Methodenartikel

Op recombinneering gebaseerde productie van gemanipuleerde virale vectoren voor onderzoek en therapie

DOI:

10.3791/68988

⸱

26 september 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CEINGE Biotecnologie Avanzate Franco Salvatore S.C.aR.L., 2Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 3ImGen-T Srl

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recombineering, een door recombinatie gemedieerde genetische manipulatiemethode, maakt nauwkeurige virale genoommodificaties mogelijk zonder afhankelijk te zijn van enzymatische vertering. Deze benadering is cruciaal voor fundamenteel onderzoek, zoals gerichte deleties, en voor het ontwikkelen van gemanipuleerde virussen die worden gebruikt in oncolytische therapieën, gentherapie en genetische vaccins, waardoor de mogelijkheden in zowel onderzoek als klinische toepassingen worden uitgebreid.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De toenemende vraag naar gemanipuleerde virale vectoren in zowel fundamenteel als translationeel onderzoek heeft de behoefte onderstreept aan flexibele, snelle en schaalbare methoden om recombinante DNA-virussen te genereren. Strategieën die gebaseerd zijn op restrictie-enzymvertering en ligatie worden beperkt door sequentieafhankelijke beperkingen en tijdrovende kloonstappen. Hier beschrijven we de recombinatie-gemedieerde genetische manipulatiemethode (recombineering) die deze beperkingen omzeilt door nauwkeurige en naadloze modificaties van virale genomen in bacteriële kunstmatige chromosomen (BAC's) mogelijk te maken. Deze aanpak maakt efficiënte deletie, invoeging of vervanging van coderende of niet-coderende genetische elementen mogelijk, en biedt een krachtig platform voor de ontwikkeling van virale vectoren met hoge doorvoer. Recombineering is bijzonder waardevol in fundamentele onderzoekstoepassingen, zoals de deletie of mutatie van virale genen om hun functie te onderzoeken. Wat nog belangrijker is, deze methodologie maakt het mogelijk om tientallen recombinante virussen te genereren die parallel coderen voor verschillende immunostimulerende of therapeutische payloads, waardoor het uitzonderlijk geschikt is voor de snelle preklinische evaluatie van nieuwe constructen. Hoewel deze technologie potentieel voor elk wetenschappelijk doel kan worden geïmplementeerd, richt dit artikel zich op de toepassing van recombineering op twee specifieke gebieden: de generatie van oncolytische virussen op basis van het herpes simplex-virus en de ontwikkeling van niet-replicatieve adenovirale vectoren voor genoverdracht. Kortom, recombineering biedt een veelzijdige benadering van virale genoomengineering, waardoor de pijplijn van ontwerp tot functioneel testen aanzienlijk wordt versneld. De relevantie ervan strekt zich uit van fundamentele virologie tot translationele geneeskunde om te voldoen aan evoluerende onderzoeks- en klinische behoeften.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Virale vectoren zijn naar voren gekomen als krachtige hulpmiddelen in gentherapie, oncolytische virotherapie en de ontwikkeling van genetische vaccins vanwege hun natuurlijke vermogen om genetisch materiaal af te leveren aan gastheercellen. Ze maken gebruik van het natuurlijke tropisme en de transductiemechanismen van virussen, waardoor zowel voorbijgaande als langdurige genexpressie wordt vergemakkelijkt. Ze zijn in staat om te overleven in de extracellulaire omgeving, zich te hechten aan een specifieke cellulaire receptor (die het virale tropisme definieert) en hun internalisatie te bevorderen, de genexpressiemachine van de gastheercel te kapen en de expressie van hun eigen genen aan te sturen, en membraangebonden en intracellulaire sensoren van de aangeboren immuunarm te ontwijken 1,2. Op deze manier transformeren virussen na een productieve virale infectie cellen in virale nageslachtfabrieken die nieuwe virussen in het organisme verspreiden en uiteindelijk een ziekte veroorzaken.

Wildtype virussen kunnen door genetische manipulatie worden getransformeerd tot een biotechnologisch hulpmiddel: hun genoom kan gemakkelijk worden gemanipuleerd om het transductievermogen te behouden en een klinisch resultaat te verkrijgen. Op basis van hun klinische toepassing kunnen virale vectoren worden gemanipuleerd om (althans gedeeltelijk) hun replicatiecompetentie te behouden of te ablateren om replicatiecompetente of replicatie-incompetente vectoren te genereren 3,4.

Replicatiecompetente virussen zijn voornamelijk bedoeld voor oncolytische virusdoeleinden. Kankercellen, vaak met een tekort aan antivirale afweer1, maken replicatie mogelijk van verzwakte recombinante virussen die zijn gemanipuleerd door deletie van virulentiegenen. Deze virussen repliceren selectief in tumoren terwijl ze normaal weefsel sparen. Naarmate het begrip van de virologie voortschreed, zijn verzwakte virussen vervangen door preciezere genoommodificaties die zijn ontworpen om zowel de veiligheid als de therapeutische werkzaamheid te verbeteren.

Tot de interessegebieden behoren die chirurgische moleculaire engineering van virale genomen vereisen: i) Replicatie-voorwaardelijke oncolytische virussen, waarbij virale promotors worden vervangen door tumor-geassocieerde promotors (cellulaire promotors die te veel worden getranscribeerd in tumorcellen), waardoor virale genexpressie wordt beperkt tot zieke cellen5. ii) Virussen met veranderd tropisme 6,7, waarbij envelopglycoproteïnen die de infectie bepalen, kunnen worden gemodificeerd of vervangen door antilichaamfragmenten of liganden die zich richten op eiwitten die tot overexpressie worden gebracht op tumorcellen 8,9. iii) Gewapende oncolytische virussen. Tumorceldood geïnduceerd door oncolytische virussen veroorzaakt immunogene celdood (ICD), gekenmerkt door het vrijkomen van ontstekingsmediatoren 1,10 en tumorantigenen11. Deze signalen bevorderen een efficiënte herkenning van tumorantigenen door het immuunsysteem, waardoor de bewaking wordt hersteld12en combinatie met immuuncheckpointremmers 13,14,15 en andere immuuntherapieën zoals op RNA gebaseerde therapieën en vaccins 16.

Ter ondersteuning van dit immunotherapeutische effect kunnen interessante transgenen worden gecodeerd in het virale genoom, waardoor het virus niet alleen wordt geëxploiteerd vanwege zijn oncolytische activiteit, maar ook om zijn immunotherapeutisch potentieel te vergroten door de in-situ productie van relevante payloads 3,7,17,18,19. Deze payloads kunnen cytokines, chemokines, antilichamen, zelfmoordgenen en antigenen bevatten 3,20. Invoeging vereist precisie, waarbij intergene regio's van het virale genoom de voorkeur hebben om verstoring van virale genen te minimaliseren en replicatie en potentie te behouden7. Daarom zijn technieken die de screening van zowel optimale insertieplaatsen als interessante transgenen mogelijk maken, essentieel.

Aan de andere kant is het in de context van niet-replicatieve virussen, die worden gebruikt voor gentherapie of als vehikel voor genetische vaccins, belangrijk dat de virale vector het transgen aflevert (tijdelijk of langdurig) zonder te repliceren in de gastheercel om toxiciteit te voorkomen21. Adenovirale vectoren worden gekenmerkt door een hoge transductie-efficiëntie, robuuste expressie van transgenen en het vermogen om zowel delende als niet-delende cellen te infecteren3. Deze eigenschappen hebben hen tot een eersteklas vaccin gemaakt voor de ontwikkeling van genetische vaccins, waaronder die voor opkomende infectieziekten, zoals COVID-19, en voor genvervangingstherapieën22. Het bekendste voorbeeld van een adenovirale vector die op de markt is gekomen, is het Oxford-AstraZeneca COVID-19-vaccin, bekend onder de commerciële naam Covishield of Vaxzevria, op basis van een gemodificeerd chimpansee-adenovirus, ChAdOx1, dat codeert voor het Spike-eiwit van SARS-CoV-2. Wanneer Covishield intramusculaire wordt geïnjecteerd, kan het in de cellen doordringen en de expressie van het Spike-eiwit induceren, waardoor het immuunsysteem wordt voorbereid om er een immuunrespons tegen op te bouwen3.

Er is een duidelijke behoefte om virale genomen te wijzigen zonder te worden beperkt door restrictie-enzymherkenningsplaatsen. Onder de oncolytische virussen bieden op herpes simplex virus-1 (HSV-1) gebaseerde vectoren unieke voordelen, waaronder lytisch vermogen, veiligheid en grote genoomgrootte, waardoor aanzienlijke transgenen of meerdere genetische elementen kunnen worden ingevoegd23,24. Naast HSV zijn er nog veel andere virussen die therapeutisch veelbelovend zijn, zoals onlangs besproken in Sasso et al.3. In plaats van een universele "best-in-class" vector, zijn verschillende virale platforms geschikt voor verschillende therapeutische behoeften3. Momenteel blijven homologe recombinatiesystemen in bacteriën of het klonen van hybride gistbacteriën de meest voorkomende alternatieven voor restrictie-enzymen, maar deze zijn arbeidsintensief, uit meerdere stappen bestaand en inefficiënt25.

Een opkomend alternatief is het gebruik van CRISPR/Cas9, dat onlangs is toegepast om genomen van virussen te ontwikkelen, waaronder het vacciniavirus (VV), het herpes simplex-virus en adenovirale vectoren. Cas9 is aantrekkelijk voor geninactivatie via indelmutaties, maar wordt minder praktisch wanneer meerdere sneden nodig zijn om genoomsegmenten te verwijderen of een transgen in te voegen via donor-DNA. Bovendien wordt bewerking beperkt door het gRNA-ontwerp, off-target-effecten in zowel virale als gastheergenomen en afhankelijkheid van PAM-sequenties in interessegebieden25.

Met dit in gedachten, en aan de hand van twee voorbeelden op basis van HSV en adenovirus, illustreert dit artikel de recombineering-methode, die breed kan worden toegepast - van virussen tot bacteriofagen, complexe plasmiden en diverse experimentele systemen. Recombineering (homologe RECOMBInation-gemedieerde genetische engineering) is een in vivo genetische manipulatietechniek, voornamelijk gebruikt in Escherichia coli, die temperatuurafhankelijke bacteriofaagrecombinatie-eiwitten gebruikt om homologe recombinatie tussen DNA-elementen te katalyseren met slechts 30 bp homologie26. Deze benadering maakt nauwkeurige insertie, deletie of wijziging van sequenties mogelijk zonder afhankelijkheid van beperkingsplaatsen of DNA-grootte. In dit manuscript beschrijven we een versie op basis van de door hitte induceerbare E. coli-stam SW102, hoewel er ook alternatieve stammen met specifieke induceerbare systemen beschikbaar zijn27.

Recombineering begint met het voorbereiden van elektrocompetente bacteriecellen door middel van een gecontroleerde temperatuurschok om faagrecombinatiemachines te activeren. DNA-moleculen die de juiste homologie-armen dragen, worden vervolgens geëlektroporeerd. Dit kunnen dubbelstrengs DNA's (dsDNA's) zijn die zijn gegenereerd door restrictievertering of PCR of enkelstrengs DNA's (ssDNA's) zoals oligonucleotiden. De aanwezigheid van homologe sequenties samen met actieve recombinatie-eiwitten maakt het mogelijk om nieuwe DNA-moleculen met de gewenste modificatie te creëren.

Recombineering moleculaire kloneringstechnologie maakt nauwkeurige genetische manipulatie mogelijk en wordt toegepast in diverse contexten, waaronder het invoegen van selecteerbare of niet-selecteerbare markers in plasmiden, bacterieel chromosomaal DNA en bacteriële kunstmatige chromosomen (BAC's). BAC's zijn bijzonder waardevol voor het klonen van grote genomische fragmenten, waaronder adenoviraal en HSV-DNA, waardoor de snelle productie van virale vectoren mogelijk wordt. Naast translationele toepassingen ondersteunt recombineering ook fundamenteel onderzoek door gerichte verwijdering, wijziging of vervanging van virale genen of eiwitdomeinen mogelijk te maken. Recombineering heeft enkele beperkingen: korte homologiearmen belemmeren recombinatie in repetitieve regio's; PCR-geamplificeerde substraten kunnen af en toe mutaties introduceren; En de volgorde van het doelgebied moet bekend zijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Als voorwaarde voor recombinneering moet er een bekwame bacteriestam (bijv. SW102) met een BAC-Genome of Interest beschikbaar zijn. Hoewel recombineering een zeer efficiënte methode is om kolonies te verrijken die de gewenste modificatie hebben ondergaan, beschrijven we hier een recombineeringstrategie in twee stappen, de zogenaamde eerste en tweede stap (Figuur 1). In de eerste stap wordt een expressiecassette met zowel positieve als negatieve selectiemarkeringen in de locus van interesse ingebracht. In de tweede stap wordt deze cassette vervangen door de eigenlijke genetische modificatie die bedoeld is voor het uiteindelijke genoom. De selectiemarkers die in deze studie zijn gebruikt, zijn onder meer ampicillineresistentie (AmpR), bèta-galactosidase-activiteit (β-gal) en het sacB-gen ; Elke combinatie van positieve en negatieve selectiemarkers kan echter worden gebruikt, afhankelijk van de specifieke behoeften van de onderzoeksgroep.

1. Plaats de selectiecassette in het doelgebied

  1. Dag 0
    1. Streep SW102-cellen die het gewenste BAC bevatten op LB Agar + antibioticum (waarvan het resistentiegen in BAC zit (bijv. chlooramfenicol 12,5 μg/ml). Kweek ze een nacht in de broedmachine bij 32 °C.
      OPMERKING: Vermijd temperaturen > 32 °C om inductie van recombineering-genen tijdens deze fase te voorkomen.
  2. Dag 1
    1. Voer een PCR uit om de AmpR/LacZ/SacB-selectiecassette te amplificeren. Gebruik voorwaartse en achterwaartse primers die aan het 3'-uiteinde de sequentie bevatten om de selectiecassette te gloeien en te versterken, en aan het 5'-uiteinde 30-80 bp die homologiearmen vertegenwoordigen voor het virale genomische gebied dat moet worden gemodificeerd (tabel 1).
      OPMERKING: De selectiecassette, evenals de insert, kunnen eenvoudig als kunststof constructies worden besteld bij gespecialiseerde aanbieders. Er moet echter voor worden gezorgd dat de aanwezigheid van gedupliceerde promotors, terminators of andere genetische elementen wordt vermeden, hetzij in de BAC (controlerende BAC-genen) of in het virale genoom om ongewenste recombinatiegebeurtenissen te voorkomen.
    2. Zorg ervoor dat de identiteit en zuiverheid van het PCR-fragment door agarosegelelektroforese wordt uitgevoerd (aangezien de AmpR/LacZ/SacB-cassette 3.400 bp is, gebruik dan een agarosegel van 1%) en dat de waarden van 260/230 en 260/280 in overeenstemming zijn met zuiver nucleïnezuur.
    3. Inoculeer 's middags een enkele SW102-kolonie in 5 ml LB en broed 's nachts uit bij 32 °C.
  3. Dag 2
    1. Inoculeer 1-2 ml van de nachtcultuur in verse 100 ml LB. Kweek de bacteriën tot een OD600 van 0,55-0,7 en meet de OD600 regelmatig om de exponentiële fase niet te missen.
    2. Bereid een waterbad voor op 42 °C voor inductie en koel af tot 4 °C ~250 ml steriele ddH2O voor wasbeurten.
    3. Zodra de cultuur de gewenste OD heeft bereikt, wordt 50 ml overgebracht in een schone, conische buis en gedurende 15 minuten bij 42 °C in een waterbad geïncubeerd. Neem een niet-geïnduceerde negatieve controle op.
      OPMERKING: Deze stap zal lambda-rode eiwitten induceren.
    4. Laat de buisjes 10 minuten in ijs liggen en centrifugeer vervolgens 5 minuten bij 3.200 × g bij 4 °C (zowel geïnduceerd als niet-geïnduceerd).
    5. Gooi het supernatant weg, voeg 40 ml ijskoude, steriele ddH2O toe en suspendeer de pellet opnieuw (zowel geïnduceerd als niet-geïnduceerd).
    6. Centrifugeer opnieuw gedurende 8 minuten (zie stap 1.3.4) en herhaal de wasstap (stap 1.3.5) en centrifugeren. Herhaal de wasstap totdat het bovenstaande zo helder is als water (zonder troebelheden en suspensies) (2-4 wasbeurten).
    7. Gooi na de laatste centrifugatie het bovenstaande weg en suspendeer de pellet opnieuw in 200 μl ijskoude, steriele ddH2O (zowel geïnduceerd als niet-geïnduceerd bij 42 °C).
    8. Breng een hoeveelheid van de geresuspendeerde pellets (50 μl HSV-1 en 25 μl Adeno) over in voorgekoelde buisjes van 1,5 ml (zowel geïnduceerd als niet-geïnduceerd) bij 42 °C. Voeg 50-400 ng gezuiverd PCR-product toe (niet meer dan 5 μl). Draai de buizen rond en broed 5 minuten op ijs.
    9. Breng het mengsel van de vorige stap over in een voorgekoelde cuvet en elektropoleer bij 2,50 kV (2.500 V, 0,2 cm cuvet) (zowel 42 °C geïnduceerd als de niet-geïnduceerde).
    10. Laat de bacteriën na elektroporatie 1,5 uur bij 32 °C herstellen in 1 ml LB. Voeg 1 ml LB toe aan de cuvet om deze schoon te maken en alles op te vangen.
    11. Verspreid verschillende hoeveelheden bacteriën (10, 50, 200 μL) op LB Agar + Ampicilline (100 μg/ml), X-Gal (20 μg/ml) en IPTG (0,5 mM) en laat ze 's nachts (AAN) groeien bij 32 °C.
    12. Bereid platen met AMP/X-Gal (dezelfde concentratie als in stap 1.3.11) en platen met sacharose5.
  4. Dag 3
    OPMERKING: Op dit punt wordt verwacht dat kolonies zijn gegroeid en dat ze blauw lijken, maar alleen op de platen waar bacteriën werden geïnduceerd bij 42 °C en geëlektropoleerd met het inzetstuk met de selectiecassette werden geplateerd. Zodra dit is vastgesteld, is het noodzakelijk om de integriteit van de selectiecassette in sommige kolonies te verifiëren.
    1. Identificeer platen van ON waar kolonies <50 zijn om te voorkomen dat twee of meer kolonies worden geplukt. Kies verschillende kolonies (meestal zijn 8-10 voldoende om ten minste één geschikte kolonie te identificeren) en verdun ze in ongeveer 50 μL H2O. Inoculeer enkele, blauwe kolonies in 50 μL H2O en streep ze op zowel negatieve (LB Agar/Sucrose/Chlooramfenicol) als positieve (LB Agar/Ampicilline/Chlooramfenicol/X-Gal/IPTG) selectieve platen (dezelfde concentratie als in stap 1.1.2 en 1.3.11) (Figuur 2).
      OPMERKING: Er wordt verwacht dat er 20-100 kolonies op de plaat worden gevonden, waar 50 μL is verspreid. Als het aantal kolonies echter lager is, betekent dit niet noodzakelijkerwijs dat de recombinatie in het gedrang komt.
    2. Inoculeer het water uit stap 1.4.1 in 5 ml LB en incubeer de platen en de LB-cultuur een nacht bij 32 °C (figuur 2).
  5. Dag 4
    1. Selecteer alleen blauwe kolonies die op Amp/X-Gal-platen groeiden en niet op Sucrose-platen groeiden (Figuur 3). Voor deze positieve klonen (tabel 2) wordt een hoeveelheid van 500 μl van de nachtcultuur overgebracht naar 50 ml verse LB.
  6. Dag 5
    1. Bereid voor elke positieve kloon een glycerolsteek voor en extraheer en isoleer het BAC-plasmide (midiprep).
    2. Voer na BAC-extractie een kwaliteitscontrole uit om te controleren of de recombinatie correct heeft plaatsgevonden. Voer Sanger-sequencing van de invoegplaats uit. Als alles er correct uitziet, gaat u verder met het tweede deel.

2. Vervang de selectiecassette met de gewenste wijziging

  1. Dag 0
    1. Streep de positieve kloon op LB-agar. Incubeer een nacht bij 32 °C.
  2. Dag 1
    1. Voer een PCR uit om de insert/modificatie te amplificeren. Gebruik voorwaartse en achterwaartse primers met aan het 3'-uiteinde de sequentie om de selectiecassette te gloeien en te versterken en aan het 5'-uiteinde dezelfde 30-80 bp homologiearmen die in stap 1.3.1 zijn gebruikt (Tabel 1).
    2. Ervoor zorgen dat het PCR-fragment identiek en zuiver is door middel van agarosegelelektroforese en dat de waarden 260/230 en 260/280 in overeenstemming zijn met zuiver nucleïnezuur.
    3. Inoculeer een enkele kolonie in 5 ml LB en broed een nacht uit bij 32 °C.
  3. Dag 2
    1. Breng 2 ml van de nachtcultuur over in 100 ml LB en groei bij 32 °C tot OD600 0,55-0,7 bereikt (in ~2,5-3 uur). Bereid een waterbad voor op 42 °C voor inductie en koel af tot 4 °C ~250 ml steriele ddH2O voor wasbeurten.
    2. Zodra de gewenste OD is bereikt, wordt 50 ml cultuur overgebracht in een conische buis en gedurende 15 minuten in het waterbad van 42 °C geïncubeerd om λ-faagrecombinatie-eiwitten te induceren. Houd nog een tube van 50 ml bij 32 °C als niet-geïnduceerde controle.
    3. Plaats de buizen na warmte-inductie 10 minuten op ijs.
    4. Centrifugeer gedurende 8 minuten bij 3.200 × g bij 4 °C (zowel geïnduceerd als niet-geïnduceerd bij 42 °C).
      OPMERKING: Werk vanaf dit punt op ijs om de SW102-celcompetentie te behouden.
    5. Verwijder het bovenstaande middel en suspendeer de pellet opnieuw met 40 ml voorgekoeld water door voorzichtig rond te draaien.
    6. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 3.200 × g bij 0-4 °C.
    7. Herhaal de wasstap (stap 2.3.5) één keer.
    8. Verwijder het bovenstaande middel en suspendeer de korrel voorzichtig opnieuw in 100 μl water.
    9. Breng een hoeveelheid van de geresuspendeerde pellets (50 μl HSV-1 en 25 μl Adeno) over in voorgekoelde buisjes van 1,5 ml (zowel geïnduceerde als niet-geïnduceerde buisjes). Voeg 50-400 ng gezuiverd PCR-product toe (niet meer dan 5 μL). Draai de buizen rond en broed 5 minuten op ijs.
    10. Breng het mengsel van de vorige stap over in een voorgekoelde cuvet en elektroporaat bij 2,50 kV (zowel geïnduceerd als niet-geïnduceerd bij 42 °C).
    11. Laat de cellen 4-5 uur bij 32 °C schudden herstellen in 5 ml LB-medium.
      OPMERKING: De hersteltijd is langer dan bij de eerste recombineering-stap om afbraak van het resterende SacB-eiwit na vervanging van de cassette mogelijk te maken.
    12. Plaat verschillende hoeveelheden (50, 200, 500 μl) cultuur op LB-agar petrischaaltjes die sacharose, X-Gal en IPTG bevatten (dezelfde concentratie als in de stappen 1.1.2 en 1.3.11). Incubeer een nacht bij 32 °C.
  4. Dag 3
    1. Screen een aanzienlijk aantal kolonies (20-100) om de kans te vergroten dat positieve klonen worden geïdentificeerd die met succes recombinatie hebben ondergaan met het fragment met de gewenste modificatie en de selectiecassette. Voer een eerstelijnsscreening uit met behulp van kolonie-PCR. Gebruik een petrischaaltje met een rooster; kies kolonies uit een bepaald kwadrant en label ze (Figuur 4).
      OPMERKING: Een bijzonder effectieve aanpak is het gebruik van een paar primers waarin de ene primer buiten het doelgebied (op het virale genoom) gloeit en de andere binnen het gerecombineerde fragment (Figuur 5).
    2. Controleer de aanwezigheid en grootte van het PCR-amplicon door middel van agarosegel (1,5%).
    3. Kies uit het juiste kwadrant de positieve klonen en inoculeer in 100 ml LB. Incubeer een nacht bij 32 °C.
  5. Dag 4:
    1. Voer een midiprep uit om het plasmide uit bacterieculturen te extraheren.
    2. Verteer het plasmide met restrictie-enzymen en laat een agarosegel lopen om het spijsverteringspatroon te analyseren.
    3. Als het verteringspatroon correct is, gaat u verder met het sequencen van het gemodificeerde gebied van het virale genoom.
    4. Nadat u de moleculaire identiteit van recombinante klonen hebt verzekerd, gaat u vervolgens verder met transfectie en redding van virale deeltjes.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Generatie van een IL12-coderend oncolytisch herpesvirus
Zoals uiteengezet in het inleidende deel van dit werk, is een mogelijke toepassing van recombineering het inbrengen van immunostimulerende transgenen in het genoom van oncolytische virussen, met als doel hun immunotherapeutisch potentieel te vergroten. Hieronder geven we een voorbeeld van een dergelijke toepassing met behulp van een oncolytische vector op basis van HSV-1. Specifiek onderzoekt deze studie de impac...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit "RECOMBINEERING" (homologe RECOMBInation-gemedieerde genetische engineering) protocol maakt gebruik van een strategie in twee stappen: ten eerste, integratie van een selectiecassette in de genomische locus van belang, en ten tweede, vervanging van deze cassette door de gewenste modificatie (Figuur 1).

De gebruikte selectiemarkers zijn onder meer ampicillineresistentie (AmpR), bèta-galactosidase (β-gal) en sacB. AmpR maakt sele...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen relevante financiële of niet-financiële belangen om bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door: PRIN 2022-MUR Italië, Grant 20224NCSN5 (PreMeRetHOn). POR Campania: piattaforma per lo sviluppo di nuove tecnologie vaccinali. PNRR CN3 Nationaal centrum voor gentherapie en geneesmiddelen op basis van RNA-technologie. PNRR PE13 One Health fundamentele en translationele onderzoeksacties die zich richten op onvervulde behoeften op het gebied van opkomende infectieziekten. De auteurs bedanken de syntheseservice van Geneart voor het leveren van aangepaste DNA's. De auteurs betuigen ook hun oprechte dankbaarheid aan Michele Veneruso, die heeft bijgedragen aan de succesvolle afronding van deze studie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Ampicillinalleallemoleculaire kwaliteit
Voor oligo om Il-12 te versterken: CTGGCTAGCGTTTAA
ACGGGCCCTCTAGACTCG
AGCGGCCGCACGCCACCA
TGTGTCCTCAGAAGCTAACC		allealleHPLC gezuiverd
Voor oligo om AmpR/LacZ/SacB  cassette te versterken: CTGGCTAGCGTTTAAA
CGGGCCCTCTAGACTCGAG
CGGCCGCACGCCACCACC
CCTATTTGTTTATTTTTC		allealleHPLC gezuiverd
IPTGalleallemoleculaire kwaliteit
LB agar
LB medium
Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase Thermo ScientificF549S
Rev oligo om Il12 te versterken: GGCAACTAGAAGGCA
CAGTCGAGGCTGATCAGC
GGTTTAAACTTAAGCTTTC
AGGCGGAGCTCAGATAG 		allealleHPLC gezuiverd
Rev oligo om AmpR/LacZ/SacB  cassette te versterken: GGCAACTAGAAGGCAC
AGTCGAGGCTGATCAGC
GGTTTAAACTTAAGCTTT
TATTTGTTAACTGTTAATTG 		allealleHPLC gezuiverd
SacB/AmpR/LacZ selectie cassettedit manuscript--
Sucrosealleallemoleculaire kwaliteit
SW102 met BAC-HSV-1 of BAC-Advdit manuscript--
Tryptonealleallemoleculaire kwaliteit
Wizard SV GelPromegaA9281
X-galalleallemoleculaire kwaliteit
Gistextractalleallemoleculaire kwaliteit

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Froechlich, G., et al. Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus. Cancers (Basel). 12 (11), 3407(2020).
  2. Froechlich, G., et al. The common H232 STING allele shows impaired activities in DNA sensing, susceptibility to viral infection, and in monocyte cell function, while the HAQ variant possesses wild-type properties. Sci Rep. 13 (1), 19541(2023).
  3. Sasso, E., et al. New viral vectors for infectious diseases and cancer. Semin Immunol. 50 (1), 101430(2020).
  4. Ma, C. C., Wang, Z. L., Xu, T., He, Z. Y., Wei, Y. Q. The approved gene therapy drugs worldwide: from 1998 to 2019. Biotechnol Adv. 40 (3-4), 107502(2020).
  5. Sasso, E., et al. Replicative conditioning of herpes simplex type 1 virus by survivin promoter, combined to ERBB2 retargeting, improves tumour cell-restricted oncolysis. Sci Rep. 10 (1), 4307(2020).
  6. Froechlich, G., et al. Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing. Int J Mol Sci. 22 (2), 477(2021).
  7. De Lucia, M., et al. Retargeted and multi-cytokine-armed herpes virus is a potent cancer endovaccine for local and systemic anti-tumor treatment. Mol Ther Oncolytics. 19 (1), 253-264 (2020).
  8. Sasso, E., et al. One-step recovery of scFv clones from high-throughput sequencing-based screening of phage display libraries challenged to cells expressing native claudin-1. Biomed Res Int. 2015 (1), 703213(2015).
  9. Rusciano, G., Sasso, E., Capaccio, A., Zambrano, N., Sasso, A. Revealing membrane alteration in cells overexpressing CA IX and EGFR by surface-enhanced Raman scattering. Sci Rep. 9 (1), 1832(2019).
  10. Lin, D., Shen, Y., Liang, T. Oncolytic virotherapy: basic principles, recent advances and future directions. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 156(2023).
  11. Troise, F., et al. Prime and pull of T cell responses against cancer-exogenous antigens is effective against CPI-resistant tumors. Mol Ther Oncolytics. 32 (1), 200760(2024).
  12. Shalhout, S. Z., Miller, D. M., Emerick, K. S., Kaufman, H. L. Therapy with oncolytic viruses: progress and challenges. Nat Rev Clin Oncol. 20 (3), 160-177 (2023).
  13. Sasso, E., et al. Massive parallel screening of phage libraries for the generation of repertoires of human immunomodulatory monoclonal antibodies. MAbs. 10 (7), 1060-1072 (2018).
  14. Vetrei, C., et al. Novel combinations of human immunomodulatory mAbs lacking cardiotoxic effects for therapy of TNBC. Cancers (Basel). 14 (1), 121(2021).
  15. Zambrano, N., et al. High-throughput monoclonal antibody discovery from phage libraries: challenging the current preclinical pipeline to keep the pace with the increasing mAb demand. Cancers (Basel). 14 (5), 1325(2022).
  16. Froechlich, G., Sasso, E. We ARE boosting translation: AU-rich elements for enhanced therapeutic mRNA translation. Mol Ther Nucleic Acids. 36 (2), 102531(2025).
  17. Gentile, C., et al. Generation of a retargeted oncolytic herpes virus encoding adenosine deaminase for tumor adenosine clearance. Int J Mol Sci. 22 (24), 13521(2021).
  18. Finizio, A., et al. Integrating system biology and intratumor gene therapy by trans-complementing the appropriate co-stimulatory molecule as payload in oncolytic herpes virus. Cancer Gene Ther. 31 (9), 1335-1343 (2024).
  19. Tripodi, L., et al. Systems biology approaches for the improvement of oncolytic virus-based immunotherapies. Cancers (Basel). 15 (4), 1297(2023).
  20. Wang, H., et al. Cytokine-armed oncolytic herpes simplex viruses: a game-changer in cancer immunotherapy. J Immunother Cancer. 12 (5), e008025(2024).
  21. D'Alise, A. M., et al. Adenovirus encoded adjuvant (AdEnA) anti-CTLA-4, a novel strategy to improve adenovirus based vaccines against infectious diseases and cancer. Front Immunol. 14 (1), 1156714(2023).
  22. Wold, W. S., Toth, K. Adenovirus vectors for gene therapy, vaccination and cancer gene therapy. Curr Gene Ther. 13 (6), 421-433 (2013).
  23. Goins, W. F., Huang, S., Cohen, J. B., Glorioso, J. C. Engineering HSV-1 vectors for gene therapy. Methods Mol Biol. 1144 (1), 63-79 (2014).
  24. De Chiara, A., et al. Peptide nucleic acid-mediated circularization of target RNA as tool to inhibit translation. Int J Biol Macromol. 308 (1), 142230(2025).
  25. Wang, L., Chen, Y., Liu, X., Li, Z., Dai, X. The application of CRISPR/Cas9 technology for cancer immunotherapy: current status and problems. Front Oncol. 11 (1), 704999(2022).
  26. Sharan, S. K., Thomason, L. C., Kuznetsov, S. G., Court, D. L. Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering. Nat Protoc. 4 (2), 206-223 (2009).
  27. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33 (4), e36(2005).
  28. Zhang, W., et al. High-throughput cloning and characterization of emerging adenovirus types 70, 73, 74, and 75. Int J Mol Sci. 21 (17), 6370(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Virale genoomengineeringbacteri le kunstmatige chromosomenrecombinante DNA virussenoncolytische virussenherpes simplexvirusadenovirale vectorengentransferhigh throughput vectorontwikkeling

Gerelateerde artikelen