Methodenartikel

CRISPR-Cas9-gebaseerde mutagenese in de entomopathogene nematode Steinernema hermaphroditum en het onderhoud van mutante lijnen

954 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68932

⸱

30 december 2025

 , 
1Division of Biosphere Sciences and Engineering, Carnegie Institution for Science

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel demonstreert CRISPR-Cas9-gemedieerde genoomengineering in Steinernema hermaphroditum, een entomopathogene (EPN: insect-parasitaire) nematode en een opkomend genetisch model. De beschreven technologie is nuttig voor het creëren van mutanten, waardoor genfuncties in de nematodebiologie kunnen worden opgehelderd die relevant zijn voor mutualistische en parasitaire symbiose.

Samenvatting

Entomopathogene nematoden (EPN's) in het geslacht Steinernema en Heterorhabditis onderhouden respectievelijk mutualistische interacties met Xenorhabdus en symbiotische bacteriën van Photorhabdus . Samen infecteren en doden deze nematode-bacterieparen insectengastheren die voornamelijk larven zijn uit de ordes Lepidoptera en Coleoptera, en vormen zo een hanteerbaar driepartiet systeem om de moleculaire basis van mutualisme en parasitisme te analyseren. Een belangrijke stap om dit model volledig te benutten is de ontwikkeling van stabiele en transgenerationele genetische instrumenten in EPN's. Hier demonstreren we een betrouwbaar CRISPR–Cas9 genoombewerkingsplatform in het opkomende model Steinernema hermaphroditum, een soort die gemakkelijk in vivo en in vitro wordt onderhouden en zeer vatbaar is voor gonadale microinjectie. Belangrijk is dat de hermafrodiete voortplanting de generatie en het onderhoud van homozygote mutantlijnen sterk stroomlijnt. We bieden een gedetailleerd protocol voor efficiënte, gerichte gendisruptie met behulp van micro-injectie-gebaseerde levering van Cas9-ribonucleoproteïnecomplexen. Als proof of concept hebben we het geconserveerde spiergeassocieerde gen unc-22 aangepast, waarmee we een karakteristiek spiertrekkend fenotype hebben gegenereerd dat gerichte mutagenese in dit systeem valideert. Dit CRISPR–Cas9-platform opent de deur naar stabiele genetische manipulatie in S. hermaphroditum, zoals transgenexpressie, en biedt een kader dat kan worden uitgebreid naar extra EPN-soorten van landbouwkundige en ecologische waarde.

Inleiding

Entomopathogene nematoden (EPN's) zijn insectendodende parasieten die soortspecifieke mutualistische partnerschappen vormen met hun bacteriële symbionten1. EPN's bestaan uit twee families: Steinermatidae en Heterorhabditidae, die associëren met Gram-negatieve bacteriën van respectievelijk Photorhabdus en Xenorhabdus spp. Tijdens de vrijlevende infectieuze juveniele fase (IJ) van Steinernema-nematoden bevinden Xenorhabdus-bacteriën zich in een darmzak van de nematode, bekend als de receptakel, en bij het binnendringen van de insectengastheer in de hemocoel worden de bacteriën vrijgegeven, waarna ze zich vermenigvuldigen en het insect doden door septicemie 3,4. In deze mutualistische relatie produceren de bacteriën antimicrobiële en insecticide verbindingen, die beschermen tegen de immuunrespons van de gastheer en voedingsondersteuning bieden aan denematode. In ruil daarvoor profiteren de bacteriën van de bescherming die de nematode-gastheer biedt tegen omgevingsmicroben en worden ze gefaciliteerd bij hun verspreiding naar nieuwe insectenprooi 6,7.

In de afgelopen decennia is het partnerschap Steinernema-Xenorhabdus gevestigd als een krachtig experimenteel systeem om verschillende aspecten van parasitaire en mutualistische interacties te bestuderen, zoals insectengastheerzoekend gedrag3, bacteriële kolonisatie in de nematodegastheer 8, en adaptief gedrag van symbiotische bacteriën die hun overgangen tussen nematoden en insectengastheerdieren faciliteren9. EPN's zijn ook belangrijke soorten voor bodemduurzaamheid en worden gebruikt als organische plaagbestrijdingsmiddelen om de landbouwproductiviteitte bevorderen 10,11.

Ondanks de snelle ontwikkeling van genetische instrumenten in de symbiotische bacteriën Xenorhabdus en Photorhabdus12, zijn consistente genetische instrumenten in EPN's schaars geweest. Gonadale microinjectie is met succes vastgesteld bij zowel Heterorhabditis als Steinernema-nematoden 13,14. Eerder werd gonadale micro-injectie in Heterorhabditis bacteriophora gebruikt om consequent dubbelstrengs RNA te leveren voor gen-knockdown bij de eerste generatienakomelingen 13,15. Onlangs is CRISPR-Cas9 genoombewerking in Steinernema ontwikkeld, toegediend via gonadale micro-injectie, en resulteerde in precieze, stabiele en erfelijke mutaties14.

Eén Steinernema-soorten, S. hermaphroditum, is aangetoond zeer hanteerbaar te zijn en heeft groot potentieel als opkomend genetisch modelorganisme 4,14. Oorspronkelijk geïsoleerd uit de bodem in Indonesië16 en opnieuw geïsoleerd in India17, is S. hermaphroditum consequent hermafrodiet, met een klein aantal mannetjes per generatie, twee kenmerken die de aanpassing van genetische instrumenten van de klassieke modelnematode C. elegans4 vergemakkelijken. Daarnaast is het genoom van S. hermaphroditum gesequenced en samengesteld tot chromosomen, wat de taak van het identificeren van potentiële Cas9-doellocaties en het ontwerpen van primers18 vereenvoudigt.

Tijdens micro-injectie van EPN wordt een injectiemengsel met geschikte reagentia, zoals dsRNA's, Cas9-eiwit of gids-RNA's, via een naald uit een kwartskapillaire aan de gonade van syncytiale nematode toegediend. Het juiste volume en de juiste druk van de injectie zorgen voor een zichtbare 'stroom' van vloeistof door de gonadale arm. Omdat deze nematoden een paar syncytiale gonaden hebben die bestaan uit kiemlijnkernen die hetzelfde cytosol19 delen, maakt deze micro-injectiemethode het mogelijk om meerdere kiemcellen toegankelijk te maken voor bewerking, voordat cytokinese plaatsvindt, waarbij de kiemlijnkernen worden gescheiden in zich ontwikkelende oocyten20. Hoewel gonadale microinjectie een consistente techniek is voor genetische modulatie bij verschillende soorten niet-model nematoden 14,21,22,23,24,25, is het cruciaal om de injectietechnieken aan te passen aan de juiste gonadale structuren, levensfase en fysiologische conditie van elke nematodesoort om succes en hoge efficiëntie bij de toediening te garanderen. Hersteltechnieken na injectie en het onderhoud van mutantlijnen zijn beide belangrijk om deze techniek kostenefficiënt te maken.

Deze studie demonstreert een CRISPR-Cas9 genoombewerkingsprotocol in Steinernema hermaphroditum. De gonadale micro-injectie wordt beschreven bij de jongvolwassene, een stadium dat bestand is tegen microinjectie onder hoge druk en ontvankelijk is voor genbewerking14. Daarnaast worden gedetailleerde methoden gegeven die het onderhoud van erfelijke en stabiele mutantlijnen beschrijven, zowel via cryopreservatie als voortplanting via insecten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Nematodevoorbereiding vóór micro-injectie

  1. Bereid Nematode Growth Media (NGM)-platen voor met bacteriën Xenorhabdus griffiniae en Comamonas aquaticus.
    OPMERKING: Kweek S. hermaphroditum-nematoden op hun inheemse symbiotische bacterie Xenorhabdus griffiniae vóór micro-injectie om de groei van nematoden te maximaliseren en de geïnjecteerde dieren te recupderen op bacterie Comamonas aquaticus om de overleving na injectie te verhogen14.
    1. Streep bacterie X. griffiniae op LB-pyruvaat agarplaten (2,5 g gistextract, 5 g trypton, 2,5 g natriumchloride, 0,5 g natriumpyruvat, 7,5 g agar in 500 ml water) en incubeer 's nachts bij 30 °C.
    2. Streep bacterie C. aquaticus op LB agarplaten en broed een nacht uit bij 37 °C.
    3. Kies een enkele bacteriekolonie om donker LB vloeibaar medium te inoculeren (5 g gistextract, 10 g trypton, 5 g natriumchloride in 1 liter water). Kweek bacteriële cultuur 's nachts (maximaal 16 uur) met beluchting (X. griffiniae bij 30 °C en C. aquaticus bij 37 °C).
    4. Bereid NGM agar voor: (3 g NaCl, 2,5 g pepton en 20 g agar toegevoegd aan 975 ml water, met 1 mL cholesterol, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL 1 M MgSO4, 25 mL 1 M KPO4 toegevoegd na autoclaven) 10 mL per 60 mm x 15 mm petrischaal.
    5. Zaadbacteriën: Voeg een paar druppels van de nachtelijke bacteriecultuur toe aan elke NGM-agarplaat, schud voorzichtig om de bacteriële druppels in een plek te verspreiden.
    6. Incubeer met bacteriën gezaaide NGM-platen op kamertemperatuur om agar te laten drogen en bacteriën te laten groeien.
      OPMERKING: Platen met X. griffiniae-zaden moeten zo snel mogelijk worden gebruikt; C. aquaticus-platen kunnen 1-2 weken op kamertemperatuur worden bewaard.
  2. Nematode-enscenering
    OPMERKING: Kies de J3-fase van de hermafrodiet de avond voor de injectie en jongvolwassenen op de dag van de injectie.
    1. Pak of klap S. hermaphroditum-nematoden op de voorbereide NGM-platen die met X. griffiniae zijn ingezaaid. Incubeer bij een temperatuur van 25-28 °C voor optimale groei.
    2. De avond voor micro-injectie pluk je J3-stadium van hermafrodieten op NGM-agar met X. griffiniae. Zoals te zien is in Figuur 1A, wordt het J3-stadium geschat op basis van de grootte van de nematode en de morfologie van de gonaden en vulva.
    3. Op de dag van de micro-injectie kies je jonge volwassen hermafrodieten (Figuur 1B).

2. CRISPR-Cas9 voorbereiding voor micro-injectie

  1. Selectie van de CRISPR crRNA's en reagentiaopslag
    1. Extraheer de doelgensequentie uit het referentiegenoom van Steinernema hermaphroditum met behulp van BlastP, PRJNA982879.
    2. Selecteer indien mogelijk een vroege coderende exonsequentie, bij voorkeur de eerste exon, en voer de sequentie in CRISPRScan in met standaardinstellingen26 om een lijst van mogelijke CRISPR-RNA's (crRNA's) te genereren.
    3. Blaas de bovenste crRNA's tegen het S. hermaphroditum-genoom om ervoor te zorgen dat alleen unieke crRNA's worden gekozen.
      OPMERKING: Optioneel: Bevestig de sequentie van het doelgebied van het genoom door PCR-amplificatie en Sanger-sequencing vóór crRNA-ontwerp, om efficiënte binding van crRNA's te waarborgen.
    4. Bewaar de CRISPR-RNA's (crRNA's) en universele trans-activerende CRISPR-RNA's (tracrRNA's) elk op 100 μM in een duplexbuffer bij -80 °C.
    5. Bewaar Cas9-eiwit bij 10 mg/mL bij -20 °C of -80 °C. Bewaar 1 M KCl op 4 °C.
  2. Het maken van het 2% agarose-kussen voor injectie (aangepast van Berkowitz et al.27)
    1. Smelt 2% agarose in water met een magnetron.
    2. Breng 50 μL gesmolten agarose over op een afdekglas (48 x 60 mm nr. 1). Bedek onmiddellijk de agarosedruppel met een ander dekselglas.
    3. Laat de agarose 20 minuten op kamertemperatuur drogen. Verwijder het bovenste glas. Label de voorkant van het agarose-pad.
      OPMERKING: Optioneel: Bak het agarosekussen een nacht op 37 °C om het agarosekussen verder te drogen.
    4. Bewaar de 2% agarose-pads maanden tot jaren op kamertemperatuur.
  3. Naaldvoorbereiding
    1. Fabriceer kwartsnaalden met de volgende parameters op een laserfilamenttrekker. Met de naaldtrekker die in deze studie wordt gebruikt, is het voorgestelde programma als volgt: Warmte: 700, Filament: 4, Snelheid: 60, Vertraging: 145, Trek: 175.
    2. Haal de kwartsnaalden (OD: 1,0 mm, ID: 0,7 mm) direct voor de injectie, of van tevoren, eruit en bewaar ze in een pipetenbewaardoos.
      OPMERKING: Alternatief hebben we ook succes met injecteren met borosilicaatnaalden (OD: 1,2 mm, ID: 0,68 mm). Let op dat verschillende maten naalden overeenkomen met verschillende maten naaldhouders.

3. CRISPR-Cas9 micro-injectie en herstel van de nematoden na micro-injectie

  1. Bereid het CRISPR-Cas9 micro-injectiemengsel voor (aangepast van Wang et al.28)
    1. Bereid verse geleide-RNA-duplexen voor door de gekozen crRNA's en universele tracrRNA's te mengen in een verhouding van 1:1, dat wil zeggen totale crRNA tot tracrRNA in een PCR-buis:
      crRNA #1 (100 μM) - 1,5 μL
      crRNA #2 (100 μM) - 1,5 μL
      tracrRNA (100 μM) - 3,0 μL
      OPMERKING: Bij gebruik van co-CRISPR richt crRNA #1 zich op het unc-22 markergen, terwijl crRNA #2 kan worden vervangen door een andere sequentie die zich richt op een tweede gen van interesse.
    2. Incubeer de PCR-buis in een thermocycler op 94 °C gedurende 2 minuten en koel daarna af tot kamertemperatuur.
    3. Stel het injectiemengsel samen door het volgende te combineren en breng het vervolgens 5 minuten uit bij kamertemperatuur:
      Cas9 (10 mg/mL) - 2 μL
      1M KCl - 0,58 μL
      gRNA-duplexen (vanaf stap 3.1.1) - 2,7 μL
    4. Meng drie keer door de PCR-buis te knippen, gevolgd door een korte draai (10-15 seconden) in een mini-centrifuge om de inhoud van de buis op te vangen. Na de laatste mix draai je het langer door, tot 1 minuut.
  2. Laad en breek de naald
    1. Laad de naald met 1-2 μL injectiemengsel met behulp van een microloader-tip.
    2. Zet de naald vast aan de pipethouder (naald) en breek vervolgens de punt open door de naald over een stuk dubbelzijdig tape te slepen, bedekt met halocarbonolie. Test de opening van de naald met de CLEAN-functie van de microinjector.
  3. Micro-injectie in de syncytiale gonaden van een jonge volwassen nematode
    1. Breng een klein druppeltje Halocarbon-olie over op een 2% agarose-pad.
    2. Gebruik onder de dissecerende stereoscoop een dun (zacht) platina draadje om een jonge volwassen hermafrodiet-nematode op te pakken en deze te wassen in een M9-buffer (per liter: 3 g KH2PO4, 11,3 g Na2HPO4, 5 g NaCl, met 1 ml 1 M MgSO4 toegevoegd na autoclaven) om bacteriën te verwijderen (zie jonge volwassen nematode in Figuur 1).
    3. Breng de gewassen nematode over op een agarose-pad en plaats deze in de druppel halocarbonolie. Gebruik een zachte platina draad om de nematode voorzichtig te borstelen totdat het dier geïmmobiliseerd is.
    4. Plaats het agarosekussen voorzichtig op het microinjectiestadium. De oriëntatie van het gonadale syncytium moet wijzen naar de naald onder een hoek van ongeveer 45°. Begin met 5x vergroting en schakel dan over op 20x en 40x vergroting voor de injecties.
    5. Zorg ervoor dat de naald het syncytium binnendringt, en gebruik vervolgens de CLEAN-functie van de micro-injector om het injectiemengsel in te voeren bij ongeveer 99 psi totdat een heldere gonadale stroom van geïnjecteerde vloeistof is waargenomen, zodat reagentia toegang krijgt tot de kiemcellen in het gonadale syncytium.
    6. Als de tweede gonadale arm toegankelijk is, verplaats dan de fase om de naald te positioneren om in de tweede arm te injecteren.
  4. Nematodeherstel na injectie
    1. Onmiddellijk na injectie wordt het geïnjecteerde dier opnieuw opgehangen in 1-2 μL M9-buffer op het agarosepad.
    2. Met een dunne platinadraad haal je de geïnjecteerde nematode van het agarosepad en spoel je de olie af met een M9-buffer.
    3. Haal de nematoden op NGM-platen terug met een gazon van C. aquatica-bacteriën (NGM-plaatvoorbereiding: zie stap 1.1), wat de overlevingskans van de nematoden na injectie verhoogt14. Broed 's nachts op 25 °C.
    4. De volgende dag isoleer je elke geïnjecteerde nematode (P0) op een individuele NGM-plaat die is bezaaid met X. griffiniae. Laat P0-dieren 's nachts F1-nakomelingen produceren (door eieren te leggen of in zakken te zetten) voor fenotypering en genotypering (zie stap 4).

4. Screening om knock-outs te bevestigen die door CRISPR-Cas9 worden gemedieerd

  1. Nicotine-gebaseerde (VOORZICHTIG) test van F1 op spiertrekkingen bij gebruik van unc-22 als co-CRISPR-marker
    1. Breng F1-nakomelingen van geïnjecteerde P0-dieren over in een plek met 2% nicotineoplossing.
    2. Kies een dier dat twitched uit de nicotineplek is en haal het dier direct op NGM-agar met X. griffiniae. Isoleer elke twitching F1 op een individuele plaat en laat deze F2-dieren produceren voor genotypering (zie stap 4.2).
  2. Genotypering
    1. Kies acht F2- of F3-nakomelingen uit elke F1 twitchinglijn voor genotypering. Deze dieren omvatten waarschijnlijk zowel +/mut heterozygote als mut/mut homozygote dieren.
    2. Bereid een verse DNA-extractiebuffer voor door 20 μL Proteinase K (10 mg/mL) toe te voegen aan de 180 μL worm lysisbuffer (50 mM KCl, 10 mM Tris pH 8,0, 2,5 mM MgCl2, 0,45% NP-40, 0,45% Tween 20, 0,01% gelatine).
    3. Voeg nematoden toe aan 10 μL van de DNA-extractiebuffer in PCR-buizen. Incubeer 10 minuten bij 65 °C, daarna 15 minuten bij 95 °C om genomisch DNA te extraheren.
    4. Genotype de nematoden door het Cas9-doelgebied met PCR-versterking te volgen de instructies van de fabrikant, met 1-2 μL lysaat uit stap 4.2.2. Het is belangrijk om voldoende ruimte te laten, indien mogelijk (ten minste 300 bp), tussen de Cas9-snijplaatsen en de primerbindingsplaatsen, voor het geval grote deleties optreden.
      OPMERKING: Agarosegelelektroforese kan worden gebruikt om succesvolle versterking te bevestigen vóór sequencing.
    5. Maak het PCR-product schoon volgens de instructies van de fabrikant om een nauwkeurige Sanger-sequencing trace-analyse te garanderen.
    6. Sequencen de PCR-amplicons die in stap 4.2.4 zijn gegenereerd met Sanger-sequencing en analyseer de chromatogrammen met het ICE-programma29.
    7. Als mutante allelen in stap 4.2.6 bevestigd zijn, ga dan terug naar de oorspronkelijke F1 twitching plate en isoleer minstens acht hermafrodieten op individuele platen. Laat elke enkele nematode nakomelingen produceren en massa-genotype het nageslacht om homozygotie te bevestigen. Homozygote lijnen kunnen in het laboratorium worden onderhouden zoals beschreven in stap 5.

5. Onderhoud van de CRISPR-lijn

OPMERKING: Er zijn drie hoofdmethoden voor lijnonderhoud. Deze omvatten trehalose-DMSO-gebaseerde cryopreservatie (stap 5.1), in vivo doorgeven via waswormen (stap 5.2) en in vitro onderhoud op NGM-platen (stap 5.3).

  1. Trehalose-DMSO cryopreservatie van wildtype- en mutantlijnen
    OPMERKING: Met behulp van een trehalose-DMSO cryopreservatiemethode4 kan S. hermaphroditum stabiel langdurig worden opgeslagen bij -80 °C en teruggewonnen op NGM-medium. Nematoden worden ingevroren in 2 ml cryogene buisjes. Optimaal invriezen wordt bereikt door geleidelijke afkoeling met een polystyreenschuimcontainer.
    1. Kweek S. hermaphroditum op NGM met X. griffiniae (zie stap 1.1) totdat de meerderheid van de populatie J1 is of hermafrodieten in de zak heeft.
      OPMERKING: Vermijd infectieuze juveniele (IJ) stadia omdat ze met deze methode niet goed bevriezen.
    2. Spoel nematodewormen af van NGM-agarplaten in een M9-buffer en verzamel in 15 mL conische buizen tot de 5 mL-grens. Concentreer door centrifugatie (1372 x g voor 1-2:30 minuten is voldoende).
    3. Verwijder het supernatant en was één keer in de 5 mL Trehalose-DMSO vriesbuffer bij kamertemperatuur door centrifugatie volgens de parameters in stap 5.1.2.
    4. Suss de wormen opnieuw in een 5 ml trehalose-DMSO vriesbuffer op kamertemperatuur. Incubeer 30 minuten op kamertemperatuur met de buis op zijn zij. Dit verhoogt de overlevingskans.
    5. Doseer 1 ml per buisje in 4 cryogene flesjes.
    6. Plaats de flesjes in doosjes polystyreenschuim in de -80 °C vriezer.
    7. Een week later test je een van de flesjes ontdooien.
    8. Doe de rest van de flesjes over in vriesdozen van -80°C en bewaar ze permanent.
    9. De testontdooiing of terugwinning van S. hermaphroditum uit bevroren voorraden
      1. Haal een flesje uit de vriezer en laat het volledig ontdooien op kamertemperatuur.
      2. Giet de vloeistof op een verse NGM-plaat. Let op dat het toevoegen van een symbiotische bacterie niet nodig is, aangezien het bevroren materiaal meestal voldoende symbiotische bacteriën bevat. Wormen zouden binnen enkele minuten tot uren moeten beginnen te herstellen.
      3. Observeer de beweging en voortplanting van de nematode. Na een dag of twee zet je verschillende nematoden over op nieuwe NGM-platen die met X. griffiniae zijn ingezaaid.
  2. In vivo onderhoud via Galleria mellonella
    OPMERKING: Voor in vivo groei vermeerdert u S. hermaphroditum-mutantlijnen via larven van Galleria mellonella (wasworm) 5e stadium. Deze methode is vooral nuttig voor lijnen die na cryopreservatie niet levensvatbaar zijn. Een gedetailleerd en vergelijkbaar protocol van de natuurlijke voortplanting van entomopathogene nematoden via insecten en andere media voor EPN-groei is te vinden in (McMullen et al.30). Kort samengevat:
    1. Laat nematoden verhongeren en IJ's worden op NGM-platen.
    2. Gebruik de M9-buffer om IJ's van de NGM-platen te verwijderen.
    3. Zet IJ's over om Galleria-insecten te infecteren met de White trap.
  3. Voor in vitro onderhoud op NGM-platen, volg de volgende stappen:
    1. Zaad-NGM-platen met ongeveer 100 μL verse vloeibare cultuur van de S. hermaphroditum-symbiont , X. griffiniae.
    2. Laat het bacteriële pleister volledig drogen voordat je de nematoden op de plaat overbrengt.
    3. Bewaar de platen op 25 °C en breng de nematoden ongeveer eens per maand over op vers gezaaide platen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Twee CRISPR-RNA's werden ontworpen (geïdentificeerd aan de hand van het Pam-locatienummer - Pam 3 en Pam 5) gericht op het S. hermaphroditum-homoloog van unc-22 op eerder gepubliceerde Pam-locaties14 (Figuur 2A). Elk crRNA werd gecomplex met tracrRNA om een enkele gids-RNA (sgRNA) te vormen en werd opgenomen in Cas9 om het ribonucleoproteïne te vormen zoals beschreven in stap 3.1. In dit protocol werden twee crRNA's ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Onconventionele genetische modeldiersystemen bieden waardevolle mogelijkheden om de functie van eukaryote genen te bestuderen binnen de ecologische en fysiologische contexten waarin die eigenschappen van nature voorkomen, bijvoorbeeld in aanwezigheid van een parasitaire gastheer of het inheemse microbioom van een organisme. Bij entomopathogene nematoden (EPN's) is genetische manipulatie gebaseerd op enkele gevallen van RNAi-gebaseerde benaderingen13,32.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict is.

Dankbetuigingen

Wij danken Margaret McFall-Ngai en Edward Ruby voor het gebruik van hun confocale microscoop. We danken Alexis (Cody) Hargadon en Grischa Chen voor de training in confocale microscopie, en Carly R. Myers voor de hulp bij het verkrijgen van foto's en analyse van twitching-video's. We danken ook Stephanie Hampton voor het toewijzen van fondsen voor de aankoop van het microinjectiesysteem. Het Carnegie Institution for Science ondersteunde dit werk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Agar (80-100 Mesh)Fisher ScientificBP26411Ook gebruikt in LB Pyruvaat platen
AgaroseFisher Scientific16500500Ook gebruikt bij genotypering
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNAIDT1072532
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3IDT1081058
Borosilicate naaldenWorld Precision Instrument1B120F-4
Calcium chloride (CaCl2)Sigma AldrichC4901
CholesterolVWR4335 mg/mL in ethanol
Comamonas aquatica (DA1877)
Dekglas voor agarose padBrain research laboratories#4860-1D48 x 60 mm no1 dikte
CRISPRScanhttps://www.crisprscan.org/
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich4723010.5 M
DNA Clean and Concentrator-5Zymo ResearchD4014
FemtoJet 4x Microinjector met Grip head set 4 maat 0 naaldhouderEppendorf/Calibre5253000017
Galleria melonella 5e instar larvenGrubCohttps://www.grubco.com/index.cfm
Gel beeldsysteemAzure400AZI400-01
Gel laaddyeThermo Fisher ScientificB72
Gelatine (2%)Sigma AldrichG1393
GelRedBiotium#41003
Genotyperingsprimers: DNA oligo, 25 nmolIDTN/A
Gibco Bacto PeptoneFisher ScientificDF0118-17-0
Gibco Bacto TryptoneFisher ScientificDF0123-17-3Ook gebruikt in Dark LB, LB Pyruvaat platen
Gibco Bacto Yeast ExtractFisher ScientificDF0127-17-9Ook gebruikt in Dark LB, LB Pyruvaat platen
Grip head set 4 maat 1 naaldhouderCalibreEPE-5196083008(gepaard met borosilicaatnaald 1B120F-4)
Halocarbon olie 700Sigma AldrichH8898
Harde platina draaddraad voor dagelijks onderhoudTritech ResearchPT-9901
Inference of CRISPR edits (ICE)SynthegoN/ASoftware gebruikt om Sangersequenties te analyseren om indels te identificeren
KClSigma AldrichP9541
Laser naald puller P-2000SutterP-2000G
Magnesium chloride (MgCl2)Sigma AldrichM8266
Magnesium sulfate (MgSO4)Sigma AldrichM7506Voor M9 buffer, Ook gebruikt in NGM
Microloader tip 2x96STCalibre930001007
Micromanipulator Montage Adapter voor Zeiss Axio Observer en Axiovert 200Tritech ResearchNZ-19-2
MicroscoopTritechSMT1
NicotineSigma AldrichN3876
NP-40Thermo Fisher Scientific85124
Nuclease Free Duplex BufferIDT11-01-03-01
OneTaq MasterMixNEBM0486
Pipet opslagdoosSutter InstrumentsBX10
Kaliumchloride (KCl)Sigma Aldrich793590
Kaliumfosfaat, dibasisch (K2HPO4)Sigma AldrichP3786KOH voor NGM
Kaliumfosfaat, monobasisch (KH2PO4)Sigma AldrichP5655Voor M9 buffer, Ook gebruikt in NGM
Proteinase KSigma AldrichP6556
Quarts naaldenSutter InstrumentsQF100-70-10
S. hermaphroditium genoomNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCA_030435675.1/
sh-unc-22 Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA'sIDTN/A
Natriumchloride (NaCl)VWRSS0430Ook gebruikt in M9, Dark LB, LB Pyruvaat platen
Natriumfosfaat, dibasisch (Na2HPO4.7H20)Sigma AldrichS9390Voor M9 buffer
NatriumpyruvaatSigma AldrichP2256Ook gebruikt in LB Pyruvaat platen
Zachte platina draaddraad voor micro-injectieSurepure Chemetals6824Platinum 90%, Iridium 10% legeringdraad, 0,002 inch diameter x 5 ft lang
Standaard naaldhouderTritech ResearchHI-7
Steinernema hermaphroditum
Stereo microscoopLeicaInveta 3
TrehaloseCole-ParmerEW-88195-990,08 M
TrisFisher ScientificAM9855GpH 8,0
Tween 20Sigma AldrichP1379
Verticale Micromanipulator Montage AdapterTritech ResearchNR2
Xenorhabdus griffiniae (HGB2511)

Referenties

  1. Stock, S., Blair, H. G. Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association. Symbiosis. 46, 65-75 (2008).
  2. Murfin, K. E., et al. Nematode-bacterium symbioses--cooperation and conflict revealed in the "omics" age. Biological Bull. 223 (1), 85-102 (2012).
  3. Dillman, A. R., et al. An entomopathogenic nematode by any other name. PLoS Pathog. 8 (3), e1002527(2012).
  4. Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Sternberg, P. W. The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis. Genetics. 220 (1), iyab170(2022).
  5. Sergeant, M., et al. Identification, typing, and insecticidal activity of Xenorhabdus isolates from entomopathogenic nematodes in United Kingdom soil and characterization of the xpt toxin loci. Appl Environ Microbiol. 72 (9), 5895-5907 (2006).
  6. Walsh, K. T., Webster, J. M. Interaction of microbial populations in Steinernema (Steinernematidae, Nematoda) infected Galleria mellonella larvae. J Invertebr Pathol. 83 (2), 118-126 (2003).
  7. Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. Friend and foe: The two faces of Xenorhabdus nematophila. Nat Rev Microbiol. 5 (8), 634-646 (2007).
  8. Flores-Lara, Y., Renneckar, D., Forst, S., Goodrich-Blair, H., Stock, P. Influence of nematode age and culture conditions on morphological and physiological parameters in the bacterial vesicle of Steinernema carpocapsae (Nematoda: Steinernematidae). J Invertebr Pathol. 95 (2), 110-118 (2007).
  9. Cao, M., Goodrich-Blair, H. Ready or Not: Microbial adaptive responses in dynamic symbiosis environments. J Bacteriol. 199 (15), e00883-e00916 (2017).
  10. Lacey, L. A., et al. Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. J Invertebr Pathol. 132 (C), 1-41 (2015).
  11. Campos-Herrera, R., et al. Intraspecific virulence of entomopathogenic nematodes against the pests Frankliniella occidentalis (Thysanoptera: Thripidae) and Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae). J Nematol. 53 (1), 1-14 (2021).
  12. Rill, A., Zhao, L., Bode, H. B. Genetic toolbox for Photorhabdus and Xenorhabdus: pSEVA based heterologous expression systems and CRISPR/Cpf1 based genome editing for rapid natural product profiling. Microb Cell Fact. 23 (1), 98(2024).
  13. Ratnappan, R., et al. RNAi-mediated gene knockdown by microinjection in the model entomopathogenic nematode Heterorhabditis bacteriophora. Parasit Vectors. 9 (1), 160(2016).
  14. Cao, M. CRISPR-Cas9 genome editing in Steinernema entomopathogenic nematodes. bioRxiv. , (2023).
  15. Heryanto, C., Ratnappan, R., O'Halloran, D. M., Hawdon, J. M., Eleftherianos, I. Culturing and genetically manipulating entomopathogenic nematodes. J Vis Exp. (181), e63885(2022).
  16. Stock, S. P., Griffin, C. T., Chaerani, R. Morphological and molecular characterisation of Steinernema hermaphroditum n. sp. (Nematoda: Steinernematidae), an entomopathogenic nematode from Indonesia, and its phylogenetic relationships with other members of the genus. Nematology. 6 (3), 401-412 (2004).
  17. Bhat, A. H., Chaubey, A. K., Shokoohi, E., William Mashela, P. Study of Steinernema hermaphroditum (Nematoda, Rhabditida), from West Uttar Pradesh, India. Acta Parasitol. 64 (4), 720-737 (2019).
  18. Schwarz, E. M., et al. Genomes of the entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum and its associated bacteria. bioRxiv. , (2025).
  19. Haglund, K., Nezis, I. P., Stenmark, H. Structure and functions of stable intercellular bridges formed by incomplete cytokinesis during development. Commun Integr Biol. 4 (1), 1-9 (2011).
  20. Ghanta, K. S., Ishidate, T., Mello, C. C. Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans. STAR Protoc. 2 (3), 100748(2021).
  21. Gang, S. S., et al. Targeted mutagenesis in a human-parasitic nematode. PLoS Pathog. 13 (10), e1006675(2017).
  22. Adams, S., Pathak, P., Shao, H., Lok, J. B., Pires-daSilva, A. Liposome-based transfection enhances RNAi and CRISPR-mediated mutagenesis in non-model nematode systems. Sci Rep. 9 (1), 483(2019).
  23. Culp, E., et al. Genome editing in the nematode Caenorhabditis briggsae using the CRISPR/Cas9 system. Biol Methods Protoc. 5 (1), bpaa003(2020).
  24. Hellekes, V., et al. CRISPR/Cas9 mediated gene editing in non-model nematode Panagrolaimus sp. PS1159. Front Genome Ed. 5, 1078359(2023).
  25. Patel, R., et al. The generation of stable transgenic lines in the human-infective nematode Strongyloides stercoralis. G3 (Bethesda). 14 (8), jkae122(2024).
  26. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: Designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nat Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
  27. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), e833(2008).
  28. Wang, H., Park, H., Liu, J., Sternberg, P. W. An efficient genome editing strategy to generate putative null mutants in Caenorhabditis elegans using CRISPR/Cas9. G3 (Bethesda). 8 (11), 3607-3616 (2018).
  29. Conant, D., et al. Inference of CRISPR Edits from Sanger Trace Data. CRISPR J. 5 (1), 123-130 (2022).
  30. McMullen, J. G. 2nd, Stock, S. P. In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae). J Vis Exp. (91), e52096(2014).
  31. Kim, H., et al. A co-CRISPR strategy for efficient genome editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 197 (4), 1069-1080 (2014).
  32. Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: A nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts. BMC Dev Biol. 7 (1), 101(2007).
  33. Du, X., McManus, D. P., French, J. D., Jones, M. K., You, H. CRISPR/Cas9: A new tool for the study and control of helminth parasites. Bioessays. 43 (1), e2000185(2021).
  34. Quinzo, M. J., Perteguer, M. J., Brindley, P. J., Loukas, A., Sotillo, J. Transgenesis in parasitic helminths: A brief history and prospects for the future. Parasit Vectors. 15 (1), 110(2022).
  35. Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Peraza, J., Raymundo, K. L. T., Sternberg, P. W. Molecular identification of a peroxidase gene controlling body size in the entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum. Genetics. 226 (2), (2024).
  36. Dokshin, G. A., Ghanta, K. S., Piscopo, K. M., Mello, C. C. Robust genome editing with short single-stranded and long, partially single-stranded DNA donors in Caenorhabditis elegans. Genetics. 210 (3), 781-787 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Genoommodificatieentomopathogene nematodengen Disruptiegonadale micro injectieonderhoud van mutante lijnenribonucleoprote necomplexenspiergeassocieerd gentransgene expressie

Gerelateerde artikelen