Hoogwaardige tomografische gegevensverzameling bereiken met behulp van de 200 kV transmissie-elektronenmicroscoop met dubbel condensorlenssysteem

Summary

Elektronentomografie maakt beeldvorming op bijna atomair niveau mogelijk van organellen, cellen en macromoleculen binnen weefsels in cryobiologische monsters. Het bereiken van zo'n resolutie vereist strikt gecontroleerde beeldvormingsomstandigheden. Hier beschrijven we, met een 200 kV transmissie-elektronenmicroscoop met een tweetraps condensorlenssysteem als voorbeeld, hoe je hoogwaardige elektronentomografiegegevens kunt verzamelen.

Abstract

Cryo-elektrontomografie (cryo-ET) is uitgegroeid tot een krachtige techniek om de structuren van cellulaire organellen en grote eiwitcomplexen in hun natuurlijke omgevingen te verduidelijken. In tegenstelling tot conventionele elektronenmicroscopie op kamertemperatuur minimaliseert cryo-ET stralingsgeïnduceerde en voorbereidingsgeïnduceerde schade aan interne structuren. Bovendien vermindert cryo-ET, in tegenstelling tot single-particle analysis (SPA), de noodzaak van herhaalde zuivering, waardoor de meest authentieke structurele informatie van de monsters behouden blijft. Om beeldvorming met hoge resolutie te bereiken, stelt cryo-ET ook strenge eisen aan de beeldvormingsomstandigheden van de TEM. Ondanks de voortdurende verbetering van de efficiëntie van cryo-ET data-acquisitie en de opkomst van talrijke softwareplatforms, zijn de meeste oplossingen propriëtair, leveranciersspecifiek en nauw gekoppeld aan bepaalde elektronenmicroscoopmodellen, wat leidt tot hoge implementatiekosten. In deze studie installeerden we de open-source software SerialEM op een 200 kV elektronenmicroscoop (Glacios 2 cryo-TEM) met een dubbel condensorlenssysteem en voerden we uitgebreide kalibraties uit om hoogwaardige tomografische gegevensverzameling mogelijk te maken. Met apoferritine als modelmonster beschrijven we de volledige workflow – van cryo-monstervoorbereiding tot geautomatiseerde cryo-ET-dataverzameling, gevolgd door tomogramreconstructie en sub-tomogramanalyse. Deze methode biedt een kosteneffectieve en toegankelijke oplossing voor cryo-ET dataverzameling, vooral voor laboratoria die Glacios-microscopen gebruiken zonder toegang tot propriëtaire software.

Introduction

Cryo-elektrontomografie (cryo-ET) is uitgegroeid tot een krachtige techniek om de natuurlijke structuren van macromoleculaire complexen en cellulaire organellen in situ te bestuderen. Een groot voordeel van cryo-ET ten opzichte van enkeldeeltjesanalyse (SPA) is het vermogen om de overmatige zuiveringsstappen te vermijden, waardoor de oorspronkelijke toestand van de doelbiomoleculen binnen hun biologische context behouden blijft. Op dit moment kan een breed spectrum aan monsters – waaronder gezuiverde organellen ^1,2,3,4, celmembraanplaten, macromoleculaire complexen⁵, virussen⁶, cellulaire lamellen⁷ en weefselsecties ^8,9,10 – worden onderzocht met cryo-ET. Gezien de diversiteit aan monstertypes en experimentele doelstellingen verschillen de strategieën voor gegevensverzameling aanzienlijk en moeten ze zorgvuldig worden afgestemd op zowel het monster als de specifieke instrumentconfiguratie.

Dataverzameling is een cruciale stap in de cryo-ET-workflow, aangezien zowel datakwaliteit als efficiëntie van de acquisitie direct invloed hebben op downstream verwerking en het algehele experimentele succes van het experiment. Om aan de veranderende experimentele eisen te voldoen, zijn er verschillende dataverzamelplatforms ontwikkeld. Tot de meest gebruikte behoren commerciële tomografie en de open-source software SerialEM 11,12,13. Tomografie biedt een zeer geïntegreerde en gebruiksvriendelijke interface met een lage leercurve, maar is minder flexibel en vereist een commerciële licentie. Daarentegen is SerialEM een gratis, open-source pakket dat zowel grafische gebruikersinterface (GUI)-gebaseerde als scriptgebaseerde workflows ondersteunt, wat meer flexibiliteit en uitbreidbaarheid biedt.

Tomografische gegevensverzameling uit cryo-lamellen brengt unieke uitdagingen met zich mee. Hoogwaardige lamellen zijn moeilijk te prepareren, en hun mechanische instabiliteit en hoge gevoeligheid voor elektronenbestraling bemoeilijken de gegevensverzameling verder. Om deze uitdagingen aan te pakken ontwikkelde Fabian Eisenstein de PACEtomo workflow¹⁴, een verbetering van SerialEM die beam-image shift introduceert om meerdere tomogrammen per kantelreeks te verkrijgen, waardoor de frequentie van scherpstelling en tracking aanpassingen wordt verminderd. Deze strategie maximaliseert de hoeveelheid bruikbare data van elk gedeelte terwijl onnodige elektronblootstelling wordt geminimaliseerd. Vergelijkbare functionaliteit is ook beschikbaar in de commerciële Tomography5-software.

Daarentegen is gegevensverzameling van cryo-gefixeerde organellen of membraanplaten over het algemeen eenvoudiger, omdat deze monsters meestal worden voorbereid op gatige koolstofroosters, wat voldoende ruimte biedt om te focussen en te volgen^15,16. In zulke gevallen bieden de ingebouwde cryo-ET acquisitieworkflows van SerialEM – direct toegankelijk via de GUI – een handige, scriptvrije optie, die vooral geschikt is voor beginners of kleinere laboratoria. Desalniettemin raden we vanuit efficiëntieoogpunt nog steeds strategieën op basis van beam image shift, waar mogelijk.

Gezien de hoge kosten van cryo-elektronenmicroscopen is het optimaliseren van dataverzamelingsstrategieën om het gebruik van het instrument te maximaliseren essentieel. Een 200 kV TEM uitgerust met een tweetraps condensorlenssysteem biedt iets lagere elektronpenetratie voor dikke monsters dan een 300 kV instrument, maar blijft volledig bruikbaar voor cryo-ET wanneer correct gekalibreerd. Het relatief smalle bereik van parallelle bundelcondities en vaste spotgrootte over vergrotingen maken het echter over het algemeen minder geschikt voor high-resolution cryo-ET, tenzij het systeem precies is geoptimaliseerd.

Onze elektronenmicroscopie-opstelling is uitgerust met een Falcon 4i directe elektronendetectiecamera, die aanzienlijke voordelen biedt in het tellen van één elektron en hogesnelheids continue beeldvorming. Om de prestaties van deze detector volledig te benutten, moet de TEM onder goed geoptimaliseerde beeldvormingsomstandigheden worden bediend. Voor TEM's met een tweetraps condensorsysteem is nauwkeurige kalibratie van de verlichtingscondities voor parallel licht een belangrijke factor om de beeldkwaliteit^{te verbeteren 17,18}. In moderne tweetraps condensatorsystemen moet het brandpunt van de condensorlens in de tweede trap samenvallen met het voorste brandpuntsvlak van de bovenste objectieflens om ervoor te zorgen dat het optische pad dat het monstervlak kruist parallel loopt. Nauwkeurig vastgestelde parallelle lichtomstandigheden zijn cruciaal om ervoor te zorgen dat de onderscherpte waarden en vergroting consistent blijven op lokale posities in de verzamelde beelden.

In deze studie richtten we ons op het opzetten van een hoogwaardige cryo-ET-workflow met apoferritine als modelmonster. Omdat het 200 kV transmissie-elektronenmicroscoopsysteem niet in licentie is voor de commerciële tomografiesoftware, hebben we in plaats daarvan het open-source SerialEM-platform geïnstalleerd en gekalibreerd. Door zorgvuldig de parallelle bundelparameters voor het tweetraps condensorlenssysteem van de microscoop te optimaliseren, realiseerden we geautomatiseerde tomografische gegevensverzameling via de SerialEM grafische interface – zonder de noodzaak van Python-scripts of complexe configuraties. Deze aanpak biedt een gebruiksvriendelijke en kosteneffectieve oplossing voor efficiënte cryo-ET dataverzameling op 200 kV-instrumenten zoals Glacios.

Protocol

1. Voorbereiding en laden van cryo-monsters

1. Om de Vitrobot voor te bereiden, zet je hem aan en stel je de temperatuur in op 10 °C. Stel de luchtvochtigheid in op 100%. Vervang het filterpapier.
2. Plaats een R1.2/1.3 koolstoffolie met een 300-mesh R1.2/1.3 kwantifoil Cu-rooster in het gloei-ontladingssysteem. Stel de gloei-ontladingscondities in op 15 mA gedurende 60 seconden met een vacuümdruk van 0,39 mBar, negatieve lading. Voer de gloei-ontlading uit om het roosteroppervlak te hydrofiliseren.
3. Stel de Vitrobot-parameters als volgt in: Blot tijd: 3 s, Wachttijd: 0 s, Blot kracht: 2, Temperatuur: 8 °C, Luchtvochtigheid: 90%.
4. Bereid vloeibare ethaan voor in een ethaanbeker omwikkeld met vloeibare stikstof door af te koelen met vloeibare stikstof.
5. Breng 3 μL apoferritinemonster aan op het gloei-ontladen rooster. Vitrificeer het monster onmiddellijk met vloeibare ethaan
6. Breng het monster van ethaan over naar een opslagdoos die voorgekoeld is in vloeibare stikstof. De cryo-monstervoorbereiding is nu voltooid.
   VOORZICHTIG: De volgende veiligheidsprotocollen moeten strikt worden gevolgd bij het omgaan met vloeibare stikstof en ethaan: Persoonlijke beschermingsmiddelen (bijv. cryogene handschoenen en veiligheidsbril) zijn vereist om bevriezing tijdens het gebruik te voorkomen; Voordat de ethaancondensatie plaatsvindt, zorg ervoor dat de ontvangsbeker vrij is van vloeibare stikstof om spetteringen door snel koken te voorkomen; na gebruik sluit je de hoofd- en drukregelkleppen van het ethaangassysteem stevig om lekkage te voorkomen; Residueel ethaan en vloeibare stikstof moeten na de monstervoorbereiding worden afgevoerd in de speciale ventilatieapparatuur in de voorbereidingsruimte.

2. Het bepalen van de parallelle lichtomstandigheden voor elektronenmicroscopie

1. Voordat je parallelle bundeluitlijning uitvoert, pas je eerst de volgende parameters van de scope aan: stage op eucentrische hoogte, objectieflens scherpgesteld, nP-bundelkanteling ppX/ppY, coma-vrije draaipunt X/Y, coma en stigma.
2. Met behulp van een kruisrooster bevestig je dat het monster op eucentrische hoogte en juiste focus staat bij een vergroting van SA 73.000× (zonder energiefilter) in Nano-probemodus.
3. Schakel over naar diffractiemodus (cameralengte: D750 mm) en plaats het 100 μm objectiefdiafragma (Figuur 1A, 1B).
4. Klik op het tabblad Aanpassen voor het objectiefdiafragma en gebruik de multifunctionele X- en Y-knoppen om het objectiefdiafragma uit het midden te bewegen, zodat de rand van het diafragma over de gouden diffractieringen ligt en gedeeltelijk de centrale plek afsluit (Figuur 1C).
5. Breng het achterste brandpuntsvlak van de objectieflens in beeld door de diffractiefocus aan te passen met de focusknop totdat de rand van het objectiefdiafragma zo scherp mogelijk is (Figuur 1D).
6. Pas de bundelintensiteit (C2-sterkte) aan totdat de breedte van de gouden diffractieringen tot een minimum is beperkt.
7. Centreer het objectiefopening. Verhoog de lengte van de diffractiecamera totdat alleen de centrale plek zichtbaar is (Figuur 1E).
8. Klik op het tabblad Diffractie in het Stigmator-paneel en gebruik de multifunctionele X- en Y-knoppen om de vorm van de centrale plek aan te passen terwijl je boven en onder het crossoverpunt ronddraait om de bundel rond te maken (Figuur 1F).
9. Pas de bundelintensiteit aan totdat de centrale plek geminimaliseerd is. Dit zal parallelle verlichtingsomstandigheden creëren. Aangezien de omstandigheden voor parallelle verlichting kunnen variëren met verschillende vlekgroottes, documenteer je de bijbehorende C2-instellingen voor elke veelgebruikte vlekgrootte om snelle configuratie tijdens toekomstige experimenten te vergemakkelijken.
   OPMERKING: De specifieke spotgrootte die wordt gebruikt tijdens de gegevensverzameling hangt af van de vergroting en de C2-diafragma-instelling; We moeten ervoor zorgen dat beeldvorming wordt uitgevoerd met de optimale dosering voor de camera.

3. Hoogwaardige elektronentomografiegegevensverzameling voor apoferritinemonsters

OPMERKING: Deze sectie beschrijft een gestandaardiseerde procedure voor high-throughput tomografische gegevensverzameling, geschikt voor zowel ervaren gebruikers als nieuwe onderzoekers.

1. Om het rooster te klemmen en het voorbereide cryomonster in de elektronenmicroscoop te laden, plaats je de O-ring in het uitlijngereedschap, met het voorbereide rooster in het midden van de O-ring. Gebruik de veerpen om de C-ring op de O-ring te klikken, waarbij het monster tussen hen vastzet.
2. Steek de Autogrid verticaal in de gleuf van de cassette, breng deze via de werkstation over naar de nanocup en laad hem vervolgens in de elektronenmicroscoop.
3. Om een volledige montage van het volledige raster vast te leggen met SerialEM, start je de SerialEM-software. Schakel de lage dosismodus in. Definieer de zoekmodus op 115× vergroting.
   OPMERKING: De zoekvergroting wordt meestal gebruikt om kaarten met grote gebieden te verkrijgen. Deze vergroting wordt zo laag mogelijk ingesteld om het mappingproces te versnellen, terwijl de nauwkeurigheid van het samenvoegen van het beeld behouden blijft.
4. Open het Navigator-bestand. Ga naar Navigator > Montaging & Grids > Volledige montage opstellen. Stel in het dialoogvenster Zoekmodus gebruiken; Sla afbeeldingen op in bin4-formaat. Klik op Start onder Montage Controls.
5. Om de zoek- en weergavevelden te kalibreren, zoek in de zoekmodus een zeer herkenbaar herkenningspunt (Figuur 2A). Klik op Voeg marker toe in de navigator. Klik op Ga naar Marker om naar de markerlocatie te gaan.
6. Schakel over naar de View (2600×) modus en zoek hetzelfde herkenningspunt. Klik op het herkenningspunt. Ga naar Navigator, klik op Shift to Marker om de velden uit te lijnen (Figuur 2B). Volgens de aanwijzingen in het dialoogvenster worden de bundelverschuivingen van beide vergrotingen toegewezen aan alle markeringen in de zoekkaart, en worden de verschuivingswaarden opgeslagen (Figuur 2C).
   OPMERKING: De beeldvergroting is doorgaans ingesteld op de laagste vergroting van het Geselecteerde Gebied (SA) om ervoor te zorgen dat zowel beeld als opname in dezelfde modus zijn, waardoor het centreren tijdens het wisselen van vergroting eenvoudiger wordt.
7. Om de weergave- en recordvelden te kalibreren (Figuur 3). In de View-modus vind je een zeer herkenbaar herkenningspunt. Schakel over naar de Record (120k×) modus. Gebruik de muis om het herkenningspunt te centreren in de Opnamemodus.
   OPMERKING: De instelling van de Record-vergroting hangt af van de geschatte resolutie van het doel (waarbij de resolutie twee keer zo groot is als de pixel) en de grootte van het monster.
8. Schakel terug naar de View-modus en maak een foto. Sleep het doelobject onder de vergroting naar het kruiskruis dat het midden van het gezichtsveld vertegenwoordigt met de rechtermuisknop.
9. Klik op Set naast Shift in het Defocus-gedeelte om de velden uit te lijnen.
10. Om het doel-vierkant te selecteren en een kaart met gemiddelde vergroting te maken, 5.1 in de volledige montage, klik je op Polygon toevoegen om het te leggen gebied te markeren. Na het afbakenen van een gebied klik je op Stop Toevoegen om de selectie af te ronden.
11. Herhaal stap 3.10 voor alle gewenste gebieden. Voor elke polygoon in de Navigator controleer je de opties Acquire (A) en New File bij Item.
12. Selecteer in het dialoogvenster dat verschijnt nadat je Nieuw Bestand bij Item hebt aangevinkt: Gemontagede afbeeldingen; Montage passen op polygon; Sluit het bestand wanneer het volgende nieuwe bestand geopend moet worden. Klik OK.
13. Selecteer in het nieuwe dialoogvenster het volgende: Move stage in plaats van shifting image; Gebruik View-parameters in de lage dosismodus. Sla de afbeelding op op de opgegeven locatie.
14. Om de kaart met gemiddelde vergroting vast te leggen, klik je in het Navigator-menu op Items verkopen. Controleer de volgende opties: Afbeelding of montage verwerven en opslaan; Maak een Navigator-kaart.
15. In de sectie Primaire Actie wilt u de Gebruik View-modus voor het vastleggen van afbeeldingen aanvinken. In het gedeelte Taken voor of na Primair controleer je Rough Eucentricity. Klik op GO om te beginnen met het vastleggen van de kaart met gemiddelde vergroting.
16. Om punten op de middelgrote vergrotingskaart te selecteren. Open de kaart met gemiddelde vergroting in de Navigator-interface. Klik op Punt toevoegen en linksklik op de Doelobjecten op de kaart.
17. Herhaal dit voor alle gewenste punten. Na het selecteren van alle punten klik je op Stop Toevoegen om de selectie af te ronden.
18. Voor apertuuruitlijning gebruik directe uitlijningen in de microscoopinterface om de nP-bundelkanteling ppX/ppY en het coma-vrije draaipunt X/Y aan te passen, waardoor het wobble van de bundelvlek in het gezichtsveld wordt geminimaliseerd.
19. Voer tune scope uit met een script uit de SerialEM scriptbibliotheek (https://serialemscripts.nexperion.net/script/47).
20. Om tomografiegegevens te verzamelen, zoek in de Navigator-interface de ROI en controleer Tilt Series. Selecteer in het dialoogvenster Afbeeldingen kaderen; Kies de locatie van de gegevensopslag.
21. Stel in het instellingenmenu een graadbereik in van -50° tot 50°. Stel de basisincrement in op 2,5°, starthoek op 0° en schakel het dosissymmetrisch schema in.
    OPMERKING: De instellingen voor de dosis per kanteling, kantelhoek en kantelstap volgen over het algemeen de onderstaande principes: De totale dosis wordt gehandhaafd op ongeveer 100 e⁻/Ų. Het kantelbereik wordt gekozen om ervoor te zorgen dat, zelfs bij de hoogste kantelhoek, het monster grotendeels vrij blijft en voldoende elektronenoverdracht en beeldvorming mogelijk maakt. Als het kantelbereik relatief groot is (bijvoorbeeld boven ±60°), kan de kantelstap worden ingesteld op 3°. Voor een kleiner kantelbereik (bijvoorbeeld rond ±50°) kan de kantelstap worden verlaagd tot 2,5° of 2° om ervoor te zorgen dat de totale dosis rond de 100 e⁻/Ų blijft. Dit is vooral belangrijk voor 200 kV-microscopen, waar stralingsschade sterker is dan bij 300 kV-microscopen, waardoor het essentieel is om een overdosis te vermijden.
22. In het gedeelte Bundelintensiteit of Belichtingscontrole, vink Bundelintensiteit behouden. Stel het defocusdoel in op -3 μm en stel de autofocusfrequentie in op één keer per kanteling.
23. Zet Stop aan als Autoalign meer dan 60% van de beeldgrootte verschuift, stel Volgen Voor en Na in.
24. Om te beginnen met het verzamelen van gegevens, klik je in Navigator op Acquire at Items. Vink in primaire actie Cycle defocus target aan in autofocus, drift wait & TS.
25. Stel het defocusbereik in van -3,5 tot -4,5 μm, in 4 stappen. Onder Algemeen schakel je kolomkleppen sluiten aan het uiteinde in. In de sectie Taken vóór of na Primair schakel je Realign to item en Fine Eucentricity vóór Primair in.

4. Subtomogramgemiddelde van apoferritine

1. Voer bewegingscorrectie en CTF-schatting uit met Warp¹⁹. Voer tomografische kantelserie-uitlijning uit met behulp van AreTomo3²⁰.
2. Voer tomografische reconstructie en deconvolutie uit met Warp. Voer sjabloongebaseerde deeltjespluk uit met PyTom²¹.
3. Voer de eerste verfijning uit met RELION 5²². Voer hoogresolutie-verfijning uit met M²³.
4. Bepaal de uiteindelijke structuur door acht kantelseries te verwerken, gevolgd door de selectie van 5.939 deeltjes en iteratief verfijnen, waarbij een uiteindelijke resolutie van 2,8 Å wordt bereikt (Figuur 4).

Results

Na precieze parallelle bundeluitlijning hebben we tomografiegegevens voor apoferritine verzameld met behulp van de grafische interfacefunctie van SerialEM. Vervolgverwerking met Warp, AreTomo, PyTom, RELION en andere relevante software leverde een uiteindelijke structuur op bij een resolutie van 2,8 Å. Deze resolutie toont voldoende de hoge kwaliteit van onze data aan, die een niveau bereikt dat momenteel haalbaar is door subtomogramgemiddelden bij relatief hoge resolutie. Zoals weergegeven in Figuur 4, tonen de uitgelijnde en gereconstrueerde resultaten (Figuur 4A) duidelijk de algehele architectuur en ruimtelijke verdeling van apoferritine. Subtomogram-gemiddelde werd uitgevoerd op deeltjes die werden geëxtraheerd uit acht uitgelijnde en gereconstrueerde kantelseries, wat resulteerde in een structuur met een resolutie van 2,8 Å (Figuur 4B). De overeenkomstige Fourier-schilkorrelatie (FSC) kromme wordt weergegeven in Figuur 4C.

Figuur 1: Bepaling van parallelle verlichtingsconditie met behulp van het tweede condensorlenssysteem. (A) Diffractiepatroon in diffractiemodus zonder apertuur. (B) Diffractiepatroon na het plaatsen van een objectief van 100 μm. (C) Apertuurverschuiving ten opzichte van het diffractiecentrum om de scherpte van de randen beter te visualiseren. (D) Gefocuste diafragma-rand en geoptimaliseerde diffractieringen door het aanpassen van objectief- en C2-lensstromen. (E) Elliptische centrale diffractievlek die correctie nodig heeft via het stigmatorpaneel. (F) Circulaire en geminimaliseerde centrale diffractievlek die geoptimaliseerde parallelle verlichting aangeeft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Uitlijningsproces van hoge naar lage vergroting van Zoeken (115×) naar Weergave (2600×). (A) Zoekmodusafbeelding met de marker (rode pijl) aan de rand van het gat. (B) Bekijk de afbeelding in de modus met de marker (rode pijl) op dezelfde objectlocatie als in (A). De optie Shift to Marker wordt aangeklikt in de navigator. (C) In het pop-up venster worden de bundelverschuivingen van beide vergrotingen toegewezen aan alle markeringen in de Zoekkaart, en worden de shiftwaarden opgeslagen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Uitlijningsproces van hoge naar lage vergroting van Weergave (2600×) naar Opname (120k×). (A) In de opnamemodus wordt het doelobject in het midden van het gezichtsveld geplaatst (rood gestippelde cirkel markeert het doelobject). (B) Afbeelding vastgelegd in View-modus, waarbij het doelobject niet uitgelijnd is met het rode kruis (rode gestippelde cirkel benadrukt het doelobject en het rode kruis). (C) Het doelobject wordt naar het midden van het rode kruiskruis gesleept door met de rechtermuisknop te klikken en te bewegen, gevolgd door het indrukken van de Set-knop naast de Shift-knop (rood gestipt vakje benadrukt de knop). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Structuurbepaling van apoferritine. (A) Structurele beeldvorming. Lokale resolutiekaart van het uiteindelijke subtomogramgemiddelde. De textuur lijkt uniform, met nauw gerangschikte, herhalende nanoschaalkenmerken over het hele gezichtsveld. (B) Ruimtelijk opgeloste kwantitatieve mapping. Een vals-kleur, cirkelvormige kaart van hetzelfde of een verwante nanogestructureerde regio. De kleuren variëren van blauw/groen tot geel/rood, overeenkomend met de numerieke waarden die op de onderstaande kleurschaal worden weergegeven (ongeveer 2,5 tot 3,5 in willekeurige eenheden). De heterogene kleurverdeling geeft ruimtelijke variatie aan in een gemeten eigenschap (bijvoorbeeld hoogte, dikte, brekingsindex of mechanische/optische respons) over het monster. (C) Globale spectrale of functionele karakterisering. Fourier-schil correlatiecurve (FSC) gebruikt voor resolutieschatting. De uiteindelijke resolutie van 2,8 Å wordt aangegeven door de stippellijn bij FSC = 0,143. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De procedures voor cryo-monstervoorbereiding en elektrontomografie-gegevensverzameling moeten worden aangepast aan het specifieke type specimen. De hier beschreven experimentele strategie is zeer geschikt voor biologische macromoleculen, eiwitcomplexen en kleine organellen. Deze monsters kunnen direct worden gevitrificeerd op EM-roosters, en hun relatief kleine dikte zorgt voor efficiënte elektronenoverdracht en het verkrijgen van hoogcontrastbeelden. Idealiter mag de dikte van het monster niet meer dan 200 nm bedragen.

Voor diepvriesmonsters wordt een laterale dimensie van minder dan 10 μm over het algemeen verkozen om kristallijne ijsvorming te minimaliseren, wat de structurele integriteit kan aantasten. Voor grotere monsters kan hogedrukbevriezing of het toevoegen van cryoprotectanten, zoals glycerol, in de buffer de ijsnucleatie²³ uitstellen. Om echter aan de dikte-eisen voor TEM te voldoen, is verdere verdunning vaak noodzakelijk. Onder de beschikbare verdunningsmethoden is gefocuste ionenbundel (FIB) freesen²⁴het meest toegepast vanwege de precisie en minimale schade, waardoor lamellen geschikt zijn voor high-resolution cryo-ET.

Tijdens het verzamelen van lamellagegevens is het cruciaal om het gebruik van lamella te maximaliseren. De implementatie van beam-image shift acquisition kan de noodzaak van herhaalde focus en trackingstappen verminderen, waardoor de doorvoersnelheid van dataverzameling toeneemt. Hoewel deze techniek hier niet in detail wordt beschreven, is deze techniek uitgebreid beschreven in de PACEtomo-methodologie.

Momenteel zijn populaire softwareopties voor tomografische gegevensverzameling onder andere Tomografie (Thermo Fisher Scientific) en SerialEM. Tomografie is een commerciële oplossing met beperkte flexibiliteit voor aanpassing, terwijl SerialEM, ontwikkeld door David Mastronarde aan de University of Colorado Boulder, een open-source software is die scriptgebaseerde automatisering ondersteunt. Het volledig benutten van de mogelijkheden van SerialEM vereist echter een aanzienlijke leercurve. In deze studie presenteren we een gestroomlijnde workflow die gebruikmaakt van de GUI van SerialEM, waardoor scripting of Python-gebaseerde configuraties niet nodig zijn, terwijl onbeheerde dataverzameling van data 's nachts mogelijk is.

Een veelvoorkomende uitdaging bij het verzamelen van tomografische gegevens met deze methode is onnauwkeurige tracking, wat kan leiden tot onvolledige kantelseries met ontbrekende hoeken of de latere uitlijning bemoeilijkt. Om deze problemen te beperken, moeten trackingparameters worden geoptimaliseerd op basis van het contrast van het monster en de stabiliteit van de kanteltrap. Effectieve strategieën zijn onder andere het aanpassen van de belichtingstijd op trackingposities om beeldhelderheid te garanderen, het fysiek scheiden van de tracking- en focusposities om cumulatieve stralingsschade te verminderen, en het verlagen van de trackingversterking wanneer de stagestabiliteit slecht is om betrouwbare patroonmatching te vergemakkelijken. Gezamenlijk zijn deze aanpassingen essentieel voor het bereiken van robuuste trackingprestaties onder diverse experimentele omstandigheden. In dit werk gebruiken we apoferritine als modelmonster. Onder het uitgangspunt van het testen en corrigeren van parallel licht gebruiken we de ingebouwde functies van SerialEM om hoogwaardige gegevens voor cryo-ET te verzamelen en subtomogramberekeningen uit te voeren op de ferritinemonsters, waarbij uiteindelijk de uiteindelijke structuur van 2,8 Å wordt verkregen.

Deze methode is ontwikkeld om de toepasbaarheid van 200 kV elektronenmicroscopen voor high-resolution cryo-ET uit te breiden. Het bereiken van zo'n resolutie hangt fundamenteel af van het verkrijgen van hoogwaardige beeldgegevens, wat op zijn beurt nauwkeurige verlichtingsomstandigheden vereist. Hiervoor voerden we nauwkeurige parallelle verlichtingsuitlijning uit als een cruciale voorbereidende stap. De hier beschreven uitlijningsprocedure is specifiek ontworpen voor TEMs die zijn uitgerust met een twee-condensorlenssysteem, zoals de Thermo Fisher Scientific Talos Arctica en Glacios. In tegenstelling tot instrumenten met een derde condensorlens (C3), beperken deze systemen de voorwaarden voor parallelle verlichting tot één specifieke excitatiewaarde van de C2-lens. Deze inherente beperking vereist een uitzonderlijk nauwkeurige uitlijning van de elektronenbundel om het bronbeeld te positioneren in het voorste brandpuntsvlak van de bovenste objectieflenz—een voorwaarde voor optimale beeldvorming. Onze daaropvolgende gegevensverwerkingsresultaten tonen aan dat, na deze afstemming, de gegevensverwervingskwaliteit die met deze 200 kV-microscoop voor de geteste monsters wordt bereikt, bijna vergelijkbaar is met wat typisch wordt verwacht van een 300 kV-instrument.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTCryoTM niti grid	Najingdingxin	M04240922A	gebruikt voor cryo-monstervoorbereiding
apoferritin	Biortus	BP17854-00A	gebruikt voor cryo-monstervoorbereiding
cross-grating grid	Agar Scientific	AGS106	gebruikt voor het bepalen van de parallelle lichtcondities
Glacios2	thermo fisher	9959084	gebruikt voor tomo data verzamelen
Number 2 filter paper, 55 mm	Whatman	10311807	Blotting papier
PELCO easiGLOW	TED PELLA	91000-01020	gebruikt voor gloeiontlading
Quantifoil Cu grid	quantifoil	N1-C14nCu30-01	gebruikt voor cryo-monstervoorbereiding
Vitrobot Mark IV	thermo fisher	230101164	gebruikt voor cryo-monstervoorbereiding