Massaal parallelle splicingtest om splicingfouten te onderzoeken die worden veroorzaakt door ziektegerelateerde intronische varianten

Samenvatting

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van massaal parallelle splicing-assays (MaPSy), die minigenconstructen gebruiken om intronische varianten systematisch in bulk te evalueren. Deze benadering maakt high-throughput analyse mogelijk van variant-geïnduceerde splicingveranderingen in cellen door middel van amplicon-sequencing, waardoor functionele beoordelingen worden verkregen van hun impact op pre-mRNA-splicing.

Samenvatting

Splitsingsfouten vertegenwoordigen 10-30% van de pathogene mutaties die verantwoordelijk zijn voor zeldzame genetische aandoeningen. RNA-splicing zorgt voor een goede genexpressie door selectief exonen samen te voegen en introns te verwijderen, waarbij de belangrijkste regulerende sequenties zich in de introns bevinden. De 5'-splitsingsplaats en -tak interageren met kleine nucleaire RNA's om het herkenningscomplex van het spliceosoom te vormen, terwijl elementen zoals het polypyrimidinekanaal en splicing-versterkers/geluiddempers eiwitten rekruteren om de assemblage van spliceosoom te reguleren. Het voorspellen van splicing-verstoringen van intronische varianten is een uitdaging vanwege de complexiteit van deze interacties.

Intronische varianten, die 90% van de natuurlijke menselijke genvariaties uitmaken, kunnen de canonieke splitsing verstoren en aanleiding geven tot ziekte. Om deze mogelijkheid te onderzoeken, hebben we een massaal parallelle splicingtest (MaPSy) ontwikkeld om door de patiënt geïdentificeerde intronische varianten te beoordelen. Gesynthetiseerde oligonucleotiden met referentie- of variantsequenties werden geligeerd tot splitsende minigenen die promotor- en polyadenyleringssignalen bevatten. Elke constructie bevatte twee constante exonen die een middelste exon flankeerden die de variabele intron-exon-junctiesequentie van belang herbergde. De cellulaire splicing-efficiëntie van de variantsequenties werd vergeleken met referentie-tegenhangers, waardoor we significante verstoringen als splicing-varianten konden identificeren.

De resultaten van de MaPSy kunnen worden gevalideerd door middel van aanvullende benaderingen, zoals minigentesten of CRISPR-gemedieerde genoombewerking in vivo. Bovendien kan geaggregeerde analyse van de verstoorde juncties diepere inzichten verschaffen in splicingmechanismen en de moleculaire basis van ziekten die verband houden met splicingfouten.

Inleiding

RNA-splicing is een cruciaal proces dat exonen samenvoegt voor translatie en introns verwijdert, waardoor RNA-export wordt vergemakkelijkt en nucleïnezuurhomeostase wordt gehandhaafd. Dit strak gereguleerde mechanisme werkt op een temporele en ruimtelijke manier en draagt bij aan de diversiteit en complexiteit van transcriptoom¹. Splicing wordt geleid door belangrijke signalen, waaronder de 5' splice-site (5'ss), filiaallocatie en 3'-splice-site (3'ss), samen met aanvullende regulerende elementen zoals het polypyrimidinekanaal stroomafwaarts van de filiaallocatie en de AG-dinucleotide-uitsluitingszone, die helpen bij 3'ss-herkenning². Mechanistisch gezien paart U1 klein nucleair RNA (snRNA) met de 5'ss, terwijl de vertakkingsplaats interageert met U2 snRNA³. De gecoördineerde activiteit van de vertakking, het polypyrimidinekanaal en de 3s's vergemakkelijkt de binding van U2 kleine nucleoproteïnen (snRNP's) en U2-hulpfactoren, waardoor het spliceosoom wordt gestabiliseerd en het vertakkingspunt wordt gepositioneerd voor nucleofiele aanval op de 5ss, waardoor splitsing wordt geïnitieerd.

Met de snelle vooruitgang van sequencing-technologieën blijven de kosten van sequencing van het hele genoom dalen, wat leidt tot een steeds groter wordende catalogus van menselijke genetische varianten. Geschat wordt dat 10-30% van de ziektegeassocieerde mutaties bij zeldzame genetische aandoeningen de RNA-splitsing beïnvloeden ^4,5,6, waarbij vaak afwijkende genproducten worden geproduceerd die als therapeutische doelen kunnen dienen. Het evalueren van de functionele impact van intronische varianten blijft echter een uitdaging vanwege de complexiteit van het splitsen van signalen, die vaak redundant en gedegenereerd zijn. Hoewel de 5' en 3' splitsingsplaatsen relatief goed gekarakteriseerd zijn, vertonen vertakkingen, polypyrimidinekanalen en andere splitsingsregulerende elementen aanzienlijke sequentie- en positionele variabiliteit in hogere eukaryoten. Grootschalige karteringsstudies hebben verder aangetoond dat er meerdere vertakkingen kunnen bestaan binnen een enkel intron 7,8,9,10, wat de interpretatie van intron-exon-grensvariaties bemoeilijkt.

Deep learning is gebruikt om te beoordelen hoe primaire sequenties bijdragen aan de herkenning van de splitsingsplaats ^4,11,12, waaruit blijkt dat splitsingsvarianten clusteren op canonieke splitsingsplaatsen, terwijl ze zich spaarzaam uitstrekken tot in het exon en het 3'-gebied van introns. Dit patroon komt overeen met de gevestigde opvatting dat de selectie van de 5'-splitsingsplaats voornamelijk wordt bepaald door consensussequenties, terwijl de herkenning van de 3'-splitsingsplaats afhankelijk is van aanvullende intronische elementen, zoals vertakkingen en polypyrimidinekanalen. Bestaande modellen zijn echter getraind om constitutieve splitsingsplaatsen te onderscheiden van alternatieve of kunstmatige plaatsen in plaats van zich specifiek te richten op intronische varianten. Als gevolg hiervan vertonen deze computationele tools slechts een matige voorspellende nauwkeurigheid, waarbij ze voornamelijk splice-sites en exonische splicingvarianten identificeren 13,14,15,16. Naast voorspellende modellen zou een experimenteel systeem dat in staat is om splicingvarianten in bulk te valideren, de identificatie en karakterisering van splicingdefecten aanzienlijk verbeteren.

Uitgebreide RNA-sequencinggegevens die ziekte-geassocieerde intronische varianten koppelen aan splicingfenotypes blijven schaars vanwege hun lage frequentie en de moeilijkheid om splicing-uitkomsten te voorspellen op basis van bestaande datasets. Om deze kloof te dichten, zijn high-throughput splicing-assays en computationele modellen ontwikkeld om splicingvarianten systematisch te analyseren. Massaal parallelle splicing reporter-assays (MaPSy) zijn ontworpen om de impact van variabele sequenties op de selectie van de splitsingsplaats te evalueren. Door sequentievariaties in de buurt van de 5'- en 3'-splitsingsplaatsen op te nemen of door volledige intron-exon-regio's binnen vaste minigen-backbones te bestrijken, maakt MaPSy een functionele beoordeling van splicingveranderingen mogelijk. Vanwege de beperkingen van bulk-oligonucleotidesynthese worden diepe intronische varianten en pseudo-exon-activering echter niet in deze benadering opgenomen.

De robuustheid van MaPSy is gevalideerd met behulp van 70 onafhankelijke splicing-minigenen, wat een Pearson-correlatie van 0,89¹⁷ oplevert. Met name vertoonde ongeveer 90% van de splicingdonorvarianten (+1 en +2) splicingdefecten, wat de nauwkeurigheid van de test benadrukt. Bovendien heeft MaPSy met gerandomiseerde sequenties van de vestigingsplaats de gedegenereerde aard van de herkenning van de vestigingsplaats en de afhankelijkheid ervan van U2-kerneiwitten¹⁸ blootgelegd. Bovendien is een split-GFP MaPSy-ontwerp in combinatie met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) gebruikt om exon-skipping-gebeurtenissen veroorzaakt door genetische variaties te onderzoeken. Uit deze benadering bleek dat 54% van de splicing-disruptieve varianten zich in intronische regio's bevinden, waaronder canonieke splice-sites¹³, wat de belangrijke rol van intronische elementen bij de splitsingsregulatie onderstreept. Gezamenlijk versterken deze bevindingen het belang van intronische sequenties bij splicingcontrole en tonen ze het nut van MaPSy aan bij het identificeren van ziektegerelateerde splicingdefecten (Figuur 1).

Figuur 1: Experimenteel ontwerp van massively parallel splicing assay (MaPSy) van bijna-exon intronische mutaties. Varianten gedocumenteerd in databases van ziekten bij de mens werden verzameld en gesynthetiseerd als 5.307 paren oligo's. Elk oligopaar bevat een referentie- en een variant-allel over de 78-nucleotide (nt) intronische en 35-nt exonische regio's. De oligo's worden geflankeerd door gemeenschappelijke priming-plaatsen voor amplificatie en ligatie in 3-exon splicing minigenen. Dienovereenkomstig omvat het gesynthetiseerde gebied de 3's van het tweede exon van het minigen. Na assemblage van minigenen werden de gepoolde minigenen gesplitst in menselijke embryonale niercellen (HEK293T). De resulterende gesplitste isovormen werden geoogst en opgelost door amplicon-sequencing. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Chiang et ^al.17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

1. Synthese van de MaPSy oligonucleotide (oligo) bibliotheek

1. Basis oligostructuur: Ontwerp elke oligo in de 155-nuncleotide (nt) pool om een 35-nt exonische sequentie en een 80-nt intronische sequentie te bevatten, waarbij een 115-nt genspecifiek gebied wordt gevormd dat wordt geflankeerd door 20-nt gemeenschappelijke priming-sequenties aan elk uiteinde (Figuur 2A).
2. Verzameling varianten: Om de integriteit van het motief te behouden en u te concentreren op regelgevende regio's die van invloed zijn op splitsing, verzamelt u de intronische varianten die:
   -78 tot +10 nt vanaf de 3ss
   -3 tot +30 nt vanaf de 5ss
   OPMERKING: Klinische varianten kunnen worden verkregen uit ClinVar¹⁹, laagfrequente vermeldingen in dbSNP²⁰, relevante publicaties en aanvullende klinische databases. Genoomcoördinaten kunnen worden gebruikt om varianten met de gewenste genomische regio's te kruisen (bijvoorbeeld met behulp van BEDTools²¹). Alleen single-nucleotide polymorfismen (SNP's) en kleine inserties/deleties (indels) onder 15 nt moeten worden geselecteerd om de variabiliteit van de grootte binnen de oligopool voor bulksynthese te minimaliseren.
3. Basis minigenstructuur: Om de splicing junction-structuur te behouden, bevat elke minigenruggengraat drie exonen: twee constante buitenste exonen die coderen voor fragmenten van EGFP (van pGint, Addgene Plasmid #24217) en een middelste exon afgeleid van exon 15 van humaan CAMTA2 (Figuur 2B). Verteer zowel het CAMTA2-fragment als pGint met BamHI- en SalI-restrictie-enzymen en ligate het CAMTA2-fragment in pGint tussen de EGFP-exonen, waardoor pGint-CAMTA2-minigenen met drie exonen ontstaan (aanvullend bestand 1).
   OPMERKING: Het middelste exon, d.w.z. CAMTA2 exon 15, moet een tussenliggende splitsingsefficiëntie vertonen wanneer het tot expressie wordt gebracht in doelcellen. Deze eigenschap is essentieel omdat het een uitgebalanceerde basislijn biedt, waardoor zowel toenames als dalingen in splicing-efficiëntie als gevolg van varianteffecten kunnen worden gedetecteerd.
4. Ontwerp van de priming-site: Voeg de sequentie van de insertieplaats toe aan beide uiteinden van de bibliotheek, zodat elke oligo ~20-nt flankerende sequenties bevat die overlappen met de beoogde insertieplaats in het middelste exon/intron (Figuur 2A).
   OPMERKING: Als de oligopool is ontworpen voor meerdere minigeenconstructies, kunnen meerdere priming-sites worden opgenomen.
5. Barcode-ontwerp: Voor intronische varianten zijn exonische barcodes essentieel om genotypen te onderscheiden van gesplitste producten, aangezien intronische sequenties na het splitsen verloren gaan. Om splicingwijzigingen als gevolg van barcodesequenties (d.w.z. het barcode-effect) te voorkomen, plaatst u de barcodes distaal binnen de exonen, weg van de splitsingsplaatsen (d.w.z. direct naast de exonische priming-site).
   LET OP: Het wordt aanbevolen om waar mogelijk meerdere barcodes per variant te gebruiken. De vereiste lengte van de barcode is afhankelijk van de complexiteit van de bibliotheek. Bijvoorbeeld:
   Een barcode van 1 nt is voldoende als een referentie-allel gepaard gaat met slechts één variant.
   Een 2-nt barcode heeft de voorkeur als een referentie-allel gepaard gaat met zes verschillende varianten.
   Bibliotheken met meerdere varianten die nauw verwant zijn aan een enkel referentie-allel (bijv. slechts door één nucleotide verschillend) kunnen de complexiteit van de analyse vergroten.
6. Oligo's bestellen: Bestel oligo's in FASTA-bestandsformaat, waarbij elke variantjunctie naast het referentie-allel wordt gekoppeld.
   OPMERKING: Voor juncties met meerdere varianten is slechts één referentie-allel per junctie nodig. Gepoolde sequentiesynthesediensten zijn verkrijgbaar bij bedrijven zoals GeneScript (https://www.genscript.com/gentitan-oligo-pools.html), Twist Bioscience (https://www.twistbioscience.com/products/oligopools), IDT (https://sg.idtdna.com/pages/products/custom-dna-rna/dna-oligos/custom-dna-oligos/opools-oligo-pools) en Agilent (https://www.agilent.com/en/product/oligo-pools-oligo-gmp-manufacturing/pooled-oligo-synthesis). De lengte van de synthese, de capaciteit van de bibliotheek en de kosten kunnen variëren, afhankelijk van de provider en de regio.

Figuur 2: Oligo en splicing minigen ontwerp voor MaPSy. (A) Ontwerp voor gepoolde oligosynthese van het 3' of 5' uiteinde van introns. De diagrammen illustreren de basisstructuur van de 155-nt oligo's. De werkelijke capaciteit van oligosynthese hangt af van het bedrijf dat voor de productie is geselecteerd. (B) Ontwerp van de MaPSy-minigenen. Een minigen met drie exonen (ii) werd gemodificeerd uit pGint-plasmide (i) en de splitsingsplaatsen werden vervangen door de gepoolde oligo's om variaties in het splitsingssignaal (iii) te introduceren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Opbouw van MaPSy-bibliotheek DNA-sjablonen

1. Initiële versterking bij ontvangst van de oligopool
   1. Na ontvangst van de oligopool amplificeert u 10-50 ng van de oligobibliotheek met de ontworpen flankerende priming-plaatsen door een polymerasekettingreactie (PCR) van 100 μL met behulp van High-Fidelity DNA-polymerase om de oligo's om te zetten in dubbele strengen (LibF- en LibR-primers in tabel 1, thermocycler-instellingen in tabel 2).
   2. Ruim de PCR-producten op met behulp van zuiveringszuilen. Bind het PCR-product in detail aan het kolommembraan en was vervolgens met buffers die 70% ethanol bevatten om resterende primers, zouten en polymerase te verwijderen. Elueer ten slotte het gezuiverde PCR-product met behulp van zoutarm buffer- of nucleasevrij water.
   3. Controleer de versterkte oligogrootte door middel van gelelektroforese. Laad 5 μL van het gezuiverde PCR-product op een 1,5% agarosegel bereid in 1× TAE-buffer (40 mM Tris-base, 20 mM azijnzuur, 1 mM EDTA, pH 8,0).
      OPMERKING: Beperk PCR-amplificatiecycli tot 15 om overamplificatie en PCR-bias te voorkomen. Een secundaire fuzzy band, meestal groter dan het doelproduct, kan duiden op overversterking en onvolledig gloeien in het oligobad. Bewaar een deel van de PCR-producten en sequentie de oligopool om de kwaliteit en foutenpercentages te beoordelen voordat u verder gaat (stoppunt).
2. Constructie van MaPSy splicing minigenen - Initiële PCR.
   1. Backbone-fragmenten: Gebruik 0,5 ng van de pGint-CAMTA2-plasmide-ruggengraat als bron voor de twee belangrijkste PCR-fragmenten
      1. PCR-product 1: Amplificeer de CMV-promotor, het eerste exon (N-terminale EGFP) en een deel van het eerste intron (tabel 1 en tabel 2).
      2. PCR-product 3: Versterk een deel van het middelste exon (CAMTA2 exon 15), het tweede intron, het derde exon (C-terminale EGFP) en het SV40-polyadenyleringssignaal (Figuur 3, Tabel 1 en Tabel 2).
   2. Bibliotheekamplicon: PCR Product 2: Amplificeer voor de bibliotheek 3ss de bibliotheekamplicons met overlappende sequenties aan elk uiteinde om overeen te komen met de binnenuiteinden van PCR-product 1 en PCR-product 3, waardoor een efficiënte integratie mogelijk is in de 3's van CAMTA2 exon 15 (Figuur 3, Tabel 1 en Tabel 2).
      OPMERKING: Vervang voor de 5's-bibliotheek het 5'-uiteinde van de middelste exonjunctie door de bibliotheeksequentie.
3. Reinig na PCR alle producten met behulp van zuiveringskolommen als stap 2.1.2. Om besmetting van de sjabloonvector te voorkomen, zuivert u de gewenste producten uit PCR1 en PCR3 door middel van agarosegelextractie. In het bijzonder, na elektroforese, accijns ~ 100 mg agarosegel met het doel-PCR-product en los het op in de bindingsbuffer. Bind de opgeloste geloplossing aan het kolommembraan en ga vervolgens verder met het standaard PCR-zuiveringsprotocol.
4. Constructie van MaPSy-splitsingsminigenen - Overlappende extensie-PCR: Voer een of opeenvolgende rondes van overlappende PCR uit om de drie hoofdfragmenten (PCR-product 1, het bibliotheekamplicon en PCR-product 3; gebruik ~ 20 ng elk als sjabloon) te ligate in een splicing-minigen van volledige lengte (gebruik de meest externe primers CAMGFPF en CMVGFPR in tabel 1 en thermocycler-instellingen in tabel 2).
   OPMERKING: Het eindproduct bevat de CMV-promotor en drie exonen met de eerste 3's afgeleid van de oligonucleotidebibliotheek, en het is transfectieklaar voor celgebaseerde experimenten.
5. Schoon na de assemblage de DNA-sjablonen over de volledige lengte op met behulp van PCR-zuiveringskolommen. Als er niet-specifieke banden in de gel worden waargenomen, voer dan gelextractie uit om precies het gewenste product over de volledige lengte te isoleren als stap 2.3.
   OPMERKING: Sterk vergelijkbare sequenties in de bibliotheek kunnen leiden tot onvolledige assemblage. Als volledige assemblage in een enkele PCR-reactie moeilijk is, kan worden geprobeerd om opeenvolgende overlappende PCR's (beginnend met twee fragmenten en vervolgens een derde toe te voegen) te proberen. Om de PCR-specificiteit te verbeteren, kunt u overwegen de gloeitemperatuur aan te passen of touch-down PCR te implementeren om de bindingsspecificiteit voor complexe sjablonen te verbeteren. Bereid voldoende MaPSy-constructies voor om ten minste vier onafhankelijke experimenten uit te voeren. Bewaar een klein aliquot van elk construct voor sequencing van de volgende generatie om de sequentie-integriteit te verifiëren, aangezien sommige oligonucleotiden mogelijk niet efficiënt amplificeren en resulteren in onvolledige assemblages (stoppunt).

Figuur 3: Workflow van de bibliotheekconstructie. (A) Primers die worden gebruikt in de overlappende PCR (zie ook tabel 1). (B) De procedure voor overlappende PCR. Kortom, oligopools en de andere delen van de splicing-minigenen werden geamplificeerd door 25 PCR-cycli. Het fragment met de promotor en het eerste exon (PCR-product 1) werd aan de oligopool (PCR-product 2) gehecht door overlappende PCR met behulp van 20 amplificatiecycli. Vervolgens werd het gehechte product (PCR-product 1+2) verder gehecht aan het fragment dat het 3e^exon - en polyadenylatiesignaal (PCR-product 3) bevatte met behulp van 20 amplificatiecycli om het uiteindelijke construct te verkrijgen (PCR-product 1+2+3). Dit cijfer is aangepast met toestemming van Chiang et ^al.17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Opbouw van MaPSy-library primer		notitie
CMVGFPF	CCGCCATGCATTAGTTATTAATAG	PCR-product 1
LibR2	CAGGTCTTCAGGCCCCAGCC	PCR-product 1
LibF	GGCTGGGGCCTGAAGACCTG	PCR-product 2
LibR	AAGGCGCACATGACCCCGGG	PCR-product 2
LibF2	CCCGGGGTCATGTGCGCCTT	PCR-product 3
CMVGFPR	GGACAAACCACAACTAGAATGC	PCR-product 3
MaPSy-bibliotheek PCR-primer voor amplicon sequencing
P7-lib0F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-lib1F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-lib2F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-lib3F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTATAAGAGACAGNNNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P5-Lib0RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
P5-Lib1RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGAGAGAGCGAAGCTCCTGTCTCTGTAGT
P5-Lib2RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGAGAGAGNNCGAAGCTCCTGTCTCTGTAGT
P5-Lib3RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGAGAGNNNCGAAGCTCCTGTCTCTGTAGT
Validatie primer
Lib0F (Bibliotheek validatie)	AAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
Lib0R (Bibliotheek validatie)	CAGCTTGCCGTAGGTGGCAT

Tabel 1: Primers gebruikt in dit protocol.

PCR-reactiemix
Onderdelen	Volume
ddH2O	13,4 μl
5x HF Buffer	4 μL
10 mM dNTP's	0,4 μL
Voorwaartse primer 10 μM	0,5 μL
Omgekeerde primer 10 μM	0,5 μL
cDNA	1 μL
High-fidelity DNA-polymerase	0,2 μL

Voer het PCR-programma uit (20 μL-reactie)
	Temp	Tijd	Cycli
Eerste denaturatie	98°C	1 minuut	1
Denaturatie	98°C	jaren 30	10–20
Annealing	65°C	jaren 30
Extensie	72°C	jaren 30	Terug naar denaturatie
Laatste verlenging	72°C	5 minuten	1
Houden	4°C	Houden	Houden

Tabel 2: Instellingen van de thermocycler.

3. Expressie en herstel van splicing minigenen uit zoogdiercellen

1. Celcultuur: Behoud HEK293T cellen in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 eenheden/ml penicilline en streptomycine, en 2 mM L-glutamine in 5% CO₂ bij 37 °C.
2. Transfectie van het verbinden minigenen:
   1. Plaat 5 × 10⁵ HEK293T cellen in 2 ml middel in platen met 6 putjes 24 uur vóór transfectie.
   2. Transfecte cellen met 1-2 μg MaPSy-constructies, gedurende 5 minuten vooraf geïncubeerd met 3,75 μL transfectiereagens, volgens het protocol van de fabrikant. Succesvolle transfectie wordt aangegeven door de aanwezigheid van EGFP-signalen uit de gesplitste bibliotheek.
   3. Lyseer de cellen met 250 μL Trizol (of gelijkwaardig) 24 uur na transfectie.
3. RNA-extractie: Extraheer totaal RNA met behulp van een RNA-miniprep-kit, volgens het protocol van de fabrikant. Bind met name RNA in de Trizol aan de kolommembranen, spoel met buffers die 70% ethanol bevatten om zouten, eiwitten en andere onzuiverheden te verwijderen, en elueer het gezuiverde RNA met behulp van zoutarme buffer of nucleasevrij water.
   LET OP: Trizol (of gelijkwaardig) is zeer bijtend en giftig. Blootstelling kan leiden tot ernstige chemische brandwonden, blijvende littekens en nierfalen.
   OPMERKING: RNA kan maximaal een jaar (stoppunt) worden opgeslagen in Trizol (of een gelijkwaardig reagens op basis van Trizol, zoals de TOOLSmart RNA-extractor van TOOLS) bij -80 °C. Gezuiverd RNA kan tot twee jaar bij -80 °C worden bewaard als de vries-dooicycli worden geminimaliseerd (stoppunt).
4. Reverse transcriptie: Bereid cDNA voor uit 2 μg totaal RNA met behulp van reverse transcriptase met willekeurige hexamatoren, volgens het protocol van de fabrikant. Incubeer het RNA met 50 μM willekeurige hexamatoren bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten om gloeien mogelijk te maken en voer vervolgens omgekeerde transcriptie uit bij 55 °C gedurende 10 minuten.
   OPMERKING: cDNA kan maximaal een jaar bij -20 °C worden bewaard (stoppunt).
5. Amplificatie van de gesplitste minigenen: Voer PCR uit met behulp van de specifieke priming-sequenties voor de gesplitste minigenen (Tabel 2). Gebruik het minimale aantal cycli dat nodig is om het product op een agarosegel te visualiseren.
   OPMERKING: Gemengde banden van niet-gesplitste en gesplitste producten moeten zichtbaar zijn op de gel. Banden kunnen diffuus lijken als gevolg van de gemengde populatie van DNA-soorten (Figuur 4A).
6. Reinig het PCR-product met behulp van zuiveringskolommen als stap 2.1.2.
7. Bevestiging van sequentieadapters: Voer een laatste PCR-ronde uit om sequentie-adaptersequenties aan de ampliconuiteinden te bevestigen. Voeg 0-3 willekeurige nucleotiden toe aan het einde van de amplicons om een evenwichtige fluorescentiedetectie op het NextSeq-platform te garanderen (Tabel 1).
8. Reinig het PCR-product met behulp van zuiveringskolommen als stap 2.1.2.

4. Amplicon sequencing en analyse

1. Short-read sequencing: Onderwerp de PCR-amplicons aan 150 paired-end sequencing met behulp van Illumina Miseq, Novaseq of gelijkwaardig, via een kernfaciliteit of commerciële dienst.
2. Uitlijning:
   1. Creëer een referentiegenoom: Creëer een synthetisch "referentiegenoom" door elk uniek genotype als een afzonderlijk chromosoom te labelen. Het referentiegenoom omvat de synthetische exonen en introns in de amplicons.
   2. Lijn de sequentielezingen uit: Lijn de lezingen van het gepaarde uiteinde uit met het referentiegenoom met behulp van HISAT2^22,23 en pas de parameters aan om te controleren op het splitsen van specifieke elementen (zie aanvullend bestand 2 voor details over de opdrachtregel).
   3. Selecteer leeskwaliteit van hoge kwaliteit: converteer SAM naar BAM-indeling, filter op leeskwaliteit van hoge kwaliteit (toewijzingskwaliteit ≥60) en sorteer en indexeer vervolgens de BAM-bestanden²⁴ (zie Aanvullend bestand 2 voor details over de opdrachtregel).
   4. Identificeer lasjuncties en bereken de leeswaarden van de junctie: Kwantificeer het gebruik van de lasjunctie door exon-skipping-gebeurtenissen te extraheren uit CIGAR-tekenreeksen in het uitgelijnde BAM-bestand. Identificeer de lasbewerkingen die de junctie overspannen op basis van "N"-bewerkingen en verzamel het aantal gelezen lezen per junctiecoördinaat en streng om splitsingspatronen te beoordelen (zie aanvullend bestand 2 voor details over de opdrachtregel).
   5. Classificeer de canonieke splitsingssites: Classificeer splitsingssites als canoniek als ze overeenkomen met de geannoteerde GT-AG-juncties.
      OPMERKING: In zeldzame gevallen kunnen referentieallelen in MaPSy niet-canonieke splitsingsplaatsen gebruiken. Leesbewerkingen zonder kruispunten die de aangewezen positie van de splitsingslocatie overspannen, worden behouden als niet-gesplitste leesbewerkingen.
3. Statistische analyse om splitsingsvarianten te identificeren: Categoriseer lezingen in drie groepen:
   (1) gesplitste versus niet-gesplitste lezingen;
   (2) canoniek versus niet-canoniek onder alle gesplitste lezingen;
   (3) canoniek versus niet-canoniek plus niet-gesplitste lezingen.
   Voer een tweezijdige Fisher's exact-test uit, gevolgd door correctie van het percentage valse ontdekkingen (FDR) (tabel 3), om de impact van varianten op de efficiëntie en nauwkeurigheid van splitsing te evalueren.
4. Filter op splicingvarianten met een hoge betrouwbaarheid: Classificeer zowel referentie-/variantparen van meer dan 100 leestellingen met een q-waarde van minder dan 0,05 over vier herhalingen als significant. Beschouw vervolgens kandidaten met een 2-voudige odds ratio-verandering, waarbij het referentie- of het variantallel >5% niet-gesplitste en niet-canonieke lezingen heeft, splicingvarianten met een hoge betrouwbaarheid (Figuur 4B).

Leest	Gesplitst	Ongesplitst en/of niet-canoniek
Referentie	een	b
Variant	c	d

Tabel 3: Tabel van twee bij twee voor de exacte test van Fisher.

5. Validatie

1. Minigene splicing voor validatie:
   1. Oligosynthese en -amplificatie: Synthese van de DNA-oligo's van geselecteerde MaPSy-kandidaatsequenties afzonderlijk (bijv. door geïntegreerde DNA-technologieën). Amplificeer vervolgens de oligo's met behulp van de ontworpen flankerende sequenties tot dubbele strengen door middel van PCR met behulp van High-Fidelity DNA-polymerase (Tabel 2).
   2. Klonen van minigenen: verteer zowel de resulterende PCR-producten als de pGint-CAMTA2 door BbsI en SmaI en ligate het verteerde product door DNA-ligasen.
   3. Transfectie: Transfect de resulterende constructen in HEK293T cellen die een transfectiereagens als stap 3.2.2 gebruiken.
   4. RNA-extractie: Extraheer RNA uit de getransfecteerde cellen, zoals beschreven in stap 3.3.
   5. Omgekeerde transcriptie: Voer omgekeerde transcriptiepolymerasekettingreactie (RT-PCR) uit met behulp van willekeurige hexameren.
   6. Splicing isovormamplificatie: Amplificeer de splicing-isovormen met primers gericht op de eerste twee exonen van het minigen (Lib0F en Lib0Rl, Tabel 1, thermocycler-instellingen in Tabel 2). Los de versterkte producten op door elektroforese en visualiseer met behulp van het Gel Doc-systeem.
   7. Kwantificeer: Kwantificeer de signaalintensiteit van elke splitsingsisovorm met behulp van ImageJ (National Institutes of Health, VS)^25,26. U kunt ook de DNA-screeningkit gebruiken met behulp van de eGENE HDA-GT12 hoogwaardige nucleïnezuuranalysator om de intensiteit en het molecuulgewicht van de PCR-producten te kwantificeren.
   8. Isovormextractie en bevestiging: Isoleer elke isovorm door extractie van agarosegel als stap 2.3 en bevestig het splitsingsresultaat door Sanger-sequencing van de PCR-producten via een kernfaciliteit of commerciële dienst, waarbij wordt beoordeeld op normale splitsing, intron-inclusie en exon skipping.
2. Multi-exon splicing minigenen:
   1. Selecteer na validatie van de MaPSy-resultaten de gewenste variant en kloon drie tot vijf exonen van genomisch DNA (gDNA) om een meer genomische context te bieden voor het waargenomen splitsingsdefect.
   2. Voer plaatsgerichte mutagenese uit met behulp van mutageniserende primers en overlappende PCR om minigenconstructies samen te stellen die de gewenste sequentieverandering op de doellocatie herbergen.
      OPMERKING: Als de flankerende introns te lang zijn om te klonen, behoud dan ongeveer 300 nt van de intronische sequentie voor elke splitsingsplaats om een goede splitsingscontext te garanderen.
   3. Voer de celgebaseerde splicing-test uit zoals hierboven beschreven in 5.1.
3. Cellulaire validatie: Om het splitsingseffect in cellen te valideren, gebruikt u sjabloongebaseerde CRISPR-bewerking om de volgorde van de geselecteerde varianten in een geschikt cellulair model te wijzigen.
   OPMERKING: Gebruik indien mogelijk menselijke monsters met de specifieke variant om het splitsingspatroon rechtstreeks te beoordelen.

Resultaten

Na cellulaire splicing van MaPSy-constructies zijn zowel gesplitste als niet-gesplitste producten als een mengsel aanwezig. Vanwege de diversiteit in grootte van de bibliotheek en het potentieel voor niet-canonieke splitsing, kunnen beide soorten producten enigszins diffuus lijken op een gel. In constructies die gericht zijn op het 3'-uiteinde, heeft het tweede intron, dat gedeeltelijke adenovirale sequenties bevat, de neiging om zeer robuust te splitsen (Figuur 4A

Discussie

Het intrinsieke EGFP-signaal in de MaPSy-constructie maakt fluorescentie-gebaseerde detectie van exon skipping mogelijk. Als de sequentie in het middelste exon of introns het overslaan van exonen bevordert, produceert ligatie van de eerste en derde exonen een EGFP-signaal dat detecteerbaar is door FACS, waardoor dit een waardevolle methode is voor het identificeren van varianten die van invloed zijn op exon-skipping en het vergemakkelijken van op microscopie gebaseerde visualisatie van s...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Direct-zol RNA MiniPrep Plus kit	Zymo Research	R2072
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	11965084
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	26140079
L-Glutamine	Thermo Fisher Scientific	A2916801
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000015
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
pGint plasmid	Addgene	24217
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific	F530L
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28706
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
QIAxcel DNA Screening Kit (2400)	Qiagen	929004
SuperScript IV reverse transcriptase	Thermo Fisher Scientific	18090010