Ontwikkeling van resistente cellijnen voor experimentele procedures

Samenvatting

Geneesmiddelresistente cellijnen maken het mogelijk om inzicht te krijgen in behandelingsresistentiemechanismen en niet-klinische evaluatie van nieuwe verbindingen, hergebruikte geneesmiddelen en combinatietherapieën. Dit artikel introduceert een protocol voor het creëren van resistente cellijnen door oudercellijnen bloot te stellen aan stapsgewijze verhogingen van de concentratie van het doelgeneesmiddel.

Samenvatting

De ontwikkeling van geneesmiddelresistente cellijnen is essentieel voor het begrijpen van de mechanismen van geneesmiddelresistentie en het identificeren van strategieën om het falen van de behandeling bij kankertherapie te overwinnen. Resistentiemodellen maken preklinische evaluatie mogelijk van nieuwe verbindingen, hergebruikte geneesmiddelen en combinatietherapieën. Om resistente cellen te genereren, worden ouderlijke kankercellijnen gedurende enkele weken herhaaldelijk blootgesteld aan stapsgewijs toenemende concentraties van het doelgeneesmiddel. Cellen die in elk stadium overleven en zich vermenigvuldigen, worden geselecteerd, uitgebreid en blootgesteld aan hogere medicijndoses. De ontwikkeling van resistentie wordt bevestigd door de half-maximale remmende concentratie (IC₅₀) waarden tussen ouderlijke en resistente cellen te kwantificeren en te vergelijken met behulp van cellevensvatbaarheidstesten en niet-lineaire regressieanalyse. Significant verhoogde IC_50-waarden duiden op een succesvolle aanpassing aan de medicijndruk en de ontwikkeling van resistentie. Deze geneesmiddelresistente cellijnen zijn beschikbaar voor uitgebreide analyse, zoals microarray en single-cell sequencing, evenals verschillende in vitro of in vivo experimenten. Deze modellen bieden waardevolle hulpmiddelen voor het onderzoeken van mogelijke therapeutische strategieën om resistentie tegen geneesmiddelen te overwinnen.

Inleiding

Chemotherapie is de meest gebruikte behandelingsoptie voor lokale kankers die niet vatbaar zijn voor chirurgie of bestralingstherapie of uitgezaaide kankers. Moleculair gerichte geneesmiddelen en chemotherapie worden gebruikt als eerstelijnsbehandelingen voor veel maligniteiten, en hun werkzaamheid wordt algemeen erkend. Sommige vormen van kanker vertonen vanaf het begin van de behandeling resistentie tegen bepaalde geneesmiddelen, waardoor de behandeling niet effectief is. In meer voorkomende gevallen wordt een behandeling die aanvankelijk effectief was, echter ondoeltreffend vanwege de ontwikkeling van resistentie tegen geneesmiddelen, wat leidt tot de progressie van kanker.

Resistentie tegen geneesmiddelen wordt veroorzaakt door zowel genetische mutaties als epigenetische respons in kankercellen die de expressie induceren van genproducten die geneesmiddelen ontwijken of celgroei bevorderen ^1,2. Bovendien evolueert deze resistentie in veel gevallen naar resistentie tegen meerdere geneesmiddelen, waarbij de kankercel resistent wordt tegen meerdere geneesmiddelen ^3,4. Daarom zijn het identificeren van de mechanismen van resistentie tegen geneesmiddelen en het ontwikkelen van strategieën om deze te overwinnen uiterst belangrijk voor de vooruitgang van de behandeling van kanker.

Geneesmiddelresistente cellijnen zijn veelgebruikte modellen voor het bestuderen van de mechanismen van therapeutische resistentie en spelen een belangrijke rol in zowel in vitro als in vivo experimenten⁵. Deze modellen zijn essentiële hulpmiddelen voor het verkrijgen van een beter begrip van de werkingsroutes van geneesmiddelen, het identificeren van biomarkers die de therapeutische werkzaamheid beïnvloeden en het vinden van therapeutische strategieën om de vorming van resistentie tegen geneesmiddelen te remmen. Het basisproces van het creëren van een geneesmiddelresistente cellijn is het induceren van resistentie door een cellijn bloot te stellen aan toenemende niveaus van het doelgeneesmiddel ^3,6.

De gebruikte concentratie en de duur van de blootstelling aan het geneesmiddel zijn cruciale componenten van dit proces. Op elk concentratieniveau wordt de subset van cellen die overleven geamplificeerd en vervolgens op een repetitieve manier blootgesteld aan de volgende concentratie van het geneesmiddel. Uiteindelijk wordt een geneesmiddelresistente cellijn afgeleid met een verhoogde halfmaximale remmende concentratie (IC₅₀) voor het geneesmiddel in vergelijking met de ouderlijke cellijn. Dit rapport beschrijft de procedure voor het genereren van een paclitaxel-resistente cellijn (DU145-TxR) uit de menselijke prostaatkankercellijn DU145, waarbij een stapsgewijze methode wordt toegepast met intermitterende blootstelling aan geneesmiddelen.

Protocol

1. Testen van celcultuur en levensvatbaarheid van cellen

OPMERKING: Paclitaxel is een geneesmiddel tegen kanker en is cytotoxisch. Draag bij het hanteren ervan een jas, een veiligheidsbril en handschoenen en werk in een veiligheidskast om inademing in het lichaam te voorkomen. DMSO is niet sterk cytotoxisch, maar wanneer het in contact komt met huid of slijmvliezen, neemt de doorlaatbaarheid van opgeloste geneesmiddelen toe, dus draag een jas, veiligheidsbril en handschoenen bij het hanteren ervan.

1. Kweek DU-145-cellen in een celkweekschaaltje van 10 cm met behulp van volledig medium (RPMI-1640 + 1% penicilline-streptomycine [pen-streptokok] + 10% foetaal runderserum [FBS]) in een incubator van 37 °C bij 5% CO₂ tot 80% confluent.
2. Aspireer het kweekmedium, was met DPBS, voeg 0,05% trypsine toe en laat 5 minuten in de incubator staan.
3. Nadat u hebt geklopt en met microscopie hebt bevestigd dat de cellen van de plaat zijn losgemaakt en zweven, voegt u 1 ml volledig medium toe om de werking van trypsine te stoppen.
4. Tel het aantal cellen en zaai ze met een dichtheid van 1,0 × 10⁴/99 μL per putje in volledig medium in elk putje van een plaat met 96 putjes. Incubeer gedurende 2 uur zodat de cellen zich aan de bodem van de plaat kunnen hechten. De cellen moeten voor elke testgroep in drievoud of viervoud worden geplateerd.
5. Pas de paclitaxel en DMSO aan die aan elk putje moeten worden toegevoegd. Zorg ervoor dat de hoeveelheid DMSO die aan elke put wordt toegevoegd hetzelfde is en dat de uiteindelijke concentratie DMSO niet meer dan 1% is.
   1. Om dit uit te voeren en ons protocol te volgen, begint u met 10 mM paclitaxel in DMSO en voegt u 87,2 μL DMSO toe aan 12,8 μL van dit geneesmiddel in een tube om 100 μL paclitaxel te verkrijgen bij 1.280 μM.
   2. Breng 50 μl van deze oplossing over in een ander buisje en verdun het tot de helft van de sterkte met 50 μl DMSO (640 μM).
   3. Herhaal deze procedure om seriële verdunning uit te voeren en oplossingen van paclitaxel te bereiden in concentraties van 0 (alleen DMSO), 0,1, 0,5, 1, 2, 4, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 620 en 1.280 μM.
      OPMERKING: Paclitaxel verdund met DMSO moet ingevroren worden bewaard voor hergebruik in volgende experimenten (om vries-dooicycli te minimaliseren, bewaren in aliquots).
6. Verdun 1 μl van de eerder bereide paclitaxeloplossing met 9 μl volledig medium in een aparte buis en voeg hiervan 2 uur na het zaaien van de cellen 1 μl toe aan elk putje. De paclitaxelconcentraties in elke put zijn 0, 0,1, 0,5, 1, 2, 4, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 620 en 1.280 nM, waarbij elke put 100 μL medium bevat.
   OPMERKING: Controleer bij het instellen van de concentratie van geneesmiddelen die worden gebruikt in tests voor de levensvatbaarheid van cellen de IC_50-waarden die in eerdere artikelen zijn gepubliceerd en zorg ervoor dat de concentratie binnen het bereik³ valt. De DMSO-concentratie in elke put was 0,1% (minder dan 1% is wenselijk).
7. Incubeer gedurende 48 uur. Voeg 10 μL celproliferatiereagens WST-1 toe aan elk putje (100 μL kweekmedium) en incubeer nog eens 0,5 tot 4,0 uur.
   OPMERKING: De optimale incubatietijd is afhankelijk van de cellijn en de celdichtheid. In deze studie hebben we cellen ongeveer 1,5 uur gekweekt. Als de incubatietijd te kort of te lang is, zal de absorptie van elk putje in de volgende stap te laag of te hoog zijn. Als gevolg hiervan zal het niet mogelijk zijn om het verschil in levensvatbaarheid van cellen te bevestigen. Voor de eerste tests moet men dus verschillende incubatietijden testen om de juiste incubatietijd te bevestigen.
8. Meet de WST-1-absorptie met behulp van een microplaatlezer.
   OPMERKING: De doelabsorptie is 450 nm (420-480 nm wordt aanbevolen) en de achtergrondabsorptie is 650 nm (600 nm of hoger wordt aanbevolen).

2. Berekening van de levensvatbaarheid van de cellen en de waarde van de halfmaximale remmende concentratie (IC₅₀)

1. Bereken de levensvatbaarheid van de cel op basis van absorptie. Absorptie is (A450nm-A650nm).
   Levensvatbaarheid van de cel (%) = [(As-Ab)/(Ac-Ab)] × 100
   Zoals: monsterabsorptie (met geneesmiddelen behandelde cellen)
   Ab: blanco absorptie (alleen medium, geen cellen)
   Ac: controle-absorptie (onbehandelde cellen)
2. Vat de levensvatbaarheid van cellen samen die in het vorige gedeelte is berekend in een spreadsheetsoftware.
3. Bereken en registreer de IC₅₀ voor de oudercellen door middel van niet-lineaire regressieanalyse.
   OPMERKING: Het logistieke model met vier parameters (4PL) is vaak een geschikte berekeningsmethode. Er zijn online IC_{50-berekeningstools} beschikbaar⁷. Het 4PL-model mag echter niet worden gebruikt wanneer de werkzaamheid van de verbinding buiten het concentratiebereik ligt en de gegevens de onderste en bovenste asymptoten van de sigmoïde curve niet volledig kunnen weergeven.
   1. Om een dergelijke toename te voorkomen, meet u de levensvatbaarheid van de cellen op zoveel mogelijk concentratiepunten. Als een sigmoïde curve niet kan worden verkregen, gebruik dan een modus met twee of drie parameters met vaste minimum- en maximumwaarden⁷.
   2. Als u geen berekeningssoftware of statistische software gebruikt, inclusief die op het web, gebruikt u de volgende formule:
      IC₅₀=((50-C)(B-A) + A(D-C))/(D-C)
      A: De laagste waarde van de geneesmiddelconcentraties gemeten met een cellevensvatbaarheid van ≤50%
      B: De hoogste waarde van de geneesmiddelconcentraties gemeten met een cellevensvatbaarheid van >50%
      C: Levensvatbaarheid van cellen bij B
      D: Levensvatbaarheid van cellen bij A
      OPMERKING: Deze formule gaat ervan uit dat de grafiek tussen de twee punten die de IC_50-waarde inklemmen, een rechte lijn is.

3. Blootstelling aan geneesmiddelen

OPMERKING: Een overzicht van de procedures die in dit hoofdstuk worden beschreven, wordt weergegeven in figuur 1.

1. Zaad oudercellen op celkweekplaten (2,0 × 10⁶ cellen/schaaltje voor schaaltjes van 100 mm).
2. Voeg paclitaxel in een cellevensvatbaarheidsremmende concentratie van ~10-20% (IC_10-20, ~0,5 nM in dit geval) toe aan het medium en kweek gedurende 2 dagen in een incubator.
3. Vervang door paclitaxelvrij medium en incubeer gedurende enkele dagen.
4. Zodra cellen zijn gegroeid en voor 80% samenvloeien, gaat u ze naar een nieuwe celkweekplaat. Cryopreserveer de resterende cellen.
5. Voeg paclitaxel toe aan de doorgegeven cellen in een concentratie van ~1,5-2,0 keer de startconcentratie (0,75-1 nM). Incubeer gedurende 2 dagen in een broedmachine.
6. Vervang door paclitaxelvrij medium en incubeer gedurende enkele dagen.
7. Als de cellen op dezelfde manier groeien, herhaal dan de stappen 3.4-3.6 en verhoog de concentratie van de blootstelling aan paclitaxel stap voor stap.
   OPMERKING: De toename van de geneesmiddelconcentratie (1,5-2,0-voudig) kan vrij worden ingesteld door de experimentator en het experiment moet bij die concentratie worden herhaald. We raden aan om de cellen in te vriezen en te bewaren telkens wanneer de geneesmiddelconcentratie wordt verhoogd. Als de paclitaxelconcentratie verder blijft stijgen, kan de celproliferatie zich niet herstellen en kunnen de cellen afsterven. Ontdooi in dergelijke gevallen de cellen die zich vóór de dood in de concentratie hebben vermenigvuldigd, verminder de paclitaxeltoename tot 1,1-1,5-voudig (1,2-voudig wordt aanbevolen) en herhaal de cultuur.
8. Verhoog geleidelijk de weerstand van de cellijn tegen het geneesmiddel en bereken en registreer vervolgens de IC₅₀ met behulp van WST-1 en software zoals beschreven in sectie 2.
   OPMERKING: Als een toename van IC₅₀ van ten minste 3-5-voudig wordt waargenomen, kan worden vastgesteld dat de stam een geneesmiddelresistente cellijn is.

4. Behoud van resistentie tegen geneesmiddelen

1. Om het resistente fenotype van de geneesmiddelresistente cellijn te behouden, incubeert met een geneesmiddelconcentratie van IC_10-20.
   OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de IC₅₀ in een celoverlevingstest periodiek te meten, aangezien de resistentie tegen geneesmiddelen kan veranderen.

Resultaten

Met behulp van deze methode hebben we eerder 9 maanden met succes paclitaxel-resistente DU145-cellen (DU145-TxR) vastgesteld. De resultaten van de cellevensvatbaarheidstest toonden aan dat de IC_50-waarde van paclitaxel voor de DU145-moedercellijn 1,1 nM was, terwijl de IC_50-waarde voor DU145-TxR 149,6x hoger was dan die van de oudercellijn (IC₅₀: 164,6 nM) (Tabel 1 en Figuur 2). Dit resultaat geeft aan dat DU...

Discussie

De ontwikkeling van resistente kankercellijnen is een gevestigde methode voor het onderzoeken van geneesmiddeltoxiciteit en resistentiemechanismen, maar de eerste uitdaging waarmee onderzoekers worden geconfronteerd, is het selecteren van een geschikt model voor het tot expressie brengen van resistentie. Een veelgebruikte methode voor het creëren van geneesmiddelresistente cellijnen in vitro is om de cellijn bloot te stellen aan het doelgeneesmiddel, maar het is noodzakelijk om te overwe...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
10 mL Disposable serological pipette	Fisher scientific	13-678-11E
100 mm dish	Corning	353003
15 mL conical tube	Corning	352097
2.0 mL Cryogenic Vials	Corning	431386
96 well cell culture plate	Corning	353072
Cell counting chamber slide	Invitrogen	C10228
Cell Proliferation Reagent WST-1	Sigma	5015944001
Centrifuge 5702 R	eppendorf
countless II	Invitrogen		Cell counter
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	D4W2J
DU145	ATCC	HTB-81	Prostaatkanker cel lijn
EVOS FLc	Thermo Fisher Scientific		Digital Inverted Microscope
FBS	Gibco	A5670701
Paclitaxel	Selleck	S1150
Penicillin–streptomycin	Invitrogen	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-093
Synergy H1	BioTek		Microplate Reader
Trypan Blue solution 0.4%	Invitrogen	15250061