Lipoproteïne-specifieke fosfolipide-effluxtest met hoge dichtheid

Samenvatting

Hierin beschrijven we de protocollen om de hoeveelheid fluorescerende fosfolipide te meten die specifiek uit lipidedonordeeltjes wordt verwijderd door lipoproteïne met hoge dichtheid (HDL) die aanwezig is in volledig menselijk plasma of serum. We hebben aangetoond dat deze metriek van HDL-functionaliteit incidentele hart- en vaatziekten voorspelt.

Samenvatting

Plasmaspiegels van high-density lipoproteïne (HDL)-cholesterol (HDL-C) zijn momenteel een belangrijke maatstaf voor de klinische beoordeling van het risico op hart- en vaatziekten (HVZ). HDL-gemedieerde verwijdering van plaquelipiden uit cellen en extracellulaire afzettingen in de arteriële wand is een van de vele anti-atherogene functies van HDL die de omgekeerde associatie met het risico op hart- en vaatziekten kunnen verklaren. De HDL-gemedieerde verwijdering van cellulair cholesterol in vitro heeft onlangs bewezen een nog betere voorspeller te zijn van het risico op hart- en vaatziekten dan HDL-C.

HDL is samengesteld uit een heterogene populatie van deeltjes, die verschillende functies vervullen. HDL-deeltjes die betrokken zijn bij de verwijdering van atherosclerotische plaquelipiden bevatten uitwisselbare apolipoproteïnen, meestal apolipoproteïne A-I, die dissociëren van het deeltje en vervolgens plaquelipiden verwijderen. Ontluikend HDL wordt gevormd door de oplosbaarheid en verwijdering van zowel fosfolipiden als cholesterol uit ABCA1-gegenereerde cellulaire plasmamembraandomeinen door HDL-afgeleide uitwisselbare apolipoproteïnen. Dit proces speelt een cruciale rol bij zowel de preventie als de regressie van atherosclerotische plaque.

Hierin beschrijven we het protocol voor de celvrije, HDL-specifieke fosfolipide-efflux (HDL-SPE)-test, waarvan we eerder hebben aangetoond dat deze het risico op hart- en vaatziekten kan voorspellen. Deze test meet specifiek de HDL-apolipoproteïne-gemedieerde verwijdering van een niet-uitwisselbaar fluorescerend fosfolipide uit een lipidedonordeeltje. Onze case-control klinische studies hebben vastgesteld dat de HDL-SPE-test net zo goed en mogelijk zelfs beter presteert dan de "gouden standaard" celgebaseerde cholesteroleffluxcapaciteitstest, een arbeidsintensieve en technisch complexe test die vaak gebruik maakt van radioactief cholesterol.

Het doel van dit protocol is om zowel basis- als klinische onderzoekers in staat te stellen de functionaliteit van HDL bij lipidenmobilisatie te beoordelen, met behulp van een eenvoudige, gestandaardiseerde, celvrije, high-throughput test. Deze test kan door basisonderzoekers worden gebruikt om inzicht te krijgen in mechanismen die ten grondslag liggen aan HDL-gemedieerde lipide-efflux en voor het screenen van nieuwe therapeutische middelen die de HDL-functionaliteit verbeteren. HDL-SPE kan ook dienen als een klinische diagnostische laboratoriumtest voor de beoordeling van het risico op hart- en vaatziekten.

Inleiding

De high-density lipoproteïne-specifieke fosfolipidenefflux (HDL-SPE) test meet de HDL-functionaliteit en is bedoeld voor gebruik in biomedisch onderzoek en klinische diagnostische laboratoria om (i) meer inzicht te krijgen in de mechanismen die ten grondslag liggen aan HDL-gemedieerde verwijdering van lipiden uit atherosclerotische laesies, (ii) te dienen als een nieuw platform om de klinische risicobeoordeling voor CVD te verbeteren en, (iii) nieuwe therapieën te ontwikkelen voor de behandeling van hart- en vaatziekten.

HDL-cholesterol (HDL-C) is een belangrijke bepalende factor voor HVZ-risico¹, maar het nut ervan wordt aangetast in zoverre dat verhoogde niveaus van HDL-C (>80 mg/dL) geassocieerd zijn met een groter CVD-risico 2,3,4,5. Verhoogde niveaus van HDL-C kunnen de accumulatie vertegenwoordigen van disfunctioneel HDL dat een verminderd vermogen heeft om arteriële plaquelipiden te verwijderen⁶.

De cellulaire cholesterol-effluxcapaciteitstest (CEC) was de eerste in-vitrotest die werd ontwikkeld om de HDL-functionaliteit te meten. In deze test worden gekweekte macrofagen (muis of mens), meestal gelabeld met ³H- of fluorescerend Bodipy-cholesterol, geïncubeerd met apoB-verarmd plasma of serum. Het % cholesterolefflux wordt berekend op basis van de hoeveelheid cel- en medium-geassocieerde fluorescentie/radioactiviteit ^7,8,9. Het is aangetoond dat de CEC-test een betere voorspeller is van CVD-incidenten dan HDL-C⁷. De CEC-test is niet vatbaar voor conversie naar een routinematige klinische diagnostische test, voornamelijk vanwege de vereisten voor celcultuur en lange duur (bijv. dagen). Bovendien wordt de CEC-test beperkt door de inherente variabiliteit (bijv. verschillende soorten cellen, labeltechnieken en PEG-depletie van β-lipoproteïnen, waardoor de HDL-samenstelling verandert¹⁰).

Verschillende onderzoeksgroepen hebben celvrije HDL-cholesteroleffluxtesten ontwikkeld die worden gebruikt als hulpmiddelen om nieuwe inzichten te verwerven in de HDL-functie en voor mogelijke vertaling naar een klinische diagnostische test om het risico op hart- en vaatziekten beter te beoordelen^11,12. Deze efflux-assays omvatten meestal meerdere stappen en gebruiken een lipidedonordeeltje dat is gelabeld met een fluorescerend cholesterol, en net als de CEC-test vereisen ze ofwel uitputting van β-lipoproteïnen of, als alternatief, het vangen van apoA-I-bevattende deeltjes met behulp van anti-apoA-I-antilichamen, om plasma-HDL-cholesterolefflux te meten. Hoewel is gevalideerd dat deze alternatieve testen in verschillende mate geassocieerd zijn met het risico op hart- en vaatziekten, is tot op heden slechts aangetoond dat één¹³, die de apoA-I-wisselkoers beoordeelt, het risico op hart- en vaatziekten^{voorspelt 14}. Interessant is dat is aangetoond dat de kinetiek van de uitwisseling van apoA-I aan en uit plasma HDL onafhankelijk geassocieerd is met CEC¹⁵ en duidelijk verminderd is bij patiënten met acuut coronair syndroom¹⁶. Bovendien is aangetoond dat verschillende HDL-uitwisselbare apolipoproteïnen in vitro zowel cholesterol als fosfolipiden uit cellen die ABCA1 tot expressie brengen, mediëren ¹⁷.

We hebben een alternatieve aanpak ontwikkeld om de HDL-functionaliteit¹⁸ te beoordelen. De eenvoudige, snelle en betrouwbare test die hier wordt beschreven, vereist slechts twee componenten, namelijk volledig menselijk (of dierlijk) plasma- of serummonsters (vers of gevriesontdooid) en een fluorescerend, met lipiden omhuld donordeeltje. De test meet het vermogen van apoA-I en andere HDL-geassocieerde uitwisselbare apolipoproteïnen in heel plasma/serum om een niet-uitwisselbare, met de kopgroep gelabelde fluorescerende fosfatidylethanolamine (PE) te verwijderen uit een met lipiden gecoat donordeeltje¹⁸ (Figuur 1).

De donordeeltjes in deze test bestaan uit calciumsilicaathydraatkristallen (CSH) bedekt met cholesterol, de fosfolipidefosfatidylcholine (PC) en een fluorescerende PE. Uitwisselbare HDL-geassocieerde apolipoproteïnen, meestal apoA-I, die vrijkomen uit HDL-deeltjes, binden zich aan de donordeeltjes en dissociëren er vervolgens van samen met donordeeltjeslipiden, waaronder fluorescerend PE. Op deze manier verkrijgt HDL, maar niet de andere lipoproteïnen die aanwezig zijn in heel plasma/serum, specifiek fluorescerend PE van de donordeeltjes ^18,19. Het hele plasma/serum wordt geïncubeerd met de fluorescerende, met lipiden beklede calciumsilicaathydraat (LC-CSH)-donordeeltjes en zoutoplossing bij 37 °C, waarbij gedurende 1 uur wordt geschud. Omdat LC-CSH ongeveer twee keer de dichtheid van water heeft, worden de donordeeltjes gemakkelijk van plasma gescheiden door centrifugatie met lage snelheid.

Het percentage PE-efflux dat in klinische onderzoeken wordt gemeten, wordt doorgaans genormaliseerd door de waarde van de PE-fluorescentie die door HDL wordt verkregen in het bovenstaande van het reactiemengsel van een klinisch monster te delen door de waarde die wordt verkregen door HDL in een humaan referentiecontroleplasma. Normalisatie naar een referentieplasma wordt uitgevoerd om te corrigeren voor variaties in de reagensbereiding. Voor onderzoekstoepassingen kan het % PE-efflux worden bepaald door de bovenstaande PE-fluorescentie te delen door de totale fluorescentie (supernatans PE-fluorescentie + LC-CSH-fluorescentie). Bovenstaande fluorescerende meetwaarden worden in een sjabloon in spreadsheetbestanden geplakt om %PE-efflux te berekenen (aanvullende tabel 1 voor drievoudige metingen en aanvullende tabel 2 voor dubbele metingen). De instructies voor het uitvoeren van deze berekeningen in de spreadsheet worden geleverd als aanvullende bestanden (Aanvullend bestand 1, Aanvullend bestand 2, Aanvullend bestand 3, Aanvullend bestand 4, Aanvullend bestand 5, Aanvullend bestand 6, Aanvullend bestand 7 en Aanvullend bestand 8) en een voorbeeldberekening wordt gegeven als aanvullende tabel 3.

Figuur 1: HDL-SPE-test. HDL-specifieke fosfolipide-efflux wordt getest in platen met 96 putjes. Zoutoplossing, calciumsilicaathydraatkristallen (grijs) bedekt met lipiden (LC-CSH), inclusief niet-uitwisselbare lissaminerhodamine-gelabelde fosfatidylethanolamine (LRh-PE; rode membraanlagen), en maximaal 30 hele plasma-/serummonsters (geel; in drievoud) worden op platen met 96 putjes geladen. Na 1 uur mengen bij 37 °C in een thermomenger, worden de platen kort gecentrifugeerd om de LC-CSH-donordeeltjes te pelleteren. Aliquots van de bovenstaande stoffen, die HDL bevatten die specifiek zijn geëtiketteerd met LRh-PE, worden overgebracht naar een zwarte plaat met wasmiddel (om Lh-Rh-PE op te lossen) en zoutoplossing. PE-fluorescentie wordt vervolgens gemeten met een fluorimeter. Zoutoplossing (negatieve controle; NC), voor achtergrondcorrectie, en samengevoegd gezond menselijk plasma (positieve controle; PC) voor plaatnormalisatie, worden geladen in plaats van monsterplasma/serum in de laatste set putjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

Bloedafname wordt uitgevoerd volgens de regels van de Verklaring van Helsinki van 1975 (https://www.wma.net/what-we-do/medical-ethics/declaration-of-helsinki/), herzien in 2013, en moet voldoen aan de institutionele richtlijnen met betrekking tot geïnformeerde toestemming.

1. Preparaat van fluorescerende, fosfolipide-gelabelde donorlipidedeeltjes

1. Vorming van lipidenfilm
   LET OP: Bereid en doseer stockoplossingen in een chemische kap. Draag een laboratoriumjas, handschoenen en een veiligheidsbril. Gooi chloroformoplossingen weg in organisch chemisch afval, Triton X-100-oplossingen (zonder plasma) in chemisch afval en plasmahoudende oplossingen in biologisch gevaarlijk/medisch afval.
   1. Koop lipidevoorraadoplossingen in chloroform van een verkoper of maak ze in het laboratorium:
      25 mg/ml: 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DMPC):
      10 mg/ml: Cholesterol
      1 mg/ml: 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-(lissaminerhodamine B-sulfonyl) [LRh-PE]
      NOTITIE: Gebruik luchtdichte glazen buizen met schroefdop. Sluit de dop af met teflontape.
      Bewaren bij -20 ^°C.
   2. Bepaal de hoeveelheid LC-CSH die nodig is en bereid het juiste aantal glazen buizen voor.
      Voeg in een chemische zuurkast aan elke buis van 10 mm 150 mm borosilicaatglas het volgende toe: 472 μl DMPC-stockoplossing (17,7 μmol, 11,8 mg), 339 μl cholesterolstockoplossing (8,8 μmol, 3,39 mg) en 305 μl LRh-PE (200 nmol, 0,305 mg). Vortex kort mengen.
   3. Droog het lipidenmengsel in een glazen buis in een chemische zuurkast onder een zachte straal N₂ gedurende 1 uur om een droge lipidenfilm op de bodem van de buis te vormen.
      OPMERKING: De stroming van N₂ zou slechts een lichte rimpeling op het vloeistofoppervlak moeten veroorzaken.
   4. Voor analyses waarvoor meerdere platen met 96 putjes gedurende dagen of weken nodig zijn, maakt u een grote batch LC-CSH die in buizen kan worden verdeeld, of kan worden gebruikt om kant-en-klare LC-CSH-platen te maken, die worden bewaard bij -20 °C of -80 °C. Zie stappen 2.2.1-2.2.2 hieronder.
2. Coating van calciumsilicaathydraat met fluorescerende lipidenfilm
   LET OP: Draag een laboratoriumjas, handschoenen, een gezichtsmasker en een veiligheidsbril tijdens het hanteren van calciumsilicaathydraat.
   1. Steek een weegpapieren kegel in de glazen buis met de gedroogde lipiden. Voeg 80 mg calciumsilicaathydraat (CSH) poeder (lipideverwijderingsreagens) toe aan de glazen buis met behulp van de weegpapierkegel om het poeder naar de bodem van de buis te leiden. Voeg onmiddellijk 2 ml normale zoutoplossing toe aan de glazen buis met de gedroogde lipiden en CSH. Bedek de bovenkant van de buis met parafilm.
   2. Draai met de hand om het grootste deel van het lipide van de bodem van de glazen buis los te maken. Steek de glazen buis in een gat in een piepschuimplatform dat aan de bovenkant van een draaikolk is bevestigd. Bevestig de buis aan het vortex-platform met behulp van versterkte tape.
      NOTITIE: Pas de vortexsnelheid vooraf aan zodat het mengsel ongeveer halverwege de glazen buis omhoog kan kruipen.
   3. Vortex gedurende 10 min. Controleer na het vortexen of er geen lipide op de wand van de buis achterblijft. Indien nodig, handmatig vortex indien nodig totdat er geen lipide meer over is. Breng het totale volume in de glazen buis over in een conische plastic buis van 15 ml met behulp van een pipet van 1 ml. Was de wanden van de glazen buis met 3 ml extra zoutoplossing en breng over naar dezelfde conische plastic buis van 15 ml.
3. Wassen LC-CSH
   1. Centrifugeer de plastic buis van 15 ml met de met lipiden omhulde CSH (LC-CSH) gedurende 2 minuten bij 935 × g bij 4 °C om de donordeeltjes te pelleteren. Verwijder het bovenstaande voorzichtig door vacuümaspiratie met behulp van een lange, zeer fijne pipetpunt.
   2. Begin aan de bovenkant van het supernatans en terwijl u de pipetpunt langzaam langs de zijkant van de buis laat glijden, kantelt u de buis terwijl het bovenstaande wordt verwijderd. Laat een kleine hoeveelheid (≈ 200 μL) zoutoplossing over om te voorkomen dat de LC-CSH per ongeluk uit de pellet wordt opgezogen. Voeg voldoende zoutoplossing toe om het totale volume op 5 ml te brengen.
   3. Herhaal stap 1.3.1-1.3.2 vier keer. Voeg na de laatste wasbeurt voldoende zoutoplossing toe om het uiteindelijke volume op 2,5 ml te brengen.
      OPMERKING: Bewaar bij LC-CSH preparaten bij 4 °C gedurende 2 weken of bij -20 °C of -80 °C gedurende maximaal 6 maanden.
4. Voorbereiding van grote batches voor kant-en-klare LC-CSH-platen
   OPMERKING: Deze benadering maakt de voorbereiding mogelijk van meetplaten met uniforme reagenssamenstelling van dezelfde LC-CSH-batch, waardoor de variabiliteit van de metingen tussen de platen wordt geminimaliseerd.
   1. Bereid 12 LC-CSH-buizen (2.5 ml x 12 buizen) voor zoals beschreven in de stappen 1.1.1-1.3.2 hierboven. Combineer de volledige inhoud van alle 12 buizen in een conische plastic buis van 50 ml (30 ml totaal volume). Draai voorzichtig om een homogene verdeling van LC-CSH-deeltjes te verkrijgen en doseer 6 ml in een plastic conische buis van 15 ml. Herhaal dit vier keer om in totaal 5 plastic conische buizen te krijgen, elk met 6 ml LC-CSH.
   2. Elke buis levert voldoende LC-CSH om 5 kant-en-klare LC-CSH-platen te maken (met 50 μL per putje voor alle 96 putjes in een enkele plaat). Zie stappen 2.2.1-2.2.2 hieronder.

2. Incubatie van plasma-/serummonsters met fluorescerende, fosfolipide-gelabelde donorlipidedeeltjes (LC-CSH)

1. Individuele platen voor direct gebruik.
   1. Pipetteer 75 μl zoutoplossing in elk putje van een plaat van 0,3 ml 96 putjes met zoveel putjes als nodig is voor de monsterset die moet worden getest. Pipetteer 100 μL zoutoplossing in drievoudige negatieve controleputjes (NC) en 75 μL zoutoplossing in dubbele positieve controleputjes (PC) (Figuur 2). Gebruik een pipet met meerdere putjes om te doseren.
   2. Voorafgaand aan het doseren van LC-CSH, vortex de 15 ml plastic voorraadbuis 3 keer, elk 10 s. Doseer met behulp van een enkele putpipet 50 μl LC-CSH langs de rechterkant van de zouthoudende putjes. Doseer snel 50 μL elk in slechts 3 putjes. Herhaal het vortexprotocol voordat u LC-CSH in de volgende 3 putjes doseert.
      OPMERKING: Deze procedure is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de zware LC-CSH, die spontaan bezinkt, homogeen wordt gesuspendeerd, waardoor gelijke hoeveelheden aan elke put kunnen worden afgegeven.
   3. Draai de plaat met 96 putjes 180° zodat de linkerkant van de putjes nu naar rechts is. Pipetteer 25 μL plasma-/serummonsters langs de rechterkant van de put (Figuur 2). Voeg voor de PC-putjes 25 μl referentiestandaard humaan normolipidemisch plasma/serum toe. Het totale volume per putje voor de test is 150 μL.
      OPMERKING: Deze procedure voorkomt kruisbesmetting van plasma/serum met LC-CSH, aangezien ze langs weerszijden van de putjes worden gedoseerd.
   4. Sluit de plaat goed af met plakfolie. Incubeer de afgesloten plaat met 96 putjes in het donker gedurende 1 uur bij 37 °C bij 1200 tpm in een thermomixer. Nadat de incubatie is voltooid, verwijdert u de plaat van de thermomixer en legt u deze op ijs. Centrifugeer de plaat gedurende 2 minuten bij 4 °C (om de overdrachtsreactie te stoppen) bij 935 g om de donordeeltjes te pelleteren.
2. Kant-en-klare LC-CSH-platen
   1. Ontdooi voor gebruik diepgevroren kant-en-klare platen (zie stap 1.4.1-1.4.2 voor het bereiden van de borden) in de kou (4 °C tot 10 °C) gedurende 2 uur (of, indien nodig, een nacht). Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 4 °C bij 935 × g om al het materiaal (125 μL) samen te verzamelen. Verwijder voorzichtig de zelfklevende film om de inhoud van de putjes niet te spatten.
   2. Doseer 25 μl plasma-/serummonsters, zoutoplossing en verwijs menselijk plasma, in drievoud, naar de daarvoor bestemde putjes (figuur 1) van de gebruiksklare plaat, op ijs en sluit af met plakfolie. Incubeer de afgesloten 96-well in het donker gedurende 1 uur bij 37 °C bij 1200 tpm in een thermomixer. Haal de plaat van de thermomixer en zet hem op ijs. Centrifugeer de plaat gedurende 2 minuten bij 4 °C (om de overdrachtsreactie te stoppen) bij 935 × g (om de donordeeltjes te pelleteren).

Figuur 2: Dosering van reagentia in putjes zonder kruisbesmetting. Doseer plasma/serum en LC-CSH op tegenoverliggende wanden van de putjes. Kruisbesmetting wordt geminimaliseerd als de plaat 180° wordt gedraaid na de eerste dosering van LC-CSH. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Meting van fluorescerende fosfolipide-efflux naar plasma/serum HDL

1. Overbrengen naar een zwarte plaat en fluorescentiemeting
   1. Verwijder voorzichtig de zelfklevende film om de LC-CSH-pellet niet te verstoren.
      NOTITIE: Als de pellet wordt verstoord, centrifugeer dan opnieuw.
   2. Breng 50 μL supernatans van de reactieplaat met 96 putjes over in de putjes van een zwarte polystyreenplaat met platte bodem met 96 putjes voor fluorescentiemetingen. Gebruik een pipet met meerdere putjes.
      OPMERKING: Zuig geen LC-CSH op. Als dit gebeurt, injecteer dan terug in de put en centrifugeer opnieuw.
   3. Vul een reservoir met normale zoutoplossing. Voeg 50 μL zoutoplossing toe aan elk putje met behulp van een pipet met meerdere putjes.
   4. Bereid 1% TX-100 door 90 ml gedestilleerd water toe te voegen aan 10 ml 10% Triton X-100 stockoplossing in een plastic erlenmeyer van 125 ml. Vul een reservoir met 1% Triton-X 100.
   5. Voeg 100 μL 1% Triton X-100 bij kamertemperatuur toe aan elk putje en meng door 2-3 keer zachtjes op en neer te pipetteren met behulp van een pipet met meerdere putjes. Vermijd het vormen van bubbels. Laat eventuele bubbels knappen met lucht uit een transferpipet van 3 ml.
   6. Meet de fluorescentie van Lissaminerhodamine met een fluorimeter (540 nm excitatie/ 600 nm emissie).
2. Berekening van %PE-efflux
   1. Berekening van PE-efflux
      1. %PE efflux = ([Totaal Supernatant Plasma of Serum FLU - Supernatant NC FLU]/Totaal GRIEP)) × 100
         FLU = fluorescentie-eenheden; NC = negatieve controle. Aangezien slechts 50 μL van de 150 μL van het bovenstaande reactiemengsel wordt gebruikt om de fluorescentie per putje te meten, is het noodzakelijk om als volgt te corrigeren:
      2. Totaal bovengemiddelde FLU/well = gemeten FLU van 50 μL (zwarte plaat) × 3
      3. Totaal FLU per 150 μL reactiemengsel/putje = Totaal FLU uitgestoten door 50 μL LC-CSH.
         OPMERKING: LC-CSH-fluorescentie wordt berekend zoals hieronder beschreven (stap 4.2.5).
   2. Genormaliseerde %PE-effluxberekening
      1. Gebruik de genormaliseerde %PE-efflux om te corrigeren voor variatie tussen tests die onder verschillende omstandigheden zijn uitgevoerd (d.w.z. experiment uitgevoerd op verschillende dagen, batchverschillen).
      2. Gebruik deze formule om de genormaliseerde %PE-efflux te berekenen:
         Genormaliseerde %PE Efflux = Monster supernatans %PE efflux waarde (FLU)/positieve referentiecontrole supernatant %PE efflux FLU waarde.
      3. Gebruik identiek gepoold humaan plasma van gezonde donoren met een normaal lipidenprofiel als referentiecontrole. Het is niet nodig om het totale bovenstaande FLU/well te berekenen, aangezien deze waarde hetzelfde is voor zowel het monster als de referentie.
      4. Plak voor drievoudige voorbeelden de onbewerkte gegevens die in stap 3.1.6 zijn verkregen in de spreadsheet (aanvullende tabel 1). Voor dubbele voorbeelden plakt u de onbewerkte gegevens die in stap 3.1.6 zijn verkregen in de spreadsheet (aanvullende tabel 2).

4. LC-CSH standaard curve

OPMERKING: De LC-CSH-standaardcurve wordt gebruikt om de hoeveelheid PE-fluorescerend signaal te berekenen die aanwezig is in het aliquoot LC-CSH per put. Doorgaans wordt 50 μL LC-CSH/well gebruikt. Deze waarde kan worden gebruikt om de %PE-efflux naar HDL te berekenen in een monster genormaliseerd naar de totale FLU (zie stap 3.2.1) die aanwezig is in het reactiemengsel.

%PE efflux = ((supernatans monster fluorescentie-eenheden [FLU] - supernatans zoutoplossing FLU)/(totaal LC-CSH FLU)) x 100.

1. Seriële verdunning van LC-CSH
   1. Bereid 10-voudige en 100-voudige verdunningen van voorraad LC-CSH (zoals bereid in de stappen 1.1.1-1.3.3):
      10-voudige verdunning: 100 μL LC-CSH + 900 μL 1% Triton X-100
      100-voudige verdunning: 100 μL 10-voudig verdunde LC-CSH + 900 μL 1% Triton X-100
   2. Doseer drievoudmonsters van 10- en 100-voudig verdund LC-CSH in een incubatieplaat met 96 putjes voor de standaardcurve (zie figuur 3).
   3. Voeg voldoende volume van 1% Triton X-100 toe aan de putjes die LC-CSH bevatten om tot een definitief volume van 200 μL te brengen (zie tabel 1).
2. Solubilisatie van LC-CSH voor fluorescentiemeting
   1. Sluit de plaat af met plakfolie en incubeer gedurende 1 uur bij 24 °C met schudden bij 1200 tpm. Centrifugeer de plaat gedurende 2 minuten bij 4 °C bij 935 × g. Verwijder voorzichtig de zelfklevende film.
   2. Meng met behulp van een pipet met meerdere putjes monsters door 2-3x op en neer te pipetteren. Breng 100 μL LC-CSH per putje over op een zwarte polystyreenplaat met vlakke bodem met 96 putjes voor fluorescentiemetingen, met behulp van een pipet met meerdere putjes.
   3. Voeg 100 μL per putje van 1% Triton-X bij kamertemperatuur toe aan elk putje, met behulp van een pipet met meerdere putjes. Meng door 2-3x op en neer te pipetteren.
   4. Meet fluorescentie met een fluorimeter (540 nm excitatie/600 nm emissie).
   5. Plak de fluorescentiewaarden gemeten met de fluorimeter in de sjabloon Lineaire regressieanalyse in aanvullende tabel 1 zoals afgebakend in het aanvullende bestand 3. De uiteindelijke concentraties van LC-CSH in het meetplaatje van de standaardcurve worden weergegeven in tabel 2.

Figuur 3: Plaat voor LC-CSH-standaardcurve. Serieel verdund LRh-PE-gelabeld-LC-CSH wordt gedoseerd in een plaat met 96 putjes, zoals getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Uiteindelijke concentratie	10-voudig verdund	100-voudig verdund	1% Triton X-100	Totaal
LC-CSH	LC-CSH	LC-CSH	Reinigingsmiddel	Volume
(μL/putje)	(μL)	(μL)	(μL)	(μL)
10	100	0	100	200
5	50	0	150	200
2.5	25	0	175	200
1	0	100	100	200
0.5	0	50	150	200
0.25	0	25	175	200

Tabel 1: Hoeveelheden reagentia toegevoegd aan putjes van de incubatieplaat voor LC-CSH-standaardcurve.

Oplosbaar	Saline	Totaal	Toegevoegd	Afgemeten
LC-CSH	Volume	Volume	LC-CSH	LC-CSH
(μL)	(μL)	(μL)	(μL/putje)	(μL/putje)
100	100	200	10	5
100	100	200	5	2.5
100	100	200	2.5	1
100	100	200	1	0.5
100	100	200	0.5	0.25
100	100	200	0.25	0.125

Tabel 2: Hoeveelheden reagentia die worden toegevoegd aan putjes van de meetplaat voor de LC-CSH-standaardcurve.

Resultaten

Analysemethoden

Zoals hierboven vermeld, kunnen HDL-SPE-monsteranalyses worden aangepast voor verschillende toepassingen, zoals hieronder wordt aangetoond. Voorafgaand aan het uitvoeren van studies met onderzoeksmonsters, worden eerst LC-CSH-standaardcurvevalidatie, reproduceerbaarheid en plasmaconcentratietests uitgevoerd om de vereiste technieken onder de knie te krijgen. Voer eerst de LC-CSH-standaardcurve-analyse uit om de kwaliteit van LC...

Discussie

HDL-C is een belangrijke bepalende factor die wordt gebruikt om het risico op hart- en vaatziekten (HVZ) klinisch te beoordelen en dus de noodzaak van lipidenverlagende of andere mogelijke preventieve behandelingen¹. Het is aangetoond dat de functie van HDL in cellulaire cholesterolefflux in vitro een nog betere voorspeller is van incidentele hart- en vaatziekten dan HDL-C⁷. Helaas is deze cellulaire test niet geschikt voor convers...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Research	850345	14:0 PC (DMPC) Chloorform Soluiton
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammoniumzout)	Avanti Research	810150-C	Chloorform Oplossing LRh-PE
Zelfklevende film	Applied Biosystems	4306311	MicroAmp Clear Zelfklevende Film
Bay Corporation Hoge Dichtheid Teflon Tape 1/2 inch x 520	Medical Testing Solutions	86732
Boorsilicaat glazen buizen 20 mm ´ 150 mm	Fisher Scientific	14-961-33
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall X Pro Series
Chloorform	Sigma-Aldrich	366927	geschikt voor HPLC, ≥99,8%
Cholesterol Poeder	Sigma-Aldrich	C8667	3β-Hydroxy-5-cholesteen, 5-Cholesteen-3β-ol
Glassine weegpapier	Cole-Palmer	UX-01338-02	Voor het hanteren van LC-CSH
Incubatieplaat	USA Scientific	1402-9700	TempPlate 96 Well Semi Skirt 0,2mL PCR Platen
Lipid Verwijderingsmiddel (LRA)	Supelco	13358-U	LC-CSH
Meetplaat	Greiner bio-one	655076	Microplaat, PS, 96-well, F-BOTTOM(CHIMNEY WELL), ZWART; FLUOTRAC, MED BINDING
Microsoft Excel	Microsoft 365 MSO	Versie 2507
MultiFlex Pipettips	Fisher Scientific	50-550-206	Voor het afzuiging van supernatant tijdens LC-CSH wasbeurten
Multilabel plaatlezer	Perkin Elmer	1420-050	Victor3 Wallac1420 Multilabel Counter
Normale zoutoplossing	Quality Biological	114-055-101	Voor meerdere gebruiken
Parafilm	Cole-Palmer	HS23452	Om de bovenkant van het glazen buisje te bedekken tijdens het vortexen
Polycabonate Erlenmeyer kolven	Fisher Scientific	10-041-8	Voor 10% Triton-X oplossing
Gepoold menselijk plasma (bloed afgeleid) Li Heparine)	Innovative Research Inc	IPLAWBLIH	Referentieplasma, positieve controle (PC)
Surfact-Amps X 100	Thermo Scientific	28314	10% Triton X-100, verdund 10x met gedestilleerd water
Thermomixer	Eppendorf	5382000023	Thermomixer C met 96-well thermoblok
Thermomixer Smartblock	Eppendorf	5306000006	96-well SmartBlock
Transfer pipetten (3 mL, Falcon)	Fisher Scientific	13-711-9CM	Voor het verwijderen van bellen vanaf de bovenkant van de put
Vortex mixer	Daigger	3030A	Bevestigingshouders voor glazen buisje bovenaan