de inhoud van PRF-groeifactoren gevoelig is voor circadiane variatie voor de standaardisatie van regeneratieve protocollen. Als de afgifte van groeifactoren gedurende de dag grotendeels stabiel blijft, kunnen clinici er zeker van zijn dat de timing van venapunctie geen substantiële invloed heeft op de behandelingsresultaten, waardoor flexibiliteit bij het plannen van procedures mogelijk is. Omgekeerd, als er subtiele verschillen naar voren komen in geselecteerde factoren, zoals die welke betrokken zijn bij angiogenese of weefselherstel, kan de timing van bloedafname worden geoptimaliseerd in gevallen waarin maximaal regeneratief potentieel gewenst is, bijvoorbeeld in gecompromitteerde genezingsomstandigheden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze studie werd uitgevoerd op de afdeling Parodontologie, Faculteit der Tandheelkunde, Çukurova University, Adana, Turkije, met deelname van 20 gezonde vrijwilligers. Voorafgaand aan opname werden alle deelnemers geïnformeerd over het doel, de methodologie en de procedures van het onderzoek en werd schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen. Ethische goedkeuring werd verleend door de Ethische Commissie voor klinisch onderzoek van de Faculteit der Geneeskunde van de Universiteit van Çukurova (Goedkeuring nr: 125/55, datum: 16.09.2022). Alle procedures, inclusief essentiële bioveiligheidsrichtlijnen voor het omgaan met menselijk bloed en instructies voor de verwijdering van afval voor biologisch gevaarlijke materialen en chemische reagentia, werden uitgevoerd in overeenstemming met de NIH-CDC-richtlijnen8. De gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Selectie van deelnemers
Deelnemers aan het onderzoek waren gezonde personen tussen 18 en 25 jaar oud, zonder bekende systemische ziekte, en die voldoende medewerking toonden tijdens de procedures. Personen werden uitgesloten als ze een systemische aandoening hadden, zwanger waren of borstvoeding gaven, of medicijnen of hormonale middelen gebruikten die de hematologische of hormonale parameters zouden kunnen beïnvloeden.
2. Bloedafname en groepstoewijzing
Bij elke deelnemer werden in totaal zes veneuze bloedmonsters van 10 ml afgenomen, drie 's ochtends (08:00 uur) en drie 's avonds (20:00 uur). In het onderzoek werden steriele PRF-buisjes van additiefvrij glas (10 ml) gebruikt. In de ochtendsessie werd buis 1 gebruikt voor het volledige bloedbeeld (CBC), buis 2 voor serumcortisolanalyse en buis 3 voor PRF-voorbereiding, gevolgd door groeifactoranalyse. In de avondsessie werd buis 4 gebruikt voor CBC, buis 5 voor serumcortisolanalyse en buis 6 voor PRF-voorbereiding en groeifactoranalyse. Op basis van het tijdstip van bloedafname werden monsters in twee groepen verdeeld: groep 1 bestond uit pure PRF bereid uit ochtendbloed (08:00 uur) en groep 2 bestond uit pure PRF bereid uit avondbloed (20:00 uur).
3. PRF voorbereiding
Bloedmonsters werden gedurende 12 minuten bij kamertemperatuur gecentrifugeerd bij 708 x g met behulp van een centrifuge die was uitgerust met een rotor van 40° met een vaste hoek en glazen buizen van 10 ml. Het gebruikte apparaat had een rotorradius die instelbaar was tussen 88 mm en 110 mm; In dit onderzoek werd een straal van 88 mm gekozen om het protocol te standaardiseren. Tijdens de procedure werden geen anticoagulantia gebruikt. Na centrifugatie werden de resulterende PRF macroscopisch geëvalueerd om een goede vorming te garanderen, die wordt gekenmerkt door een glad en homogeen oppervlak, een elastische en cilindrische vorm en een compacte, stevige consistentie.
4. Groeifactor ELISA-analyse
PRF-stolsels werden zorgvuldig gescheiden van de rode bloedcellaag met behulp van een steriele schaar. Elk stolsel werd gewogen en RPMI-1640 kweekmedium werd toegevoegd in een verhouding van 1:1 op basis van gewicht (g = ml) om de incubatieomgeving in alle monsters te standaardiseren en een consistente diffusie van oplosbare groeifactoren uit de PRF-matrix te garanderen. Deze verhouding maakt proportionele extractie mogelijk op basis van de stolselgrootte, waardoor de variabiliteit in groeifactorconcentraties als gevolg van ongelijke stolselmassa's wordt geminimaliseerd. Monsters werden gedurende 24 uur en 72 uur geïncubeerd in een orbitale schudder bij 100 tpm en 3 °C om een uniforme diffusie van groeifactoren van de PRF-matrix in het kweekmedium te bevorderen. Na incubatie werden de supernatanten verzameld en opgeslagen bij -8 °C tot analyse. Groeifactorconcentraties werden gekwantificeerd met behulp van commerciële ELISA-kits, waaronder FGFR, VEGF, IGF-1, PDGF en TGF-β1, volgens het bereidingsprotocol van de fabrikant 9,10.
5. ELISA-stappen
Standaarden en monsters (elk 100 μL) werden aan de putten toegevoegd en gedurende 90 minuten bij 3 °C geïncubeerd. Putten werden vervolgens drie keer gewassen met wasbuffer. Vervolgens werd 100 μL biotine-gelabeld antilichaam aan elk putje toegevoegd en gedurende 60 minuten bij 3 °C geïncubeerd, gevolgd door drie extra wasbeurten. Vervolgens werd 100 μl mierikswortelperoxidase (HRP)-oplossing toegevoegd en gedurende 30 minuten bij 3 °C geïncubeerd. Na nog eens drie wasbeurten werd 100 μL substraatreagens toegevoegd en gedurende 15 minuten geïncubeerd. Ten slotte werd 50 μL stopoplossing aan elk putje toegevoegd en werd de extinctie gemeten bij 450 nm.
6. Statistische analyse
Categorische variabelen werden uitgedrukt als frequenties en percentages, terwijl numerieke gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie of mediaan (minimum-maximum), al naar gelang het geval. De normaliteit van numerieke variabelen werd beoordeeld met behulp van de Shapiro-Wilk-test. Variabelen die niet voldeden aan de aanname van normaliteit, met name de groeifactorconcentraties en cortisolspiegels, werden geanalyseerd met behulp van niet-parametrische tests, waaronder de Wilcoxon signed-rank-test voor gepaarde vergelijkingen en Spearman's rangcorrelatiecoëfficiënt voor associaties. Alle statistische analyses zijn uitgevoerd met behulp van IBM SPSS Statistics software. Een p-waarde <0,05 werd als statistisch significant beschouwd. Alle vergelijkingen werden uitgevoerd binnen - onder voorbehoud van controle op interindividuele variabiliteit.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Alle 20 vrijwillige deelnemers (10 vrouwen en 10 mannen, tussen 18 en 25 jaar) voltooiden het onderzoek zonder enig monsterverlies. Volledige resultaten van het bloedbeeld bevestigden dat bloedplaatjes en hematologische parameters in alle monsters binnen normale referentiebereiken lagen, wat de betrouwbaarheid van de PRF-preparaten valideerde.
Vergelijking van bloedparameters tussen ochtend en avond
Cortisolspiegels waren significant hoger ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Op basis van de bekende circadiane regulatie van bloedplaatjesactiviteit en hormoonsecretie, werd aanvankelijk verondersteld dat het tijdstip van bloedafname (ochtend versus avond) het PRF-groeifactorgehalte kan veranderen. Deze studie was bedoeld om te testen of een dergelijke temporele variatie bestaat, en zo ja, of deze correleert met serumcortisolspiegels en hematologische parameters. De studie was opgezet als een pilotonderzoek om de circadiane variatie in de afgifte van PR...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| CENTRIFUGE MACHINE | DUO | 913023410238 | |
| ELISA KITS | Fine Test, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. | IGF-1 (Catalog no:EH0165) | |
| ELISA KITS | Fine Test, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. | PDGF (Catalog no:EH3531) | |
| ELISA KITS | Fine Test, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. | FGFR (Catalog no:EH0715) | |
| ELISA KITS | Fine Test, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. | VEGF (Catalog no:EH0327) | |
| ELISA KITS | Fine Test, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. | TGF-β1(Catalog no:EH0287) | |
| PRF Tubes |  | 6370 |
Referenties
- Dohan, D. M., et al. Platelet-rich fibrin (PRF): A second-generation platelet concentrate. Part I: Technological concepts and evolution. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 101 (3), e37-e44 (2006).
- Ehrenfest, D. M. D., Rasmusson, L., Albrektsson, T. Classification of platelet concentrates: From pure platelet-rich plasma (P-PRP) to leucocyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF). Trends Biotechnol. 27 (3), 158-167 (2009).
- Scheiermann, C., Kunisaki, Y., Frenette, P. S. Circadian control of the immune system. Nat Rev Immunol. 13 (3), 190-198 (2013).
- Haus, E., Smolensky, M. Biological clocks and shift work: Circadian dysregulation and potential long-term effects. Cancer Causes Control. 17, 489-500 (2006).
- Weitzman, E. D., et al. Twenty-four hour pattern of the episodic secretion of cortisol in normal subjects. J Clin Endocrinol Metab. 33 (1), 14-22 (1971).
- Scheer, F. A., et al. The human endogenous circadian system causes greatest platelet activation during the biological morning independent of behaviors. PLoS One. 6 (9), e24549(2011).
- Aoto, K., et al. Circadian variation of growth factor levels in platelet-rich plasma. Clin J Sport Med. 24 (6), 509-512 (2014).
- Richmond, J. Y., McKinney, R. W. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , US Government Printing Office. (2009).
- Hyslop, P. A., Bender, M. H. Methods for sample preparation for direct immunoassay measurement of analytes in tissue homogenates: ELISA assay of amyloid β-peptides. Curr Protoc Neurosci. 18 (1), 7.20.21-7.20.27 (2002).
- ELISA sample preparation protocol. , FineTest. (2022).
- Karolczak, K., et al. Plasma concentration of cortisol negatively associates with platelet reactivity in older subjects. Int J Mol Sci. 24 (1), 717(2022).
- Bass, J., Takahashi, J. S. Circadian integration of metabolism and energetics. Science. 330 (6009), 1349-1354 (2010).
- Atkinson, G., Todd, C., Reilly, T., Waterhouse, J. Diurnal variation in cycling performance: Influence of warm-up. J Sports Sci. 23 (3), 321-329 (2005).
- Petrovsky, N., Harrison, L. C. The chronobiology of human cytokine production. Int Rev Immunol. 16 (5-6), 635-649 (1998).
- Hilderink, J. M., et al. Within-day biological variation and hour-to-hour reference change values for hematological parameters. Clin Chem Lab Med. 55 (7), 1013-1024 (2017).
- Xie, Y., et al. FGF/FGFR signaling in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 5 (1), 181(2020).
- Farooq, M., Khan, A. W., Kim, M. S., Choi, S. The role of fibroblast growth factor (FGF) signaling in tissue repair and regeneration. Cells. 10 (11), 3242(2021).
- Murgo, E., Falco, G., Serviddio, G., Mazzoccoli, G., Colangelo, T. Circadian patterns of growth factor receptor-dependent signaling and implications for carcinogenesis. Cell Commun Signal. 22 (1), 319(2024).
- McCarthy, T. L., Centrella, M., Canalis, E. Cortisol inhibits the synthesis of insulin-like growth factor-I in skeletal cells. Endocrinology. 126 (3), 1569-1575 (1990).
- Dong, J., et al. The proliferative effect of cortisol on bovine endometrial epithelial cells. Reprod Biol Endocrinol. 17, 1-9 (2019).
- Moraes, L. A., et al. Ligand-specific glucocorticoid receptor activation in human platelets. Blood. 106 (13), 4167-4175 (2005).
- Deutsch, V., et al. Sustained leukocyte count during rising cortisol level. Acta Haematol. 118 (2), 73-76 (2007).
- Lightman, S. L., Conway-Campbell, B. L. The crucial role of pulsatile activity of the HPA axis for continuous dynamic equilibration. Nat Rev Neurosci. 11 (10), 710-718 (2010).
- Gabbitas, B., Pash, J. M., Delany, A. M., Canalis, E. Cortisol inhibits the synthesis of insulin-like growth factor-binding protein-5 in bone cell cultures by transcriptional mechanisms. J Biol Chem. 271 (15), 9033-9038 (1996).
- Gado, M., Baschant, U., Hofbauer, L. C., Bad Henneicke, H. to the bone: The effects of therapeutic glucocorticoids on osteoblasts and osteocytes. Front Endocrinol. 13, 835720(2022).
- Raica, M., Cimpean, A. M. Platelet-derived growth factor (PDGF)/PDGF receptors (PDGFR) axis as target for antitumor and antiangiogenic therapy. Pharmaceuticals. 3 (3), 572-599 (2010).
- Li, J., Forhead, A., Dauncey, M., Gilmour, R., Fowden, A. Control of growth hormone receptor and insulin-like growth factor-I expression by cortisol in ovine fetal skeletal muscle. J Physiol. 541 (2), 581-589 (2002).
- Al-Sharabi, N., et al. Proteomic analysis of mesenchymal stromal cells secretome in comparison to leukocyte- and platelet-rich fibrin. Int J Mol Sci. 24 (17), 13057(2023).
- Coucke, B., et al. Leukocyte- and platelet-rich fibrin for enhanced tissue repair: An in vitro study characterizing cellular composition, growth factor kinetics and transcriptomic insights. Mol Biol Rep. 51 (1), 954(2024).
- Chtourou, H., Souissi, N. The effect of training at a specific time of day: A review. J Strength Cond Res. 26 (7), 1984-2005 (2012).
- Kang, Y. H., et al. Platelet-rich fibrin is a bioscaffold and reservoir of growth factors for tissue regeneration. Tissue Eng Part A. 17 (3-4), 349-359 (2011).
- Miron, R. J., et al. Use of platelet-rich fibrin in regenerative dentistry: A systematic review. Clin Oral Investig. 21, 1913-1927 (2017).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.