Methodenartikel

Detectie van aggregatiegevoelig gedrag in mutante P53 V157F borstkankercellen met behulp van multipoint Thioflavine T-fluorescentie

DOI:

10.3791/68921

⸱

30 december 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, I-Shou University, 2School of Chinese Medicine for Post Baccalaureate, I-Shou University, 3Department of Medical Science and Biotechnology, I-Shou University, 4Department of Biomedical Engineering, I-Shou University, 5Department of Pathology, E-Da Hospital, 6Department of Physical Therapy, I-Shou University, 7Department of Occupational Therapy, I-Shou University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hs578T-borstkankercellen met de p53 V157F-mutatie vertonen significant een hogere fluorescentie van Thioflavine T vergeleken met MCF7-cellen, wat wijst op een verhoogde eiwitaggregatie. Multipoint fluorescentiemetingen verbeteren de detectienauwkeurigheid en betrouwbaarheid bij het identificeren van β-sheet-rijke aggregaten, wat het belang onderstreept van aggregatiegevoelige p53-mutaties in kankeronderzoek en de ontwikkeling van therapeutische strategieën.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De tumorsuppressor p53, gecodeerd door het TP53-gen , speelt een centrale rol bij het behouden van genomische stabiliteit. TP53-mutaties , met name hotspotvarianten, komen voor in ongeveer 50% van de menselijke kankers en kunnen leiden tot verlies van tumorsuppressieve functies of het verkrijgen van gain-of-function eigenschappen, waaronder aggregatie in prionachtige structuren.

In deze studie beoordeelden we de aggregatietendens van de p53 V157F-mutatie in Hs578T-borstkankercellen vergeleken met MCF7-cellen die wildtype p53 tot expressie brengen. Eiwitaggregatie werd geëvalueerd met behulp van Thioflavin T (ThT) kleuring, gevolgd door fluorescentiekwantificering in 96-put plaatassays. Cellen werden gekleurd met een ThT/Hoechst-oplossing, gewassen en geanalyseerd met een microplaatlezer onder gedefinieerde excitatie-/emissieparameters. Kwantitatieve analyse met behulp van zowel enkelpunt- als vierpuntsfluorescentiemetingen toonde aan dat Hs578T-cellen een 3,20- tot 4,26-voudige toename van ThT-fluorescentieintensiteit vertoonden ten opzichte van MCF7, wat wijst op significant verhoogde niveaus van β-velrijke of amyloïde-achtige aggregaten. Multipointmetingen bevestigden de wijdverspreide en consistente aanwezigheid van eiwitaggregaten over het putoppervlak. Deze bevindingen ondersteunen het gebruik van multipoint plate reading om eiwitaggregatie nauwkeurig te detecteren in celgebaseerde assays.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het TP53-gen, dat codeert voor het tumorsuppressoreiwit p53, is gemuteerd in ongeveer 50% van de menselijke kankers 1,2. Dergelijke mutaties elimineren niet alleen de tumorsuppressieve functies van p53, maar bevorderen in bepaalde hotspotvarianten ook de vorming van prionachtige aggregaten 3,4. Deze geaggregeerde vormen van mutant p53 verkrijgen vaak gain-of-function eigenschappen, waaronder verhoogde resistentie tegen antikankertherapieën 5,6. Daarom is het bepalen welke p53-hotspotmutaties gevoelig zijn voor aggregatie cruciaal om de ontwikkeling van effectieve behandelstrategieën bij p53-mutante kankerste sturen 7,8.

In eerdere studies observeerden we dat specifieke p53-mutaties in hoofd- en halsplaveiselcelcarcinoom (HNSCC) en borstkankercellijnen sterke Thioflavine T (ThT) kleuringssignalen vertonen, wat wijst op de aanwezigheid van geaggregeerde eiwitten. ThT is een benzothiazolkleurstof die specifiek bindt aan β-velrijke amyloïdestructuren, waardoor er een verbeterde fluorescentie ontstaat bij binding9. Zo vertoonde de Detroit 562 HNSCC-cellijn, die de p53 R175H-mutatie draagt, sterke ThT-fluorescentiesignalen10. Evenzo vertoonden twee andere HNSCC-cellijnen, TW01 en HONE-1, die beide de p53 R280T-mutatie bevatten, ook een uitgesproken ThT-kleuring11. In deze gevallen colocaliseerden ThT-signalen p53, wat de aanwezigheid van geaggregeerd p5310,11 ondersteunde.

Bij borstkankercellen vertoonden MDA-MB-231 (p53 R280K-mutatie) en T47D (p53 L194F-mutatie) eveneens sterke ThT-kleuring met duidelijke p53/ThT-colokalisatie12. Daarentegen vertoonden MCF7-cellen, die wildtype p53 tot expressie brengen, en MDA-MB-468-cellen (p53 R273H-mutatie) slechts zwakke ThT-signalen12. Evenzo vertoonden OECM-1 HNSCC-cellen met de p53 V173L-mutatie lage niveaus van ThT-kleuring10.

In vergelijking met andere methoden voor eiwitaggregatiedetectie – zoals filterval-assays, transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) of immunokleuring met aggregate-specifieke antilichamen – biedt ThT-fluorescentieanalyse verschillende voordelen. Het is niet-destructief, snel en toepasbaar op zowel levende als vaste cellen zonder uitgebreide verwerking. Hoewel filterval-assays effectief onoplosbare aggregaten vastleggen, vereisen ze een sterke denaturatie en zijn ze ongeschikt voor gebruik in levende cellen13. TEM biedt directe visualisatie van fibrillenmorfologie, maar is arbeidsintensief en heeft een lage doorvoersnelheidvan 14. Aggregate-specifieke immunokleuring maakt in situ detectie mogelijk met conformatieafhankelijke antilichamen, hoewel de beschikbaarheid en specificiteit vanantistoffen beperkt kunnen zijn tot 15. Daarentegen biedt ThT-fluorescentie – vooral in combinatie met multipoint plate reading – een eenvoudige, kwantitatieve en ruimtelijk betrouwbare benadering om β-velrijke of amyloïde-achtige structuren te detecteren.

Praktische overwegingen zijn ook essentieel voor reproduceerbaarheid. ThT-fluorescentie correleert lineair met de amyloïdeconcentratie over een breed concentratiebereik (0,2-500 μM), en het pieksignaal wordt doorgaans bereikt bij 20-50 μM, afhankelijk van het eiwit – hoewel ThT zelffluorescentie kan ontstaan bij ≥5 μM, en hogere concentraties kunnen de aggregatiekinetiekbeïnvloeden 16. Daarom wordt een werkende ThT-concentratie rond 10-20 μM over het algemeen aanbevolen om gevoeligheid in balans te brengen en tegelijkertijd potentiële effecten op aggregatieprocessente minimaliseren. In ons protocol wordt de 1.000x ThT-voorraad (12. mM) verdund met 1:1.000 tot een werkconcentratie van ongeveer 12. μM, wat binnen dit aanbevolen bereik valt.

ThT bindt bij voorkeur aan β-velrijke amyloïdestructuren, die kenmerkend zijn voor amyloïdefibrillen. Deze specificiteit ontstaat door de interactie van de kleurstof met de cross-β architectuur van amyloïde fibrillen, waarbij de oppervlakken gevormd door β-strengen bindplaatsen voor ThT vormen. Daardoor kan ThT mogelijk andere verkeerd gevouwen of niet-amyloïde aggregaten die deze β-sheet-rijke structuur17 niet effectief detecteren. Daarom is het, hoewel ThT een waardevol hulpmiddel is voor het identificeren van amyloïde fibrillen, aan te raden complementaire validatiemethoden toe te passen – zoals co-lokalisatie met p53-immunofluorescentie of biofysische benaderingen – om de identiteit en specificiteit van de gedetecteerde aggregaten10,18 te verifiëren.

Structurele voorspellingsstudies suggereren dat de p53 V157F-mutatie een conformatie aanneemt die gevoeliger is voor aggregatie dan het wildtype-eiwit19. In deze studie vergeleken we ThT-fluorescentiesignalen tussen Hs578T borstkankercellen, die de aggregatiegevoelige p53 V157F-mutatie bevatten, en MCF7 borstkankercellen die wildtype p53 tot expressie brengen. Met behulp van een multipoint plaatlezer gebaseerde ThT-kleuringstest probeerden we de aggregatieneiging van p53 V157F ten opzichte van wildtype p53 te beoordelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Celzaaiing

  1. Om de levensvatbaarheid van cellen te beoordelen, meng je 10 μL Trypan Blue met 10 μL resuspendeerde cellen in 1x Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) in een microcentrifugebuis en meng je grondig.
  2. Laad 10 μL van het mengsel op een tellerglijplaat en tel vervolgens de actieve cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller.
  3. Op basis van de levensvatbaarheidstelling zaaide men 30.000 levensvatbare cellen per put in een kweekplaat met 96 putten, waarvan één put werd aangewezen als niet-gekleurde controle en de overige drie putten werden gebruikt voor kleuring.

2. Incubatie

  1. Plaats de kweekplaat in een CO-2-broedmachine en broei 12 uur uit bij 37 °C.

3. Bereiding van verse ThT-kleurstof (1.000x)

  1. Weeg 0,02 g (20 mg) ThT-poeder en los het op in 5,0 mL gedeïoniseerd water. Meng grondig totdat het poeder volledig is opgelost.
    OPMERKING: Deze bereiding levert een 1.000x ThT voorraadoplossing op met een eindconcentratie van 4 mg/mL, gelijk aan 12,5 mM (ThT heeft een molecuulgewicht van ~318,85 g/mol. Een oplossing van 4 mg/mL is gelijk aan 4 g/L. Door 4 g/L te delen door 318,85 g/mol levert 0,0125 mol/L, oftewel ~12,5 mM.

4. Bereiding van ThT-kleuringsbuffer met nucleaire tegenkleuring

  1. Bereid de kleuroplossing voor door het volgende toe te voegen aan 1 mL 1x DPBS en meng voorzichtig om homogeniteit te garanderen.
    1. Voeg 1 μL vers bereide 1.000x ThT-voorraad toe, wat een uiteindelijke ThT-concentratie van 12,5 μM (1x) oplevert.
    2. Voeg 1 μL van 1 mg/mL Hoechst 33342 voorraadoplossing toe, wat een eindconcentratie van ~1 μg/mL (=1,6 μM) oplevert.

5. Vlekken

  1. Verwijder het kweekmedium uit elke put. Voeg 100 μL van de voorbereide ThT/Hoechst kleurbuffer toe aan elke kleurput. Voeg 100 μL 1x DPBS toe aan de niet-gekleurde controle.

6. Incubatie

  1. Zet het bord op een donkere plek bij kamertemperatuur (25 °C) gedurende 30 minuten.

7. Wassen

  1. Aspireer of verwijder voorzichtig de kleuringsoplossing uit elke put, waarbij je erop let dat de celmonolaag niet wordt verstoord.
  2. Voeg 100 μL van 1× DPBS toe aan elke put en laat een optioneel zachte weking van 30 seconden toestaan.
  3. Aspireer voorzichtig of gooi de DPBS-wasoplossing weg.
  4. Herhaal de wash door 100 μL verse 1x DPBS aan elke put toe te voegen, opnieuw een optionele zachte week van 30 seconden, en gooi daarna de DPBS-wasoplossing weg.
  5. Voeg na de tweede wasbeurt 100 μL verse 1x DPBS toe aan elke put.

8. Fluorescentiemeting

  1. Verwijder voordat je het fluorescentiesignaal leest de kap van de 96-well plaat. Meet fluorescentie met een van twee methoden: enkelpuntsmeting of vierpuntsmeting.
  2. Plaats de 96-wellplaat in een microplaatlezer en meet fluorescentie met de volgende instellingen: ThT-fluorescentie: Excitatie bij 450 nm, emissie bij 490 nm; Hoechst 33342 fluorescentie: Excitatie bij 360 nm, emissie bij 460 nm; lezersinstellingen: Schudden: 5 seconden voor lezen; Leesrichting: Bovenste leeswijze; Integratietijd: 140 ms; Leeshoogte: 1,00 mm; Punten per bronl: 1 (eindpunt) of 4 (putscan); Well scan instelling: (Dichtheidsinstelling: 2; Puntafstand: 2,5).

9. Data-analyse

  1. Bereken de eiwitaggregatie als volgt:
    figure-protocol-1
  2. Normaliseer de ThT-fluorescentieintensiteit door de verhouding in MCF7-cellen in te stellen op 1 (basiscontrole).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de aanwezigheid van β-sheet-rijke eiwitaggregaten in borstkankercellen te onderzoeken, werden MCF7- en Hs578T-cellijnen onderworpen aan ThT-kleuring gevolgd door fluorescentiekwantificering. Zoals te zien is in Figuur 1, werden cellen in vier putten van een 96-put plaat geplant, waarvan één put werd aangeduid als een ongekleurde controle. De overige drie putten werden volgens het standaardprotocol met ThT gekleurd. Fluorescentie werd gemeten met twee bena...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bij het plaatsen van cellen in platen met 96 putten is het vaak moeilijk om een gelijkmatige verdeling over het putoppervlak te bereiken, omdat het voorzichtig schudden of tikken van de plaat om de cellen te spreiden niet altijd haalbaar is. Deze ongelijke verdeling kan variabiliteit in signaalintensiteit over de put introduceren. Multipoint fluorescentiemeting toonde significante variatie tussen verschillende regio's binnen dezelfde put, wat deze bias en het potentieel voor misleidende ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs erkennen dankbaar de technische ondersteuning die is geboden door het Basic Medical Core Laboratory aan het College of Medicine, I-Shou University. Dit werk werd ondersteund door subsidies van het E-DA Ziekenhuis [EDAHJ114001 aan C.-C.C.] en de National Science and Technology Council, Taiwan [NSTC 112-2813-C-214-032-B aan B.-H. C]

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
96-well culture plateSimplyPC396-0100
counter slideInvitrogenC10228
Countess II FL Automated Cell CounterThermo Fisher Scientific AMQAF1000
dPBSSimplyCC704-0500
Eppendorf tubeSimplyPC101-5000
Hoechst 33342AAT Bioquest17530
SpectraMax iD3Molecular Devices735-0391 
Thioflavin TSigma-AldrichT3516
Trypan BlueInvitrogenT10282

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Binayke, A., Mishra, S., Suman, P., Das, S., Chander, H. Awakening the "guardian of genome": Reactivation of mutant p53. Cancer Chemother Pharmacol. 83 (1), 1-15 (2019).
  2. Chen, C. C., et al. A simple and affordable method to create nonsense mutation clones of p53 for studying the premature termination codon readthrough activity of ptc124. Biomedicines. 11 (5), 1310(2023).
  3. Rangel, L. P., Costa, D. C., Vieira, T. C., Silva, J. L. The aggregation of mutant p53 produces prion-like properties in cancer. Prion. 8 (1), 75-84 (2014).
  4. Kim, S., An, S. S. Role of p53 isoforms and aggregations in cancer. Medicine (Baltimore). 95 (26), e3993(2016).
  5. Zhou, G., et al. Gain-of-function mutant p53 promotes cell growth and cancer cell metabolism via inhibition of ampk activation. Mol Cell. 54 (6), 960-974 (2014).
  6. Zhang, C., et al. Gain-of-function mutant p53 in cancer progression and therapy. J Mol Cell Biol. 12 (9), 674-687 (2020).
  7. De Oliveira, G. aP., et al. The status of p53 oligomeric and aggregation states in cancer. Biomolecules. 10 (4), 548(2020).
  8. Wang, H., Guo, M., Wei, H., Chen, Y. Targeting p53 pathways: Mechanisms, structures, and advances in therapy. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 92(2023).
  9. Sulatskaya, A. I., Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K. Interaction of thioflavin t with amyloid fibrils: Stoichiometry and affinity of dye binding, absorption spectra of bound dye. J Phys Chem B. 115 (39), 11519-11524 (2011).
  10. Cai, B. H., et al. Nampt inhibitor and p73 activator represses p53 r175h mutated HNSCC cell proliferation in a synergistic manner. Biomolecules. 12 (3), 438(2022).
  11. Cai, B. H., et al. Chlorophyllides repress gain-of-function p53 mutated hnscc cell proliferation via activation of p73 and repression of p53 aggregation in vitro and in vivo. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1871 (3), 167662(2025).
  12. Wu, K. -Y., et al. Synergistic anticancer activity of hsp70 inhibitor and doxorubicin in gain-of-function mutated p53 breast cancer cells. Biomedicines. 13 (5), 1034(2025).
  13. Nasir, I., Linse, S., Cabaleiro-Lago, C. Fluorescent filter-trap assay for amyloid fibril formation kinetics in complex solutions. ACS Chem Neurosci. 6 (8), 1436-1444 (2015).
  14. Goldsbury, C., et al. Amyloid structure and assembly: Insights from scanning transmission electron microscopy. J Struct Biol. 173 (1), 1-13 (2011).
  15. Kayed, R., et al. Fibril specific, conformation dependent antibodies recognize a generic epitope common to amyloid fibrils and fibrillar oligomers that is absent in prefibrillar oligomers. Mol Neurodegener. 2, 18(2007).
  16. Xue, C., Lin, T. Y., Chang, D., Guo, Z. Thioflavin t as an amyloid dye: Fibril quantification, optimal concentration and effect on aggregation. R Soc Open Sci. 4 (1), 160696(2017).
  17. Biancalana, M., Koide, S. Molecular mechanism of thioflavin-t binding to amyloid fibrils. Biochim Biophys Acta. 1804 (7), 1405-1412 (2010).
  18. Yang-Hartwich, Y., et al. P53 protein aggregation promotes platinum resistance in ovarian cancer. Oncogene. 34 (27), 3605-3616 (2015).
  19. Lei, J., et al. Insights into allosteric mechanisms of the lung-enriched p53 mutants v157f and r158l. Int J Mol Sci. 23 (17), 10100(2022).
  20. Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).
  21. Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochem Biophys Rep. 26, 100987(2021).
  22. Yoshimura, Y., et al. Distinguishing crystal-like amyloid fibrils and glass-like amorphous aggregates from their kinetics of formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (36), 14446-14451 (2012).
  23. Yang, D. S., et al. Mesoscopic protein-rich clusters host the nucleation of mutant p53 amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (10), e2015618118(2021).
  24. Hackl, E. V., Darkwah, J., Smith, G., Ermolina, I. Effect of acidic and basic ph on thioflavin t absorbance and fluorescence. Eur Biophys J. 44 (4), 249-261 (2015).
  25. Bom, A. P., et al. The p53 core domain is a molten globule at low ph: Functional implications of a partially unfolded structure. J Biol Chem. 285 (4), 2857-2866 (2010).
  26. Ano Bom, A. P., et al. Mutant p53 aggregates into prion-like amyloid oligomers and fibrils: Implications for cancer. J Biol Chem. 287 (33), 28152-28162 (2012).
  27. Muller, P., Ceskova, P., Vojtesek, B. Hsp90 is essential for restoring cellular functions of temperature-sensitive p53 mutant protein but not for stabilization and activation of wild-type p53: Implications for cancer therapy. J Biol Chem. 280 (8), 6682-6691 (2005).
  28. Arsic, N., et al. Δ133p53β isoform pro-invasive activity is regulated through an aggregation-dependent mechanism in cancer cells. Nat Commun. 12 (1), 5463(2021).
  29. Zhao, L., Punga, T., Sanyal, S. Delta133p53alpha and delta160p53alpha isoforms of the tumor suppressor protein p53 exert dominant-negative effect primarily by co-aggregation. Elife. 14, RP106469(2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

P53 aggregatieThioflavine T kleuringdetectie van prote neaggregatiemultipunt fluorescentieTP53 mutatieamylo deaggregatenmicroplaatlezerHs578T cellenfluorescentiekwantificatie

Gerelateerde artikelen