Methodenartikel

Leeftijdsafhankelijke dynamiek van voortbeweging in Caenorhabditis elegans: een Lyapunov-exponentanalyse

915 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68955

⸱

23 september 2025

 ,  ,  , 
1Physics and Astronomy Department, Vassar College

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie onderzoekt het effect van leeftijd op de voortbeweging in C. elegans door de grootste Lyapunov-exponent (LLE) te meten. Naarmate ze ouder worden, vertonen C. elegans een toename en daaropvolgende afname van de motorische controle. De resultaten laten een piek LLE zien na vijf dagen, gevolgd door een afname naarmate de wormen ouder worden.

Samenvatting

Deze studie onderzoekt de invloed van leeftijd op de mobiliteit van Caenorhabditis elegans (C. elegans) door gebruik te maken van dynamische optische diffractie (DOD) om de grootste Lyapunov-exponent (LLE) te schatten. De LLE, een belangrijke metriek in dynamische systemen, kwantificeert de snelheid van divergentie of convergentie van trajecten in de faseruimte, wat de voorspelbaarheid en chaos in de dynamiek van het systeem aangeeft, in dit geval het locomotiefgedrag van de worm. 632 nm laserlicht buigt af van de zwemmende worm in een waterkolom en vormt een diffractiepatroon. Een fotodiode detecteert het licht op een enkel punt binnen het diffractiepatroon en legt een eendimensionale tijdreeks vast terwijl de worm golft. Deze tijdreeks dient als een samengestelde weergave van de beweging van de hele worm en omvat de voortbewegingsdynamiek, aangezien één punt in het diffractiepatroon een superpositie is van alle punten op de worm. De tijdreeks wordt vervolgens ingebed in een hoger-dimensionale faseruimte om de LLE te berekenen. C. elegans leven meestal ongeveer 14 dagen, volgens een patroon van toenemende en afnemende motorische controle met de leeftijd. Om leeftijdsspecifieke effecten te isoleren, werden wormen om de twee dagen overgebracht naar verse agarplaten met E. coli , zodat ze op de juiste leeftijd waren (3 tot 12 dagen oud). Analyse van een cohort van 13 C. elegans onthulde dat de LLE vijf dagen na het uitkomen een piek bereikte, met een snelheid van 1,34 ± 0,03 1/s. Deze piek duidt op een kritiek punt in de ontwikkeling waar de voortbeweging van de wormen de hoogste complexiteit en chaotisch gedrag vertoont. De waargenomen LLE-waarden komen overeen met de Moore-vergelijking, een gerenommeerd model dat leeftijdsgerelateerde veranderingen in vrijwillige activiteit beschrijft, waarbij afnemende motorische controle en activiteitsniveaus worden gekoppeld aan toenemende leeftijd in C. elegans.

Inleiding

De voortbeweging van Caenorhabditis elegans (C. elegans), een microscopisch kleine worm, is bestudeerd om het begrip van de bedrading van motorneuronen te vergroten, omdat deze nematode neurologisch eenvoudig is, met slechts 302 neuronen1. C. elegans is een modelorganisme dat gemakkelijk te onderhouden is met een levensduur van slechts 14 dagen2. Slechts ongeveer 72 neuronen van 302 in C. elegans worden gebruikt voor voortbeweging en bevinden zich in het volwassen lichaam van de nematode1. De laagdimensionale beweging (d.w.z. van links naar rechts, vooruit en achteruit)3 van C. elegans maakt ze een gemakkelijk exemplaar van waaruit het bereik in LLE kan worden gevolgd. Het zenuwstelsel van nematoden wordt in ongelooflijke mate begrepen4.

Video-analyse heeft geholpen bij het kwantificeren van de voortbeweging van C. elegans door grootheden te meten zoals kromtestraal, golvingsfrequenties en golflengte5. Deze metingen hebben controlevariabelen vastgesteld die het mogelijk maken om locomotorische eigenschappen in verschillende omgevingen en onder verschillende omstandigheden te vergelijken 6,7. Deze informatie vormt een evoluerend model van de schakelingen die de voortbeweging van C. elegansaandrijven 8 en maakt het zelfs mogelijk om zowel virtuele als fysieke dynamische simulaties van wormen9 te maken.

Dynamic Optical Diffraction (DOD)10 is ook gebruikt om de voortbeweging van C. elegans te kwantificeren. Tijdens DOD buigt laserlicht met lage intensiteit rond de levende worm en vormt een far-field diffractiepatroon dat bekend staat als een Fraunhofer-diffractiepatroon. De intensiteitsverdeling in het levende patroon verandert naarmate de nematode beweegt. Eén punt in de diffractie is een superpositie van alle punten op de worm, zodat de tijdsafhankelijke intensiteit in het diffractiepatroon een eendimensionale tijdreeks vormt die informatie bevat over de locomotorische dynamica11. We richten ons op de leeftijdsafhankelijke grootste Lyapunov-exponent (LLE) van voortbeweging die we berekenen uit de experimentele eendimensionale tijdreeks. De LLE in verschillende ontwikkelingsstadia is vergelijkbaar met andere leeftijdsgerelateerde onderzoeken, wat aantoont dat de neurale circuits zich manifesteren in locomotorische patronen die kunnen worden gemeten met behulp van verschillende hulpmiddelen, zoals video-analyse of DOD5.

DOD biedt een tijdreeksgevoeligheid op meerdere schalen, aangezien het interferentiepatroon de voortbeweging kan oplossen tot een fractie van de gebruikte golflengte, terwijl het ook rekening houdt met grootschalige veranderingen in de plasticiteit (vorm) van de soort. Deze functie is vooral handig wanneer een systeem gevoelig is voor beginomstandigheden, zoals in chaotische systemen waar kleine veranderingen leiden tot exponentiële veranderingen in het traject, ook wel bekend als het vlindereffect12. Om deze reden is het van cruciaal belang om de tijdreeksen vast te leggen met een snelheid die het mogelijk maakt om kleine veranderingen vast te leggen, aangezien deze veranderingen kunnen resulteren in aanzienlijke verschuivingen naarmate het systeem evolueert. Een fotodiode (PD) kan de tijdreeksen sneller vastleggen dan veel dure hogesnelheidscamera's. De combinatie van de ruimtelijke gevoeligheid in het diffractiepatroon en een hoge gegevensaccumulatiesnelheid kan de essentie van een chaotisch systeem vastleggen13,14.

De LLE beschrijft de exponentiële divergentie van faseruimtebanen. De faseruimte bevat alle mogelijke toestanden van een systeem, beschreven door hun toestandsvariabelen (of coördinaten) en de bijbehorende afgeleiden (of momenta)15. Verschillende trajecten beschrijven de evolutie van het systeem voor verschillende beginvoorwaarden. In een chaotisch systeem zullen twee nabijgelegen trajecten in de loop van de tijd exponentieel uiteenlopen, en die divergentie wordt gekwantificeerd door een positieve LLE. In fysische systemen manifesteert deze divergentie zich als de voortplanting van onzekerheid in de beginvoorwaarden van het systeem, en ook als het onvermogen om de toestand van het systeem na enige tijd betrouwbaar te voorspellen, zoals gegeven door de LLE14.

In experimentele systemen zijn de toestandsvariabelen vaak onbekend; de topologie van de faseruimte kan echter worden gereconstrueerd uit slechts één gemeten variabele met behulp van Takens-inbeddingsstelling16 door de vertraagde versies ervan te construeren (equivalent aan tijdafgeleiden). Elke vertraagde versie wordt weergegeven op een as; Samen vormen de vertragingen een vertragingsplot, die topologisch identiek is aan een fasediagram als de tijdreeks oneindig lang is. Experimentele tijdreeksen zijn beperkt in lengte en kunnen daarom alleen geschatte LLE's weergeven die worden begrensd door experimentele onzekerheden.

De voortbeweging van C. elegans heeft een positieve LLE10, een indicator van chaos. Een jong organisme ondergaat locomotorische veranderingen op de leeftijd van17 jaar. Een grotere LLE duidt op een lagere voorspelbaarheid in vergelijking met een kleinere LLE. De LLE biedt een betrouwbare methode voor het kwantificeren van de voortbewegingspatronen van een organisme 10,13,14. De locomotorische kenmerken van nematoden zijn gerelateerd aan de neuronen in de nematoden18. Volgens Cohen et al.19 is de voortbeweging van nematoden afhankelijk van motorneuronen, wat suggereert dat de studie van de complexiteit in de voortbeweging van de nematode ook verband houdt met de neuronale circuits.

We kalibreren de LLE op basis van leeftijd om onzekerheden voor toekomstige studies te minimaliseren. Eerdere studies hadden het gemiddelde van de LLE in drie tot zes dagen oude nematoden13. Deze studie heeft de ouderdom van nematoden zorgvuldig gevolgd om een rigoureuze analyse van achteruitgang geassocieerd met veroudering mogelijk te maken. Daarnaast zijn veranderingen in voortbeweging onderzocht om andere biologische veranderingen in C. elegans18 te identificeren. De vergelijking van Moore houdt leeftijdsparameters bij die verband houden met voortbeweging20. Hier gebruiken we een aangepaste versie van de vergelijking van Moore die flexibiliteit mogelijk maakt in wanneer het locomotorische mechanisme op zijn plaats is om te worden geëvalueerd, geïntroduceerd als een temporele markering T:

figure-introduction-1, (1)

waarbij P(t) staat voor prestatie, t voor tijd, a en c voor schaalparameters, terwijl b en d de karakteristieke tijden zijn van respectievelijk de exponentiële groei en afname. Het is aangetoond dat de vergelijking van Moore de trajecten voorspelt van schijnbaar niet-gerelateerde grootheden, zoals snelheid en vrijwillige activiteit, naarmate organismen ouder worden. Soorten kunnen worden gekenmerkt door de vorm van de kromme zoals gespecificeerd door de vergelijking van Moore; dat wil zeggen dat sommige soorten eerder kunnen pieken dan andere21.

Protocol

1. C. elegans voorbereiding op data-acquisitie

  1. Doe 0.5 ml E. coli met OD600 in elke Nematode Growth Medium (NGM) agarplaat voor de nematoden om te eten. Wacht tot de E. coli op elk bord agar is opgedroogd.
  2. Koop een controleplaat van C. elegans bij een leverancier van biologische materialen om nieuwe platen van C. elegans te maken met het oog op leeftijdscontrole.
  3. Steriliseer een platina plectrum met behulp van een vlam van een bunsenbrander of gelijkwaardig. Gebruik een ontleedmicroscoop om 5-10 volwassen wildtype C. elegans te kiezen om in elke plaat te plaatsen.
  4. Laat de nematoden 4-5 uur eieren leggen voordat je de volwassen dieren van het bord plukt. Incubeer de resterende aaltjes en laat ze deze op de gewenste dag plukken.
  5. Vul op de dag van gegevensverzameling een kwartscuvet van optische kwaliteit van 4,5 ml met afmetingen 10 mm x 10 mm x 45 mm met gedestilleerd water op kamertemperatuur net onder de bovenkant van de cuvet om morsen te voorkomen wanneer een plastic bovenkant wordt toegevoegd. Pluk 2-3 nematoden en plaats ze voorzichtig in de cuvet. Zodra de nematoden in de cuvet zitten, legt u deze op zijn kant om de worm gemakkelijk uit te lijnen in de laserstraal. De C. elegans kan naar de bodem drijven, maar zal doorgaan met zwemmende golvingen zolang hij volledig is ondergedompeld in water5.

2. Gegevensverzameling

OPMERKING: De onderstaande procedure voor het registreren van de tijdreeksen moet elke dag rond hetzelfde tijdstip worden geïmplementeerd om onzekerheden in leeftijd te minimaliseren.

  1. Zet het experiment op dat in het vorige artikel22 is beschreven. Voer een kleine aanpassing uit door een periscoop met twee spiegels te bouwen en de cuvet op zijn kant tussen de twee spiegels te plaatsen om het later gemakkelijker te maken om de worm in de laserstraal te centreren. Plaats in plaats van de camera een PD in het diffractiepatroon (Figuur 1).
    1. Lijn de spiegels verticaal uit om de bovengenoemde periscoop te bouwen.
      OPMERKING: Dit is het enige laseruitlijningswerk dat moet worden voltooid.
  2. Zet de HeNe (Helium Neon) laser aan en laat deze opwarmen om een thermisch evenwicht te bereiken (~15 min).
  3. Start de digitale oscilloscoop om te beginnen met het verzamelen van gegevens. Stel de parameters van het tijdsinterval en de geheugenbuffer in op de digitale oscilloscoop. Stel het tijdsinterval in op 100 s en implementeer een geheugenbuffer van ten minste 100 kilosamples per seconde (kS).
  4. Stel de resolutie in op 1 kHz voor de data-acquisitiesnelheid en 12 bits om de amplitudes op te lossen, wat helpt om complexiteit op kleine schalen te onderscheiden23.
  5. Stel de oscilloscoop in om de intensiteitsoscillaties te centreren door de automatische AC-offset te gebruiken om de tijdreeks op nul volt te centreren.
  6. Pluk 2-3 nematoden en plaats ze voorzichtig in een cuvet gevuld met gedestilleerd water, zodat het gemakkelijker is om ten minste 1 worm in de laserstraal te vinden en te centreren. Schud de cuvet niet.
  7. Plaats de cuvet met 2-3 nematoden in de periscoop en centreer 1 nematode in de laserstraal.
    1. Wanneer de C. elegans gecentreerd is in de laserstraal, vormt zich een far-field diffractiepatroon op ongeveer 50 cm van de periscoop.
  8. Plaats de fotodiode in het farfield-diffractiepatroon wanneer een C. elegans de laserstraal doorkruist. Zorg ervoor dat de PD niet in het midden in het diffractiepatroon is geplaatst om verstrooid licht op te vangen in plaats van het centrale maximum (doorgelaten laserstraal).
  9. Verzamel ten minste 10 s aan gegevens om de LLE betrouwbaar te berekenen; d.w.z. er zijn minimaal 10.000 datapunten nodig om een stabiele LLE te berekenen.
    OPMERKING: Minder gegevenspunten resulteren in een LLE die kunstmatig fluctueert.
  10. Herhaal de bovenstaande gegevensverzameling voor elke dag 9-15 keer. Verzamel gegevens voor leeftijden 3-12 dagen op hetzelfde tijdstip van de dag.

3. Gegevensanalyse

OPMERKING: Voor de gegevensanalyse wordt de tijdreeks ingebed in de faseruimte met behulp van een vertragingsplot16 en wordt vervolgens de LLE geschat door de divergentie van de trajecten te berekenen.

  1. Kies secties in de tijdreeks waarin de nematode vrij in de laserstraal zwemt door de tijdreeks zorgvuldig te onderzoeken. Figuur 2A toont een levensvatbare tijdreeks met een continu signaal van ten minste 20 s.
  2. Screen de tijdreeks voor een lage signaal-ruisverhouding (Figuur 2B). Bepaal het geluidsniveau door een tijdreeks op te nemen zonder de worm in de cuvet. De kenmerken in de tijdreeks, niet alleen de amplitude, moeten meer dan twee keer het ruisniveau zijn.
  3. Sluit verzadigde gegevens uit van de relevante tijdreeksen (Figuur 2C). Als er te veel gegevens verzadigd zijn om bruikbare informatie te extraheren, ga dan terug naar het gedeelte Gegevensverzameling hierboven, herhaal de stappen 2.7.1 tot en met 2.9 en pas het intensiteitsniveau aan door de fotodiode weg te plaatsen van het centrale maximum.
  4. Bepaal de gemiddelde frequentie gegeven door
    figure-protocol-1(2)
    waarbij f de frequentie is en P het vermogensspectrum (Figuur 3). Dit kan computationeel worden gedaan met behulp van een Fast Fourier Transform (FFT) en vervolgens het gemiddelde van de frequenties. Veel rekenprogramma's hebben een ingebouwde functie om de gemiddelde frequentie van een dataset te berekenen.
  5. Reconstrueer de topologie van de faseruimte met behulp van een tijdvertragingsmethode. Kies een tijdreeks X en vertraag de tijdreeks met een tijdvertraging τ om de trajecten op te lossen (Figuur 4). De optimale tijdsvertraging wordt bepaald door het eerste lokale minimum te identificeren in de wederzijdse informatie (MI)24:
    figure-protocol-2(3)
    waarbij N het aantal punten is, Xi een punt in de tijdreeks X, terwijl Xi+τ een vertraagd punt in dezelfde tijdreeks is. p(Xi) is de kans dat punt Xi optreedt, en p(Xi+τ) is de kans dat Xi+τ optreedt. p(Xi, Xi+τ) is de gezamenlijke kans25 van zowel de tijdreeks Xi als de vertraagde tijdreeks Xi+τ die samenvalt.
  6. Identificeer het eerste minimum in de MI-grafiek tussen 0,140 en 0,240 s (140 en 240 datapunten), zoals weergegeven in figuur 5. Er is geen exact aantal voor de vertraging; Het primaire doel is om de fasetrajecten voldoende op te lossen om de divergentie te bepalen.
  7. Gebruik de tijdreeks Xi en de vertraagde versies door τ, zoals bepaald door het minimaliseren van de MI in de vorige stap.
  8. Bepaal de inbeddingsdimensie. De meest geschikte inbeddingsdimensie is de laagste dimensie waarvoor valse naaste buren (FNN) zich minimaal stabiliseren (Figuur 6)26. Gebruik de methode ontwikkeld door Abarbanel et al.27,28.
  9. Gebruik het Rosenstein-algoritme29 om het dynamische systeem in een faseruimte te reconstrueren en de divergentie van nabijgelegen trajecten in de tijd te volgen. Gebruik in het bijzonder de MATLAB-routine van Merve Kizilkaya, zoals gepost op het MATLAB-forum30, om de LLE te berekenen. Deze routine vereist de volgende invoer: de tijdreeks, de gemiddelde frequentie van de attractor, de vertraging τ, de gegevensacquisitiesnelheid voor de tijdreeksen en het interval om bij de divergentie te passen.
  10. Herhaal de bovenstaande procedure voor 9-15 datasets om de onzekerheid van de LLE-schattingen te verminderen. Neem het gemiddelde van de LLE's voor elke dag en pas vervolgens aan de curve van Moore (Figuur 7).

Resultaten

Terwijl we de LLE versus leeftijd meten, hebben we ook andere grootheden gemeten die vaak worden geassocieerd met complexe dynamische systemen, zoals de frequentie van de attractor, MI en FNN. We verzamelden gegevens over leeftijdsstudies van dag 3 tot 12. De wormen zijn te klein en onvolwassen voordat ze 3 dagen oud zijn om handmatig te hanteren. Na 12 dagen zijn de wormen oud en bewegen ze nauwelijks omdat hun neuronale circuits verslechteren en hun zenuwstelsel achteruitgaat31.

Het Rosenstein-algoritme selecteert een naburig punt met een interval van ten minste één gemiddelde periode voor elk punt op het ingebedde traject. Beginnend met de scheidingsvector tussen de twee punten op de twee aangrenzende trajecten (Figuur 8), volgt het algoritme de evolutie van de divergentie. De scheiding van de trajecten neemt aanvankelijk exponentieel toe als gevolg van de chaotische aard van het systeem32, en dan plateaut het omdat het traject wordt begrensd. Het uitzetten van de logaritme van de gemiddelde divergentie in de tijd volgt de scheiding van de trajecten (Figuur 8 en Figuur 9). De helling van de lineaire kleinste kwadraten die passen bij het eerste deel van de curve voordat deze afvlakt, resulteert in een betrouwbare schatting voor de LLE33 van het systeem. Merk op dat er onzekerheid is bij het kiezen van het assortiment voor de minst kwadraatvormige pasvorm en de pasvorm zelf. De gevoeligheid voor beginvoorwaarden zorgt ervoor dat het lineaire fit-gebied een oscillerend gedrag vertoont terwijl de divergentie op de attractor wordt gevolgd. De biologische variatie tussen wormen, die voor elke leeftijdsgroep werden gemiddeld, weegt zwaarder dan de variabiliteit in de lineaire LLE die geschikt is voor een enkele proef, zoals aangetoond in een eerdere publicatie10.

De tijdreeks (Figuur 2A) laat zien dat pieken en dalen samenvallen met de aspecten van de voortbeweging van de worm, zoals veranderingen in zwemfrequentie, vorm en oriëntatie. De tijdreeks is aperiodiek; De oscillaties in de tijdreeksen herhalen zich nooit, maar blijven begrensd in intensiteit. De frequentie is stabiel terwijl hij licht fluctueert, wat wijst op complexiteit en begrensdheid in frequentie. Figuur 10 toont een dalende trend in zwemfrequenties naarmate de worm ouder wordt, die op dag 12 uiteenvalt. De gemiddelde frequentie springt voor de meeste wormen na dag 12. Dit is waarschijnlijk een indicatie dat het neurale circuit kapot gaat. Daarentegen neemt de gemiddelde vertraging τ, zoals bepaald door het eerste minimum van het MI, toe naarmate de populatie ouder wordt, aangezien de cyclus langer wordt (Figuur 11).

In ons geval vertegenwoordigt de MI de statistische overlap tussen twee vertraagde tijdreeksen. Als het MI minimaal is, is er een minimale overlap tussen trajecten. Theoretisch overlappen chaotische trajecten elkaar nooit; In de praktijk zullen sommige punten elkaar echter overlappen binnen enige tolerantie24, met beperkte significante cijfers en enige experimentele ruis. We streven ernaar de kans op overlap te minimaliseren door de MI te minimaliseren. Het verschil tussen een geminimaliseerde MI en een aanzienlijk grotere MI wordt geïllustreerd in figuur 4.

De inbeddingsdimensie wordt bepaald door de valse naaste buren (FNN's). Het aantal FNN's wordt vlakker met 5% of minder FNN's rond inbeddingsdimensies 3 of 4. In figuur 6 heeft de ouderdom van de nematoden geen invloed op de inbeddingsmaat, behalve op dag 12, wanneer de worm bijna aan het einde van zijn levensduur is.

Het traject van de LLE volgt de Moore-curve (Figuur 7) met een piek na 5 dagen, wat aangeeft dat de meest onvoorspelbare (en mogelijk complexe) voortbeweging plaatsvindt wanneer de C. elegans pas volwassen zijn. In figuur 7 toont een grafiek van LLE's van dag 3 tot en met 12 een lineaire toename met een piek na 5 dagen, gevolgd door een afname na dag 5. De foutbalken in figuur 10 geven de standaarddeviatie van het gemiddelde 4,34 weer en weerspiegelen verschillende factoren, waaronder de diversiteit binnen biologische soorten en de LLE-schatting. De variatie tussen de wormen weegt meestal op tegen de onzekerheden in de LLE-aanpasroutine. De variabiliteit tussen dagen, zoals dag 5 en 7, overlapt elkaar niet, dus de gegevens zijn duidelijk te onderscheiden. De trend van LLE's met leeftijd komt nauw overeen met een Moore's vergelijking uit een eerdere studie18, die leeftijdseffecten op geheugen en voortbeweging in andere levende organismen beschrijft.

De LLE's in tabel 1 zijn consistent en vertonen een langzaam stijgende en vervolgens afnemende trend met de leeftijd. De waarden komen overeen met eerder gepubliceerde resultaten met behulp van DOD10 en video-analyse34,35.

figure-results-1
Figuur 1: Experimentele far-field diffractieopstelling (niet op schaal getekend). De stuurspiegels vormen een periscoop. De cuvet met de C. elegans wordt tussen de stuurspiegels geplaatst. De laserstraal wordt door de worm afgebogen en gaat via de tweede stuurspiegel naar de PD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Intensiteit tijdreeksen. De DOD-tijdreeks toont intensiteitsfluctuaties terwijl de nematode in de laserstraal beweegt met (A) een levensvatbare tijdreeks voor gegevensanalyse. (B) Deze tijdreeks geeft aan dat het interval tussen 11 en 30 s geen signaal vertoont; Het geeft alleen het ruisniveau van het systeem weer, aangezien de kortere constante amplitudes voornamelijk afkomstig zijn van verstrooid licht. (C) Deze tijdreeks bevat een paar voorbeelden van verzadigde gegevens. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt een significante piek in de grafiek die wordt afgesneden en afgevlakt bij de pieken en dalen. In dit voorbeeld worden de pieken afgevlakt als de intensiteit varieert van -100 tot 100 AU tussen 45 en 50 s. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Vermogensspectrum. Het vermogensspectrum geeft een maximum aan rond de 0,95 Hz. De frequenties zijn gespreid omdat de frequentie in de banen op de attractor verschuift en zich nooit precies herhaalt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Experimentele gegevens ingebed in 3D-lag-plots met twee verschillende vertragingen van dezelfde tijdreeks van een 9 dagen oude worm. Deze tijdreeks laat zien dat voortbeweging een begrensde attractor is die consistent is met de chaostheorie. (A) Het traject wordt bepaald met behulp van het eerste lokale minimum (MI ≈ 2.11), wat een vertraging oplevert van ongeveer 0.183 s (183 datapunten). De zichtbare trajectkruisingen zijn het resultaat van een projectie op een tweedimensionale ruimte. (B) Deze vertragingsgrafiek blijft onopgelost door een ongepaste vertraging van 0,002 s (2 datapunten, (MI > 7)) omdat de punten te dicht bij elkaar liggen om te kunnen worden onderscheiden en geen divergentie vertonen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: De exponentiële afname van de onderlinge informatie. Het eerste minimum in het MI bepaalt in dit specifieke geval de vertraging van de dataset op 0,161 s (161 datapunten) om het fasetraject op te lossen. Deze vertraging verschuift de tijdreekswaarde om de attractor in de faseruimte te reconstrueren. De vertraging hoeft alleen maar in de buurt van het eerste minimum te zijn, genoeg om de trajecten op te lossen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: De gemiddelde inbeddingsafmetingen op respectievelijk dag 3, 5, 9 en 12. Een vergrote weergave van de inbeddingsdimensie wordt gebruikt om het specifieke verschil tussen de inbeddingsdimensies van elke dag weer te geven. Alleen dag 12 laat een opmerkelijk verschil zien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Het gemiddelde van de geschatte LLE's tussen dag 3 en 12. De LLE piekt na 5 dagen. Gedurende maximaal 5 dagen vertonen nematoden een groeitraject dat consistent is met de overgang van onrijpheid naar volwassenheid. Na die 5 dagen ervaren nematoden een afname van de divergentie. De onzekerheden zijn maatstaven voor de standaarddeviatie van het gemiddelde, die wordt gedomineerd door variaties tussen wormen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-8
Figuur 8: Weergave van de divergentie in de chaostheorie. Een positieve LLE zal ervoor zorgen dat aanvankelijk nauwe trajecten in de loop van de tijd uiteenlopen. t is een tijdsinterval, d is de divergentie en x(t) is een punt in de faseruimte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-9
Figuur 9: Divergentie van fasetrajecten op logaritmische schaal. De geschatte LLE is de helling van de lineaire fit (1,08 1/s) in het stijgende gebied voordat deze afvlakt als gevolg van de begrensdheid van de attractor tussen 0,96 en 1,01 s. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-10
Figuur 10: De gemiddelde gemiddelde frequentie voor elke dag. Het gemiddelde van dag 12 duidt op een significante verandering in de neurologische signalen die de voortbeweging aandrijven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-11
Figuur 11: De gemiddelde vertraging voor elke dag. De MI leidt gemiddeld tot lagere vertragingen tussen dag 3 en 6, terwijl een hogere gemiddelde vertraging optreedt tussen dag 7 en 12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Leeftijd (dagen)Aantal datasetsLLE (1/s)Standaarddeviatie van het gemiddelde (1/s)
3111.140.02
4151.200.03
5131.340.03
6111.230.02
7101.160.03
8121.130.02
9121.070.02
1091.000.03
1190.960.03
1290.920.02

Tabel 1: Het aantal datasets en de gemiddelde LLE voor elke dag van het leeftijdsonderzoek. De LLE's komen overeen met eerdere gegevens die via DOD zijn verzameld en tonen het toenemende en vervolgens afnemende traject van de Moore's-curve uit figuur 7. Er werden 9-15 datasets verzameld voor elke dag aan gegevens. De datasets daalden naarmate de wormen ouder werden vanwege de aard van hun spierafbraak en neuronale achteruitgang, waardoor de voortbeweging verminderde

Discussie

We hebben de voortbeweging van C. elegans gecategoriseerd door de LLE over verschillende leeftijden te evalueren, ondersteund door parameters zoals zwemfrequentie, wederzijdse informatie (MI) en valse naaste buren (FNN) - die elk extra inzicht bieden in de dynamische eigenschappen van het systeem. De deterministische en niet-lineaire eigenschappen van dit systeem worden bestudeerd met behulp van surrogaatgegevensmethoden en herhalingsplots36.

Het gebruik van DOD om de effecten van veroudering op de voortbeweging te kwantificeren, is een aanvullende techniek voor traditionele microscopie. Het is geen vervanging voor het visueel inspecteren van de microscopisch kleine soorten; Het biedt een consistente en efficiënte manier om voortbeweging te kwantificeren die verder gaat dan traditionele technieken. Aangezien DOD video-analyse omzeilt, wordt een deel van de rekenlast inherent beheerd door de optische techniek, aangezien diffractie de intensiteitsverdeling rechtstreeks in de Fourier-ruimte in kaart brengt. De superpositie van het optische veld tijdens diffractie volgt de hele microscopische soort. Idealiter wordt de resolutie bepaald door de golflengte λ van het gebruikte licht, in dit geval 632 nm. Zelfs een verschuiving van een fractie van de golflengte zal resulteren in een verandering in de intensiteit. Om deze reden wordt de resolutie bepaald door het bereik en de resolutie van de fotodetector en het vermogen van de laser. Als de detector bijvoorbeeld een tijdreekssignaal detecteert dat fluctueert tussen twee spanningen, Vmin en Vmax, en de resolutie is n bits (zie Protocol stap 2.4), dan is de maximale resolutie λ/n, of in ons geval 632 nm/12. In theorie kan deze methode worden toegepast op elk lichaam dat van vorm verandert; DOD is echter bijzonder geschikt voor microscopisch kleine soorten, omdat goedkope lasers met de juiste golflengten direct beschikbaar en kosteneffectief zijn.

Om een duidelijk en consistent diffractiepatroon te garanderen, moet de worm zorgvuldig worden gevolgd en gecentreerd worden gehouden in de laserstraal terwijl deze zwemt. Als de worm niet goed uitgelijnd is, kan het signaal verslechteren of volledig verloren gaan. Om problemen met de verzadiging van fotodiodes te verminderen en stochastische ruis te verminderen, wordt een filter met neutrale dichtheid gebruikt om de laserintensiteit te dempen. Deze filtering helpt het dynamisch bereik van de fotodiode te behouden en voorkomt oververzadiging in de opgenomen tijdreeksen. Desalniettemin worden alle segmenten van de gegevens die een overmatige verzadiging of lage signaal-ruisverhoudingen vertonen, uitgesloten van de uiteindelijke analyse om de gegevenskwaliteit te behouden.

Een afwijking in de zwemfrequentie produceert een continu frequentiespectrum, een gevestigde vroege marker van chaos13. De omgekeerde relatie tussen de gemiddelde frequentie en MI suggereert dat ongeveer 1/8 van een cyclus het traject met voldoende nauwkeurigheid oplost om de LLE te schatten, vergelijkbaar met de resolutie die nodig is voor het analyseren van een sinusoïdale golfvorm.

Het lage percentage FNN's rond de inbeddingsdimensies 3 en 4 in figuur 6 impliceert lage geluidsniveaus in zowel de voortbeweging van C. elegans als het optische systeem. Bij wormen van 12 dagen oud neemt het percentage FNN's echter licht toe, maar blijft het ruim onder de 5%, niet noodzakelijkerwijs als gevolg van een toename van de werkelijke inbeddingsdimensie, maar waarschijnlijk als gevolg van verhoogde ruis in het bewegingssignaal, toegeschreven aan neurale degradatie in ouder wordende organismen34,37.

Veranderingen in de LLE tijdens de ontwikkeling laten zien dat de mate van chaos in de voortbeweging varieert met de leeftijd, en komt nauw overeen met de voorspellingen van de vergelijking van Moore. Een piek in de LLE vroeg in het leven komt overeen met kenmerken van R-geselecteerde soorten, zoals C. elegans, die snel neuromusculaire functionaliteit moeten ontwikkelen bij afwezigheid van ouderlijke zorg. Met name 70% van de neuronale verbindingen op lange afstand worden gevormd wanneer de worm slechts 20% van zijn volwassen grootte heeft37,38. Daarentegen vertonen K-geselecteerde soorten, zoals mensen, een langzamere neurologische ontwikkeling, ondersteund door ouderlijke investeringen, wat resulteert in vertraagde maar complexere motorische patronen. Deze verschillen worden weerspiegeld in de timing van piek-LLE tussen soorten.

De korte levenscyclus van C. elegans, ongeveer 14 dagen, met een snelle ontwikkeling gedurende de eerste twee dagen over vier larvale stadia2, maakt het bijzonder geschikt voor het bestuderen van piekcomplexiteit in voortbeweging. Terwijl eerdere studies zich hebben gericht op de achteruitgang van de neuronale structuur om leeftijdsgerelateerde veranderingen in voortbeweging te verklaren34,39, verbindt ons werk deze fysieke veranderingen met de onderliggende chaotische dynamiek van het systeem. De integratie van DOD met niet-lineaire dynamica maakt nauwkeurige kwantitatieve karakterisering mogelijk over meerdere lengteschalen, wat nieuwe inzichten biedt in de neuronale drijfveren van gedrag. De consistent positieve LLE in alle ontwikkelingsstadia ondersteunt sterk de aanwezigheid van chaotisch gedrag in het bewegingsapparaat.

Deze studie biedt een nieuw methodologisch kader voor het onderzoeken van leeftijdsgerelateerde gedragsveranderingen in C. elegans, waardoor het huidige begrip van de biologische en dynamische correlaten van motorische achteruitgang wordt uitgebreid. Het valideert verder het gebruik van de LLE als een gevoelige biomarker voor leeftijdsgebonden neurologische veranderingen en toont aan dat de LLE een betrouwbare kwantitatieve maat is voor de locomotorische dynamiek die wordt beïnvloed door veroudering.

DOD is een krachtige, niet-invasieve methode voor het kwantificeren van voortbeweging en chaos in microscopisch kleine organismen, die het best kan worden gezien als een aanvulling op video-analyse in plaats van een vervanging. In de huidige uitvoering vereist het experiment dat nematoden ten minste drie dagen oud zijn, omdat jongere wormen te klein zijn om betrouwbare diffractiesignalen te produceren. De eendimensionale tijdreeksen die uit een enkel punt in het diffractiepatroon worden geëxtraheerd, comprimeren noodzakelijkerwijs ruimtelijke informatie, die de gelokaliseerde dynamiek langs het lichaam van het organisme kan verdoezelen. Meerkanaalsbenaderingen helpen deze beperking aan te pakken door de consistentie van parameters in het diffractieveld te verifiëren, hoewel subtiele ruimtelijke heterogeniteiten nog steeds over het hoofd worden gezien. Een nauwkeurige schatting van de LLE hangt verder af van het verkrijgen van voldoende lange, ruisvrije tijdreeksen; praktische uitdagingen zoals wormbeweging uit de bundel of omgevingsfluctuaties kunnen de gegevenskwaliteit in gevaar brengen en het vertrouwen in LLE-waarden verminderen. Zoals bij alle experimentele methoden, introduceren meetruis en subjectieve beslissingen tijdens LLE-aanpassing extra onzekerheid, die voor afzonderlijke metingen doorgaans binnen ongeveer 15% blijft.

Toekomstig werk zal zich richten op het meten van de LLE onder verschillende experimentele omstandigheden, waardoor vergelijkingen tussen gemodelleerde en gemeten LLE's mogelijk worden. Dit zal de ontwikkeling van voorspellende neurologische modellen vergemakkelijken die ons begrip kunnen verdiepen van hoe complexe motorische controle in de loop van de tijd ontstaat en verslechtert. We zullen ook doorgaan met het onderzoeken van de consistentie van onze bevindingen door andere computationele methoden te onderzoeken, zoals het berekenen van het entropie-complexiteitsvlak om de deterministische aard van dit biologische systeem opnieuw te verifiëren40.

Openbaarmakingen

De auteur heeft niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken Vassar College en het Lucy Maynard Salmon Research Fund voor financiële steun. We danken ook Dr. Kathleen Susman, Dr. Juan Merlo en Dr. Susannah Zhang voor het verstrekken van hun inzicht en hulp tijdens alle stadia van dit onderzoek.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2 Front Surface Aluminum MirrorsThorlabsPF10-03-F01
632 nm HeNe LaserNewportLGX1Elke rode laser
Empty Petri DishCarolina971632Kunststof petrischalen waarin we de nematode growth agar in gieten
Escherichia coli K12, Living, Bacteriophage HostCarolina124500Gebruikt als voedselbron voor de C. elegans; OD600
Leica S9i MicroscopeLeica MicrosystemsLED2500Dissectiemicroscoop
LighterBic LightersElk type sterilisatietool gebruikt om de pick vóór en na het plukken van elke worm te steriliseren
MATLABMathWorksRosenstein-algoritme-routine op het MATLAB-forum gemaakt door Merve Kizilkaya
Nematode Growth AgarCarolina173520Voorbereide media fles, 135 mL
PhotodiodeThorlabsDET36A350-1100 nm Si-voorgeschakelde detector
Picoscope5204Pico TechnologyPP376PC-oscilloscoop www.picotech.com
Platinum PickGebruikt om C. elegans te scheppen; het is een kleine, handgemaakte pick met een glazen handgreep en een platinaschep
Quartz CuvetteStarna Cells21/G/5Gevuld met gedistilleerd water om C. elegans in te plaatsen

Referenties

  1. Zhen, M., Samuel, A. D. C. elegans locomotion: small circuits, complex functions. Curr Opin Neurobiol. 33, 117-126 (2015).
  2. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , http://www.wormbook.org (2015).
  3. Gjorgjieva, J., Biron, D., Haspel, G. Neurobiology of Caenorhabditis elegans locomotion: where do we stand. Bioscience. 64 (6), 476-486 (2014).
  4. Boyle, J. H. C. elegans locomotion: an integrated approach. , https://core.ac.uk/download/pdf/43059.pdf (2009).
  5. Pierce-Shimomura, J. T., et al. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20982-20987 (2008).
  6. Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans. J Exp Biol. 210 (13), 2383-2389 (2007).
  7. Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6 (8), e198(2008).
  8. Barbulescu, R., Mestre, G., Oliveira, A. L., Silveira, L. M. Learning the dynamics of realistic models of C. elegans nervous system with recurrent neural networks. Sci Rep. 13 (1), 467(2023).
  9. Sarma, G. P., et al. OpenWorm: overview and recent advances in integrative biological simulation of Caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 373 (1758), 20170382(2018).
  10. Zanetti, R. F., Canavan, K. L., Zhang, S. G., Magnes, J. Multichannel measurements of C. elegans largest Lyapunov exponents using optical diffraction. Appl Opt. 62 (29), 7812-7818 (2023).
  11. Magnes, J., et al. Live C. elegans diffraction at a single point. Open J Biophys. 8, 155-162 (2018).
  12. Lorenz, E. N. The predictability of hydrodynamic flow. Trans N Y Acad Sci Ser II. 25 (4), 409-432 (1963).
  13. Magnes, J., et al. Chaotic markers in dynamic diffraction. Appl Opt. 59 (22), 6642-6650 (2020).
  14. Strogatz, S. H. Nonlinear dynamics and chaos: with applications to physics, biology, chemistry, and engineering. , Westview Press. Boulder, CO. (2001).
  15. Nolte, D. D. Introduction to modern dynamics: chaos, networks, space and time. , Oxford University Press. Oxford. (2015).
  16. Takens, F. Detecting strange attractors in turbulence. , Springer. Berlin. (1981).
  17. Murakami, H., et al. Manipulation of serotonin signal suppresses early phase of behavioral aging in Caenorhabditis elegans. Neurobiol Aging. 29 (7), 1093-1100 (2008).
  18. Marck, A., et al. Age-related changes in locomotor performance reveal a similar pattern for Caenorhabditis elegans, Mus domesticus, Canis familiaris, Equus caballus, and Homo sapiens. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 72 (4), 455-463 (2017).
  19. Cohen, N., Sanders, T. Nematode locomotion: dissecting the neuronal-environmental loop. Curr Opin Neurobiol. 25, 99-106 (2014).
  20. Moore, D. H. A study of age group track and field records to relate age and running speed. Nature. 253 (5489), 264-265 (2020).
  21. Varier, S., Kaiser, M. Evolution and development of brain networks: from Caenorhabditis elegans to Homo sapiens. Network. 22 (1-4), 143-147 (2011).
  22. Magnes, J., Susman, K., Eells, R. Quantitative locomotion study of freely swimming micro-organisms using laser diffraction. J Vis Exp. (68), e4412(2012).
  23. Tzepos, D., Trader, O., Magnes, J. 16th Chaotic Modeling and Simulation International Conference, , https://link.springer.com/book/10.1007/978-3-031-60907-7 (2024).
  24. Fraser, A., Swinney, H. Independent coordinates for strange attractors from mutual information. Phys Rev A. 33, 1134-1140 (1986).
  25. Starmer, J. The StatQuest illustrated guide to machine learning!!!: triple bam. , StatQuest Publications. (2022).
  26. Kizilkaya, M. MATLAB routine. , https://www.mathworks.com/matlabcentral (2020).
  27. Abarbanel, H. D. I., Kennel, M. B. Local false nearest neighbors and dynamical dimensions from observed chaotic data. Phys Rev E. 47, 3057-3068 (1993).
  28. Kizilkaya, M. False nearest neighbor algorithm. , https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/37239-minimum-embedding-dimension (2020).
  29. Rosenstein, M. T., Collins, J. J., De Luca, C. J. A practical method for calculating largest Lyapunov exponents from small data sets. Physica D. 65 (1-2), 117-134 (1993).
  30. Kizilkaya, M. Largest Lyapunov exponent with Rosenstein's algorithm. , https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/38424-largest-lyapunov-exponent-with-rosenstein-s-algorithm (2020).
  31. Liu, J., et al. Functional aging in the nervous system contributes to age-dependent motor activity decline in C. elegans. Cell Metab. 18 (3), 392-402 (2013).
  32. Zhang, S. G., Singhvi, A., Susman, K. M., Hastings, H. M., Magnes, J. Dynamic markers for chaotic motion in C. elegans. Nonlinear Dyn Psychol Life Sci. 26 (1), 21-43 (2022).
  33. Giordano, N. J., Nakanishi, H. Computational physics. , Upper Saddle River, NJ. (2006).
  34. Olsen, A., Vantipalli, M. C., Lithgow, G. J. Using Caenorhabditis elegans as a model for aging and age-related diseases. Ann N Y Acad Sci. 1067 (1), 120-128 (2006).
  35. Ahamed, T., Costa, A. C., Stephens, G. J. Capturing the continuous complexity of behaviour in Caenorhabditis elegans. Nat Phys. 17 (2), 275-283 (2021).
  36. Zhang, S. G., Singhvi, A., Susman, K. M., Hastings, H. M., Magnes, J. Dynamic markers for chaotic motion in C. elegans. Nonlinear Dyn Psychol Life Sci. 26 (1), 21-43 (2022).
  37. Kennel, M., Brown, R., Abarbanel, H. Determining embedding dimension for phase-space reconstruction using a geometrical construction. Phys Rev A. 45, 3403-3411 (1992).
  38. Varier, S., Kaiser, M. Evolution and development of brain networks: from Caenorhabditis elegans to Homo sapiens. Network. 22 (1-4), 143-147 (2011).
  39. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419, 808-814 (2002).
  40. Rosso, O. A., Larrondo, H. A., Martin, M. T., Plastino, A., Fuentes, M. A. Distinguishing noise from chaos. Phys Rev Lett. 99 (15), 154102(2007).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Locomotiedynamiekdynamische optische diffractieleeftijdsafhankelijke locomotieneurale circuitanalysenematodesynchronisatiediffractiepatroonanalysefaseruimte inbeddingzwemfrequentie
Leeftijdsafhankelijke dynamiek van voortbeweging in Caenorhabditis elegans: een Lyapunov-exponentanalyse
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.