Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In-vivo en ex-vivo calciumbeeldvorming van een reukcircuitneuron in de larve van de Drosophila melanogaster met een derde instar

1.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68956

⸱

31 oktober 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Nevada, Reno, 2Integrative Neuroscience Program, University of Nevada, Reno, 3Molecular Biosciences Program, University of Nevada, Reno, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nevada, Reno

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren calciumbeeldvormingsprotocollen voor een Drosophila-larvale olfactorische neuron, met behulp van een topische weefsellijm voor immobilisatie. Deze methode verbetert de stabiliteit en maakt betrouwbare in- en ex-vivo-experimenten mogelijk. Aangepaste R-scripts analyseren calciumsignalen en bieden een efficiënt platform voor gedetailleerd neurofysiologisch onderzoek.

Samenvatting

Calciumbeeldvorming is cruciaal voor het bestuderen van neurale dynamiek en hersenfunctie. De huidige methoden voor het in beeld brengen van calcium in Drosophila-larven zijn echter een uitdaging vanwege bewegingsartefacten en gespecialiseerde apparatuurbehoeften. Hier presenteren we een praktische, goedkope methode voor het uitvoeren van zowel in vivo als ex vivo calciumbeeldvorming in Drosophila-larven van de derde inster, met behulp van een topische weefsellijm voor het immobiliseren van monsters. We bieden ook aangepaste R-scripts en een raamwerk voor gegevensanalyse, waardoor metingen van calciumveranderingen onder verschillende experimentele omstandigheden worden vergemakkelijkt. Met behulp van deze aanpak hebben we met succes calciumtransiënten geregistreerd in een paar larvale CZS-neuronen met minimale bewegingsartefacten, waardoor de reproduceerbaarheid in verschillende preparaten wordt aangetoond. De methode is compatibel met standaard confocale systemen met draaiende schijven en kan worden aangepast voor doe-het-zelf of commerciële twee-foton-opstellingen, waardoor het toegankelijk is voor laboratoria met verschillende middelen. Deze benadering kan de toegankelijkheid van calciumbeeldvormingsstudies met larven vergroten en kan worden aangepast om de effecten van zowel externe stimuli, zoals geuren, als interne stimuli, zoals neuromodulatoren, te onderzoeken.

Inleiding

Het begrijpen van de calciumdynamiek in neuronen is cruciaal voor het ontrafelen van de complexe mechanismen die ten grondslag liggen aan neurale signalering en hersenfunctie, aangezien calciumionen een cruciale rol spelen bij het moduleren van neuronale activiteit en het aansturen van cellulaire reacties op stimuli. Neuronale calciumdynamiek kan worden gevolgd via calciumbeeldvorming, die real-time inzicht biedt in calciumgemedieerde signalering in een breed scala aan organismen, waaronder de Drosophila-larve. De Drosophila-larve is in opkomst als een krachtig modelsysteem om de onderliggende circuitfunctie van gedrag te bestuderen. Het is een van de slechts drie organismen waarvoor een volledig synaptisch hersenconnectoom is gegenereerd1. De larve is vatbaar voor een reeks geavanceerde hulpmiddelen die beeldvorming en manipulatie van neuronen mogelijk maken, zowel op het niveau van de hele hersenen als op het niveau van één neuron, 2,3.

Het vermogen om de calciumdynamiek in Drosophila-larvale neuronen te meten via calciumbeeldvorming is cruciaal geweest voor het bevorderen van neurowetenschappelijk onderzoek4. Recente ontwikkelingen in calciumbeeldvorming hebben het mogelijk gemaakt om de calciumdynamiek te meten op het niveau van enkele synapsen in de larve5 tot multi-neuronale opnames in vrij bewegende larven6. Calciumbeeldvorming kan in vivo worden uitgevoerd, waarbij calciumgebeurtenissen worden vastgelegd onder natuurlijke fysiologische contexten van de hele larve 4,7,8,9, of ex vivo, waarbij calciumgebeurtenissen worden geregistreerd in ontlede larvale weefsels die onder gesimuleerde fysiologische omstandigheden worden bewaard10. Over het algemeen hebben onderzoekers verschillende iteraties van de calciumbeeldvormingsmethode in Drosophila-larven gebruikt om fundamentele mechanismen van neurale circuits, sensaties, leren en geheugen en gedrag bloot te leggen 8,11,12,13,14,15,16,17. Beeldvormingsonderzoeken naar larvale calcium zijn echter beperkt vanwege de behoefte aan gespecialiseerde apparatuur en problemen bij de interpretatie van gegevens als gevolg van bewegingsartefacten.

Hier introduceren we een kosteneffectieve en gemakkelijk te implementeren methodologie voor zowel in vivo als ex vivo calciumbeeldvorming in Drosophila melanogaster-larven van de derde inster. We brengen de calciumdynamiek in beeld in Keystone-LN, een remmend olfactorisch circuitneuron18,19, in hele larvale preparaten om in vivo calciumbeeldvorming te demonstreren, en in ontlede larvale hersenen om ex vivo calciumbeeldvorming te demonstreren. Hele larven en ontlede hersenen blijven ongeveer 10-15 minuten levensvatbaar en responsief onder onze beeldvormingsomstandigheden, waardoor meerdere stimulusproeven per monster kunnen worden verkregen. Om de uitdaging aan te gaan om hele larven of weefselmonsters te immobiliseren met behoud van de levensvatbaarheid van het weefsel en het verminderen van experimentele variabiliteit, hebben we het gebruik van GLUture, een biocompatibele cyanoacrylaat topische weefsellijm, geoptimaliseerd.

Vergeleken met traditionele methoden voor immobilisatie van larven, zoals het inbedden of pinnen van agarose, vermindert deze op lijm gebaseerde benadering bewegingsartefacten met behoud van de levensvatbaarheid van het weefsel20,21; In vergelijking met beeldvormingssystemen met twee fotonen verlaagt de opstelling van de draaiende schijf de instrumentatiekosten en verbetert het de toegankelijkheid voor laboratoria met beperkte middelen. Ten slotte beschrijven we eenvoudige beeldvormingsbenaderingen, gekoppeld aan op maat ontwikkelde R-scripts voor data-analyses. Onze aanpak kan de toegankelijkheid van calciumbeeldvormingsstudies met larven vergroten en kan worden aangepast om de effecten van zowel externe stimuli, zoals geuren, als interne stimuli, zoals neuromodulatoren, te onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Drosophila-larven van de derde instar voorbereiden op calciumbeeldvorming

  1. Houd vliegen op standaard vliegenvoer (zie materiaaltabel) bij 25 °C, met een relatieve vochtigheid (RV) van 50-60% en een licht/donkercyclus van 12 uur.
  2. Om rood fluorescerend eiwit (RFP) tot expressie te brengen voor neuronidentificatie en GCaMP6f (calciumindicator) in de neuron(en) van belang ('X'), kruist u maagdelijke vrouwtjes van de X-Gal4-lijn met mannetjes die UAS-GCaMP6f en UAS-tdTomato22 dragen.
    OPMERKING: Voor deze studie werd de Keystone-Gal4-lijn gebruikt om de expressie van tdTomato en GCaMP6f te stimuleren in een enkel paar remmende lokale neuronen (Keystone-LN's) in de larvale hersenen 18,19.
  3. Nadat mannelijke en vrouwelijke vliegen 48 uur lang hebben kunnen paren en eieren hebben gelegd, brengt u de volwassenen over naar een vers flesje.
  4. Extraheer de larven van de derde instar (ongeveer 120 uur na het leggen van de eieren) door ze op een 15% sucrose-oplossing te laten drijven. Gebruik een P1000 micropipet om de drijvende larven over te brengen in een glazen bekerglas van 1.000 ml.
  5. Was de larven 3-4x door het water in het bekerglas telkens te vervangen door 800 ml vers gedestilleerd water. Laat de larven 10 minuten rusten voordat u verder gaat met de rest van het protocol.

2. Uithongeringsprotocol voor Drosophila-larven van de derde instar (bij testen van uitgehongerde versus niet-uitgehongerde omstandigheden)

  1. Bereid twee voedingskamers voor door een klein vierkant laboratoriumdoekje in petrischaaltjes van 6 cm te plaatsen. Voeg voor niet-uitgehongerde omstandigheden 350 μL 0,2 M sucrose-oplossing toe; voeg voor uitgehongerde omstandigheden 350 μL gedestilleerd water toe.
  2. Breng een gelijk aantal gewassen larven over naar elke voederkamer. Laat de larven zich 2 uur bij kamertemperatuur voeden met sacharose (niet uitgehongerd) of gedestilleerd water (uitgehongerd).

3. In-vivo beeldvorming van calcium

OPMERKING: Alle experimenten met de weefsellijm moeten worden uitgevoerd volgens de standaard veiligheidspraktijken in het laboratorium. Persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), waaronder nitrilhandschoenen, een laboratoriumjas en een veiligheidsbril of een gelaatsscherm, zijn vereist; Katoenen handschoenen moeten worden vermeden vanwege exotherme reacties met cyanoacrylaat. Vermijd contact van de huid, ogen of slijmvliezen. In het geval van huidhechting, week het gebied in warm zeepsop en scheid het voorzichtig; In geval van blootstelling van de ogen, spoel ≥5 minuten met lauw water en zoek onmiddellijk medische hulp. De lijm moet uit de buurt van open vuur en hoge temperaturen worden gehouden, omdat uitgeharde lijm bij verbranding irriterende dampen kan afgeven. Bewaar lijm bij ≤30 °C, uit de buurt van vocht en direct zonlicht, in een goed afgesloten verpakking wanneer deze niet in gebruik is.

  1. Bereid de calciumbeeldvormingsbuffer voor met de volgende samenstelling: NaCl 110 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 1,2 mM, MgCl2 0,8 mM, D-glucose 10 mM en HEPES 10 mM. Bewaren bij 4 °C wanneer niet in gebruik.
    OPMERKING: De gemodificeerde zoutoplossing die 110 mM NaCl bevat, is een algemeen aanvaarde formulering voor dissectie en beeldvorming van het CZS en valt binnen het typische bereik dat wordt gebruikt in elektrofysiologie en beeldvormingsonderzoeken (≈108-128 mM NaCl)23,24,25,26.
  2. Maak op een microscoopafdekglas van 24 x 50 mm (1,5 mm dik) een putje met vaseline uit een spuit.
  3. Plaats een kleine druppel topische weefsellijm (60% 2-octyl en 40% n-butylcyanoacrylaat) in het midden van het dekglas. Verdeel de lijm gelijkmatig over een dunne, uniforme laag met behulp van een glazen staaf.
  4. Breng voorzichtig een enkele larve over op de lijm met behulp van een borstel of dunne draad. Druk de buikzijde van de larve voorzichtig op de lijm. Laat de lijm drogen en zorg ervoor dat de larve volledig geïmmobiliseerd is.
  5. Zodra de larve is geïmmobiliseerd, plaatst u het dekglas op de omgekeerde microscooptafel (Figuur 1A).

4. Ex-vivo beeldvorming van calcium

  1. Bereid de larvale dissectiebuffer voor met de volgende samenstelling: NaCl 110 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 0,3 mM, MgCl2 0,8 mM, D-glucose 10 mM en HEPES 10 mM. Bewaren bij 4 °C wanneer niet in gebruik.
  2. Ontleed de hersendissecties zoals beschreven door Ishimoto en Sano10. Breng kort met een borstel of dunne draad een enkele larve over op een petrischaaltje van 3,5 cm met siliconenelastomeer aan de onderkant.
  3. Plaats de larve onder een dissectiemicroscoop met de ventrale kant naar boven en lokaliseer de hersenen. Maak met een dissectieschaar een snede van ongeveer een derde van het voorste uiteinde van de larve. Maak nog een snede in de mondhaken. Behoud de hersenen tijdens het verwijderen van de lichaams- en mondhaken (aangepast van Janelia Flylight Protocol27).
  4. Identificeer de cluster van motorneuronbevattende zenuwen uit het ventrale koord. Trek met een tang de hersenen voorzichtig weg van de rest van de ontlede larve. Knip overtollig weefsel uit de hersenen.
    OPMERKING: Voorzichtig omgaan met overmatige kracht kan weefselbeschadiging veroorzaken omdat de hersenen kwetsbaar zijn.
  5. Bereid een microscoopafdekglas voor met de weefsellijm voor calciumbeeldvorming zoals beschreven in de stappen 3.2 tot 3.3.
  6. Zuig met een P10-micropipet de ontlede hersenen voorzichtig op met 5 μL dissectieoplossing uit de petrischaal. Verdrijf de hersenen langzaam op de lijm. Voordat de huidplak opdroogt, oriënteert u de hersenen in een positie met de dorsale kant naar boven (met de twee hersenlobben naar beneden en het dorsale ventrale koord naar boven).
  7. Breng met behulp van een P200-micropipet 100 μL van de calciumbeeldvormingsbuffer over de geïmmobiliseerde larvale hersenen op het dekglas.
  8. Plaats het dekglas met de hersenen op de omgekeerde microscoop, aangesloten op een confocale scannermodule met draaiende schijf en een CCD-camera voor calciumbeeldvorming (Figuur 1B).
    OPMERKING: Zorg er voor ex-vivo preparaten voor dat u de hersenen correct oriënteert terwijl de lijm nog nat is. Voor een optimale beeldkwaliteit plaatst u de hersenen zo dat de ROI het dichtst bij het microscoopdoel ligt en vermijdt u het aanbrengen van overtollige lijm in de buurt van de ROI.

5. Protocol voor beeldvorming

  1. Open de software voor calciumbeeldvorming met behulp van de confocale microscoop. Leg beelden vast met een 10x/1.4 NA-objectief met filterschakeling tussen GFP-laser (excitatie 488 nm, intensiteit 70%, emissie 525 nm/50 m, OD8) en RFP-laser (excitatie 561 nm, intensiteit 50%, emissie 610 nm/75 m, OD8). Stel de belichting in tussen 100 ms en 1.000 ms, de versterking op 50% van de overeenkomstige belichtingswaarde en een binningfactor van 2 tijdens het vastleggen van de foto.
  2. Stel de microscoop in op een vergroting van 10x en lokaliseer de hersenen onder helderveldverlichting.
  3. Identificeer het neuron van interesse door te zoeken naar het tdTomato-signaal met de RFP-laser (excitatie ingesteld op 561 nm).
    OPMERKING: Selecteer verzadiging en verklein gamma om de juiste belichtingswaarde in te stellen.
  4. Zodra het interessegebied (ROI) is geïdentificeerd, schakelt u over naar de GFP-laser (excitatie ingesteld op 488 nm) om GCaMP6f-signalen op te vangen. Zorg ervoor dat zowel tdTomato- als GCaMP-signalen colokaliseren voordat u stapelafbeeldingen van beide kanalen vastlegt.
    OPMERKING: Pas de beeldinstellingen aan voor tdTomato- en GCaMP6f-stackopnamen om de fluorescentie te maximaliseren.
  5. Leg twee afzonderlijke tijdreeksopnames van tdTomato- en GCaMP6f-signalen tegelijkertijd vast met een snelheid van 0,5 frames/s (voor een totaal van 2 minuten).
    OPMERKING: Het ontlede larvale brein blijft ongeveer 10 minuten levensvatbaar onder deze bufferomstandigheden; Na deze tijd zullen de signalen verslechteren.
  6. Zodra het voorbeeld klaar is om te imagen, legt u tegelijkertijd twee afzonderlijke tijdreeksopnames van tdTomato- en GCaMP6f-signalen vast met een snelheid van 0,5 frames/s (voor een totaal van 2 minuten).
    OPMERKING: Het ontlede larvale brein blijft ongeveer 10 minuten levensvatbaar onder deze bufferomstandigheden; Na deze tijd zullen de signalen verslechteren.
    OPMERKING: Tijdens het uitvoeren van kwantitatieve analyses raden we aan het laservermogen te verhogen en de belichtingsversterking van de detector naar behoefte aan te passen, met behoud van lineaire intensiteitsschaling.

6. Gegevensverwerking en -analyse

  1. Open en importeer de tdTomato- en GCaMP6f-signaalstapels in ImageJ (NIH)28.
  2. Om het juiste interessegebied (ROI) te identificeren, voegt u de tdTomato- en GCaMP6f-signalen samen om colokalisatie te bevestigen. Splits na verificatie de tdTomato- en GCaMP6f-kanalen.
  3. Selecteer in het hoofdmenu de optie Plug-ins | Nieuw en klik op Macro's om een nieuwe macro te starten. Importeer vervolgens de aangepaste ROI-gebaseerde macro's in ImageJ. Selecteer de GCaMP6f-stack en druk op Uitvoeren voor calciumanalyse.
  4. Verwerk de fluorescentiesignalen met behulp van een aangepaste ImageJ-macro (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging). De macro genereert eerst projecties met maximale intensiteit, voert bewegingscorrectie uit met behulp van de StackReg-plug-in (Rigid Registration-modus )29 en past bleekmiddelcorrectie toe.
  5. Er verschijnt een pop-up "Actie vereist" met het verzoek om handmatige ROI-selectie, waarmee gebruikers handmatig een brede ROI kunnen tekenen. Klik op OK om door te gaan met de analyse. Om bewegingscorrectie uit te voeren, moet u ervoor zorgen dat de rechthoekige doos de volledige ROI in alle frames dekt voor nauwkeurige bewegingscorrectie met behoud van de lokale ruimtelijke en ROI-vorm over de frames.
    OPMERKING: Opnames zijn geregistreerd in ImageJ met behulp van StackReg. Wanneer de beweging in het vlak groot was (cumulatieve XY-verplaatsing > 1 μM) of axiale Z-drift leidde tot verlies van focus, werd de registratie onbetrouwbaar of ging het monster volledig verloren uit het beeldvormingsvenster. Monsters die extreme drift of afnemende calciumsignalen vertoonden (>30%) werden dus automatisch gelabeld en uitgesloten van stroomafwaartse analyse om nauwkeurige metingen van neuronale activiteit te garanderen. Deze drempels komen overeen met algemeen toegepaste kwaliteitscontrolepraktijken in calciumbeeldvormingsonderzoeken 30,31,32,33. Uitsluiting zorgde er ook voor dat alleen stabiele opnames met betrouwbare stimulusgekoppelde calciumtransiënten werden gebruikt voor analyses.
  6. Voor de analyse worden fluorescentiesporen geëxtraheerd uit handmatig gedefinieerde circulaire ROI's, geleid door pixelautocorrelatie; deze ROI's omvatten het hele veld van de hoeksteenneuronen.
    1. Extraheer de ruwe fluorescentie-intensiteitsgegevens voor twee fluoroforen: GCaMP6f/GFP en tdTomato/RFP, met behulp van aangepaste macro's in ImageJ (v1.54p) (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging, zie Materiaaltabel).
    2. Pas een schuifvenster toe met een ROI van 20 x 20 pixels en een stapgrootte van 10 pixels over het gezichtsveld. Voor elke ROI berekent de macro: (1) de intensiteit over alle frames, (2) het verschil in basisfluctuatie (d.w.z. het verschil tussen de maximale en minimale intensiteitswaarden tijdens de eerste 10 frames) en (3) de maximale frame-tot-frame intensiteitsverandering (ΔF). ROI's die intensiteitsfluctuaties van minder dan 10 eenheden vertonen, worden geëlimineerd en alleen de scherpste ΔF-waarden worden geselecteerd voor verdere analyse.
    3. Normaliseer de fluorescentiesporen met behulp van de volgende methoden:
      1. Fmax- en Fmin-normalisatie: Bereken genormaliseerde Δ met behulp van de formule:
        figure-protocol-1
        Waarbij F de ruwe fluorescentie op elk tijdstip is, Fmin de minimale fluorescentie (basislijn) en Fmax de maximale fluorescentie tijdens de opname.
      2. ΔF/F 0-normalisatie: Voer bovendien ΔF/Fo-normalisatie uit, waarbij Fo (basislijn) wordt bepaald door de eerste 10 frames van elke opname, met behulp van de formule:
        figure-protocol-2
        Waarbij Ft de fluorescentie op tijdstip t is en F0 de basiswaarde is berekend op basis van de eerste 10 frames.
  7. Nadat u GCaMP6f-signalen hebt geëxtraheerd, klikt u met de linkermuisknop en selecteert u alles, knippen en plakken om alle waarden over te brengen naar een nieuw Excel-werkblad. Selecteer in de bovenste menubalk de optie Gegevens | Tekst naar kolommen. Er verschijnt een pop-up van de wizard "Tekst naar kolom". Selecteer in stap 1 de optie Gescheiden en klik vervolgens op Volgende. Selecteer in stap 2 onder Scheidingstekens de optie Tab en komma en klik vervolgens op Volgende. Selecteer in stap 3 de optie Voltooien.
    OPTIONEEL: Als u de genormaliseerde calciumsignalen wilt uitzetten, markeert u Fnorm_FminFmax en selecteert u Spreidingsdiagram.
  8. Zoek naar een .csv bestand dat wordt gegenereerd met: (1) ruwe fluorescentiewaarden F, (2) ΔF/Fo en (3) Fnorm (genormaliseerde fluorescentie-intensiteit). Organiseer de uiteindelijke gegevensset in vier kolommen: (1) tijd (frames), (2) steekproefconditie (uitgehongerd of gevoed), (3) repliceer-ID (individuele steekproef) en (4) genormaliseerde intensiteit (Fnorm-waarden geschaald van 0 tot 1).
  9. Voer ten slotte gegevensanalyse en visualisatie uit in R met behulp van aangepaste R-scripts (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging. zie Materiaaltabel).
    1. Importeer het aangepaste R-script in een nieuw R-project. Zorg ervoor dat de vereiste R-pakketten, waaronder ggplot2, dplyr en readr, zijn geïnstalleerd en bijgewerkt voordat de analyse wordt uitgevoerd.
    2. Begin vanaf regel 1 van het aangepaste R-script en druk continu op Uitvoeren om de calciumanalyse uit te voeren. Zorg er ook voor dat de uitvoer heatmaps bevat die de genormaliseerde calciumintensiteit illustreren voor de eerste 30 frames, 60 frames en alle frames van de tijdreeksopname, en boxplots om de mediaan van genormaliseerde intensiteiten weer te geven.
    3. Beoordeel de significantie van genormaliseerde calciumintensiteit met behulp van de Mann-Whitney U-test .

7. Verwijdering en ontsmetting van afvalstoffen

  1. Verwijder na experimenten grof vuil van gereedschappen en oppervlakken onder stromend water en desinfecteer vervolgens met 70% ethanol of 10% bleekmiddel, gevolgd door steriel water. Werk op een gedesinfecteerd oppervlak en was de handen na het uittrekken van de handschoen; Eet of drink niet in het labo.
  2. Plaats larvale weefsels en besmette wegwerpartikelen in biohazard zakken en autoclaaf voordat u ze weggooit.
  3. Gooi volledig uitgehard lijmafval weg bij het gewone afval; Niet-uitgeharde lijm en verontreinigde wegwerpartikelen moeten worden verzameld in een verzegelde, geëtiketteerde container voor gevaarlijk chemisch afval.
  4. Plaats alle scherpe voorwerpen (messen, naalden, gebroken glas) in een prikbestendige naaldencontainer.
  5. Verzamel ontvlambare oplosmiddelen (ethanol, aceton) in geëtiketteerde, brandbare afvalcontainers.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om onze benadering van calciumbeeldvorming voor larven te demonstreren, hebben we deze met succes toegepast op zowel in-vivo als ex-vivo preparaten van de Drosophila-larven (Figuur 2 en Figuur 3, Video 1, Video 2, Video 3 en Video 4). We maten de calciumdynamiek in Drosophila-larven die GCaMP6f en Td-Tomato tot expressie brengen in een enkel p...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier beschrijven we een benadering voor zowel in-vivo als ex-vivo calciumbeeldvorming in Drosophila melanogaster-larven van de derde instar. We hebben de calciumdynamiek in kaart gebracht in Keystone-LN, een remmend lokaal neuron in de Drosophila-larve . We hebben de calciumdynamiek van Keystone-LN gemeten in hele larvale preparaten (in vivo) en in ontlede preparaten van de larvale hersenen (ex vivo) (Figuur 1

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

We zijn Dr. Jeffrey Harper dankbaar, die de confocale microscoop van zijn lab voor deze experimenten ter beschikking heeft gesteld. We zijn dankbaar voor het geschenk van de vlieglijn: w; UAS-GCaMP6f/CyO, huilen; UAS-tdTomaat van Dr. Jung Hwan Kim. Dit werk werd ondersteund door fondsen van de National Science Foundation onder de toekenningsnummers 2341202 en 2129234. Figuur 1 is gemaakt met behulp van Biorender.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Fly Stocks & Onderhoud
Nutrifly vliegvoerGenesee Scientific66-112
UAS-GCaMP6f, tdTomatoGift van Dr. JH Kim 
w;;Keystone-Gal4 (GMR27F08-GAL4)BDSC49232
Reagentia voor hongerprotocol
6 cm Petri schotelGenesee Scientific32-106G
SucroseMillipore SigmaS0389-500G
Reagentia voor beeldvorming en dissectiebuffer
CalciumchlorideJ.T. Baker, Avantor SciencesJT1311-1CAS: 1311-01, 500g
D-(+)-GlucoseThermo Fisher ScientificA16828.36CAS: 50-99-7, 500g
HEPES-2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethaansulfonzuurJ.T. Baker, Avantor SciencesJT4018-1CAS: 4018-01, 100g
MagnesiumchlorideVWR97064-150CAS: 7786-30-3, 100g
KaliumchlorideThermo Fisher ScientificJ64189.36CAS: 7447-40-7, 500g
NatriumchlorideEMD Milipore SigmaEMD-SX0420-1CAS: 7647-14-5, 500g
Hulpmiddelen en Reagentia voor Dissectie
DissectiebufferSamenstelling vermeld in tekst
Olympus Petri schotels, 60 x 15mm GeventileerdGenesee Scientific32-105
Sylgard 184 Elastomer BasisElectron Microscopy Sciences24236-10A
Sylgard 184 Elastomer Basis UithardingsmiddelElectron Microscopy Sciences24236-10B
Pincet Stijl 5, EMSElectron Microscopy Sciences78320-5
Vannas Lenteschaart - 3mm SnijrandFine Science Tools15000-00
Beeldvorming en Montageapparatuur/Reagentia
Confocal Scanner moduleYokogawaCSU-W1Aangesloten op microscoop
Beeldvorming BufferSamenstelling vermeld in tekst
Omgekeerde MicroscoopLeica MicrosystemsDMi8 Aangesloten op een spinning disc confocale scanner module en een CCD-camera
Microscoop Dekglas, 24mm x 50mm, # 1.5 DikteGlobe Scientific Inc.1415-15
MWI Veterinary GLUTURE Topisch AdhesiefFisher ScientificNC0632797
Pure Petroleum JellyWalgreens912556
Links naar Openbaar Beschikbare Bronnen
BioRenderhttps://www.biorender.com/
ImageJNIH912556https://imagej.net/ij/
Janelia Flylight protocol videohttps://www.janelia.org/https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o
Mathew Lab Githubhttps://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging

Referenties

  1. Winding, M., et al. The connectome of an insect brain. Science. 379 (6636), eadd9330(2023).
  2. Eschbach, C., Zlatic, M. Useful road maps: studying Drosophila larva's central nervous system with the help of connectomics. Curr Opin Neurobiol. 65, 129-137 (2020).
  3. Aimon, S., Grunwald Kadow, I. C. Studying complex brain dynamics using Drosophila. J Neurogenet. 34 (1), 171-177 (2020).
  4. Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
  5. Fukumasu, K., Nose, A., Kohsaka, H. Extraction of bouton-like structures from neuropil calcium imaging data. Neural Netw. 156, 218-238 (2022).
  6. Yamaguchi, A., et al. Multi-neuronal recording in unrestrained animals with all acousto-optic random-access line-scanning two-photon microscopy. Front Neurosci. 17, 1135457(2023).
  7. Marescotti, M., Lagogiannis, K., Webb, B., Davies, R. W., Armstrong, J. D. Monitoring brain activity and behaviour in freely moving Drosophila larvae using bioluminescence. Sci Rep. 8 (1), 9246(2018).
  8. Si, G., et al. Structured odorant response patterns across a complete olfactory receptor neuron population. Neuron. 101 (5), 950-962.e7 (2019).
  9. Ji, H., Han, C. Larvaspa, a method for mounting Drosophila larva for long-term time-lapse imaging. J Vis Exp. (156), e60792(2020).
  10. Ishimoto, H., Sano, H. Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in Drosophila. J Vis Exp. (136), e57701(2018).
  11. Maier, G. L., Komarov, N., Meyenhofer, F., Kwon, J. Y., Sprecher, S. G. Taste sensing and sugar detection mechanisms in Drosophila larval primary taste center. Elife. 10, (2021).
  12. Carreira-Rosario, A., York, R. A., Choi, M., Doe, C. Q., Clandinin, T. R. Mechanosensory input during circuit formation shapes Drosophila motor behavior through patterned spontaneous network activity. Curr Biol. 31 (23), 5341-5349.e4 (2021).
  13. Yoon, Y., et al. System level analysis of motor-related neural activities in larval Drosophila. J Neurogenet. 33 (3), 179-189 (2019).
  14. Vaadia, R. D., et al. Characterization of proprioceptive system dynamics in behaving Drosophila larvae using high-speed volumetric microscopy. Curr Biol. 29 (6), 935-944.e4 (2019).
  15. Utashiro, N., Williams, C. R., Parrish, J. Z., Emoto, K. Prior activity of olfactory receptor neurons is required for proper sensory processing and behavior in Drosophila larvae. Sci Rep. 8 (1), 8580(2018).
  16. Gillespie, J. M., Hodge, J. J. CASK regulates CaMKII autophosphorylation in neuronal growth, calcium signaling, and learning. Front Mol Neurosci. 6, 27(2013).
  17. Francis, J., et al. Inhibitory circuit motifs in Drosophila larvae generate motor program diversity and variability. PLoS Biol. 23 (4), e3003094(2025).
  18. Berck, M. E., et al. The wiring diagram of a glomerular olfactory system. Elife. 5, (2016).
  19. Odell, S. R., et al. Internal state affects local neuron function in an early sensory processing center to shape olfactory behavior in Drosophila larvae. Sci Rep. 12 (1), 15767(2022).
  20. Worrell, J. W., Levine, R. B. Characterization of voltage-dependent Ca2+ currents in identified Drosophila motoneurons in situ. J Neurophysiol. 100 (2), 868-878 (2008).
  21. Marley, R., Baines, R. A. Dissection of third-instar Drosophila larvae for electrophysiological recording from neurons. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (9), (2011).
  22. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  23. Held, M., et al. Aminergic and peptidergic modulation of insulin-producing cells in Drosophila. Elife. 13, (2025).
  24. Kim, S. M., Wang, J. W. Calcium imaging of pheromone responses in the insect antennal lobe. Methods Mol Biol. 1068, 179-187 (2013).
  25. Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol [A]. 175 (2), 179-191 (1994).
  26. Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation. J Neurosci. 24 (10), 2496-2505 (2004).
  27. Larval Dissection. , Howard Hughes Medical Institute. https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o (2019).
  28. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: an open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  29. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  30. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  31. Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nat Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
  32. De Vries, S. E. J., et al. A large-scale standardized physiological survey reveals functional organization of the mouse visual cortex. Nat Neurosci. 23 (1), 138-151 (2020).
  33. Zhang, Y., et al. Imaging sensory transmission and neuronal plasticity in primary sensory neurons with a positively tuned voltage indicator. Nat Commun. 16 (1), 6396(2025).
  34. Root, C. M., Ko, K. I., Jafari, A., Wang, J. W. Presynaptic facilitation by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search. Cell. 145 (1), 133-144 (2011).
  35. Slankster, E., et al. Mechanism underlying starvation-dependent modulation of olfactory behavior in Drosophila larva. Sci Rep. 10 (1), 3119(2020).
  36. Lehnert, B. P., Baker, A. E., Gaudry, Q., Chiang, A. S., Wilson, R. I. Distinct roles of TRP channels in auditory transduction and amplification in Drosophila. Neuron. 77 (1), 115-128 (2013).
  37. Murthy, M., Turner, G. Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (2), 140-148 (2013).
  38. Giovannucci, A., et al. CaImAn: an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, (2019).
  39. Cao, G., et al. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154 (4), 904-913 (2013).
  40. Simpson, J. H., Looger, L. L. Functional imaging and optogenetics in Drosophila. Genetics. 208 (4), 1291-1309 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Drosophila-larvein vivo imagingex vivo imagingspinning disk confocale microscopiebewegingscorrectieGCaMP6f-fluorescentieweefselimmobilisatieROI-analyse
In-vivo en ex-vivo calciumbeeldvorming van een reukcircuitneuron in de larve van de Drosophila melanogaster met een derde instar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.