Een flexibele procedure voor het uitvoeren van telomeer, FISH en immunofluorescentie in cellen die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een methode voor het combineren van telomeer FISH (natief of denaturerend) met immunofluorescentie en/of visualisatie van een fluorescerend eiwit.

Samenvatting

Het visualiseren van telomeren met behulp van fluorescentie in situ hybridisatie (TelFISH) is al lang een essentieel hulpmiddel in experimenten met telomeerbiologie. Het combineren van TelFISH met immunofluorescentie (IF) is ook een gevestigde methode (IF-TelFISH), bijvoorbeeld bij het identificeren van door telomeerdisfunctie geïnduceerde foci, waarbij telomeren co-lokaliseren met 53BP1. Meer recentelijk is natieve telomeer FISH (nTelFISH) een belangrijk hulpmiddel geworden voor het testen van alternatieve verlenging van telomeren, een telomeeronderhoudsmechanisme dat in sommige tumorcellen wordt gebruikt. Het tot expressie brengen van fluorescerende eiwitten is ook een essentieel hulpmiddel in de celbiologie, waardoor visualisatie mogelijk is van eiwitten en structuren die mogelijk niet detecteerbaar zijn met andere methoden. Omdat FISH-buffers eiwitten denatureren, resulteert het uitvoeren van de test in cellen met een tot expressie gebracht fluorescerend eiwit (FP) in verlies van het FP-signaal. Een methode voor het integreren van IF en telomeer FISH in cellen met een tot expressie gebracht fluorescerend eiwit dat het FP-signaal behoudt, zelfs nadat FISH hier wordt beschreven. Er worden alternatieven geboden voor denaturerende en natuurlijke telomeer FISH in combinatie met verschillende IF- en FP-scenario's. Alles bij elkaar biedt dit protocol een flexibel kader voor het onderzoeken van telomeerbiologie in zowel normale als tumorcellen.

Inleiding

Organismen met lineaire chromosomen hebben te kampen met twee problemen. Ten eerste, als gevolg van het eindreplicatieprobleem, eroderen de uiteinden van chromosomen enigszins elke keer dat DNA wordt gerepliceerd. Ten tweede moeten cellen in staat zijn om natuurlijke DNA-uiteinden te onderscheiden van DNA-breuken. Telomeren evolueerden als een oplossing voor deze problemen. Door de werking van het ribonucleoproteïne telomerase worden chromosomen verlengd door de toevoeging van korte tandemherhalingen - TTAGGG bij mensen. Deze herhalingen worden gebonden door het shelterine-complex, dat het chromosoomuiteinde verbergt voor cellulaire DNA-schadeherstelmachines¹. Korte of disfunctionele telomeren leiden tot cellulaire veroudering en veroudering van fenotypes², terwijl ontsnapping aan de telomeercrisis een belangrijke mijlpaal is in tumorigenese³. Om deze redenen is telomeerbiologie van bijzonder belang voor het begrijpen van de gezondheid en ziekten van de mens.

Telomeer fluorescerende in situ hybridisatie (FISH) is al lang een belangrijke methode voor het visualiseren van telomeren in interfasecellen of metafasespreads⁴. Decennialang is telomeer FISH gekoppeld aan 53BP1 immunofluorescentiekleuring (IF) om door telomeerdisfunctie geïnduceerde foci (TIF's) te identificeren, een marker van disfunctionele, niet-afgetopte telomeren ^5,6. Evenzo is een kenmerk van tumoren die alternatieve verlenging van telomeren (ALAT) gebruiken voor telomeeronderhoud de associatie van telomeren met nucleaire PML-lichamen om ALT-geassocieerde PML-lichamen of APB's te vormen⁷. APB's kunnen worden getest door telomeer FISH te koppelen aan PML IF-kleuring. IF-FISH is dus een gerenommeerd hulpmiddel in de telomeerbiologie.

Hier is het gebruik van IF-FISH op twee manieren uitgebreid. Eerst wordt IF-FISH uitgevoerd op cellen met tot expressie gebrachte fluorescerende eiwitten (FP). De expressie van fluorescerend gelabelde eiwitten is een alomtegenwoordig hulpmiddel geworden in de celbiologie. Het tot expressie brengen van een gelabeld eiwit kan de enige optie zijn om een eiwit te visualiseren waarvoor geen goede antilichamen bestaan. Het tot expressie gebrachte GFP-gelabelde nucleaire actine-chromolichaam (nAC-GFP) onthult bijvoorbeeld de dynamiek van nucleaire actine⁸. Dit reagens heeft nieuwe mogelijkheden geopend voor de exploratie van nucleaire f-actine, die ooit als een controversieel onderwerp werd beschouwd. Terwijl FP's zoals GFP en mCherry doorgaans fluorescentieactiviteit behouden na fixatie, zal de formamide in FISH-hybridisatiebuffers ze donker maken⁹. Om dit probleem te omzeilen, biedt dit protocol de innovatie van een met fluorofoor gelabelde anti-FP "booster" in de secundaire stap van IF-kleuring. De helderheid van de fluorofoor wordt niet beïnvloed door formamide, waardoor IF-FP-FISH mogelijk is.

Ten tweede wordt IF uitgevoerd in combinatie met Native Telomere FISH (nTelFISH), een belangrijke diagnose voor de ALT-status. Bij het denatureren van FISH moet men een methode gebruiken om de DNA-strengen¹⁰ te smelten (bijv. warmte of alkali), waardoor de sonde toegang krijgt tot DNA dat normaal gesproken dubbelstrengs is. Daarentegen bevat native FISH geen denatureringsstap, dus de sonde heeft alleen toegang tot DNA dat al enkelstrengs is. Natief telomeer FISH detecteert specifiek enkelstrengs C-streng telomeerherhalingen, een ander kenmerk van ALAT in tumorcellen^11,12. Door deze test te koppelen aan IF-FP-kleuring kunnen we nieuwe vragen beantwoorden bij het begrijpen van het mechanisme van ALAT, dat nu wordt beschouwd als een sterke kandidaat voor gerichte tumortherapieën.

Het hier beschreven protocol kan worden gebruikt in een "kies je eigen avontuur"-stijl om elke combinatie van IF, FP en native of denaturerende telomeer FISH te kleuren. Omdat het protocol in hoge mate configureerbaar is, kan de timing aanzienlijk variëren. Over het algemeen is hands-on tijd vereist op vier dagen, maar deze dagen zijn mogelijk niet opeenvolgend. Figuur 1 geeft een schatting van de tijd die nodig is om een typische denatureringswerkstroom voor FISH te voltooien. Inheemse FISH hoeft niet van de ene op de andere dag te worden gehybridiseerd, dus men kan mogelijk een nachtelijke stap (een combinatie van dag 2 en dag 3) elimineren als een lange dag aan de bank haalbaar is.

Een typische confocale microscoop is geschikt voor het afbeelden van vier kleurkanalen: ruwweg blauw, groen, rood en verrood. Er worden vier voorbeelden van mogelijke vierkleurencombinaties gedemonstreerd, maar de mogelijke permutaties zijn eindeloos. Het is mogelijk om twee IF-antilichamen of twee tot expressie gebrachte FP's met evenveel succes te gebruiken. Het protocol is eenvoudig en robuust. Elk antilichaam dat op zichzelf goede IF-resultaten produceert, is geschikt. Hoewel hier alleen telomeersondes voor FISH zijn opgenomen, levert het denatureren van FISH met een centromeersonde ook goede resultaten op. Dit protocol biedt dus een brede mate van flexibiliteit voor het beantwoorden van belangrijke vragen in de nucleaire biologie.

Protocol

Voordat u begint, moet u de microscoop, de cellijn die FP tot expressie brengt en de beschikbare sondes en antilichamen overwegen. Blauw wordt meestal gebruikt voor een DNA-kleuring zoals DAPI, omdat blauwe fluoroforen over het algemeen niet helder zijn. Blauwe secundaire antilichamen kunnen indien nodig worden gebruikt. Als de cellen GFP tot expressie brengen, kan een FISH-sonde gelabeld met een rode fluorofoor worden gebruikt samen met een secundair antilichaam voor IF gelabeld met AF-647. Als alternatief kan voor het afbeelden van cellen die mCherry tot expressie brengen, een secundair IF-antilichaam gelabeld met AF-488 en een FISH-sonde gelabeld met AF-647 worden geselecteerd. Voorbeelden van vier mogelijke IF-FP-FISH-combinaties worden weergegeven in figuur 2 en zijn bedoeld als leidraad om experimentele ontwerpflexibiliteit aan te moedigen. Het is belangrijk om te kiezen voor inheemse of denaturerende FISH, omdat deze methoden niet kunnen worden gecombineerd. Een betrouwbare methode voor het wassen van dekglaasjes met zuur om celhechting mogelijk te maken, is hier opgenomen. Dit kan op elk moment voor gebruik worden voltooid en steriele dekglaasjes kunnen voor onbepaalde tijd worden bewaard. De gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Zuurwassen van dekglaasjes

OPMERKING: Glazen dekglaasjes moeten worden schoongemaakt en met zuur worden gewassen om gekweekte cellen te laten hechten. Voor de groei in 12-gaats platen zijn ronde dekglaasjes van 18 mm ideaal. Overleg met de microscopiekernfaciliteit om te bepalen of #1 of #1.5 dekglaasjes de voorkeur hebben. De vermelde tijden voor het reinigen van dekglaasjes zijn niet kritiek, maar bezuinigen niet op de zure was.

1. Gebruik een deksliptang (Figuur 3A) om dekglaasjes in de rekken te plaatsen, zodat de oppervlakken elkaar niet raken. Plaats indien nodig diagonaal extra dekglaasjes om de capaciteit te vergroten (Figuur 3B). Plaats meerdere rekken comfortabel in de kleurschaal (Figuur 3C).
2. Vul de kleurschaal met water en een kleine hoeveelheid afwasmiddel. Laat de roosters met de dekglaasjes voorzichtig in de schaal zakken.
3. Schud de dekglaasjes 30 minuten in het sopje met behulp van een tuimelschakelaar of moer.
4. Til de rekken met dekglaasjes uit de kleurschaal. Gooi het zeepsop weg.
5. Spoel de kleurschaal af en vul deze met gedeïoniseerd water. Leg de rekken met dekglaasjes terug in het schone water en plaats ze op een wip om 5 minuten zachtjes te roeren.
6. Herhaal de spoeling met twee extra verversingen van schoon gedeïoniseerd water, voor een totaal van drie spoelingen.
7. Til de rekken met dekglaasjes uit de kleurschaal. Voeg 1 N HCl toe aan de schaal.
   LET OP: HCl is bijtend. Hanteren in een zuurkast en persoonlijke beschermingsmiddelen gebruiken. Laat de dekglaasjes voorzichtig in de zuuroplossing zakken. Zorg ervoor dat de 1 N HCl de dekglaasjes volledig bedekt. Plaats het deksel op de kleurschaal.
8. Plaats het kleurschaaltje met de dekglaasjes en de zuuroplossing in het reservoir van een badsonicator. Sonificeer gedurende 15 minuten bij 55 °C.
9. Laat de dekglaasjes een nacht in het zuurbad liggen.
10. Verwijder de dekglaasjes de volgende dag voorzichtig van de kleurschaal. Gooi de 1 N HCl weg volgens de veiligheidsprotocollen van de instelling.
11. Spoel de kleurschaal af en vul deze met gedeïoniseerd water. Leg de rekken met dekglaasjes terug in het schone water en plaats ze op een wip om 5 minuten zachtjes te roeren.
12. Herhaal de spoeling met nog twee keer schoon gedeïoniseerd water, voor een totaal van drie spoelingen.
13. Til de rekken met dekglaasjes uit de kleurschaal. Leeg de schaal en vul deze met 70% ethanol. Leg de rekjes met dekglaasjes terug in de schaal en schud zachtjes gedurende 5 minuten.
14. Til de rekken met dekglaasjes uit de kleurschaal. Maak de schaal leeg en vul deze met 100% ethanol. Leg de rekjes met dekglaasjes terug in de schaal en schud zachtjes gedurende 5 minuten.
15. Breng het schaaltje met 100% ethanol en de dekglaasjes naar een weefselkweekkap. Haal in de kap de rekjes met dekglaasjes uit de schaal en laat ze aan de lucht drogen.
16. Maak de schaal leeg en leg de rekken met dekglaasjes er weer op. Bewaar met het deksel erop om de steriliteit te behouden. Het kleurschaaltje is niet luchtdicht; Als de dekglaasjes in ethanol achterblijven, zal het uiteindelijk verdampen. De dekglaasjes blijven bruikbaar.

2. Cellen op dekglaasjes plateren

OPMERKING: Het hanteren van dekglaasjes vereist oefening. Het is gemakkelijker om met een plaat met 6 putjes te beginnen totdat je er zeker van bent. Als u een bord met 6 putjes gebruikt, verdubbel dan de wasvolumes die voor borden met 12 putjes worden gegeven.

1. Kweek gezonde, groeiende cellen die het eiwit van interesse tot expressie brengen dat is gelabeld met GFP of mCherry (verschillende rode of groene FP's zijn geschikt; zie de opmerkingen in de materiaaltabel). In de getoonde voorbeelden worden U2OS-osteosarcoomcellen gebruikt, die ALAT gebruiken voor telomeeronderhoud.
   1. Gebruik tijdelijk getransfecteerde cellen of cellijnen met stabiele FP-expressie. Als het experiment medicamenteuze behandeling of transfectie vereist, overweeg dan de gewenste samenvloeiing bij fixatie (typisch 70%-80%), de behandelingsduur en de celgroeisnelheid om het juiste aantal cellen te berekenen dat per dekglaasje moet worden opgevouwen.
2. Bereid dekglaasjes voor in de weefselkweekkap om de steriliteit te behouden. Voeg aan elk putje van een plaat met 12 putjes 1 ml steriele PBS toe. Plaats met behulp van een dekglaaspincet een schoon, met zuur gewassen dekglaasje in elk putje. Schud zachtjes met de hand gedurende een paar seconden.
3. Aspireren PBS. Voeg 1 ml verse steriele PBS toe per putje. Zet het bord opzij.
4. (Optioneel) Smeer dekglaasjes in met fibronectine om de celhechting te verbeteren. Veel aanhangende cellijnen hechten goed aan met zuur gewassen dekglaasjes wanneer ze ten minste 18 uur worden geplateerd voordat ze worden gefixeerd. Als cellen niet goed hechten of kort na het plateren moeten worden gefixeerd, smeer dan dekglaasjes in om de hechting te bevorderen.
   1. Bereid een 5 μg/ml oplossing van fibronectine in steriel PBS.
   2. Zuig PBS aan van de dekglaasjes. Breng voorzichtig ongeveer 300 μL fibronectineoplossing aan op elk dekglaasje en vorm een druppel die wordt vastgehouden door oppervlaktespanning.
   3. Incubeer gedurende enkele uren bij 37 °C of een nacht bij 4 °C.
   4. Spoel meerdere keren af met PBS en houd de dekglaasjes vast in een laatste verandering van PBS. Zet de plaat opzij tijdens het voorbereiden van cellen.
   5. Als fibronectine niet geschikt is, overweeg dan poly-L-lysine, collageen of gelatine als alternatieven.
5. Trypsiniseer cellen en verdun een geschikt aantal in 12 ml kweekmedium op basis van het experimentele ontwerp en de gewenste celdichtheid bij fixatie.
6. Zuig PBS op uit de dekglaasjes en voeg 1 ml celsuspensie per putje toe.
7. Plaats de cellen in de couveuse.
8. Behandel cellen zoals nodig met medicijnen, siRNA's of andere reagentia volgens het experimentele ontwerp. Groei naar de gewenste samenvloeiing.

3. IF-FP kleuring

OPMERKING: Laat gedurende het hele protocol geen dekglaasjes uitdrogen. Het is raadzaam om met de ene hand te pipetteren en met de andere hand oplossingen aan te zuigen, zodat dekglaasjes zo min mogelijk uit de oplossing zijn. Pipetoplossingen voorzichtig tegen de wand van de put, niet direct op het dekglaasje. Pak dekglaasjes stevig maar voorzichtig vast met een tang. Het is gemakkelijk om een dekglaasje te breken door het met te veel kracht vast te pakken. Plan in het begin voor dubbele dekglaasjes in geval van breuk. Met ervaring worden kapotte dekglaasjes een zeldzame gebeurtenis. Dekglaasjes kunnen niet uit een droge put worden gehaald. Dekglaasjes moeten worden afgedekt met buffer om te kunnen worden opgepakt.

1. Verwijder media en corrigeer cellen met behulp van het fixatief van uw keuze. Het is niet nodig om de cellen te spoelen voor fixatie. Gebruik 1 ml per putje in een plaat met 12 putjes of 2 ml per putje in een plaat met 6 putjes.
   1. Optie 1: Gebruik 4% formaldehyde in PBS.
      LET OP: Formaldehyde is giftig. Hanteren met handschoenen en op de juiste manier weggooien. Bereid vers met 16% methanolvrije formaldehyde en 10x PBS-bouillon. Fixeer gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.
   2. Optie 2: Gebruik 4% formaldehyde in de cytoskeletbuffer met sucrose (CBS).
      OPMERKING: Deze buffer heeft de voorkeur voor het behoud van de cytoskeletstructuur¹³. CBS heeft een eindconcentratie van 10 mM MES pH 6,1, 138 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 2 mM EGTA en 0,32 M sucrose. Maak voor het bereiden van fixeermiddel een 2x CBS-bouillon met 20 mM MES pH 6,1, 276 mM KCl, 6 mM MgCl₂, 4 mM EGTA. Bereid een aparte bouillon van 1,28 M sucrose voor. Bewaar beide bouillons bij 4 °C. Meng voor een vers werkend fixeermiddel 1 deel 16% methanolvrije formaldehyde, 1 deel sucrosebouillon en 2 delen 2x CBS-bouillon. Fixeer gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.
   3. Optie 3: Fixeer met -20 °C methanol. Aanbevolen voor doelen van nucleïnezuurantilichamen (bijv. ssDNA, G-quadruplexen, RNA-DNA-hybriden). Fixeer gedurende 5 minuten bij -20 °C.
2. Aspiratie, fixatief en weggooien volgens institutioneel beleid.
3. Spoel dekglaasjes meerdere keren af met PBS.
   1. STOPPUNT: Vaste dekglaasjes kunnen enkele dagen in PBS bij 4 °C worden bewaard met minimaal signaalverlies. Voor langere opslag dehydrateert u tot 100% ethanol (2 minuten in 70% ethanol, 2 minuten in 90% ethanol, bewaren in 100% ethanol), sluit u de plaat af met laboratoriumfolie en bewaart u deze bij -20 °C. Dekglaasjes kunnen op deze manier weken tot maanden worden bewaard. Als u klaar bent om te bevlekken, rehydrateert u de dekglaasjes (2 minuten in 90% ethanol, 2 minuten in 70% ethanol, 15 minuten in PBS) en gaat u verder met de volgende stap.
4. Permeabiliseer de dekglaasjes in 0,5% Triton X-100 in PBS gedurende 5 minuten bij 4 °C. Voer deze stap uit in de plaat.
5. Spoel dekglaasjes meerdere keren af met PBS.
6. Bereid de bevochtigde kamer voor (Figuur 3D). Leg vochtig keukenpapier op de bodem van de kamer. Om een drager voor kleuring te creëren, labelt u de bovenkant van een deksel van een plaat met 12 putjes zodat deze overeenkomt met de dekglaasjes.
   1. Dek het deksel af met labfolie zodat de labels zichtbaar blijven. Zorg ervoor dat de kamer lichtdicht is met een nauwsluitend deksel. Dek indien nodig af met folie (Figuur 3E).
7. Pipetteer 75 μL druppels van 100 μg/ml RNase A in PBS op de gelabelde drager. Pak elk dekglaasje voorzichtig op en dep de rand op het laboratoriumpapier om overtollige buffer te verwijderen. Keer dekglaasjes om op de RNase A-druppels (met de celzijde naar beneden). Plaats de steun in de bevochtigde kamer en sluit het deksel. Incubeer gedurende 45 minuten bij 37 °C.
8. Voeg verse PBS toe aan de plaat met 12 putjes. Leg de dekglaasjes terug op het bord, met de celkant naar boven. Meerdere keren spoelen met PBS.
9. Blokkeer 30 minuten of langer bij kamertemperatuur. Veeg de RNase-oplossing van de met film bedekte drager. Pipetteer 75 μL druppels 20% ezelserum in PBS op de film. Keer dekglaasjes om op de blokkeerbuffer (celzijde naar beneden).
10. Bereid het primaire antilichaam voor.
    1. Gebruik 75 μL per dekglaasje. Bereid 10% extra voor om rekening te houden met pipetteerfouten.
    2. Verdun het antilichaam in 5% ezelserum. Bepaal empirisch de verdunningen van antilichamen. Een verdunning van 1:100 is een redelijk uitgangspunt.
    3. Bereid tijdens het blokkeren een tweede gelabelde ondersteuning voor op incubatie van primaire antilichamen. Bedek het deksel met folie en breng 75 μL druppels van het verdunde antilichaam aan op de aangewezen plekken.
11. Breng aan het einde van de blokkeringsstap dekglaasjes over op de antilichaamdruppeltjes (celzijde naar beneden). Plaats de steun in de bevochtigde kamer, sluit het deksel en incubeer gedurende ten minste 2 uur bij kamertemperatuur of een nacht bij 4 °C.
12. Voeg verse PBS toe aan de plaat met 12 putjes. Leg de dekglaasjes terug op het bord, met de celkant naar boven. Was in PBS drie keer gedurende 5 minuten elk op kamertemperatuur met schommelen.
13. Bereid tijdens de laatste wasbeurt secundaire antilichamen voor.
    1. Gebruik 75 μL per dekglaasje. Bereid 10% extra voor om rekening te houden met pipetteerfouten.
    2. Een verdunning van 1:400 wordt aanbevolen voor fluorescerende secundaire antilichamen en GFP/RFP-boosterantilichamen. Pas indien nodig aan op basis van ervaring met het doel.
    3. Verdun secundaire antilichamen in 5% ezelserum. Breng druppels van 75 μL aan op de juiste plekken op de gelabelde drager.
14. Breng na het wassen dekglaasjes over op de secundaire antilichaamdruppels (celzijde naar beneden). Incubeer gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur in de afgesloten bevochtigde kamer.
15. Voeg verse PBS toe aan de plaat met 12 putjes. Leg de dekglaasjes terug op het bord, met de celkant naar boven. Was in PBS drie keer gedurende 5 minuten elk op kamertemperatuur met schommelen.

4. Opnieuw fixeren en uitdrogen

1. Bereid 4% formaldehyde in PBS bij kamertemperatuur voor herfixatie. Gebruik formaldehyde voor deze stap, zelfs als methanol is gebruikt voor de eerste fixatie. Verwijder de laatste PBS-wasbeurt en fixeer de cellen opnieuw gedurende 15 minuten met zacht schommelen.
2. Aspiratie het fixatief en gooi het weg in overeenstemming met het institutionele beleid.
3. Spoel de dekglaasjes meerdere keren af met PBS.
4. Dehydrateer de dekglaasjes en laat ze aan de lucht drogen om ze voor te bereiden op hybridisatie:
   1. Incubeer in 70% ethanol gedurende 2 min.
   2. Incubeer gedurende 2 minuten in 90% ethanol.
   3. Incubeer 2 minuten in 100% ethanol.
   4. Plaats na 100% ethanol de dekglaasjes met de celkant naar boven op het geëtiketteerde filterpapier om de oriëntatie te behouden. Laat ze volledig aan de lucht drogen terwijl u de FISH-sonde voorbereidt.

5. VIS (OPTIE 1): VIS denatureren

1. Bereid twee foliesteunen voor (zie afbeelding 3F).
   1. Vouw een stuk aluminiumfolie in vieren om vier lagen te maken. Zorg ervoor dat de doffe kant naar buiten wijst.
   2. Snijd de gevouwen folie af zodat deze in het deksel van een plaat met 12 putjes past. Wrijf de folie met een laboratoriumdoekje tegen de binnenkant van het deksel, zodat de ribbels van het deksel een patroon op de folie vormen. Hierdoor ontstaan ribbels die voorkomen dat de dekglaasjes in elkaar schuiven tijdens volgende stappen.
   3. Bereid twee van dergelijke steunen voor. Ze kunnen worden gewist en opnieuw worden gebruikt in latere experimenten.
2. Verdun de 10 μM-sonde 1:50 in hybridisatiebuffer (70% gedeïoniseerde formamide, 10 mM Tris, pH 7,4, 0,5% 10× Roche-blokkeringsoplossing). Gebruik 75 μL van deze verdunde sonde per dekglaasje en bereid 10% extra voor om pipetteerverlies te compenseren. De uiteindelijke sondeconcentratie moet 200 nM zijn.
3. Verwarm een heatblock voor op 90 °C en een thermocycler op 85 °C.
4. Denatureer de dekglaasjes: Leg aan de lucht gedroogde dekglaasjes met de celkant naar boven op een van de voorbereide foliedragers. Plaats de folie voorzichtig op het thermocyclerblok en sluit het deksel. Incubeer gedurende 5 minuten om te denatureren.
5. Verwarm tegelijkertijd de verdunde sonde in het warmteblok gedurende 5 minuten op 90 °C.
6. Pipetteer 75 μL druppels van de gedenatureerde sonde op de tweede voorbereide foliedrager. Zorg ervoor dat de doffe kant van de folie naar boven wijst om goed gevormde druppels mogelijk te maken. Als de glanzende kant naar boven is, zal de sonde zich verspreiden en de oppervlaktespanning verliezen.
7. Keer de gedenatureerde dekglaasjes om op de sondedruppels en plaats ze met de celkant naar beneden.
8. Breng de foliesteun met sonde en dekglaasjes over op het thermocyclerblok dat op 85 °C is ingesteld en incubeer gedurende 5 minuten. Gebruik een spatel om te helpen bij het verplaatsen. Beweeg voorzichtig om te voorkomen dat de dekglaasjes stoten of verschuiven.
9. Verplaats de folie met dekglaasjes en sonde in een bevochtigde kamer. Dek af met het deksel en broed een nacht uit bij kamertemperatuur.

6. VIS (OPTIE 2): Inheemse VIS

1. Verdun de 10 μM-sonde 1:200 in hybridisatiebuffer (70% gedeïoniseerde formamide, 10 mM Tris, pH 7,4, 0,5% 10× Roche-blokkeringsoplossing). De uiteindelijke sondeconcentratie is 50 nM. Gebruik 75 μL per dekglaasje en bereid 10% extra voor om pipetteerfouten te voorkomen.
2. Breng 75 μL druppels verdunde sonde aan op de aangewezen plekken op de met film bedekte drager.
3. Keer de gedenatureerde dekglaasjes om op de druppels sonde van 75 μl en plaats ze met de celzijde naar beneden.
4. Plaats de steun in een bevochtigde kamer en sluit het deksel. Incubeer gedurende ten minste 45 minuten bij kamertemperatuur. De incubatie kan desgewenst worden verlengd tot een nacht

7. Wassen en monteren

OPMERKING: Het optimale montagemedium is afhankelijk van de numerieke apertuur van het microscoopobjectief. Raadpleeg de lokale microscopiekernfaciliteit voor aanbevelingen. Een geschikte keuze kan ProLong Glass met NucBlue zijn, dat een brekingsindex van 1,52 heeft. Afhankelijk van de microscoop kan een alternatief montagemedium echter geschikter zijn.

1. Leg de dekglaasjes terug op de plaat met 12 putjes om ze te wassen. Keer ze om zodat ze met de celkant naar boven liggen.
2. Was 3× 10 minuten in 70% formamide/10 mM Tris, pH 7,5.
   LET OP: Formamide is giftig; Gooi het weg in overeenstemming met het institutionele beleid.
3. Was 3× 5 min in TNT (0,05 M Tris/0,15 M NaCl/0,05% Tween-20, pH 7,5).
4. Spoel meerdere keren in PBS. Als een DNA-kleuring niet in het montagemedium zit, overweeg dan om DAPI toe te voegen aan de laatste wasbeurt. Om te kleuren met DAPI, voegt u 300 nM DAPI toe aan PBS, brengt u aan op dekglaasjes en incubeert u gedurende 5 minuten. Gooi de DAPI-oplossing weg volgens de richtlijnen van de instelling.
5. Monteer dekglaasjes op glazen geleiders met behulp van een druppel montagemedium. Keer dekglaasjes om op de druppel: met de celzijde naar beneden.
6. Laat het montagemedium een nacht uitharden voordat u de beeldvorming uitvoert.

Resultaten

Typische resultaten van dit protocol worden weergegeven in figuur 4. Als het goed wordt uitgevoerd, zal de celmorfologie goed worden gehandhaafd en zullen fluorescerende signalen helder zijn. Bij het denatureren van telomeer FISH zou een patroon van tientallen puncta in elke kern moeten worden onthuld die elke telomeer vertegenwoordigt (zie figuur 4, voorbeelden 1 en 2). Telomeerfoci zouden bijna uitsluitend in de kern aanwezig moeten zijn, hoewel cytoplasmatische telomeerkleuring soms voorkomt, vooral in ALT-cellijnen. De resulterende telomeersignalen zijn meestal extreem helder, zozeer zelfs dat er voor moet worden gezorgd dat het telomeersignaal niet in andere detectiekanalen terechtkomt. In ALT-cellijnen clusteren telomeren vaak op PML-lichamen¹⁴, wat resulteert in minder foci dan normaal zou worden verwacht. Deze clustering is te zien in Figuur 4, Voorbeeld 2.

In cellijnen die ALT gebruiken voor telomeeronderhoud, detecteert native telomeer FISH het telomere ssDNA dat een kenmerk is van ALAT^11,12. Het is niet te verwachten dat elke kern telomeer ssDNA zal hebben, noch dat er meer dan een klein aantal puncta in een enkele kern aanwezig zal zijn (zie Figuur 4, Voorbeelden 3 en 4). Het oorspronkelijke telomeer FISH-signaal zal niet zo helder zijn als het denatureren van telomeer FISH. De osteosarcoomcellijn U2OS is een goede positieve controle voor inheemse FISH. Telomeer ssDNA zal naar verwachting niet worden waargenomen in cellijnen met telomeren die in stand worden gehouden door telomerase.

Voor zowel denaturerende als natieve FISH is sterke nucleolaire fluorescentie artefactisch. Als een overmatig nucleolair signaal wordt waargenomen, probeer dan een verse oplossing van RNase A te gebruiken of de RNase A-behandeling¹⁵ uit te breiden (protocolstap 3.8). Voor native telomeer-FISH-experimenten waarbij cellen met een onbekende ALT-status worden gebruikt, wordt een positieve ALT-cellijn zoals U2OS gebruikt om de detectie-instellingen te kalibreren.

Waarnemingen van FP's in IF-FP-FISH-experimenten kunnen gemakkelijk worden vergeleken met live-cell beeldvormingsexperimenten voor validatie. Als er afwijkingen worden waargenomen, probeer dan verschillende fixatiecondities. Fixatie in CSB-buffer (protocolstap 3.1.2) kan gunstig zijn voor het behoud van cellulaire structuren, waardoor een nauwkeurigere FP-lokalisatie¹³ wordt onthuld.

Immunofluorescentiekleuring varieert sterk, afhankelijk van het eiwit van belang. IF-resultaten moeten worden vergeleken met monsters die zonder FISH zijn geprepareerd om de impact van het FISH-protocol op de lokalisatie en intensiteit van het betreffende eiwit te beoordelen. Over het algemeen zijn IF-FP-FISH-experimenten geschikt voor het tellen van brandpunten, maar de intensiteit is mogelijk niet kwantitatief⁶.

Figuur 1: Voorbeeld workflow met geschatte duur. Een extra dag kan nodig zijn als de incubatie van primaire antilichamen 's nachts wordt uitgevoerd. In het geval van inheemse FISH worden dag 2 en 3 soms gecombineerd, hoewel dit resulteert in een langere banktijd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Voorbeelden van succesvolle experimentele combinaties gebruikt met vierkleurenbeeldvorming. Voorbeelden 1 en 2 demonstreren denaturerende telomeer-FISH, terwijl 3 en 4 native FISH gebruiken. Merk op dat dit protocol nuttig is, of het nu gaat om immunokleuring van twee doeleiwitten (voorbeeld 1), het combineren van één FP- en één IF-kleuring (voorbeelden 2 en 4) of twee FP's (voorbeeld 3). Representatieve resultaten voor deze experimenten worden gegeven in figuur 4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Apparatuur die in dit protocol wordt gebruikt. (A) Dekglaasjestang. Terwijl een rechte tang kan worden gebruikt om dekglaasjes te hanteren, maakt een schuine dekschuiftang de taak veel gemakkelijker. (B) Dekglaasjes die in een rek zijn geplaatst om te worden gewassen. Merk op dat dekglaasjes niet alleen recht overdwars worden geplaatst, maar ook schuin tussen aangrenzende groeven om de capaciteit te vergroten. (C) Vier rekken met dekglaasjes in een kleurschaaltje. Een glazen kleurplaat bevat tientallen dekglaasjes met rekken en is ongevoelig voor de HCl-zuurwas. (D) Een voorbereide bevochtigde kamer. De buitenkant is bedekt met folie om een donkere omgeving te creëren, waarbij de fluoroforen behouden blijven. Vochtige papieren handdoeken aan de onderkant zorgen voor vocht. (E) De verzegelde bevochtigde kamer. Een goed sluitend deksel is essentieel om uitdroging te voorkomen. (F) Het maken van de aluminiumfoliesteun. Het reliëf van ribbels op de bijgesneden folie helpt voorkomen dat de dekglaasjes tijdens de denatureringsstap in elkaar schuiven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Representatieve resultaten van vierkanaals beeldvormingsexperimenten, waaronder IF, FISH en tot expressie gebrachte FP's. Panelen geven de werkelijke resultaten weer van de experimenten die in figuur 2 worden beschreven. DAPI kleurt DNA, nAC-GFP markeert nucleaire f-actine, TelFISH en TRF2-mCherry markeren telomeren, PML-immunokleuring markeert nucleaire PML-lichamen en nTelFISH onthult telomer ssDNA. Alle cellen zijn U2OS-osteosarcoomcellen. Beelden werden verkregen op een confocale microscoop met superresolutie. Voorbeeld 1: afbeeldingen zijn verkregen met confocale microscopie met laserscanning; alle andere afbeeldingen zijn verkregen met Structured Illumination Microscopy. Alle schaalbalken vertegenwoordigen 5 μM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Experimenten met IF-FISH zijn al lang een steunpilaar op het gebied van telomeren als test voor telomeerstress of detectie van ALAT ^5,6,16. Hier wordt het protocol uitgebreid met een fluorescerend eiwit. Bovendien wordt de optie van natieve telomeer FISH aangeboden als een orthogonale ALT-test¹¹. Dit protocol is eenvoudig uit te voeren en levert op betrouwbare wijze bevredigende resultaten op.

Door te opereren op dekglaasjes met druppeltjes antilichamen of PNA-sondes, is dit protocol ontworpen om zuinig te zijn. Door het gebruik van druppeltjes blijven waardevolle reagentia behouden. Alternatieven zoals geleiders met kamers zijn daarentegen duur en bieden minder flexibiliteit. Hoewel het hanteren van dekglaasjes oefening vergt om vaardigheid te ontwikkelen, maken de kostenbesparingen de investering van tijd de moeite waard. Opgemerkt moet worden dat reagensdruppels groter dan 75 μL niet worden aanbevolen. Grotere druppels zorgen er gewoon voor dat de dekglaasjes gaan schuiven en verbeteren de resultaten niet.

De expressie van nAC-GFP is een onmisbaar hulpmiddel voor de visualisatie van nucleair f-actine⁸, zoals te zien is in figuur 4. Er bestaan veel andere gelabelde reagentia die kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke biologische vragen. Het FUCCI-plasmidesysteem kan bijvoorbeeld worden gebruikt om de celcyclus te visualiseren en het gebruik van dit protocol kan worden gecombineerd met telomeer FISH¹⁷. Een andere benadering van het testen van de celcyclus zou het PCNA-chromolichaam kunnen gebruiken om informatie over de celcyclus te verkrijgen¹⁸. Afhankelijk van de vraag die wordt gesteld, zijn er veel reagentia met FP-tags in de handel verkrijgbaar.

Hier wordt dit protocol gedemonstreerd met telomeer FISH, maar er zijn ook succesvolle resultaten bereikt met centromeer FISH, met behulp van een PNA-sonde in dezelfde concentratie. Het is bijvoorbeeld mogelijk om een FAM-gelabelde centromeersonde te multiplexen met een Cy3-gelabelde telomeersonde. Het is belangrijk om te benadrukken dat het onwaarschijnlijk is dat het protocol werkt met single-locus DNA FISH. Voor het onderzoeken van een enkele locus is protease-digestie van het monster noodzakelijk, en deze digestie is duidelijk onverenigbaar met IF- of FP-detectie¹⁹. Er is echter succes geboekt bij het combineren van IF en mRNA FISH met een vergelijkbare aanpak; uiteraard moet de RNase-behandelingsstap in dit scenario worden weggelaten.

Ten slotte is het duidelijk dat natieve telomeer FISH snel een essentiële test wordt voor de ALT-status^20,21 . In tegenstelling tot de C-cirkeltest voor ALAT, die populatiegebaseerd is²², biedt native telomeer FISH een ALT-uitlezing op cellulair niveau, waardoor gevoelige detectie van veranderingen in ALT-dynamiek mogelijk is. Door native telomeer FISH te verenigen met IF- en FP-expressie, kunnen belangrijke inzichten in het ALT-mechanisme worden onthuld. We hopen dat deze inzichten na verloop van tijd zullen leiden tot gerichte therapieën voor tumoren die afhankelijk zijn van ALAT voor telomeeronderhoud.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10 % Tween-20	Bio-Rad	1610781	Gooi weg als de oplossing troebel is.
10x PBS	Gibco	70011044	Gebruik voor het bereiden van fixatief en andere buffers post-fixatie
12-well cell culture plates	Nunc	150628
16% methanol-free formaldehyde	Thermo Scientifc	28908
5 M sodium chloride	Millipore Sigma	S6546
Adherent cells, e.g. U2OS osteosarcoma cells	ATCC	HTB-96
Airtight box for humidified chamber	Mepal	106415032500	Elke geschikte luchtdichte doos zal werken, maar pas op voor dozen met ongelijke bodems.
Alconox	Millipore Sigma	Z742914
aluminum foil	Fisher Scientific	01-213-100
Appropriate cell culture medium, e.g. McCoy's 5A	Gibco	16600082	Voor U2OS, voeg 15% FBS toe
Centromere probe (FAM)	PNA Bio	F3001	Er zijn verschillende fluoroforen beschikbaar
ChromoTek Nuclear Actin-Chromobody plasmid (TagGFP)	Proteintech	acg-n
Coverslip forcers	Fine Science Tools	11251-33
Coverslip racks	Millipore Sigma	Z688568
DAPI	Invitrogen	D21490	Optioneel, voor het geval de montagemedium geen DNA-kleurstof bevat
Donkey serum	Jackson Immunoresearch	017-000-121
EGTA	Bio-World	40520008	0,5 M oplossing pH 8,0
ethanol	Warner-Graham	200 Proof
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5670801
Fibronectin	Millipore Sigma	F0635	Voor optionele coating van coverslips
formamide	Millipore Sigma	47671-250ML-F
German glass coverslips	Warner Insruments	64-0714	CS-18R15 (#1,5 dikte, bevestig dat dit geschikt is voor uw microscoop)
GFP Booster	Proteintech	gb2AF488	herkent GFP/mClover/YFP/Venus en anderen.  Zie productinformatie voor een uitgebreide lijst
Glass staining dish with lid	Millipore Sigma	900203
Heated Ultrasonic Cleaner with Digital Timer	Branson	CPX-952-218R	Dit bad sonicator-model bevat warmte maar heeft geen configureerbare kracht of intensiteit.
Hydrochloric Acid	Millipore Sigma	258148	Geconcentreerd HCl is 12 N.  Voeg 20 mL geconcentreerd HCl toe aan 220 mL gedeïoniseerd water voor 1 N HCl
Magnesium chloride solution	Millipore Sigma	63069	1 M oplossing
MES	Millipore Sigma	475893
methanol	Millipore Sigma	179337
Parafilm	USA Scientific	3023-4526
Potassium chloride	Millipore Sigma	P9541
primary antibody  mouse anti-PML	Santa Cruz	sc-377390
primary antibody  rabbit anti-53BP1	Novus	NB100-904
primary antibody  rabbit anti-PML	ABclonal	A1184
Prolong Glass with NucBlue	Invitrogen	P36981
RFP Booster	Proteintech	rb2AF568	herkent mRFP/mCherry/mKate2/mPlum.  Zie productinformatie voor een uitgebreide lijst
RNAse A	Millipore Sigma	RNASEA-RO
Roche blocking solution	Millipore Sigma	11096176001
secondary antibody e.g. AF488 anti-mouse	Invitrogen	A-11001	Of soortgelijk
secondary antibody e.g. AF594 anti-rabbit	Invitrogen	A-11012	Of soortgelijk
secondary antibody e.g. AF647 anti-mouse	Invitrogen	A-21235	Of soortgelijk
spatula	Fisher Scientific	10257402
Sterile PBS	Gibco	14190144	Voor het bereiden van coverslips
sucrose	Millipore Sigma	S0389
TelC probe (Cy3)	PNA Bio	F1002	Er zijn verschillende fluoroforen beschikbaar
TelG probe (AF647)	PNA Bio	F1014	Er zijn verschillende fluoroforen beschikbaar
Tris Base	Millipore Sigma	648311	Bereid 1 M oplossing in water, pas pH aan met behulp van HCl
triton X-100	Millipore Sigma	X100
Trypsin-EDTA (0,25%), phenol red	Gibco	25200072
Zeiss Elyra microscope	Zeiss		Of soortgelijk