Evaluatie van de microbiële veiligheid van zuivelfabrieken met behulp van bacteriële proteomische profilering via de MALDI-benadering

Samenvatting

Dit protocol maakt een snelle, kosteneffectieve evaluatie van de microbiële samenstelling in zuivelproducten mogelijk door culturomics te combineren met MALDI-TOF MS. Het levert taxonomieresultaten die vergelijkbaar zijn met 16S rRNA-sequencing met een kortere doorlooptijd dan traditionele kweekmethoden.

Samenvatting

We presenteren een protocol met behulp van de matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF MS, hierna "MS" genoemd) identificatiemethode voor het monitoren van de aanwezigheid van micro-organismen in verschillende zuivelproducten (boter, mozzarella, kaas, melk, room) met behulp van een proteomische benadering, moderne culturomics en verschillende monstervoorbereidingsprocedures die als een snelle kunnen worden opgenomen in de laboratoria voor kwaliteitscontrole op het gebied van voedselveiligheid, Betrouwbaar en robuust hulpmiddel voor het bewaken van microbiële veiligheid. Het omvat een microbiële isolatiestap, het kiezen van gekweekte kolonies, monstervoorbereidingsprocedures (intacte cellen, extractie ter plaatse en in de buis), het instellen van MS-analyseparameters, het genereren en verzamelen van MS-spectra (eiwitvingerafdrukken) en ten slotte het verkrijgen van taxonomie met behulp van het MS-platform, gevolgd door gegevensinterpretatie en visualisatie. Deze methode, gevalideerd door talrijke studies, biedt een betrouwbaardere en kosteneffectievere identificatie van micro-organismen uit melk in vergelijking met commerciële biochemische testsystemen. Het onderscheidt zich als een veelbelovende vooruitgang in de voedselmicrobiologie en voldoet aan de uiteenlopende eisen van laboratoria door zijn eenvoudige protocollen en aanzienlijk kortere analysetijd. Het gepresenteerde protocol komt tegemoet aan de behoeften van de voedingsindustrie door betrouwbare microbiële identificatie te bieden in een juiste doorlooptijd (TAT) die zeer geschikt is voor productieprocessen.

Inleiding

Het algemene doel van dit protocol is om een uitgebreide methodologie te bieden voor het bewaken van de microbiële veiligheid van verschillende zuivelproducten, waaronder boter, kaas, melk en room, door MS te gebruiken voor bacteriële proteomische profilering. Deze aanpak, die moderne culturomics combineert met geoptimaliseerde monstervoorbereidingsprocedures, is bedoeld als een snel, betrouwbaar en robuust hulpmiddel voor laboratoria voor voedselveiligheid en kwaliteitscontrole. De grondgedachte achter het creëren en toepassen van deze methodologie komt voort uit de beperkingen van standaard microbiële identificatiemethoden. Veterinaire en voedseldiagnostische laboratoria vertrouwen al vele jaren op conventionele biochemische tests die de groei en het metabolisme van bacteriën onderzoeken op differentiële kweekmedia, gevolgd door verschillende enzymatische tests¹. Hoewel deze methoden, vaak gebaseerd op standaardrichtlijnen zoals die van Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, relatief goedkoop zijn en zowel kwantitatieve als kwalitatieve gegevens kunnen produceren, zijn ze arbeidsintensief en tijdrovend en vereisen ze uitgebreide mediavoorbereiding, monsterverdunning, plating, incubatie, kolonietelling, isolatie en gedetailleerde karakteriseringsstappen ^2,3.

De introductie van commerciële semi-geautomatiseerde en geautomatiseerde systemen zoals Analytical Profile Index (API), BBL Crystal, Vitek en Biolog MicroPlates stroomlijnde de microbiële identificatie met behulp van biochemische tests, waardoor de kosten en doorlooptijden werden verlaagd. Deze systemen hebben echter enkele nadelen, zoals een slechte reproduceerbaarheid, een gebrek aan vermeldingen in hun respectievelijke databases en moeilijkheden bij het bepalen van fenotypische variaties tussen stammen, met name voor niet-fermentatieve bacteriën of stammen binnen een soort met kleine biochemische verschillen, wat zou kunnen leiden tot onjuiste in vitro resultaten⁴. Daarom is MS geëvolueerd als een krachtig alternatief, dat momenteel veel voorkomt in de klinische microbiologie en aandacht krijgt in laboratoria voor veterinaire diagnostiek en melkkwaliteit. Deze aanpak wordt aangevuld door de snelheid, nauwkeurigheid en kosteneffectiviteit bij het detecteren van verschillende micro-organismen¹. Talrijke studies hebben aangetoond dat MS een betrouwbaardere identificatie van micro-organismen uit melk biedt, wat snellere en goedkopere resultaten oplevert dan commerciële biochemische testsystemen ^5,6,7. Hoewel biochemisch testen kan volstaan voor identificatie op genusniveau of groepsniveau, vereist diagnose op soortniveau vaak meer geavanceerde methoden zoals MS- of 16S rRNA-sequencing⁸. MS wordt inderdaad beschouwd als een veelbelovend platform voor flexibele en betrouwbare identificatie van microbiële isolaten in levensmiddelen, dat voldoet aan de uiteenlopende eisen van laboratoria voor voedselmicrobiologie door middel van eenvoudige protocollen en aanzienlijk kortere analysetijd, waardoor de voedselveiligheid wordt verbeterd ^4,5. De operationele kosten zijn minimaal dankzij het lage reagensverbruik, en de verwerking van monsters zorgt voor een grotere automatisering en een hoge doorvoer⁸. Er moet echter worden opgemerkt dat het nut van deze methode inherent afhankelijk is van de geselecteerde microbiële groeiomstandigheden (inclusief het type kweekmedia) en de dekking van een referentiedatabase van soorten, die worden erkend als de belangrijkste factoren die het nut ervan beperken.

MS speelt een belangrijke rol in de voedselmicrobiologie door door voedsel overgedragen pathogene, melkzuurbacteriën (LAB) en andere fermentatieve bacteriën te identificeren en te differentiëren⁹. Het nut ervan strekt zich uit tot moderne culturomics, die de identificatie mogelijk maken van alle microbiële kolonies die op kweekmedia worden gekweekt en het verkrijgen van informatie over kolonievormende eenheden (CFU's) vergemakkelijken⁷. Deze benadering is al met succes toegepast om complexe microbiële gemeenschappen te ontdekken, zoals die in menselijke darmen, betrokken zijn bij diabetische voetinfecties of verbonden zijn met de urinewegen, waardoor cultuurafhankelijke methoden in microbiologische praktijken nieuw leven worden ingeblazen ^10,11.

Dit protocol wordt gepresenteerd om laboratoria te begeleiden bij het effectief implementeren van MS voor de routinematige evaluatie van microbiële veiligheid in zuivelproducten, en komt tegemoet aan de behoefte van de industrie aan betrouwbare microbiële identificatie binnen een praktische doorlooptijd (TAT) die geschikt is voor productieprocessen. Het protocol beschrijft cruciale stappen, waaronder (1) microbiële isolatie van vloeibare (melk, room, wei) en vaste (boter, kaas) zuivelproducten met behulp van een selectie van geschikte kweekmedia (de Man, Rogosa en Sharpe agar - MRS-agar, M-17 agar, All-Purpose Tween 80 agar - APT-agar, China Blue Lactose agar - CBL-agar, Milk Plate Count Agar - MPCA, Tryptic Soy Agar - TSA) en op maat gemaakte incubatieomstandigheden; (2) gestandaardiseerde monstervoorbereidingsprocedures voor MS-analyse, met opties zoals directe kolonieoverdracht, mierenzuurextractie op het doel en ethanol/mierenzuur-eiwitextractie in de buis om tegemoet te komen aan verschillende bacterietypen en laboratoriumworkflows; en (3) systematische MS-analyse, inclusief instrumentkalibratie, het definiëren van optimale spectra-acquisitieparameters en richtlijnen voor gegevensinterpretatie, inclusief beoordeling van scorewaarden en consistentiecontroles voor een betrouwbare taxonomische toewijzing. Door een gestructureerde en gevalideerde aanpak te bieden, wil dit protocol de nauwkeurigheid en efficiëntie van microbiële monitoring in de zuivelindustrie verbeteren en uiteindelijk bijdragen aan een betere voedselkwaliteit en volksgezondheid.

Protocol

De reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Isolatie van zuivelgerelateerde bacteriën

1. Het verkrijgen van bacterieculturen uit vloeibare of vaste zuivelproducten
   1. Selectie van cultuurmedia
      1. Voor bacteriële isolatie uit zuivelmonsters selecteert u de kweekmedia op basis van de verwachte microbiële groepen, waaronder algemene groeimedia, media voor Gram-negatieve bacteriën, melkzuurbacteriën (LAB), sporenvormende bacteriën, evenals langzaam groeiende of kieskeurige micro-organismen.
         OPMERKING: Om het herstel van zowel dominante als zeldzame soorten te maximaliseren, moeten meerdere media parallel worden geënt. Een reeks voorbeeldmedia voor microbioomanalyse van zuivelmonsters wordt weergegeven in tabel 1.
   2. Inenting en uitplating
      1. Verkrijg een representatief monster van het zuivelproduct en meng grondig.
      2. Breng aseptisch 1 ml (vloeibare monsters: melk, room, karnemelk) of 1 g (vaste monsters: kaas, boter) van het monster over in een conische centrifugebuis van 15 ml met 9 ml steriel vloeibaar medium (peptonwater / 0,85% NaCl-oplossing). Verwarm voor vaste monsters het vloeibare medium tot 40-42 °C voordat u het monster toevoegt.
      3. Homogeniseer het monster door krachtig te vortexen gedurende 30-60 s. Ga voor vette of harde monsters door met homogeniseren totdat een uniforme suspensie is verkregen.
      4. Bereid een reeks tienvoudige verdunningen voor door 1 ml suspensie te nemen en deze over te brengen in opeenvolgende buisjes met 9 ml steriele oplossing. Meng elke verdunning goed.
         OPMERKING: Afhankelijk van het monstertype en het verwachte niveau van microbiële besmetting, bereidt u verdunningen van ^10-1 tot ^10-6. Voor de meeste monsters zijn verdunningen tot ^10-3 voldoende; Bij het analyseren van verse melk of blauwe kaas zal het echter nodig zijn om verdere verdunningen te bereiden. Om een nauwkeurige isolatie en gemakkelijke selectie van kolonies te garanderen, moet de optimale inoculatieverdunning 30-300 kolonies per plaat opleveren. Dit bereik zorgt voor een duidelijke differentiatie van individuele kolonies en minimaliseert het risico van overlappende groei, waardoor het verkrijgen van niet-verontreinigde en homogene bacterieculturen voor latere analyse wordt vergemakkelijkt. Voor sommige verwerkte zuivelproducten (bijv. karnemelk) kan een onverdund vers monster (bijv. 0.1 ml) worden gebruikt voor direct plateren.
      5. Neem 0,1 ml van het monster of de verdunning ervan en breng het over op het oppervlak van eerder bereide petrischaaltjes die het juiste agarmedium bevatten.
      6. Verdeel het inoculum gelijkmatig over het agaroppervlak met behulp van een steriele spreider. Laat het inoculum 15 minuten in het medium trekken en keer vervolgens de platen om.
   3. Incubatie
      1. Aërobe incubatie: inoculeer voor alle onderzochte monsters APT-, M-17-, CBL-, MPCA- en TSA-agarplaten, incubeer onder aërobe omstandigheden bij 37 °C en 30 °C gedurende 24 uur. De incubatietemperaturen werden bepaald op basis van de optimale groeivereisten van verschillende microbiële groepen die cruciaal zijn voor het beoordelen van zowel de hygiënische kwaliteit (30 °C voor algemene mesofielen) als de veiligheid van de volksgezondheid (37 °C voor met de mens geassocieerde pathogenen en indicatororganismen) van zuivelproducten.
         OPMERKING: Als een intensieve groei van sporenvormende bacteriën wordt verwacht, heeft in het geval van TSA de voorkeur aan een kortere (~12 uur) incubatietijd.
      2. Anaërobe incubatie: voor alle onderzochte monsters MRS-agarplaten inoculeren, 24-72 uur onder anaërobe omstandigheden bij 37 °C en 30 °C incuberen, waarbij de microbiële groei elke dag wordt gecontroleerd. De incubatietemperaturen zijn bepaald zoals vermeld in stap 3.1.
         OPMERKING: Anaërobe incubatieomstandigheden kunnen worden bereikt door platen in luchtdichte containers te plaatsen met anaërobe atmosfeergenererende sachets, die zuurstof elimineren en een geschikte atmosfeer bieden voor de groei van anaërobe bacteriën.
   4. Het verkrijgen van zuivere culturen
      1. Inspecteer na de incubatie de platen en selecteer volwassen enkele kolonies op basis van hun morfologische kenmerken (bijv. grootte, vorm, kleur, textuur).
      2. Zuiver de geselecteerde kolonies door subcultuur (strepen) op hetzelfde agarmedium met behulp van een microbiële lus van 1 μl en dezelfde incubatieomstandigheden.

Cultuur medium	Toepassing	Cultuur conditie
Tryptische soja-agar (TSA)	Algemeen medium voor de kweek van een breed scala aan bacteriën	30–37 °C, 24–48 uur, aeroob
Bloedagar (BLA; met 5% schapenbloed)	verrijkt, differentiatie van hemolyse, nuttig voor Streptococcus, Listeria, Bacillus	30–37 °C, 24–48 uur, aeroob
MRS-agar (de Man, Rogosa en Sharpe-agar)	selectief voor Lactobacillus en andere LAB Voeg 1% Tween-80 toe om de groei van L. casei, L. delbrueckii, L. helveticus of L. acidophilus te ondersteunen.	30 °C, 48–72 uur, anaëroob of micro-aerofiel
M17 agar	selectief voor Lactococcus, Streptococcus thermophilus	30 °C, 48–72 uur, anaëroob of micro-aerofiel
APT-agar (Tween voor alle doeleinden 80 agar)	selectief voor LAB en sommige Bifidobacteriën	30 °C, 48–72 uur, anaëroob of micro-aerofiel
Scheadler agar	selectief en verrijkend, isolatie van anaëroben, waaronder Bifidobacterium, Clostridium	30–37 °C, 48–72 u, anaëroob
CBL-agar (China Blue Lactose-agar)	Differentieel medium, voor coliforme bacteriën en andere lactosefermenterende bacteriën	37 °C, 24–48 uur, aëroob
Agar met melkschijftelling (MPCA)	universeel, voor het totale aantal aërobe mesofiele bacteriën	30–37 °C, 24–48 uur, aeroob

Tabel 1: Lijst met voorgestelde media voor microbioomanalyse van zuivelmonsters met gespecificeerde kweekomstandigheden.

2. Voorbereiding van bacteriële monsters voor MS-analyse

1. Bereid voor voordat u begint de MALDI-matrixoplossing voor
   OPMERKING: De meest gebruikte matrixverbinding is HCCA, α-cyaan-4-hydroxykaneelzuur. Deze verbinding is lichtgevoelig, dus bereid de matrix voor en bewaar deze in donkere containers of uit de buurt van licht.
   1. Bereid het oplosmiddelmengsel in de volgende verhoudingen: 50% acetonitril (HPLC-kwaliteit), 47,5% water (HPLC-kwaliteit) en 2,5% trifluorazijnzuur (TFA).
   2. Los de matrix op in het oplosmiddelmengsel tot een uiteindelijke concentratie van ongeveer 10 mg/ml (of tot verzadiging - totdat onopgeloste kristallen zichtbaar blijven).
   3. Als de oplossing niet helder is (er blijven kristallen achter), centrifugeer of filtreer de oplossing dan (bijv. door een spuitfilter van 0,22 μm) om een heldere vloeistof te verkrijgen.
      OPMERKING: Opslag in de koelkast is toegestaan voor korte periodes, mits een laag aantal ontdooicycli.
2. Om bacteriën met MS te identificeren, gebruikt u een van de 3 monstervoorbereidingsprocedures:
   1. Directe kolonieoverdracht - Gebruik deze eenvoudigste en snelste methode bij het omgaan met goed groeiende, niet-lysisresistente bacteriën, zoals de meeste Gram-negatieve bacteriën.
      1. Breng met behulp van een steriele lus of tandenstoker een kleine hoeveelheid (~1 μL) van de volwassen kolonie over naar een plek op de MALDI-plaat.
      2. Smeer het bacteriële materiaal rechtstreeks op een aangewezen plek op de MALDI-richtplaat om een dunne, gelijkmatige laag te creëren.
      3. Eenmaal gedroogd, bedek de plek met 1 μL HCCA-matrixoplossing en laat aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.
   2. On Target mierenzuurextractie - Gebruik voor moeilijk te identificeren bacteriën (bijv. Gram-positief, gist) waarvan de celwanden het moeilijk maken om eiwitten vrij te maken zonder aanvullende verwerking.
      1. Pak een kleine hoeveelheid bacteriële biomassa op van een enkele bacteriekolonie met behulp van een microbiële wegwerplus of steriele tandenstoker.
      2. Smeer het bacteriële materiaal rechtstreeks op een aangewezen plek op de MALDI-richtplaat om een dunne, gelijkmatige laag te creëren.
      3. Bedek het uitgesmeerde bacteriële materiaal met 1 μL 70% mierenzuuroplossing en laat aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.
      4. Eenmaal gedroogd, bedek de plek met 1 μL HCCA-matrixoplossing en laat aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.
   3. In-tube eiwitextractie (ethanol/mierenzuurmethode) - Gebruik deze methode voor moeilijk te identificeren micro-organismen, waaronder sommige Gram-positieve bacteriën, gisten en mycobacteriën.
      1. Breng met behulp van een steriele lus of wattenstaafje 1-3 volledige kolonies over van een agar-kweekplaat naar een microcentrifugebuis van 1.5 ml met 300 μL steriel water.
      2. Voeg 900 μL absolute ethanol toe om de uiteindelijke ethanolconcentratie aan te passen tot ongeveer 75%. Mix of vortex voor een paar seconden.
      3. Centrifugeer het monster gedurende 2 minuten bij 15.000 x g (kamertemperatuur).
      4. Gooi het bovenstaande voorzichtig weg zonder de celpellet te verstoren.
         OPMERKING: In het geval van slijmverrekkingen wordt extra centrifugeren bij 4 °C aanbevolen.
      5. Laat de pelletbuis open totdat alle resterende ethanol is verdampt (5-10 min, kamertemperatuur).
      6. Voeg 20-50 μL 70% mierenzuur (FA) toe aan de gedroogde celpellet. Meng door pipetteren of vortexen totdat de pellet volledig is geresuspendeerd.
         OPMERKING: Het volume moet in verhouding staan tot de hoeveelheid biologisch materiaal.
      7. Voeg een gelijk volume acetonitril (ACN) toe aan de mierenzuursuspensie. Meng voorzichtig.
      8. Centrifugeren op 15.000 x g gedurende 2 minuten (kamertemperatuur).
      9. Breng 1 μl van het bovenstaande over op een aangewezen plek op een MALDI-richtplaat.
      10. Laat de plek volledig aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.
      11. Bedek de gedroogde monsterplek met 1 μl α-cyaan-4-hydroxykaneelzuur (HCCA) matrixoplossing.
      12. Laat de matrix volledig aan de lucht drogen bij kamertemperatuur voordat u de MS-analyse uitvoert (Figuur 1).
          OPMERKING: 70% mierenzuur: bijtend; Veroorzaakt brandwonden. Handvat in een zuurkast. Acetonitril: Ontvlambaar en giftig. Blijf uit de buurt van vlammen en vermijd inademing/contact. Trifluorazijnzuur (TFA): Sterk, bijtend en vluchtig; Vermijd huid-/oogcontact en inademing. Draag altijd een laboratoriumjas, chemicaliënbestendige handschoenen en een veiligheidsbril. Behandel alle reagentia in een zuurkast om inademing te voorkomen. Vermijd huid- en oogcontact; Werk uit de buurt van open vuur. Verzamel zuur en organisch oplosmiddelafval in duidelijk geëtiketteerde, compatibele containers voor correcte verwijdering.

Figuur 1: Een beslissingsboom die het proces visualiseert van het selecteren van een geschikte monstervoorbereidingsprocedure voor de identificatie van bacteriële isolaten via de MS-techniek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Spectra-acquisitie en microbiële identificatie met behulp van de MS-techniek

1. Calibratie
   OPMERKING: Voor een nauwkeurige massabepaling in MS moet het instrument, voordat onbekende monsters worden geanalyseerd, worden gekalibreerd met behulp van de juiste normen. Een goede kalibratie van het instrument is cruciaal voor een betrouwbare identificatie.
   1. Bereid kalibratorvlekken op de MALDI-richtplaat voor die 1 μl van: a) Bacterial Test Standard (BTS) bevatten, met een extract van Escherichia coli DH5-alfa, met een massabereik van 3,6-17 kDa (voor MBT Biotyper); (b) Microbiologische kalibrator met E. coli ATCC 25922 eiwitextract, ribonuclease en myoglobine, met een massabereik van 3,6-17 kDa (voor EXS2600 systeem). Laat aan de lucht drogen en bedek de gedroogde kalibratorplekken met 1 μL HCCA-matrixoplossing, vergelijkbaar met monstervoorbereiding.
   2. Laad de MALDI-richtplaat met de voorbereide monsters en kalibrerende spots in het instrument. Voer de analyse uit op kalibrerende spots met behulp van de kalibratiemodus (automatisch).
   3. Controleer de kalibratie om ervoor te zorgen dat de nauwkeurigheid van de massa binnen acceptabele limieten ligt (100 ppm) het gespecificeerde massabereik (2-20 kDa).
2. Spectra acquisitie
   OPMERKING: Wanneer het instrument is gekalibreerd, worden massaspectra van elke voorbereide monsterplek verkregen.
   1. Algemene acquisitieparameters
      1. Gebruik de massaspectrometer in de lineaire positieve ionenmodus.
      2. Stel het massadetectiebereik in van 2.000-20.000 m/z (2-20 kDa).
   2. Gebruik de volgende instrumentspecifieke instellingen
      1. Ionenbronspanningen: ionenbron 1 (IS1) bij 20 kV, ionenbron 2 (IS2) bij 18 kV, lensspanning bij 9 kV. De acceleratiespanning kan oplopen tot 25 kV.
      2. Detectorspanning: Ingesteld op ongeveer 2,65 kV.
      3. Instellingen voor pulsionenextractie: 100 ns, vertraagde extractietijd vastgesteld op 230 ns.
      4. Laservermogensinstellingen: handmatig aanpassen om de beste spectrumkwaliteit te verkrijgen (gezien het aantal signalen en signaalintensiteiten), meestal variërend van 40%-65% van het minimaal vereiste vermogen.
      5. Aantal opnamen per spectrum: verkrijg een voldoende aantal laseropnamen vanuit verschillende regio's van elke plek om een somspectrum te genereren met een goede signaal-ruisverhouding (S/N)→ (a) gemiddeld 200 opnamen, genomen in stappen van 50 schoten vanuit 4 verschillende regio's van elke plek of (b) opname in stappen van 500 schoten - 50 opnamen vanuit tien verschillende posities van de doelplek met behulp van de AutoXecute-modus.
   3. Voorbeeld meetstrategie
      1. Meet meerdere plekken per isolaat (minimaal 2 plekken per isolaat).
      2. Verkrijg spectra in replicatie voor elke plek om de consistentie en nauwkeurigheid van de bevindingen te garanderen → in tweevoud te meten, waarbij wordt gestreefd naar een bepaald aantal totale spectra per monster (4 spectra per monster ten minste → technische replicaten).
         OPMERKING: Onderwerp biologische monsters (ten minste 3) om biologische replicaten te krijgen.

4. Identificatie van micro-organismen en gegevensanalyse

OPMERKING: Identificatie van het organisme vindt plaats door het verkregen eiwitprofiel (specifieke eiwit "vingerafdruk" van het micro-organisme) te vergelijken met een referentiedatabase, en de resulterende correlatie van zowel signaalpositie als intensiteit wordt gebruikt om een overeenkomende waarde te genereren, die het betrouwbaarheidsniveau beschrijft waarmee het bestudeerde organisme werd gematcht met het overeenkomstige referentiemicro-organisme. Identificeer micro-organismen door verwerkte spectra te vergelijken met referentiedatabases.

1. Spectra verwerking
   1. Gebruik geschikte software voor spectraverwerking: (a) flexAnalysis voor MALDI Biotyper-systemen of (b) EX-Accuspec voor EXS2600-systemen.
   2. Pas een Savitzky-Golay-methode toe als een afvlakkingsalgoritme (breedte 2 m/z, 10 cycli).
   3. Voer een basislijncorrectie uit om achtergrondruis te verwijderen met behulp van het TopHat-algoritme (S/N-drempel = 2, TopHat-filterbreedte 0,2 Da ).
   4. Gebruik een centroid-modus als algoritme voor piekdetectie (S/N-drempel = 2 ).
2. Databasevergelijking en score-interpretatie
   1. Upload de verwerkte massaspectra van onbekende isolaten naar het MALDI-platform voor microbiële identificatie. Voer vervolgens de identificatie uit.
      OPMERKING: In deze onderzoeken is de volgende software gebruikt: Biotyper versie 4.1.100, Ex-Accuspec versie V1. In het geval van MALDI Biotyper-software wordt aanbevolen om hoofdspectra (MSP's) te maken op basis van ruwe spectra om de best passende betrouwbaarheid te garanderen.
   2. Evalueer de identificatieresultaten volgens de standaarddrempels van de fabrikant.
      OPMERKING: Voor MALDI Biotyper en EXS2600 zijn de scorewaarden:
      2.300-3.000: zeer waarschijnlijke identificatie van soorten;
      2.000-2.299: veilige identificatie van het geslacht, waarschijnlijke identificatie van de soort;
      1.700-1.999: waarschijnlijke identificatie van het geslacht;
      0.000-1.699: geen betrouwbare identificatie.
      Tijdens de evaluatie van het identificatieresultaat afgeleid van het MALDI Biotyper-platform worden de bevindingen ondersteund met behulp van consistentiecategorieën: A-Species Consistent → beste match en alle andere matches met een vergelijkbare hoge scorewaarde (>1.999 ) wijzen op dezelfde soort; B - Geslacht Consistent → beste overeenkomst en andere overeenkomsten met vergelijkbare scorewaarden (1.700 - 1.999) wijzen op hetzelfde geslacht, maar kunnen verschillen op soortniveau; C- Er is niet voldaan aan de consistentie- → vereisten voor consistentie op soort- of geslachtniveau.

Resultaten

Culturele benadering
De culturomische benadering is een strategie die gericht is op het maximaal diversifiëren van de omstandigheden van de teelt van micro-organismen om de kans te vergroten dat onder andere zeldzame, moeilijk te kweken of voorheen onbeschreven soorten worden geïsoleerd¹². Dit maakt het mogelijk om een veel breder beeld te krijgen van de biodiversiteit van de microflora die aanwezig is in verschillende monsters, bijvoorbeeld vo...

Discussie

Het protocol voor microbiële identificatie van zuivelproducten biedt een belangrijke vooruitgang ten opzichte van traditionele methoden door te zorgen voor een optimale consensus over snelheid, betrouwbaarheid en kosteneffectiviteit. Desalniettemin vereisen enkele cruciale stappen binnen het protocol zorgvuldige aandacht. Ten eerste is de isolatie- en kweekfase fundamenteel. De kweekmedia en incubatieomstandigheden moeten overeenkomen met de verwachte microbiële diversiteit en belasting....

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
70% mierenzuur	Chempur	115676307
Acetonitril	Merck KGaA	1.00014.1011
APT agar	Merck KGaA	1.10453.0500
Bacterie Test Standaard	Bruker Daltonik GmbH	8255343
CBL Agar (China Blue Lactose Agar)	Merck KGaA	1.02348.0500
Columbia Blood agar	Oxoid	CM0331B
M17 agar
Milk Plate Count Agar (MPCA)	Oxoid	cm0681
MRS agar (de Man, Rogosa en Sharpe Agar)	Merck KGaA	1.10660.0500
MSP 96 target gepolijst staal BC	Bruker Daltonik GmbH	8280800
Pepton water	Sigma-Aldrich	70179
Scheadler agar	Sigma-Aldrich	91019
Schapenbloed	Biomaxima	SL0160-100
trifluorazijnzuur	Sigma-Aldrich	T6508
Tryptic Soy Agar (TSA)	Sigma-Aldrich	22091
Water	Merck KGaA	1.15333.2500
α-Cyano-4-hydroxycinnaminezuur	Bruker Daltonik GmbH	8201344