Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Oprichting en onderhoud van van patiënten afgeleide organoïden voor prostaatkanker: een gedetailleerd experimenteel protocol

1.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68912

⸱

14 november 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, Jiangnan University Medical Center (Wuxi No. 2 People's Hospital), 2Wuxi School of Medicine, Jiangnan University

In dit artikel

Samenvatting

De heterogeniteit van prostaatkanker en de resistentie tegen de behandeling blijven uitdagingen. We beschrijven een protocol voor het genereren van patiënt-afgeleide organoïden (PDO's) die de belangrijkste kenmerken van de ouderlijke tumor behouden. Dit gestandaardiseerde model ondersteunt de screening van geneesmiddelen en de vooruitgang op het gebied van precisiegeneeskunde.

Samenvatting

Prostaatkanker (PCa) is een zeer heterogene maligniteit en een belangrijke oorzaak van kankergerelateerde mortaliteit bij mannen, met aanzienlijke klinische uitdagingen bij het aanpakken van behandelingsresistentie en ziekteprogressie. Bestaande preklinische modellen, zoals tweedimensionale (2D) cellijnen en van de patiënt afgeleide xenotransplantaten (PDX's), hebben beperkingen bij het getrouw recapituleren van de complexiteit van PCa, inclusief tumorheterogeniteit, androgeenreceptor (AR)-afhankelijke signalering en micro-omgevingsinteracties. Om deze kloof te dichten, presenteert deze studie een robuust en reproduceerbaar protocol voor het vaststellen van van patiënten afgeleide organoïden (BOB's) die de genetische, fenotypische en histologische kenmerken van de ouderlijke tumoren behouden. Deze methode maakt het mogelijk om organoïden te kweken uit zowel gelokaliseerde als geavanceerde PCa, wat een biologisch relevant model biedt voor het bestuderen van ziektemechanismen, medicijnrespons en ontdekking van biomarkers. De resultaten tonen het vermogen van het protocol aan om organoïden te genereren uit een verscheidenheid aan klinische monsters, met toepassingen in high-throughput screening van geneesmiddelen en precisiegeneeskunde. Door een gestandaardiseerde workflow aan te bieden die de belangrijkste technische uitdagingen aanpakt, benadrukt deze studie het belang van BOB's als veelzijdige hulpmiddelen voor het bevorderen van onderzoek naar prostaatkanker en het ontwikkelen van effectievere therapeutische strategieën.

Inleiding

Prostaatkanker (PCa) blijft wereldwijd een van de meest voorkomende maligniteiten bij mannen, de tweede alleen voor longkanker bij kankergerelateerde mortaliteit. Volgens recente epidemiologische studies is de wereldwijde incidentie van PCa gestaag gestegen en wordt verwacht dat het aantal nieuwe gevallen van prostaatkanker jaarlijks zal stijgen van 1,4 miljoen in 2020 tot 2,9 miljoen in 20401. Ondanks de vooruitgang op het gebied van vroege opsporing en de ontwikkeling van nieuwe therapieën, waaronder androgeendeprivatietherapie (ADT) en gerichte middelen, blijft prostaatkanker een belangrijke klinische uitdaging vanwege de heterogene aard en de onvermijdelijke ontwikkeling van behandelingsresistentie, vooral in gevorderde stadia2. Castratieresistente prostaatkanker (CRPC), die ontstaat na ADT-falen, vertegenwoordigt een dodelijke vorm van de ziekte, gekenmerkt door slechte overlevingsresultaten en beperkte therapeutische opties3. Inzicht in de moleculaire mechanismen die ziekteprogressie en resistentie aansturen, is daarom cruciaal voor het identificeren van nieuwe therapeutische doelen en het verbeteren van de patiëntresultaten.

De ontwikkeling van preklinische modellen die de complexiteit van menselijke prostaatkanker nauwkeurig nabootsen, is van cruciaal belang voor het bevorderen van onderzoek op dit gebied. Traditionele 2D-celculturen, hoewel veel gebruikt, slagen er niet in om de cellulaire heterogeniteit, tumorarchitectuur en micro-omgeving die in vivo worden waargenomen samen te vatten 4. Als gevolg hiervan is het translationele nut van deze modellen beperkt, met name voor het bestuderen van tumorprogressie, resistentie tegen geneesmiddelen en de dynamische interacties tussen kankercellen en de micro-omgeving van de tumor5. Daarentegen zijn patiënt-afgeleide xenotransplantaten (PDX's) en organoïdeculturen naar voren gekomen als meer geavanceerde hulpmiddelen die de kloof tussen conventionele cellijnen en klinische tumoren overbruggen 4,5,6.

Organoïde kweeksystemen hebben een revolutie teweeggebracht in kankermodellering. Deze driedimensionale (3D) structuren zijn afgeleid van weefsels van patiënten en kunnen de histologische, genomische en fenotypische kenmerken van de oorspronkelijke tumor behouden 7,8,9,10. Belangrijk is dat organoïden voor prostaatkanker kritieke kenmerken van de heterogeniteit van de ziekte behouden, waaronder AR-signalering, resistentie tegen behandeling en genomische instabiliteit, waardoor ze ideale hulpmiddelen zijn voor translationeel onderzoek11. Vergeleken met PDX-modellen zijn organoïden kosteneffectiever, schaalbaarder en vatbaarder voor genetische manipulatie, wat high-throughput screening van geneesmiddelen, ontdekking van biomarkers en functionele studies mogelijk maakt. Organoïde-platforms hebben al veelbelovende resultaten laten zien bij andere maligniteiten, waaronder colorectale, borst- en pancreaskanker, wat hun potentieel voor gepersonaliseerde oncologie onderstreept 4,12.

Het opzetten en onderhouden van prostaatkankerorganoïden (PCO's) brengt echter unieke technische uitdagingen met zich mee. Het prostaatepitheel is inherent afhankelijk van androgeensignalering en ondersteuning van de extracellulaire matrix (ECM), waardoor gespecialiseerde kweekomstandigheden nodig zijn. Bovendien vertoont prostaatkanker een breed scala aan klinisch gedrag, van gelokaliseerde hormoongevoelige tumoren tot zeer agressieve, therapieresistente CRPC, wat de ontwikkeling van reproduceerbare organoïde systemen verder bemoeilijkt11,12. Succesvolle protocollen voor het genereren van PCO moeten deze biologische complexiteiten aanpakken door belangrijke stappen te optimaliseren, waaronder weefselverwerking, enzymatische vertering, ECM-inbedding en suppletie met kritische groeifactoren, hormonen en kleine moleculen. Dergelijke protocollen zijn essentieel om de getrouwheid van organoïden aan hun ouderlijke tumoren te waarborgen en hun toepassing in downstream-analyses te vergemakkelijken.

In deze studie presenteren we een gedetailleerd en reproduceerbaar protocol voor het opzetten en onderhouden op lange termijn van BOB's. Onze workflow omvat het hele proces, van weefselacquisitie en verwerking van biopsie en chirurgische monsters tot organoïde passaging, cryopreservatie en reanimatie (Figuur 1). Dit protocol is geoptimaliseerd om de fenotypische en genomische integriteit van prostaatkankerweefsels te behouden, waardoor robuuste 3D-kweeksystemen mogelijk zijn die geschikt zijn voor een breed scala aan toepassingen, waaronder genomische profilering, testen op geneesmiddelrespons en functionele tests. Onze methode pakt met name veelvoorkomende technische hindernissen aan, zoals lage slagingspercentages in de organoïdecultuur, suboptimale groei en moeilijkheden bij het daaropvolgende passeren, en biedt gestandaardiseerde richtlijnen, waardoor de reproduceerbaarheid in laboratoria wordt vergemakkelijkt.

De ontwikkeling van betrouwbare organoïdemodellen voor prostaatkanker is van groot belang voor zowel fundamenteel als translationeel onderzoek13. Deze systemen bieden een krachtig platform voor het ontcijferen van ziektemechanismen, het identificeren van nieuwe therapeutische doelen en het bevorderen van precisiegeneeskundebenaderingen die zijn afgestemd op individuele patiënten. Door bestaande technische hiaten aan te pakken en een uitgebreid protocol te bieden, is ons werk gericht op het versnellen van de acceptatie van organoïdetechnologie in prostaatkankeronderzoek en het ondersteunen van de wereldwijde inspanningen om deze uitdagende ziekte te bestrijden14.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Deze studie is beoordeeld en goedgekeurd door de Medisch Ethische Commissie van het Wuxi No. 2 People's Hospital (Goedkeuringsnummer: Y-38 (2023)). Alle deelnemers verstrekten schriftelijke formulieren voor geïnformeerde toestemming. Patiëntgegevens werden geanonimiseerd om de bescherming van de privacy te waarborgen in overeenstemming met ethische normen.

1. Afname van monsters

  1. Weefsel acquisitie
    1. Voorbereiding voor de bemonstering
      1. Inclusiecriteria: Zorg ervoor dat alle deelnemers een bevestigde diagnose van prostaatkanker hebben, zoals bepaald door pathologisch of beeldvormend onderzoek. Leid tumormonsters af uit chirurgische resectie, biopsie of andere klinische monsters. Zorg ervoor dat alle deelnemers 18 jaar of ouder zijn en geen andere maligniteiten hebben, om mogelijke interferentie van andere vormen van kanker bij het onderzoek naar prostaatkanker uit te sluiten. Verzamel van alle deelnemers de schriftelijke geïnformeerde toestemming om deel te nemen aan het onderzoek en laat hun monsters gebruiken voor wetenschappelijk onderzoek.
      2. Uitsluitingscriteria: Sluit patiënten uit van wie de monsters niet genoeg tumorweefsel bevatten voor kweek of analyse. Sluit patiënten uit die hun toestemming intrekken of niet in staat zijn om de vereiste monsters te verstrekken tijdens het onderzoek.
    2. Prostaat kern naald biopsie monsters: Gebruik een speciale naald om monsters van prostaatweefsel te verkrijgen. Plaats het weefsel onmiddellijk in conserveringsoplossing (Advanced DMEM/F-12 (adDMEM/F-12) medium + gesteenteremmeroplossing (verdunning 1:2000)) en transporteer het op ijs naar het laboratorium, waarbij u ervoor zorgt dat het binnen 24 uur wordt afgeleverd.
      OPMERKING: Richt u nauwkeurig op prostaatkankerweefsel en voer bemonstering op meerdere locaties uit in verschillende anatomische regio's. Voer 1-2 puncties per plaats uit, elk met ≥ kernmonsters van 1 cm.
    3. Monsters van radicale prostatectomie: Plaats de monsters na afname snel in conserveringsoplossing (adDMEM/F-12 medium + gesteentineremmeroplossing (verdunning 1:2000)) en vervoer op ijs, zodat ze binnen 24 uur in het laboratorium worden afgeleverd.
      OPMERKING: Meer weefselfragmenten kunnen worden verkregen door radicale prostatectomie15.
      Verzamel monsters ≥ 1 g (≈ 5 mm diameter) en minimaliseer besmetting door normaal weefsel. Preoperatief coördineren met clinici om te specificeren: 1) tumorkern; 2) peri-tumoraal weefsel; 3) Normale controle. Geef prioriteit aan stevige fragmenten met grijsgele verkleuring. Als dit niet het geval is, implementeer dan systematische willekeurige steekproeven. Raadpleeg Tabel 1 voor informatie over het verzamelen van monsters.
  2. Verwerking van monsters
    1. Labeling en categorisatie: Label de verzamelde weefselmonsters duidelijk (inclusief de naam van de patiënt, het ziekenhuisopnamenummer, de weefselnaam, de weefselplaats en het weefseltype).
    2. Cryopreservatie: Verwerk weefselmonsters onmiddellijk (≤ 12 uur na afname). Breng de monsters in een voorgekoelde (4 °C) conserveringsoplossing (adDMEM/F-12 medium + gesteenteremmeroplossing (verdunning 1:2000)) en bewaar ze bij 4 °C. Ga binnen 4-6 uur verder met experimentele stappen voor optimale resultaten.
  3. Transport en opslag
    1. Transport van de koelketen: Transporteer de weefselmonsters naar het laboratorium onder lage temperaturen.
    2. Monsterregistratie: Bij aankomst in het laboratorium verifieert en registreert u de monsterinformatie in detail, inclusief de persoonlijke basisinformatie van de patiënt, het weefseltype, de naam en de bemonsteringsplaats.
  4. Laboratoriumontvangst en inspectie:
    1. Monsterinspectie: Open de monsters in een bioveiligheidskast en inspecteer ze op verlies, vervuiling of zichtbare afwijkingen.
    2. Monster dissectie: Pak het monster en plaats het in een kweekschaal. Gebruik een tissueschaar of een scalpel om het monster in kleine stukjes (ongeveer 1-3 mm³) te verdelen voor gebruik in volgende experimenten.

2. Experimentele procedures

  1. Bereiding van suspensies van primaire weefselcellen
    1. Bewaring: Plaats de verzamelde weefselblokken in steriele conische centrifugebuisjes van 50 ml en zorg ervoor dat de weefsels op type worden gecategoriseerd. Label elke tube op de juiste manier. Voeg conserveringsoplossing (adDMEM/F-12 medium + gesteenteremmeroplossing (verdunning 1:2000)) toe aan elke buis totdat het weefsel volledig is ondergedompeld. Bewaar de monsters bij 4 °C tot verdere verwerking.
      OPMERKING: Weefseltypen moeten zowel tumor- als niet-tumorweefsels bevatten. Voorbeeldetiketten moeten doorgaans het nummer van het medisch dossier bevatten.
    2. Weefselscheiding: Gebruik een gesteriliseerd pincet om de weefselmonsters van prostaatkanker over te brengen in een middelgrote kweekschaal. Was het doekje 2-3 keer met 2 ml Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (D-PBS) om bloed en vuil te verwijderen. Verwijder voorzichtig vetweefsel, spieren en andere niet-epitheliale componenten met behulp van een pincet met fijne punt, waarbij alleen de epitheelgebieden behouden blijven. Hak vervolgens met een schaar het gereinigde weefsel in kleine stukjes van ongeveer 1-3 mm³ groot.
      OPMERKING: Volledige verwijdering van niet-epitheliale componenten is van cruciaal belang voor stroomafwaartse toepassingen, aangezien verontreiniging van stromaal of vetweefsel de efficiëntie en specificiteit van celisolatie kan verminderen. Zorg tijdens de procedure voor steriele omstandigheden om het risico op microbiële besmetting te minimaliseren.
    3. Weefselvertering: Breng de voorbereide weefselstukken over in weefselverwerkingsbuizen. Voeg de oplossing voor de vertering van tumorweefsel (tabel 2) toe aan elk buisje. Activeer het spijsverteringsapparaat (eencellig suspensiepreparater) met behulp van het medium-harde weefseldissociatieprogramma voor enzymatisch-mechanische dissociatie.
      OPMERKING: Het verteringsprotocol is als volgt: voorwaartse rotatie met 200 tpm gedurende 3 s, omgekeerde rotatie met 200 tpm gedurende 3 s, voorwaartse rotatie met 300 tpm gedurende 4 s, omgekeerde rotatie met 300 tpm gedurende 4 s, voorwaartse rotatie met 600 tpm gedurende 5 s, omgekeerde rotatie met 600 tpm gedurende 5 s, voorwaartse rotatie met 400 tpm gedurende 3 s, Omgekeerde rotatie bij 400 tpm gedurende 3 s. Deze reeks vormt één cyclus, die drie keer moet worden herhaald. Na het voltooien van de eerste twee cycli gaat u verder met een langzame rotatie van 20 tpm gedurende ongeveer 25 minuten. De duur kan worden aangepast op basis van experimentele omstandigheden. Verteer de weefsels bij 37 °C gedurende 40 minuten tot 1 uur.
    4. Beëindiging van de spijsvertering: Voeg een gelijk of dubbel volume FBS-aangevuld adDMEM/F-12-medium toe aan de celsuspensie om de enzymatische activiteit te beëindigen.
      OPMERKING: Als er onverteerd residu achterblijft, verzamel dan het supernatant, voeg verse spijsverteringsenzymen toe aan het residu en ga door met de spijsvertering bij 37 °C gedurende nog eens 15-20 minuten. Controleer het proces regelmatig en combineer celsuspensies van beide verteringsstappen.
    5. Filtratie: Maak een celzeef van 100 μm nat met 1 ml adDMEM/F-12-medium en filtreer vervolgens de celsuspensie. Spoel de weefselverwerkingsbuis en de celzeef tweemaal met 5 ml adDMEM/F-12-medium aangevuld met gesteentenremmeroplossing (verdunning 1:2000). Vang het filtraat op in een steriele conische centrifugebuis van 50 ml. Laat de suspensie door de zeef van 70 μm lopen en verzamel alle celsuspensies in een nieuwe buis van 50 ml.
      OPMERKING: Het aantal filtratiestappen en de poriegrootte van de zeven kunnen worden aangepast aan de monsterkenmerken.
    6. Lysis van rode bloedcellen: centrifugeer de verzamelde celsuspensie bij 200 × g gedurende 5 minuten bij 25 °C. Gooi het supernatant voorzichtig weg en suspendeer de celpellet vervolgens opnieuw in 2 ml lysisbuffer van rode bloedcellen. Incubeer de suspensie 2-3 minuten op ijs.
      OPMERKING: De incubatietijd voor lysis van rode bloedcellen kan worden aangepast op basis van de efficiëntie van de lysis. Langdurige incubatie kan leiden tot verhoogde celdood. Het wordt aanbevolen om het monster onder een microscoop te controleren om volledige lysis van rode bloedcellen te garanderen zonder overmatige schade aan andere celtypen.
    7. Beëindig de lysis:Voeg 6 ml adDMEM/F-12-medium aangevuld met gesteentenremmeroplossing (verdunning 1:2000) toe aan de celsuspensie. Breng het mengsel over in een steriele conische centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 x g bij 25 °C. Gooi het bovenstaande weg. Was de celkorrel 1-2 keer met hetzelfde aangevulde medium en breng de uiteindelijke celsuspensie over in een Eppendorf-tube van 1,5 ml.
    8. Beoordeling van de levensvatbaarheid: Meng 10 μl van de celsuspensie met een gelijk volume trypanblauwoplossing en observeer de levensvatbaarheid van de cellen onder een microscoop.
      OPMERKING: Als er aanzienlijke hoeveelheden dode cellen of vuil worden waargenomen, voer dan een centrifugatie met lage snelheid uit bij 50 x g gedurende 5 minuten bij 25 °C om ze te verwijderen voordat u verder gaat met tellen.
    9. Celtelling: Resuspendeer de pellet in 1 ml adDMEM/F-12-medium, verdun de suspensie indien nodig (meestal in een verdunning van 1:20) en plaats 6 μL van de verdunde suspensie op een hemocytometer om cellen onder een microscoop te tellen.
    10. Verzameling celpellets: centrifugeren bij 200 x g, 25 °C, gedurende 5 min. Verzamel de uiteindelijke celpellet in een Eppendorf-buis van 1,5 ml.

3. Organoïde vorming uit primaire celsuspensies

  1. Zaaien: Bepaal het vereiste volume matrixgel op basis van het aantal cellen. Breng met behulp van voorgekoelde pipetpunten (bewaard bij -20 °C) voorzichtig de juiste hoeveelheid matrixgel over op de celpellet. Meng het cel-gelmengsel voorzichtig op ijs, vermijd de vorming van luchtbellen om een uniforme zaaiing en een optimale integriteit van de matrixgel te garanderen.
    OPMERKING: Ontdooi de matrixgel een nacht voor gebruik bij 4 °C. Zorg ervoor dat alle hanteringsgereedschappen, inclusief pipetpunten en buisjes, voorgekoeld zijn om voortijdige geleering te voorkomen.
  2. Plating: Doseer het cel-matrixgelmengsel op een kweekplaat met 24 putjes met een lage hechting en breng ongeveer 30 μL per druppel aan. Zorg ervoor dat elke druppel meer dan 10.000 cellen bevat om een effectieve driedimensionale (3D) structuurvorming te ondersteunen.
    OPMERKING: Vermijd overmatige verdunning van de matrixgel. Om de structurele integriteit te behouden en de vorming van 3D-culturen te ondersteunen, moet de matrixgel meer dan 70% van het totale volume van het mengsel uitmaken. Organoïden afgeleid van menselijke biopsie- en prostatectomiemonsters zijn gelijkwaardig van aard, verschillen voornamelijk in levensvatbare celopbrengst, en identieke zaaidichtheden werden in dit protocol toegepast.
  3. Incubatie: Plaats de kweekplaat gedurende 5 minuten in een bevochtigde broedmachine bij 37 °C met 5% CO2 en laat de matrixgel voorlopig stollen. Keer de plaat om en laat deze 20 minuten staan om de matrixgel in 3D-vorm te houden. Voeg 800-1000 μL voedingsbodem (tabel 3) toe aan elk putje. Vervang het kweekmedium elke 2-3 dagen.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de matrixgel niet wordt verstoord tijdens de inversiestap om de 3D-structuur te behouden.

4. Organoïde passeren

  1. Verzameling en bereiding van organoïden: Gebruik een voorgekoelde pipetpunt om de matrixgel mechanisch te verstoren om de organoïdeclusters te fragmenteren. Spoel elk putje 1-2 keer met adDMEM/F-12 medium + gesteenteremmeroplossing (verdunning 1:2000). Breng de gefragmenteerde clusters samen met het kweekmedium over in een steriele conische centrifugebuis van 15 ml. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 × g bij 25 °C en gooi het bovenstaande weg.
    OPMERKING: Wanneer organoïden een diameter van 100 μm bereiken (meestal op teeltdag 14). Als een te groot mediumvolume de mechanische verstoring verstoort, zuig dan een deel van het medium op voordat u de clusters opbreekt. Voor resterende matrixgel die zich aan het plaatoppervlak hecht, schraapt u voorzichtig met een pipetpunt en spoelt u 2-3 keer met adDMEM/F-12 medium + gesteenseremmeroplossing (verdunning 1:2000). Alle spoelingen moeten worden samengevoegd met de eerste collectie voor een maximale opbrengst.
  2. Dissociatie van organoïden: Resuspendeer de resulterende pellet in 2 ml voorverwarmde recombinante trypsine-achtige enzymoplossing. Pipetteer op en neer om de dissociatie op gang te brengen en incubeer vervolgens gedurende 15-30 minuten bij 37 °C. Bewaak de dissociatie onder de microscoop elke 5 minuten totdat kleine celclusters (ongeveer 5-6 cellen per cluster) het veld domineren en ga dan verder met de volgende stap.
    OPMERKING: Tijdige beëindiging van de spijsvertering is cruciaal om overmatige dissociatie te voorkomen en de levensvatbaarheid van de cellen te behouden. Frequente microscopische observatie zorgt ervoor dat de spijsvertering op het optimale moment voor clustervorming wordt gestopt.
  3. Beëindig de spijsvertering: Beëindig de spijsvertering door een gelijk of dubbel volume adDMEM/F-12-medium toe te voegen, aangevuld met foetaal runderserum (FBS) om de enzymatische activiteit te doven. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 25 °C en gooi het bovenstaande weg.
  4. Verwijdering van de matrixgel: Resuspendeer de pellet in 2 ml celhersteloplossing en incubeer gedurende 20-40 minuten bij 4 °C om de resterende matrixgel op te lossen. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, gooi het supernatant weg en herhaal de wasbeurt tweemaal met adDMEM/F-12-medium om resterende matrixcomponenten te verwijderen. Breng de uiteindelijke pellet over naar een steriele Eppendorf-buis van 1,5 ml voor verdere verwerking.
    OPMERKING: Incubatie bij lage temperatuur is van cruciaal belang voor een effectieve depolymerisatie van matrixgel met behoud van de celintegriteit. Minimaliseer de tijd buiten de koude omgeving om voortijdige hergeling te voorkomen.
  5. Zaaien en kweken: Ga verder met het opnieuw inzaaien van de gedissocieerde organoïde clusters volgens de procedures beschreven in de stappen 3.1-3.3. Zorg voor de juiste celdichtheid en matrixgelverhouding voor een optimale hervorming van de 3D-structuur.
    OPMERKING: Gedetailleerde protocollen voor cryopreservatie, ontdooien, herinbedding en histologische verwerking van organoïden zijn op aanvraag beschikbaar.

5. Organoïde cryopreservatie

  1. Verzameling organoïden: Verwijder de kweekplaat uit de incubator en dissocieer de organoïde hydrogelaggregaten mechanisch met behulp van een voorgekoelde pipetpunt. Breng de gedissocieerde aggregaten samen met het kweekmedium over in een conische centrifugebuis van 15 ml. Spoel de putjes 2-3 keer met adDMEM/F-12 medium en combineer de wasbeurten met de primaire suspensie. Centrifugeer bij 200 × g gedurende 5 minuten bij 25 °C en gooi het bovenstaande weg.
    OPMERKING: Om een maximale opbrengst te garanderen, moet u de organoïde aggregaten voorzichtig verstoren zonder overmatige schade aan te richten. Alle wasbeurten moeten worden gecombineerd met de primaire collectie om het verlies van organoïden tijdens het inzamelingsproces te verminderen.
  2. Enzymatische dissociatie: Voeg 2-4 ml voorverwarmde recombinante trypsine-achtige enzymoplossing toe aan de organoïde pellet in een conische buis en meng de suspensie voorzichtig. Incubeer de suspensie gedurende 15-20 minuten bij 37 °C. Bewaak het dissociatieproces microscopisch om de 5 minuten.
    OPMERKING: Indien nodig voorzichtig pipetteren om te helpen bij het opsplitsen van grotere clusters in kleinere aggregaten (ongeveer 5-6 cellen per cluster). Kortere verteringstijden zijn nodig voor cryopreservatie om overmatige dissociatie en verlies van cellevensvatbaarheid te voorkomen. Frequente observatie zorgt ervoor dat de spijsvertering in het juiste stadium wordt beëindigd om de integriteit van de organoïde te behouden.
  3. Beëindiging van de spijsvertering: Voeg een gelijk of groter volume FBS-aangevuld met adDMEM/F-12-medium toe om de enzymatische activiteit te stoppen. Centrifugeer bij 200 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het bovenstaande weg.
    OPMERKING: Als de pellet vrij is van resterende matrixgel, ga dan verder met stap 5.5 voor cryopreservatie. Als de vervuiling van de matrixgel aanhoudt, gaat u verder met stap 5.4.
  4. Verwijdering van de matrixgel (optioneel): Volg de procedure beschreven in stap 4.4 om de matrixgel te verwijderen. Resuspendeer de pellet in 2 ml celhersteloplossing en incubeer gedurende 20-40 minuten bij 4 °C. Centrifugeer bij 200 × g gedurende 5 minuten bij 4°C, gooi het bovenstaande weg en herhaal het wasproces 1-2 keer om ervoor te zorgen dat de matrixgel volledig is verwijderd.
    OPMERKING: Het verwijderen van de resterende matrixgel is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat alleen gedissocieerde cellen worden gecryopreserveerd. Onvolledige verwijdering van de gel kan de levensvatbaarheid en structurele integriteit van de organoïden bij het ontdooien aantasten.
  5. Cryopreservatie: Resuspendeer de celpellet in 1,5 ml organoïde vriesmedium door voorzichtig te pipetteren om een gelijkmatige suspensie te garanderen. Breng de suspensie over in een cryovial en bewaar deze bij -80 °C voor kortstondige bewaring. Breng de injectieflacons na 24 uur over op vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat het cryopreservatiemedium grondig wordt gemengd met de cellen om ongelijkmatige bevriezing te voorkomen, wat kan leiden tot celbeschadiging. Injectieflacons moeten onmiddellijk na de korte opslagperiode worden overgebracht naar vloeibare stikstof om bewaring op lange termijn te garanderen en celafbraak te voorkomen.

6. Herstel van organoïden

  1. Ontdooien van gecryopreserveerde organoïden: Verwijder cryovials met organoïden uit vloeibare stikstof of -80 °C opslag. Dompel de injectieflacon onmiddellijk onder in een waterbad van 37 °C en schud voorzichtig totdat de inhoud volledig is ontdooid. Zodra het ontdooien is voltooid, brengt u de organoïde suspensie over in een conische centrifugebuis van 15 ml met behulp van een voorgekoelde (-20 °C) pipetpunt.
    OPMERKING: Snel en gelijkmatig ontdooien is van cruciaal belang om cryo-geïnduceerde celbeschadiging te minimaliseren. Gebruik voorgekoelde pipetpunten om voortijdige opwarming en matrijsgelvorming tijdens de overdracht te voorkomen.
  2. Verwijdering van cryoprotectant: Voeg voorzichtig 1-2 ml adDMEM/F-12-medium toe langs de wand van de conische buis om de cryoprotectant geleidelijk te verdunnen. Meng voorzichtig door inversie. Centrifugeer bij 200 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het bovenstaande weg.
    OPMERKING: Vermijd in dit stadium krachtig pipetteren of vortexen, omdat plotselinge osmotische verschuivingen en mechanische belasting de levensvatbaarheid van de organoïde in gevaar kunnen brengen. Een langzame verdunningsbenadering minimaliseert cellulaire shock.
  3. Wassen en suspenderen: Voeg 1 ml verse adDMEM/F-12 medium toe aan de pellet. Resuspendeer de cellen voorzichtig met behulp van een voorgekoelde (-20 °C) pipetpunt om voortijdige hechting van de matrixgel te voorkomen. Breng de suspensie over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
    OPMERKING: Het handhaven van een lage temperatuur tijdens het wassen is essentieel om thermisch geïnduceerde herassemblage van matrixgelcomponenten te voorkomen, wat de daaropvolgende reformatie van organoïden zou kunnen belemmeren.
  4. Verzameling: Centrifugeer bij 200 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het bovenstaande weg. Herhaal de wasstap 2-3 keer om ervoor te zorgen dat de resterende cryoprotectant en verontreinigingen volledig worden verwijderd.
  5. Zaaien en kweken: Resuspendeer de uiteindelijke celpellet in organoïde kweekmedium dat is bereid volgens experimentele behoeften. Ga verder met zaaien volgens het protocol beschreven in de stappen 3.1-3.3 en zorg voor de juiste verhouding van de matrixgel en de celdichtheid om het herstel van de 3D-structuur te ondersteunen.
    OPMERKING: De levensvatbaarheid en het herstel van cellen na ontdooiing zijn sterk afhankelijk van een zachte behandeling, de juiste verdunning van cryoprotectanten en het onmiddellijke herstel van een ondersteunende 3D-matrixgelomgeving.

7. Verwerking vóór de analyse voor de karakterisering van organoïden

  1. Organoïde oogsten: Aggregaten mechanisch dissociëren wanneer de organoïdediameters 70-100 μm bereiken en deze overbrengen naar een conische buis van 15 ml met medium voor verdere teelt. Spoel de putjes 2-3 keer met adDMEM/F-12 medium en combineer de wasbeurten met de organoïde suspensie. Centrifugeer bij 200 × g gedurende 5 minuten bij 25 °C en gooi het bovenstaande weg.
    OPMERKING: Gebruik voor kleinschalige verzamelingen (bijv. 1-2 putjes) een microcentrifugebuis van 1.5 ml om een efficiënte behandeling te garanderen en monsterverlies te verminderen. Wees voorzichtig om te voorkomen dat de organoïde structuren tijdens dissociatie worden verstoord.
  2. Resuspendeer: Resuspendeer de pellet in 1 ml adDMEM/F-12-medium en breng over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Centrifugeer bij 200 × g gedurende 5 minuten bij 25°C en gooi het bovenstaande weg.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de pellet grondig wordt geresuspendeerd voordat hij wordt gecentrifugeerd om klonteren te voorkomen en om een uniforme verwerking in de volgende stappen te vergemakkelijken.
  3. Wassen en fixeren: Voeg 1 ml D-PBS toe aan de pellet en meng voorzichtig door pipetteren of inversieren. Centrifugeer bij 200 × g gedurende 5 minuten bij 25 °C, gooi het bovenstaande weg en herhaal de wasstap 1-2 keer. Fixeer de pellet met 1-2 ml 4% paraformaldehyde (PFA) en incubeer een nacht bij 4 °C.
    OPMERKING: Voer de wasstappen zorgvuldig uit om ervoor te zorgen dat het achtergebleven medium en andere verontreinigingen grondig worden verwijderd. De fixatie in paraformaldehyde is cruciaal om de organoïde morfologie te behouden voor latere analyse.
  4. Wassen na fixatie: centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 200 × g bij 4 °C en gooi het bovenstaande weg. Was de vaste monsters 2-3 keer met D-PBS, meng voorzichtig door met de vinger te vegen of voorzichtig te inversieren om een goede verdeling van de wasbuffer te garanderen en verlies van organoïden te voorkomen.
    OPMERKING: Goed wassen na fixatie is essentieel om overtollig paraformaldehyde te verwijderen en achtergrondkleuring in downstream-toepassingen, zoals immunohistochemie, te verminderen.
  5. Ethanol Re-Fixatie: Resuspendeer de pellet in 1 ml 70% ethanol, meng voorzichtig door met de vinger te tikken en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer bij 200 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het bovenstaande weg.
    OPMERKING: Ethanolfixatie in dit stadium helpt de integriteit van de organoïde te behouden en de monsters voor te bereiden op inbedding of verdere verwerking. Zorg voor een gelijkmatige suspensie in ethanol om ongelijkmatige fixatie te voorkomen.
  6. Klaring van matrixgel (optioneel): Als er restanten van matrixgel in de pellet achterblijven, volg dan het protocol beschreven in stap 4.4 om deze te verwijderen. Deze stap omvat het opnieuw suspenderen van de pellet in celhersteloplossing en het incuberen bij 4 °C gedurende 20-40 minuten, gevolgd door centrifugeren en meerdere wasbeurten om volledige verwijdering van de gel te garanderen.
    OPMERKING: Het verwijderen van matrixgel is vooral belangrijk voor downstream histologische analyse of beeldvorming, omdat resterende gel de weefselsectie en -analyse kan verstoren.
  7. Agarose inbedding: Bereid ongeveer 6 ml 2% agarose door te smelten bij 96 °C tijdens de fixatie van organoïde ethanol. Meng 100 μL van de gesmolten agarose met de organoïde pellet, zorg voor minimale vorming van luchtbellen. Breng het mengsel over in een vorm, stol bij 4°C en verwerk het vervolgens voor het inbedden van paraffine.
    OPMERKING: Verwarm de pipetpunten voor (met bijgesneden uiteinden) om verstopping te voorkomen. Agarose-inbedding vergemakkelijkt het behoud van de organoïde structuur en zorgt tegelijkertijd voor eenvoudige hantering en secties. Vermijd luchtbelvorming tijdens het mengen om een gelijkmatige inbedding en optimale weefselsectie te garanderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Morfologische en dynamische groeikenmerken van patiënt-afgeleide prostaatkankerorganoïden
Van patiënten afgeleide organoïden voor prostaatkanker werden met succes vastgesteld uit vers tumorweefsel dat tijdens klinische procedures was verzameld. De initiële vorming van organoïden werd doorgaans waargenomen binnen 5-7 dagen na kweek (Figuur 2). Onder helderveldmicroscopie vertoonden organoïden verschillende morfologische kenmerken, waarbij ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het opzetten van PDO's voor PCa vertegenwoordigt een cruciale vooruitgang in preklinische modellering en biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van conventionele 2D-celculturen en PDX's16. De methode die in deze studie wordt gepresenteerd, maakt het mogelijk om organoïden te genereren die de histologische, genetische en fenotypische kenmerken van de oorspronkelijke tumor getrouw samenvatten. Door de heterogeniteit van tumoren te behouden, inclusief AR-signaleri...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs zijn dankbaar voor de steun van de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 82172831) en het Key Research Project van de Jiangsu Provincial Health and Family Planning Commission (Grant No. X20240121).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
A 83-01TOCRIS2939
adMEM/F12Gibco12634010
biosafety cabinetJinan Xinbeixi Biotechnology Co., Ltd
Cell Recovery SolutionCorning354253
centrifugeShenzhen Ruiwode Life Technology Co., LtdM1416R
centrifuge tubesNanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd
Cultrex PathClear BMR&D3533-010-02
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2R&D3533-005-02
culture containers (24-well low-adhesion plates)thermoNunc-174930-ZX
DHTISOREAG521-18-6
electronic balanceNanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd
Fetal Bovine SerumGibco10099141
GlutaminePlus-200mMR&DB90210
HEPESR&D1254/10
humidified cell culture incubator (37°C, 5% CO2)Shanghai Hetian Scientific Instrument Co., LtdHY-160SY
ice boxNanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd
medium-sized culture dishesabsinabs7005
N21-MAX Media Supplement (50X)R&DAR008
N-AcetylcysteineSigmaA9165-5G
NicotinamideR&D3533-010-02
NormocinInvivogenant-nr-2
Pipet-aid pipetting deviceNanjing Hotspot Scientific Instrument Co., Ltd
pipettesNanjing Hotspot Scientific Instrument Co., Ltd
PrimocinInvivogenant-pm-2
rhEGFR&D236-EG-01M
rhFGFR&D233-FB-025
rhFGF-10R&D345-FG-025
rhNogginR&D6057-NG-100
rhR-Spondin 1R&D4656-RS-100
SB 202190TOCRIS1264
Single-cell suspension preparation apparatusRWDDSC-400
Tissue scissors/scalpelNanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd
TryplE ExpressGibco126A04013
Tumor Dissociation Kit, HumanMiltenyi Biotec130-095-929
tweezersNanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd
water bathChangzhou Zhongjie Experimental Instrument Manufacturing Co., LtdHH-600
Y-27632 dihydrochlorideR&D1254/10

Referenties

  1. James, N. D., et al. The lancet commission on prostate cancer: planning for the surge in cases. Lancet. 403 (10437), 1683-1722 (2024).
  2. Knutson, T. P., et al. AR alterations inform circulating tumor DNA detection in metastatic castration resistant prostate cancer patients. Nat Commun. 15 (1), 10648(2024).
  3. Haffner, M. C., et al. Framework for the pathology workup of metastatic castration-resistant prostate cancer biopsies. Clin Cancer Res. 31 (3), 466-478 (2025).
  4. Fang, Z., Li, P., Du, F., Shang, L., Li, L. The role of organoids in cancer research. Exp Hematol Oncol. 12 (1), 69(2023).
  5. Sachs, N., Clevers, H. Organoid cultures for the analysis of cancer phenotypes. Curr Opin Genet Dev. 24, 68-73 (2014).
  6. Zhou, L., Zhang, C., Zhang, Y., Shi, C. Application of organoid models in prostate cancer research. Front Oncol. 11, 736431(2021).
  7. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  8. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
  9. Puca, L., et al. Patient-derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nat Commun. 9 (1), 2404(2018).
  10. Pamarthy, S., Sabaawy, H. E. Patient-derived organoids in prostate cancer: improving therapeutic efficacy in precision medicine. Mol Cancer. 20 (1), 125(2021).
  11. Karkampouna, S., et al. Patient-derived xenografts and organoids model therapy response in prostate cancer. Nat Commun. 12 (1), 1117(2021).
  12. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nat Protoc. 15 (10), 3380-3409 (2020).
  13. Neal, J. T., Kuo, C. J. Organoids as models for neoplastic transformation. Annu Rev Pathol. 11, 199-220 (2016).
  14. Waseem, M., Wang, B. D. Organoids: an emerging precision medicine model for prostate cancer research. Int J Mol Sci. 25 (2), (2024).
  15. Moschovas, M. C., Patel, V. Neurovascular bundle preservation in robotic-assisted radical prostatectomy: how I do it after 15,000 cases. Int Braz J Urol. 48 (2), 212-219 (2022).
  16. Li, Y., Qin, M., Liu, N., Zhang, C. Organoid development and applications in gynecological cancers: the new stage of tumor treatment. J Nanobiotechnology. 23 (1), 20(2025).
  17. Xiang, D., et al. Building consensus on the application of organoid-based drug sensitivity testing in cancer precision medicine and drug development. Theranostics. 14 (8), 3300-3316 (2024).
  18. Van Hemelryk, A., et al. Patient-derived xenografts and organoids recapitulate castration-resistant prostate cancer with sustained androgen receptor signaling. Cells. 11 (22), 3632(2022).
  19. Zhao, H., et al. Patient-derived bladder cancer organoids as a valuable tool for understanding tumor biology and developing personalized treatment. Adv Sci (Weinh). 12 (13), e2414558(2025).
  20. Polak, R., Zhang, E. T., Kuo, C. J. Cancer organoids 2.0: modelling the complexity of the tumour immune microenvironment. Nat Rev Cancer. 24 (8), 523-539 (2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Patiëntafgeleide organoïdenorganoïdenkweekdigestie van tumorweefselinbedding in Matrix Gelonderhoud van organoïdendrugscreeningprecisiegeneeskundeexpressie van de androgeenreceptorontdekking van biomarkers
Oprichting en onderhoud van van patiënten afgeleide organoïden voor prostaatkanker: een gedetailleerd experimenteel protocol
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.