Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Identificatie van immuungerelateerde moleculaire biomarkers bij autismespectrumstoornis met behulp van data-onafhankelijke acquisitieproteomics en machine learning

565 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68949

⸱

26 september 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Sciences, Hunan Normal University, 2Changsha Maternal and Child Health Hospital, Affiliated to Hunan Normal University, 3Changsha Central Hospital, Affiliated to University of South China, 4Shanghai Bioprofile Technology Co., Ltd.

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol met behulp van data-onafhankelijke acquisitie, massaspectrometrie en machine learning dat acht immuungerelateerde eiwitten identificeerde als nauwkeurige biomarkers voor de vroege diagnose van autismespectrumstoornis, gevalideerd door een enzymgekoppelde immunosorbenttest.

Samenvatting

Deze studie presenteert een reproduceerbaar protocol voor het identificeren van serumeiwitbiomarkers geassocieerd met autismespectrumstoornis (ASS) met behulp van data-independent acquisition (DIA) massaspectrometrie in combinatie met machine learning (ML). DIA maakt onbevooroordeelde profilering met hoge resolutie van het serumproteoom mogelijk, inclusief eiwitten met een lage abundantie, terwijl de reproduceerbaarheid van alle monsters wordt gegarandeerd. ML-benaderingen werden toegepast om diagnostisch informatieve eiwitpanels te selecteren en de robuustheid van het model te verbeteren. De analyse omvatte serum van 99 kinderen met ASS en 70 controles van dezelfde leeftijd. Eiwitten met een hoge abundantie werden uitgeput, peptiden werden bereid met behulp van gestandaardiseerde verterings- en fractioneringsprocedures en DIA werd uitgevoerd op een massaspectrometer met hoge resolutie. Gegevensverwerking en kwantificering identificeerden differentieel tot expressie gebrachte eiwitten, die een functionele verrijkingsanalyse ondergingen. Acht immuungerelateerde eiwitten kwamen naar voren als sterke kandidaten voor de ontwikkeling van biomarkers. Een logistisch regressiemodel dat op deze eiwitten was getraind, bereikte een nauwkeurigheid van 95,27%, een Kappa-waarde van 0,9025 en een AUC van 1,000 bij kruisvalidatie. Deze bevindingen tonen het potentieel aan van op DIA gebaseerde proteomics, gecombineerd met machine learning, als een robuust raamwerk voor het ontdekken van biomarkers bij ASS en voor aanpassing in breder klinisch onderzoek.

Inleiding

Autismespectrumstoornis (ASS) is een groep van neurologische ontwikkelingsstoornissen met vroege aanvang die wordt gekenmerkt door heterogeniteit in etiologie en klinische presentatie. Kernkenmerken zijn onder meer aanhoudende tekorten in sociale communicatie en interactie, evenals beperkt, repetitief gedrag, interesses of activiteiten. In de Verenigde Staten is de prevalentie ongeveer 2,3% onder 8-jarige kinderen en ongeveer 2,2% onder volwassenen, wat de impact op de volksgezondheidonderstreept 1,2,3,4. Risicofactoren zijn divers, waaronder genetische aanleg, ontregeling van het immuunsysteem en prenatale blootstelling aan het milieu 5,6,7. Vroege diagnose en interventie kunnen de ontwikkelingsresultaten aanzienlijk verbeteren, waardoor de identificatie van objectieve en betrouwbare biomarkers een belangrijk aandachtspunt is van ASS-onderzoek 8,9,10. Dit protocol bouwt voort op ons eerder gepubliceerde werk waarbij data-onafhankelijke acquisitie (DIA) proteomics en machine learning worden toegepast om immuungerelateerde eiwitten te identificeren als potentiële biomarkers voor vroege ASS-diagnose11.

Ondanks uitgebreide inspanningen bestaan er momenteel geen specifieke en universeel gevalideerde biomarkers voor klinische ASS-diagnose12. Voorgestelde kandidaten, zoals veranderingen in het darmmicrobioom13, verhoogd interleukine-6 (IL-6)14, veranderingen in van de hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF)15 en oxidatieve stressmarkers zoals glutathion16 - blijven voorlopig en missen reproduceerbaarheid voor klinisch gebruik. Proteomics is naar voren gekomen als een veelbelovende benadering voor het identificeren van ziektespecifieke moleculaire handtekeningen, en verschillende onderzoeken hebben verschillende biologische monsters (bloed, speeksel, urine, PBMC's) onderzocht op differentieel tot expressie gebrachte eiwitten 8,17,18,19,20,21,22 . Bao et al. toonden bijvoorbeeld aan dat ontstekingseiwitten geïdentificeerd door Olink-proteomics kunnen helpen bij een vroege diagnose van ASS (17), terwijl andere studies suggereren dat gedeelde proteomische en metabole routes robuuste biomarkers kunnen opleveren ondanks de genetische heterogeniteit van ASS23.

DIA-massaspectrometrie heeft steeds meer aandacht gekregen vanwege de uitgebreide en reproduceerbare eiwitprofilering. In tegenstelling tot traditionele data-afhankelijke acquisitie (DDA), die selectief de meest intense ionen fragmenteert, fragmenteert DIA alle voorloperionen over vooraf gedefinieerde m/z-vensters. Dit zorgt voor een diepere proteoomdekking en verbeterde reproduceerbaarheid in grote cohorten, een belangrijk voordeel voor klinische vergelijkingen14. Benchmarkstudies tonen aan dat DIA meer kwantificeerbare peptiden detecteert dan DDA, met name voor eiwitten met een lage abundantie, met een lagere variatie tussen de runs14.

Voortbouwend op deze vooruitgang hebben we op DIA gebaseerde proteomische analyse toegepast op serummonsters van 99 kinderen met ASS en 70 controles, na uitputting van eiwitten met een hoge overvloed. Onze bevindingen benadrukken het potentieel van immuungerelateerde eiwitten als moleculaire markers voor vroege ASS-diagnose en tonen de waarde aan van op DIA gebaseerde proteomics bij het ontdekken van biomarkers in combinatie met rigoureuze methodologie11.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het protocol werd uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en het protocol werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van het Changsha Maternal and Child Health Hospital; Er werd geïnformeerde toestemming verkregen van de proefpersonen.

1. Identificatie van kinderen met autisme met DSM-5

  1. Verzamelen van medische geschiedenis en achtergrondinformatie
    1. Ontwikkelingsgeschiedenis
      1. Verzamel informatie over de vroege ontwikkeling van de patiënt, inclusief taal-, sociale en motorische vaardigheidsprogressie.
      2. Noteer eventuele ontwikkelingsachterstanden of afwijkingen (bijv. taalachterstand, moeilijkheden in sociale interactie).
    2. Familiegeschiedenis
      1. Informeer naar een familiegeschiedenis van autisme of andere neurologische ontwikkelingsstoornissen.
    3. Huidig functioneel niveau
      1. Beoordeel de prestaties van de patiënt in het dagelijks leven, inclusief leren, werken, sociale interacties en vaardigheden op het gebied van zelfstandig wonen.
  2. Diagnostische criteria voor DSM-5 gebruiken
    1. Hardnekkige tekorten in sociale communicatie en sociale interactie
      1. Zorg ervoor dat aan ten minste twee van de volgende drie criteria wordt voldaan:
        1. Tekorten in sociaal-emotionele wederkerigheid - zoeken naar een gebrek aan normaal oogcontact, gezichtsuitdrukkingen of lichaamstaal en moeite met het vormen van vriendschappen of relaties die bij de leeftijd passen.
        2. Tekorten in non-verbaal communicatief gedrag - zoek naar uitdagingen bij het gebruik van gebaren, gezichtsuitdrukkingen of stemgeluid om emoties over te brengen en een beperkt begrip van non-verbale signalen van anderen.
        3. Tekorten in het ontwikkelen, onderhouden en begrijpen van relaties - zoek naar moeite om zich aan te passen aan verschillende sociale contexten en een gebrek aan interesse in leeftijdsgenoten of onvermogen om fantasierijk spel te spelen.
    2. Beperkte, zich herhalende gedragspatronen, interesses of activiteiten
      1. Zorg ervoor dat aan ten minste twee van de volgende vier criteria wordt voldaan:
        1. Stereotiepe of repetitieve motorische bewegingen (bijv. met de hand fladderen, wiegen van het lichaam of herhaaldelijk gebruik van voorwerpen).
        2. Aandringen op gelijkheid of geritualiseerde gedragspatronen - zoek naar extreem leed over kleine veranderingen in de routine.
        3. Zeer beperkte, gefixeerde interesses - zoek naar abnormaal intense focus op specifieke onderwerpen of activiteiten.
        4. Hyper- of hyporeactiviteit op sensorische input - zoek naar atypische reacties op sensorische stimuli zoals geluiden, lichten of aanraking.
  3. Beoordeling van het begin en de ernst van de symptomen
    1. Timing van de symptomen - bevestig dat de symptomen aanwezig waren in de vroege kinderjaren (meestal vóór de leeftijd van 3 jaar), zelfs als ze later duidelijker worden.
    2. Impact van symptomen - bevestig dat de symptomen aanzienlijke beperkingen veroorzaken op sociaal, beroepsmatig of ander belangrijk gebied van functioneren.
    3. Ernst niveaus
      OPMERKING: Volgens DSM-5 is de ernst van ASS onderverdeeld in drie niveaus (aanvullende tabel S1).
      1. Categoriseer als niveau 1 als de patiënt slechts milde ondersteuning nodig heeft.
      2. Categoriseer als niveau 2 als de patiënt substantiële ondersteuning nodig heeft (matig).
      3. Categoriseer als niveau 3 als de patiënt zeer substantiële ondersteuning nodig heeft (ernstig).
  4. Uitsluiting van andere mogelijke oorzaken
    1. Medisch onderzoek Voer de nodige medische evaluaties uit (bijv. genetische tests, beeldvorming van de hersenen) om andere aandoeningen uit te sluiten die soortgelijke symptomen kunnen veroorzaken (bijv. genetische syndromen, gehoorstoornissen, verstandelijke handicaps).
    2. Comorbiditeitsbeoordeling: Evalueer de aanwezigheid van comorbide aandoeningen (bijv. aandachtstekortstoornis met hyperactiviteit, angststoornissen, depressie, epilepsie, enz.).

2. Monstervoorbereiding voor DIA-massaspectrometrieanalyse

  1. Ethische naleving en monsterverzameling
    1. Verkrijg geïnformeerde toestemming van de ouders of wettelijke voogden van kinderen van 3-7 jaar met de diagnose autismespectrumstoornis (ASS).
    2. Classificeer patiënten in ernstniveaus 1 tot 3 volgens de diagnostische criteria uiteengezet in de Amerikaanse DSM-5 voor autisme (stap 1.3.3).
    3. Verzamel serummonsters van de deelnemers. Zorg ervoor dat alle monsters binnen vier uur na bloedafname worden verwerkt om eiwitafbraak te voorkomen. Bewaar monsters tijdens de verwerking op ijs.
  2. Verwijdering van eiwitten met een hoge abundantie
    1. Gebruik een in de handel verkrijgbare kit om eiwitten met een hoge overvloed uit 60 μL serum per monster te deduceren, volgens de instructies van de fabrikant. Kortom, breng de uitputtingskolom in evenwicht met de bindingsbuffer, laad het serummonster en laat het onder zwaartekracht door de kolom gaan. Verzamel de doorstroom, die de eiwitfractie met een lage abundantie bevat.
    2. Meet de totale eiwitconcentratie met behulp van een BCA-test. Normaliseer alle monsters tot een eindconcentratie van 0,5-1,0 μg/μl voordat ze in oplossing worden verteerd. Zorg ervoor dat elk monster ten minste 100 μg eiwit bevat voor latere analyse.
  3. Eiwit vertering
    OPMERKING: De eiwitvertering werd uitgevoerd met behulp van de FASP-methode beschreven door Wisniewski et al.24.
    1. Voeg het wasmiddel, dithiothreitol (DTT) en jodoacetamide (IAA) toe in UA (ureumbuffer) buffer om gereduceerd cysteïne te blokkeren.
    2. Verteer de eiwitsuspensie met trypsine in een verhouding van 50:1 's nachts bij 37 °C.
  4. Peptide ontzouten, opruimen en fractionering met omgekeerde fase met hoge pH
    1. Centrifugeer de peptidemengsels bij 16.000 g × gedurende 15 minuten bij °C om onoplosbaar vuil te verwijderen.
    2. Breng het bovenstaande (dat verteerde peptiden bevat) over naar een nieuwe microcentrifugebuis met een lage binding om adsorptieverliezen te minimaliseren.
    3. . Bereid C18-microkolommen voor (intern verpakt met C18-hars) door te preconditioneren met 100% methanol (20 μL) en te balanceren met 0,1% (v/v) trifluorazijnzuur (TFA) in water (buffer A; 20 μL).
    4. Laad het peptidemonster op de microkolom. Was de kolom met 20 μL buffer A om zouten, wasmiddelen en niet-peptidische verontreinigingen te verwijderen.
    5. Elute gezuiverde peptiden met 20 μL 80% acetonitril met 0,1% TFA.
    6. Droog de geëlueerde peptiden onder vacuüm met behulp van een centrifugale vacuümconcentrator. Bewaar gedroogde peptiden bij -8 °C tot verder gebruik.
    7. Reconstitueer gedroogde peptiden in 0,1% mierenzuur voorafgaand aan LC-MS/MS-analyse.
    8. Kwantificeer de peptideconcentratie door de extinctie bij 280 nm (OD280) te meten met behulp van een spectrofotometer, waarbij rekening wordt gehouden met de bijdragen van tryptofaan- en tyrosineresiduen voor een nauwkeurige kwantificering.
      Voor het fractioneren van peptidemengsels met behulp van HPLC met omgekeerde fase met hoge pH wordt een C18-kolom (3,5 μm, 2,1 x 150 mm) gebruikt op een HPLC-systeem met een debiet van 0,3 ml/min, mobiele fase A: 10 mM ammoniumformiaat in water, pH 10 (aangepast met ammoniumhydroxide), mobiele fase B: 10 mM ammoniumformiaat in 90% acetonitril, pH 10. Voer een gradiënt-elutie uit om 60 fracties per monster te verzamelen gedurende ~60 minuten.
    9. Combineer elke derde fractie om redundantie te verminderen, wat resulteert in 20 gepoolde fracties per monster. Droog elke gepoolde fractie onder vacuüm voor stroomafwaartse analyse.
      OPMERKING: De resulterende peptidefracties zijn nu klaar voor nano-LC-MS/MS-analyse.

3. Indiening voor DIA-massaspectrometrieanalyse

  1. DIA massaspectrometrie analyse
    1. Spike het Data-dependent Acquisition (DDA) Peptide uit de HPRP-fractie met iRT-standaardpeptiden en scheid ze met behulp van reverse-phase high-performance vloeistofchromatografie (RP-HPLC) op een nano-HPLC-systeem met een kolom (75 μm x 150 mm; 2 μm C18-korrels, 120 Å) bij een debiet van 300 nL/min met mobiele fase A: 0,1% mierenzuur in water, mobiele fase B: 0,1% mierenzuur in 95% acetonitril.
    2. Elute de peptiden gedurende 60 minuten met een lineaire gradiënt van buffer B als volgt ingesteld: 0 - 2 min, lineaire gradiënt van 2% tot 5% buffer B; 2 - 42 min, lineaire gradiënt van 5% tot 20% buffer B; 42 - 50 min, lineaire gradiënt van 20% tot 35% buffer B; 50 - 52 min, lineaire gradiënt van 35% tot 90% buffer B; 52 - 60 min, buffer B op 90% gehouden.
    3. Analyseer de geëlueerde peptiden op de massaspectrometer waarnaar wordt verwezen. Verkrijg MS-gegevens met behulp van een gegevensafhankelijke top20-methode waarbij dynamisch de meest voorkomende voorloperionen uit de survey-scan (350 - 1500 m/z) worden gekozen voor HCD-fragmentatie.
    4. Voer het instrument uit terwijl de peptideherkenningsmodus is ingeschakeld. Gebruik een slotmassa van 445.120025 Da als interne standaard voor massakalibratie. Verkrijg de volledige MS-scans met een resolutie van 70.000 bij m/z 200 en 17.500 bij m/z 200 voor MS/MS-scan. Stel de maximale injectietijd in op 50 ms voor MS en 30 ms voor MS/MS, genormaliseerde botsingsenergie op 28, het isolatievenster op 1,6 th en de dynamische uitsluitingsduur op 30 s.
  2. LC-MS/MS-analyse voor data-onafhankelijke acquisitie (DIA)
    1. Prik de peptiden van elk monster met iRT gelijkmatig en afzonderlijk.
    2. Voer LC-MS/MS uit op een quadrupoolmassaspectrometer in combinatie met een nano-HPLC-systeem. Stel de LC-voorwaarde op dezelfde manier in als voor de DDA-methode hierboven. Voer een survey-scan uit van 400 tot 1.200 m/z met een resolutie van 60.000 met een AGC-doelstelling van 3E6 en 30 ms injectietijd. Verkrijg de DIA MS/MS-scans met een resolutie van 15.000 met een isolatievenster van 20 m/z en met een AGC-doel van 1E6 en 50 ms injectietijd. Stel de genormaliseerde botsingsenergie in op 30.
    3. Registreer de spectra van volledige MS- en DIA-scans in respectievelijk profiel- en zwaartepunttypen.
  3. Sequentie database zoeken
    1. Analyseer de DDA MS-gegevens met behulp van de DIA-software2.
    2. Zoek de MS-gegevens tegen de UniProtKB-database voor mensen (186.532 totale inzendingen, gedownload op 10/2019), verrijkt met eiwitten bestaande uit 11 iRT-peptidesequenties.
    3. Selecteer trypsine als het spijsverteringsenzym. Definieer de maximale twee gemiste splitsingsplaatsen en de massatolerantie van 4,5 ppm voor voorloperionen en 20 ppm voor fragmentionen voor het doorzoeken in databases. Definieer carbamidomethylering van cysteïnen als een vaste modificatie en acetylering van eiwit N-terminaal en oxidatie van methionine als variabele modificaties voor het doorzoeken in databases.
    4. Filter de zoekresultaten van de database en exporteer ze met <1% false discovery rate (FDR) op respectievelijk peptidespectrum-gematchte en eiwitniveaus.
  4. Verwerking van onbewerkte gegevens uitvoeren
    1. Analyseer de DIA MS-gegevens werden geanalyseerd met de DIA-software [34, 35] voor een spectrale bibliotheekgeneratie op basis van de zoekresultaten. Gebruik de standaardinstellingen voor de zoekopdracht en de dynamische iRT voor het voorspellen van de retentietijd. Zorg ervoor dat de interferentiecorrectie voor MS/MS-scan is ingeschakeld.
    2. Exporteer de resultaten met <1% FDR op peptideniveau.

4. Differentiële eiwitanalyse

  1. Voer hypothesetesten uit met behulp van de t-toets van de student in combinatie met vouwverandering (FC) op http://www.omickits.com/open/tooldetail?id=70.
    1. Log in op het cloudplatform en navigeer naar de Hypothesis Testing Analysis tool. Upload het voorbewerkte gegevensbestand voor de kwantificering van eiwitten (bijv. CSV- of TXT-indeling).
    2. Selecteer in de parameterinstellingen de t-toets van de student als statistische methode en de significantiedrempel bij p-waarde < 0,05. Definieer de drempelwaarde voor het wijzigen van de vouw als FC > 1,5 of FC < 1/1,5. Klik op Analyse uitvoeren en wacht tot de resultaten zijn gegenereerd.
    3. Download het uitvoerbestand met p-waarden, log2(FC) en significantiestatus voor elk eiwit.
      OPMERKING: Deze benadering met twee criteria brengt statistische significantie in evenwicht met biologische relevantie, en zorgt voor een robuuste identificatie van differentieel tot expressie gebrachte eiwitten (DEP's).

5. Analyse van het signaalpad

  1. Visualisatie van vulkaanplot
    1. Navigeer naar de tool op http://www.omickits.com/open/tooldetail?id=63 en vervolgens naar de pagina met de tool voor vulkaanplots .
      1. Upload het resultatenbestand van de DEP-analyse vanuit sectie 4.
      2. Configureer visualisatieparameter: X-as: log2 (Fold Change) - geeft de richting van de verandering aan; Y-as: -log10 (p-waarde) - geeft statistische significantie weer; Kleurcodering: Rood : significant opgereguleerde eiwitten (p < 0,05 en FC > 1,5); Blauw : significant gedownreguleerde eiwitten (p < 0,05 en FC < 0,667); Grijs : niet-significante eiwitten (p ≥ 0,05 of 1/1,5 ≤ FC ≤ 1,5).
      3. Klik op Afbeelding genereren en download de afbeelding met hoge resolutie (PDF/SVG-indeling) voor publicatie.
  2. Hiërarchische clustering heatmap
    1. Navigeer naar de tool op http://www.omickits.com/open/tooldetail?id=17
      1. Toegang tot de tool voor clustering heatmap .
      2. Upload de gefilterde DEP-expressiematrix.
      3. Stel de volgende parameters in: Normalisatiemethode: rijgewijze Z-score om schaalverschillen te elimineren; Afstand metrisch: Euclidische afstand; Clusteringmethode: volledige koppeling hiërarchische clustering; Optioneel: schakel kolom- en/of rijclustering in, afhankelijk van de steekproefgroepering.
      4. Klik op Uitvoeren om de heatmap te genereren.
      5. Download en sla de heatmap op als een publicatieklare afbeelding.
        OPMERKING: De heatmap geeft visueel de gelijkenis en divergentie van eiwitexpressiepatronen tussen monsters weer.
  3. GO functionele annotatie en verrijkingsanalyse
    1. Installeer en laad de vereiste R-pakketten:
      bibliotheek(clusterProfiler)
      bibliotheek(org. Hs.eg.db)
      Bibliotheek(ggplot2)
    2. Zet eiwit-ID's (bijv. Uniprot of gensymbolen) om in Entrez-ID's:
      entrez_ids <- bitr(diff_proteins, fromType = "UNIPROT", toType = "ENTREZID", OrgDb = org. Hs.eg.db)
    3. Voer een GO-verrijkingsanalyse uit:
      go_enrich <- enrichGO(gen = entrez_ids$ENTREZID, OrgDb = org. Hs.eg.db, keyType = "ENTREZID", ont = "BP")
    4. Visualiseer de resultaten met behulp van puntdiagrammen:
      1. dotplot(go_enrich, showCategory = 20)
        Formule:
        Rijke factor = (a/b) / (c/d)
        Waar:
        a = aantal DEP's dat bij de term is geannoteerd;
        b = totaal aantal DEP's;
        c = aantal achtergrondeiwitten dat bij de term is geannoteerd;
        d = totaal aantal achtergrondeiwitten.
  4. Annotatie en verrijkingsanalyse van de KEGG-route
    1. Voer een KEGG-verrijkingsanalyse uit:
      kegg_enrich <- verrijkenKEGG(gen = entrez_ids$ENTREZID, organisme = "heeft")
    2. Visualiseer de resultaten van de KEGG-route:
      barplot(kegg_enrich, showCategory = 20)
    3. Pas plots aan met ggplot2 voor publicatie-opmaak.

6. Eerste screening van eiwitten met behulp van ROC-curveanalyse

  1. Gegevensvoorbereiding : Laad de proteomics-dataset met alle differentieel tot expressie gebrachte eiwitten (DEP's) geïdentificeerd uit de autismespectrumstoornis (ASS) en controlegroepen. Zorg ervoor dat de dataset eiwitexpressiewaarden voor beide groepen bevat, met duidelijke labels die ASS en controlemonsters aangeven.
  2. Voer een ROC-curveanalyse uit.
    1. Gebruik het pROC-pakket in R om de Receiver Operating Characteristics (ROC)-curveanalyse voor elk eiwit uit te voeren.
    2. Evalueer het vermogen van elk eiwit om onderscheid te maken tussen de ASS- en controlegroep door de Area Under the Curve (AUC) te berekenen.
      AUC = 0,5: Geen discriminatie (gelijk aan willekeurig toeval).
      0,7 ≤ AUC < 0,8: Aanvaardbare discriminatie.
      0,8 ≤ AUC < 0,9: Uitstekende discriminatie.
      AUC ≥ 0,9: Uitstekende discriminatie.
      OPMERKING: De AUC geeft de kans weer dat een willekeurig geselecteerde persoon uit de ASS-groep een hoger eiwitgehalte heeft dan een willekeurig geselecteerde persoon uit de controlegroep. Een hogere AUC duidt op betere diagnostische prestaties, waarbij waarden boven 0,8 over het algemeen als klinisch significant worden beschouwd in biomarkerstudies.
    3. Noteer de AUC-waarden voor alle eiwitten.
  3. Selecteer kandidaat-biomarkers.
    1. Identificeer eiwitten met een AUC groter dan 0,7 als kandidaat-biomarkers.
    2. Exporteer de lijst met kandidaat-biomarkers voor verdere analyse.
  4. Visualiseer resultaten.
    1. Gebruik het ggplot2-pakket in R om visualisaties te maken van de ROC-curven voor de best presterende eiwitten.
    2. Neem de AUC-waarden op in de plotlegenda's voor de duidelijkheid.

7. Secundaire screening met behulp van Random Forest

  1. Bereid invoergegevens voor.
    1. Gebruik de lijst met kandidaat-biomarkers verkregen uit de ROC-analyse als input voor willekeurige bosanalyse.
    2. Zorg ervoor dat de gegevensset op de juiste manier is opgemaakt, met rijen die monsters vertegenwoordigen en kolommen die eiwitexpressiewaarden vertegenwoordigen.
  2. Train het Random Forest-model.
    1. Pas het random forest-algoritme toe met behulp van het randomForest-pakket in R.
    2. Stel het aantal bomen (ntree) in op 500 en het aantal variabelen dat willekeurig wordt bemonsterd bij elke splitsing (mtry) op de vierkantswortel van het totale aantal objecten.
    3. Beoordeel het belang van kenmerken met behulp van de metrische gegevens MeanDeclineAccuracy, waarmee de vermindering van de modelnauwkeurigheid wordt gemeten wanneer een specifiek kenmerk wordt verwijderd.
    4. Train een random forest-model met behulp van het randomForest-pakket in R:
      R. bibliotheek(randomForest)
      # Voorbeeld: het voorspellen van de groep (bijv. ASS vs. controle) met behulp van eiwitniveaus
      rf_model <- willekeurigBos (x = protein_data,
      y = als.factor(groep),
      importance = TRUE, # Vereist om de belangrijkheid van functies te berekenen
      ntree = 500) # Aantal bomen
    5. Extraheer metrische gegevens over de belangrijkheid van functies met behulp van de functie importance():
      R. importance_scores <- belang(rf_model)
    6. Haal de MeanDecreaseAccuracy-waarden op en sorteer ze in aflopende volgorde:
      R. mean_dec_acc <- importance_scores[ , "MeanDecreaseAccuracy"]
      importance_rank <- sorteren(mean_dec_acc, afnemend = WAAR)
    7. Visualiseer het belang van functies met behulp van de ingebouwde varImpPlot() functie:
      R. varImpPlot(rf_model, main = "Belang van kenmerken (gemiddelde afname in nauwkeurigheid)")
      OPMERKING: De metrische waarde MeanDecreaseAccuracy geeft aan hoe essentieel elke functie is voor de voorspellende prestaties van het model. Een grote afname van de nauwkeurigheid bij verwijdering duidt op een groot belang. Deze aanpak is vooral nuttig voor het ontdekken van biomarkers, omdat het helpt bij het prioriteren van eiwitten of genen met de sterkste onderscheidende kracht tussen groepen.
    8. Exporteer de belangrijkheidsscores voor rapportage of downstreamanalyse:
      R. importance_table <- gegevens.frame(
      Functie = namen(importance_rank),
      MeanDeclineAccuracy = importance_rank
      )
      write.csv(importance_table, "feature_importance.csv", rij.namen = ONWAAR)
    9. Rangschik de eiwitten op basis van hun MeanDecreaseAccuracy-scores.
    10. Selecteer de top 15 eiwitten met de hoogste MeanDecreaseAccuracy-scores als de belangrijkste kenmerken voor latere modellering.
    11. Exporteer de lijst van deze eiwitten voor verdere validatie.
      OPMERKING: Eiwitten met lage MeanDecreaseAccuracy-waarden kunnen een minimale invloed hebben op de modelprestaties als ze worden verwijderd.
    12. Benadruk de biologische relevantie van de geselecteerde eiwitten, met name die welke verband houden met immuunfuncties of -routes die betrokken zijn bij ASS.

8. Combineer de resultaten voor de uiteindelijke selectie van biomarkers.

OPMERKING: Zorg ervoor dat R is geïnstalleerd met de volgende pakketten: pROC, randomForest en ggplot2. Zorg ervoor dat de proteomics-dataset is voorverwerkt en genormaliseerd vóór analyse. Sla de lijsten met kandidaat-biomarkers en visualisatieplots op als afzonderlijke bestanden ter referentie.

  1. Integreer bevindingen.
    1. Vergelijk de resultaten van de ROC-analyse en willekeurige bosscreening om overlappende eiwitten te identificeren.
    2. Geef prioriteit aan eiwitten die in beide analyses voorkomen als zeer betrouwbare kandidaat-biomarkers.
    3. Voer aanvullende validatiestappen uit, zoals leave-one-out cross-validation (LOOCV), om de robuustheid van de geselecteerde biomarkers te bevestigen.
    4. Gebruik logistische regressiemodellen om de voorspellende nauwkeurigheid van de gecombineerde biomarkerset te evalueren.
    5. Maak ROC-curven en precisie-recall-plots voor de uiteindelijke set biomarkers met behulp van het ggplot2-pakket.
    6. Voeg statistieken toe zoals AUC en precisie-recall-waarden om het diagnostische potentieel van de geselecteerde biomarkers aan te tonen.

9. Selectie van bidirectionele kenmerken

  1. Bereid gegevens voor en definieer het model.
    1. Laad de dataset met eiwitexpressiewaarden en bijbehorende labels (bijv. ASS versus controle). Zorg ervoor dat de gegevensset is voorverwerkt en genormaliseerd.
    2. Definieer het initiële model: Gebruik een gegeneraliseerd lineair model (GLM) met een binomiale familie voor classificatie.
    3. Gebruik AIC als evaluatiemaatstaf om modellen te vergelijken tijdens de selectie van functies.
  2. Voorwaartse functieselectie uitvoeren.
    1. Begin met een leeg model dat alleen de onderscheppingsterm bevat.
    2. Voeg één functie tegelijk toe op basis van de grootste vermindering in AIC.
    3. Noteer de AIC-waarde na elke toevoeging. Stop wanneer er geen verdere vermindering van de AIC wordt waargenomen.
  3. Achterwaartse functieselectie uitvoeren.
    1. Train een model met behulp van alle beschikbare functies.
    2. Verwijder één functie tegelijk op basis van de kleinste toename in AIC.
    3. Noteer de AIC-waarde na elke verwijdering. Stop wanneer er geen verdere vermindering van de AIC wordt waargenomen.
    4. Combineer voorwaartse en achterwaartse stappen.
  4. Wissel af tussen voorwaartse en achterwaartse selectie.
    1. Voer één ronde uit om elementen vooruit te selecteren, onmiddellijk gevolgd door één ronde om ze achterwaarts te selecteren. Herhaal dit proces totdat er geen verdere verbeteringen in AIC worden waargenomen.
    2. Alternatieve benadering: Begin met achterwaartse functieselectie en voer vervolgens voorwaartse functieselectie uit. Evalueer het effect van het opnieuw toevoegen van eerder verwijderde elementen aan het model.
  5. Voltooi de geselecteerde functies.
    1. Exporteer de definitieve lijst met geselecteerde objecten en de bijbehorende coëfficiënten (aanvullende afbeelding S1).

10. Kruisvalidatie van bidirectionele kenmerkselectie met behulp van logistische regressie met leave-one-out-methode

NOTITIE: Zorg ervoor dat R is geïnstalleerd met de volgende pakketten: caret, pROC en ggplot2. De proteomics-dataset moet vóór analyse worden voorverwerkt en genormaliseerd. Sla de verwarringsmatrix, de ROC-curve en de modelsamenvatting op als afzonderlijke bestanden ter referentie.

  1. Bereid de gegevens voor en definieer het model.
    1. Laad de dataset met eiwitexpressiewaarden en bijbehorende labels (bijv. ASD versus controle) vanuit het GLMSTEP/bothFitModel.txt bestand. Zorg ervoor dat de gegevensset is voorverwerkt en genormaliseerd.
    2. Definieer het initiële model met behulp van een gegeneraliseerd lineair model (GLM) met een binomiale familie voor classificatie.
    3. Gebruik nauwkeurigheid en Kappa-coëfficiënt als evaluatiemetrieken om de modelprestaties tijdens kruisvalidatie te beoordelen.
  2. Voer leave-one-out kruisvalidatie uit.
    1. Initialiseer kruisvalidatie met behulp van het caret-pakket in R om leave-one-out cross-validatie (LOOCV) te implementeren.
    2. Pas het logistische regressiemodel aan met behulp van de acht geselecteerde functies.
    3. Noteer de nauwkeurigheid en Kappa-coëfficiënt voor elke iteratie van kruisvalidatie.
  3. Analyseer de resultaten van de kruisvalidatie.
    1. Resultaten samenvatten.
      OPMERKING: De resultaten van het LOOCV-proces zien er als volgt uit (zoals in deze studie): Gegeneraliseerd lineair model, 169 monsters, 8 voorspellers, 2 klassen: 'A', 'B', Herbemonstering: Leave-One-Out Cross-Validation, Samenvatting van steekproefgroottes: 168, 168, 168, 168, 168, ... , Resultaten van herbemonstering: Nauwkeurigheid Kappa 0,9526627 0,9024531.
    2. Interpreteer de metrische gegevens.
      OPMERKING: Hier behaalde het model een nauwkeurigheid van 0,9527 en een Kappa-coëfficiënt van 0,9025, wat wijst op een uitstekende overeenkomst tussen voorspelde en waargenomen resultaten.
      1. Kijk naar de Kappa-coëfficiënt om de voorspellende kracht van het model te meten. De Kappa-coëfficiënt varieert van -1 tot 1, waarbij 0 staat voor willekeurige voorspelling en 1 voor perfecte overeenstemming.
        OPMERKING: In deze studie weerspiegelt de Kappa-waarde van 0,9025 de sterke voorspellende kracht van het model.
  4. Evalueer de modelcoëfficiënten.
    1. Onderzoek de coëfficiënten van het logistische regressiemodel om de bijdrage van elk kenmerk te begrijpen. Evalueer de nulafwijking, de resterende afwijking en de AIC om de pasvorm van het model te bevestigen.
      OPMERKING: In deze studie kregen we bijvoorbeeld Nulafwijking: 2.2928e+02 op 168 vrijheidsgraden, Resterende afwijking: 2.2378e-07 op 160 vrijheidsgraden, AIC: 18, Aantal Fisher Score-iteraties: 25.
  5. Visualiseer de resultaten.
    1. Maak een verwarringsmatrix om de voorspellende prestaties van het model te visualiseren.
    2. Zet de Receiver Operating Characteristics (ROC)-curve uit om de classificatieprestaties van het model te evalueren.
    3. Interpreteer de resultaten s. Bereken de oppervlakte onder de curve (AUC) om de classificatieprestatie-index van het model te verkrijgen.
      OPMERKING: De ROC-curve toont de afweging tussen het percentage echt positieve en het percentage valse positieven. Het gebied onder de curve (AUC) moet dicht bij 1 liggen, wat wijst op uitstekende classificatieprestaties. De ROC-curve weerspiegelt de veranderingen in het percentage echte positieven en het percentage valse positieven van het model bij verschillende drempels. Hoe groter de AUC-waarde, hoe beter de prestaties van het model.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De studie omvatte 99 kinderen met ASS en 70 leeftijdsgematchte controles (3-7 jaar), met een evenwichtige geslachtsverdeling (aanvullende tabel S2). Serum werd verzameld na een nacht vasten met behulp van gestandaardiseerde protocollen: bloed werd in serumseparatorbuisjes gezogen, gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur laten stollen en vervolgens gedurende 10 minuten bij 4 °C gecentrifugeerd bij 1.500 × g . Het bovenstaande w...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het protocol dat in dit manuscript wordt beschreven, schetst een alomvattende benadering voor het identificeren van immuungerelateerde moleculaire biomarkers bij autismespectrumstoornis (ASS) met behulp van data-onafhankelijke acquisitie (DIA) massaspectrometrie en machine learning-technieken. De belangrijke stappen binnen het protocol zorgen voor betrouwbare en reproduceerbare resultaten, terwijl ook gebieden worden gemarkeerd waar wijzigingen of probleemoplossing nodig kunnen zijn (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

Dank aan alle leden van het centrale laboratorium en degenen die hebben geholpen met dit project.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagents en chemicaliënAcetonitrile (HPLC Grade)Fisher ScientificA18-50
Reagents en chemicaliënAmmoniumbicarbonaat (NH?HCO?)Sigma-Aldrich38939
Reagents en chemicaliënAmmoniumformiaatSigma-Aldrich90265
Reagents en chemicaliënBovine Serum Albumine (BSA)Thermo Fisher Scientific23212
Reagents en chemicaliënDithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815
Reagents en chemicaliënForminezuur (0,1%)Thermo Fisher Scientific28905
Reagents en chemicaliënIodoacetamid (IAA)Sigma-AldrichI1149
Reagents en chemicaliënMethanol (HPLC Grade)Fisher ScientificA452-4
Reagents en chemicaliënTrifluorazijnzuur (TFA)Sigma-AldrichT6508
Reagents en chemicaliënUreaSigma-AldrichU5378
Kits en gespecialiseerde reagentiaBCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23227
Kits en gespecialiseerde reagentiaC18 Sep-Pak CartridgesWatersWAT023590
Kits en gespecialiseerde reagentiaC18 StageTips (homemade)3M Empore™
Kits en gespecialiseerde reagentiaHigh-Abundance Protein Depletion KitMillipore Sigma122642
Kits en gespecialiseerde reagentiaiRT Standard PeptidesBiognosys AG
Kits en gespecialiseerde reagentiaLysozyme ELISA KitWuhan Fine Biotech Co. Ltd.
Kits en gespecialiseerde reagentiaTrypsin/LysC Enzyme MixPromegaV5071
ApparatuurCentrifugeEppendorf5430R
ApparatuurEasy-nLC 1200 SystemThermo Fisher Scientific
ApparatuurNanodrop One SpectrofotometerThermo Fisher ScientificND-ONE-W
ApparatuurQ Exactive HF-X Mass SpectrometerThermo Fisher Scientific
ApparatuurSpeedVac ConcentratorThermo Fisher ScientificSPD131DDA
ApparatuurSwinning-Bucket Rotor CentrifugeVarious
ApparatuurWaters XBridge BEH130 ColumnWatersC18, 3,5 μm, 2,1×150 mm
ApparatuurAgilent 1260 HPLC SystemAgilent1260 Infinity II
Software en online toolsBioconductor (R-pakketten)bioconductor.org
Software en online toolscaret (R-pakket)CRANcaret_6.0-93
Software en online toolsclusterProfiler (R-pakket)Bioconductor4.0.5
Software en online toolsDIA-NNDIA-NN softwarev1.8
Software en online toolsggplot2 (R-pakket)CRAN3.4.0
Software en online toolsMaxQuantMax Planck Institute1.6.17
Software en online toolsomickits.comOmiKits Cloud Platformhttp://www.omickits.com
Software en online toolspROC (R-pakket)CRAN1.18.0
Software en online toolsrandomForest (R-pakket)CRAN4.7-1.1
Software en online toolsSpectronaut Pulsar XBiognosys AG17
Software en online toolsUniProtKB Human Databaseuniprot.orgRelease 2019_10
Overige materialenLow-bind Microcentrifuge TubesEppendorf30120094
Overige materialenSerum Separator Tubes (SST)BD Biosciences367988
Overige materialen3M Empore™ C18 Disks3M

Referenties

  1. Ophir, Y., Rosenberg, H., Tikochinski, R., Dalyot, S., Lipshits-Braziler, Y. Screen time and autism spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. JAMA Netw Open. 6 (12), e2346775(2023).
  2. He, S., Zhou, F., Tian, G., Cui, Y., Yan, Y. Effect of anesthesia during pregnancy, delivery, and childhood on autism spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. J Autism Dev Disord. 54 (12), 4540-4554 (2024).
  3. Alkhonezan, S. M., Alkhonezan, M. M., Alshayea, Y., Bukhari, H., Almhizai, R. Factors influencing the lives of parents of children with autism spectrum disorder in saudi arabia: A comprehensive review. Cureus. 15 (11), e48325(2023).
  4. Larson, C., Thomas, H. R., Crutcher, J., Stevens, M. C., Eigsti, I. M. Language networks in autism spectrum disorder: A systematic review of connectivity-based fmri studies. Rev J Autism Dev Disord. 12 (1), 110-137 (2025).
  5. Kodak, T., Bergmann, S. Autism spectrum disorder: Characteristics, associated behaviors, and early intervention. Pediatr Clin North Am. 67 (3), 525-535 (2020).
  6. Zwaigenbaum, L., et al. Early intervention for children with autism spectrum disorder under 3 years of age: Recommendations for practice and research. Pediatrics. 136 (Suppl 1), S60-S81 (2015).
  7. Whitehouse, A. J. O., et al. Effect of preemptive intervention on developmental outcomes among infants showing early signs of autism: A randomized clinical trial of outcomes to diagnosis. JAMA Pediatr. 175 (11), e213298(2021).
  8. Ngounou Wetie, A. G., et al. A pilot proteomic analysis of salivary biomarkers in autism spectrum disorder. Autism Res. 8 (3), 338-350 (2015).
  9. Mota, F. S. B., et al. Potential protein markers in children with autistic spectrum disorder (asd) revealed by salivary proteomics. Int J Biol Macromol. 199, 243-251 (2022).
  10. Corbett, B. A., et al. A proteomic study of serum from children with autism showing differential expression of apolipoproteins and complement proteins. Mol Psychiatry. 12 (3), 292-306 (2007).
  11. Hu, E., et al. Data independent acquisition proteomics and machine learning reveals that proteins associated with immunity are potential molecular markers for early diagnosis of autism. Clin Chim Acta. 573, 120238(2025).
  12. Shen, L., et al. Biomarkers in autism spectrum disorders: Current progress. Clin Chim Acta. 502, 41-54 (2020).
  13. Yap, C. X., et al. Autism-related dietary preferences mediate autism-gut microbiome associations. Cell. 184 (24), 5916-5931.e17 (2021).
  14. Zhang, H., et al. The use of data independent acquisition based proteomic analysis and machine learning to reveal potential biomarkers for autism spectrum disorder. J Proteomics. 278, 104872(2023).
  15. Francis, K., et al. Brain-derived neurotrophic factor (bdnf) in children with asd and their parents: A 3-year follow-up. Acta Psychiatr Scand. 137 (5), 433-441 (2018).
  16. Bjorklund, G., et al. The impact of glutathione metabolism in autism spectrum disorder. Pharmacol Res. 166, 105437(2021).
  17. Bao, X. H., et al. Olink proteomics profiling platform reveals non-invasive inflammatory related protein biomarkers in autism spectrum disorder. Front Mol Neurosci. 16, 1185021(2023).
  18. Ngounou Wetie, A. G., et al. Comparative two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis of the salivary proteome of children with autism spectrum disorder. J Cell Mol Med. 19 (11), 2664-2678 (2015).
  19. Suganya, V., Geetha, A., Sujatha, S. Urine proteome analysis to evaluate protein biomarkers in children with autism. Clin Chim Acta. 450, 210-219 (2015).
  20. Shen, L., et al. Itraq-based proteomic analysis reveals protein profile in plasma from children with autism. Proteomics Clin Appl. 12 (3), e1700085(2018).
  21. Shen, L., et al. Proteomics study of peripheral blood mononuclear cells (pbmcs) in autistic children. Front Cell Neurosci. 13, 105(2019).
  22. Mesleh, A., et al. Blood proteomics analysis reveals potential biomarkers and convergent dysregulated pathways in autism spectrum disorder: A pilot study. Int J Mol Sci. 24 (8), 7443(2023).
  23. Yang, J., et al. Association between plasma proteome and childhood neurodevelopmental disorders: A two-sample mendelian randomization analysis. EBioMedicine. 78, 103948(2022).
  24. Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  25. Wu, Y., et al. Quantitative proteomics analysis of serum and urine with dia mass spectrometry reveals biomarkers for pediatric obstructive sleep apnea. Arch Bronconeumol. 61 (2), 67-75 (2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Immuunbiomarkersserumproteoomprote nebiomarkersdifferenti le prote ne expressiefunctionele verrijkinglogistische regressie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.