Methodenartikel

Monstervoorbereiding voor eencellige massaspectrometrie Metabolomics-onderzoeken: gecombineerd cellenwassen, afschrikken, drogen en bewaren

DOI:

10.3791/68995

⸱

16 september 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Oklahoma, 2Department of Biochemistry and Physiology, University of Oklahoma Health Sciences Center

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol heeft tot doel celmetabolieten te behouden voor eencellige massaspectrometrie (SCMS) door het wassen van vluchtige zoutoplossingen, het snel afschrikken van vloeibare stikstof, vriesdrogen en opslag van -8 °C te combineren. Het toont aan dat het afschrikken van vloeibare stikstof essentieel is voor het behoud van metabolietprofielen, terwijl langdurige koude opslag tot een minimum moet worden beperkt om metabole veranderingen te voorkomen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eencellige massaspectrometrie (SCMS) is een onmisbaar hulpmiddel geworden voor het bestuderen van het cellulaire metabolisme. Als gevolg van de vooruitgang in moderne massaspectrometrie (MS) technieken en de vraag naar studies naar celheterogeniteit in fundamentele biologische wetenschappen en ziekten bij de mens, is een verscheidenheid aan verschillende SCMS-technieken ontwikkeld en toegepast in laboratoriumonderzoek. Aangezien metabolieten de celstatus nauwkeurig kunnen weergeven, wordt SCMS-metabolomics-analyse van levende cellen beschouwd als een krachtig hulpmiddel om moleculaire informatie over cellen te verstrekken. Een grote uitdaging bij SCMS-analyse van levende cellen is echter het behoud van de endogene metabolietprofielen tijdens de voorbereiding, het transport en de meting van monsters. Cellulaire metabolieten ondergaan een snelle omzet en zijn zeer gevoelig voor veranderingen in het milieu, waardoor ze vatbaar zijn voor degradatie of transformatie voorafgaand aan de analyse. Om deze beperking aan te pakken, presenteren we een robuust en reproduceerbaar celbereidingsprotocol dat is ontworpen om de integriteit van cellulaire metabolieten voor SCMS te behouden. Het protocol integreert celspoeling met een vluchtige ammoniumformiaat (AF)-oplossing, snel blussen met vloeibare stikstof (LN2), vacuüm vriesdrogen en opslag bij -80 °C. Deze aanpak minimaliseert schade aan het celmembraan en stopt de metabolische activiteit effectief. De resultaten geven aan dat een snelle celafkoeling van vitaal belang is; het beperken van de bewaartijd bij -80 °C is echter noodzakelijk om celmetabolieten te behouden. Het voorgestelde protocol kan mogelijk worden gebruikt voor andere bestaande SCMS-technieken voor brede toepassingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cel-tot-cel heterogeniteit is naar voren gekomen als een fundamenteel principe van biologische systemen, vooral in de context van ziekteprogressie, resistentie tegen geneesmiddelen en cellulaire differentiatie 1,2. In meercellige organismen kunnen zelfs genetisch identieke cellen in dezelfde micro-omgeving verschillende fenotypes vertonen, die voortkomen uit verschillen op transcriptomisch3, proteomisch4 en, cruciaal, metabolomischniveau 5. Hoewel single-cell genomics en transcriptomics het afgelopen decennium aanzienlijk aan populariteit hebben gewonnen, blijft single-cell metabolomics relatief onderontwikkeld vanwege de inherente complexiteit en snelle dynamiek van metabolieten6. Metabolieten zijn zeer gevoelig voor omgevingssignalen, hebben diverse chemische structuren en polariteiten7 en bestaan in lage concentraties in kleine celvolumes8. Deze eigenschappen maken het betrouwbaar meten van individuele cellen tot een analytische uitdaging. Aangezien metabolomics de dichtstbijzijnde momentopname biedt van de real-time functionele toestand van een cel, is het ontwikkelen van methoden om het metaboloom robuust te bestuderen met een resolutie van één cel essentieel voor een beter begrip van cellulaire fysiologie en pathologie7.

Traditionele bulkmetabolomics-technieken nemen het gemiddelde van signalen over grootcellige populaties, waardoor cellulaire heterogeniteit wordt gemaskeerd en zeldzame maar significante metabole handtekeningen mogelijk worden verdoezeld. Daarentegen onthult single-cell metabolomics unieke biochemische profielen op individueel celniveau, waardoor het van onschatbare waarde is voor het bestuderen van processen zoals stamceldifferentiatie, geneesmiddelresponsen en ziektemechanismen 6,9,10,11,12,13. Op massaspectrometrie (MS) gebaseerde methoden, zoals matrix-geassisteerde laserdesorptie-ionisatie (MALDI) MS en secundair ion (SI) MS, hebben het veld vooruit geholpen, maar worden geconfronteerd met uitdagingen zoals complexe voorbereiding, vacuümvereisten en destructieve ionisatie die de analyse van levende cellen beperken 9,14. Met name recente ontwikkelingen in instrumentatie hebben geresulteerd in geavanceerde technieken, waaronder MALDI in transmissiemodus in combinatie met lasergeïnduceerde postionisatie (t-MALDI-215) en Orbitrap secundaire ionenmassaspectrometrie (OrbiSIMS)16,17, die labelvrije 3D-metabolische beeldvorming met hoge resolutie op eencellig en subcellulair niveau mogelijk maakte, met een uitzonderlijke massanauwkeurigheid en ruimtelijke resolutie.

Omgevingsionisatie MS pakt deze problemen aan. De representatieve ambient SCMS-technieken omvatten live single-cell video massaspectrometrie (Video-MS)18, DESI19 en nano-DESI20. Onder hen is het SCMS met één sonde een van de technieken die opvalt door zijn vermogen om levende cellen in realtime direct te bemonsteren en te ioniseren met behulp van een dubbel capillair systeem 21,22,23,24. Deze techniek minimaliseert monsterverstoring en maakt tegelijkertijd in situ metabole profilering met hoge resolutie mogelijk en is met succes toegepast op onderzoeken naar de opname van geneesmiddelen en de invloed op het celmetabolisme 22,25,26,27,28,29,30, omgevingsreacties 31,32 en metabole heterogeniteit33, 34,35,36 onder individuele cellen.

Hoewel veel omgevings-SCMS-methoden live celanalyse mogelijk maken, hebben ze doorgaans last van een lage doorvoer vanwege de handmatige verwerking die nodig is voor individuele celselectie 23,37,38. Aangezien het celmetabolisme zeer dynamisch is, kan uitgebreide monstervoorbereiding de metabolietprofielen veranderen. Om dit aan te pakken, passen onderzoekers afschriktechnieken toe direct na het isoleren van cellen 39,40. Afschrikken stopt de metabolische activiteit door snelle afkoeling 41,42,43,44 of enzymdenaturatie 43,45,46,47, waardoor de biochemische toestand van de cellen op een bepaald moment behouden blijft. Deze stap is van vitaal belang voor het waarborgen van nauwkeurige en tijdelijk relevante metabolomische gegevens. Een effectief blusprotocol moet de intracellulaire metabole activiteit snel en grondig stoppen. Er zijn verschillende methoden geëvalueerd, waaronder koude isotone zoutoplossing48, gekoeld acetonitril46, koude methanol 44,47,48,49, ijskoude fosfaatbufferoplossing (PBS) 43,50, LN2 43,44,51 en zelfs heteluchtbehandelingen 52. Hoewel veel van deze oorspronkelijk zijn ontwikkeld voor bulkcelmetabolomics, zijn sommige, zoals koude methanol en acetonitril, aangepast voor eencellige technieken zoals Pico-ESI-MS39 en MALDI-MS46. Ondanks hun effectiviteit heeft elke methode nadelen: organische oplosmiddelen kunnen metabolietlekkage en schade aan celmembranen veroorzaken48,53, en niet-vluchtige zoutoplossingen kunnen MS verstoren door ionenonderdrukking te veroorzaken54, de gevoeligheid te verminderen en de nauwkeurigheid van de gegevens in gevaar te brengen47,55.

LN2 snap freezing wordt vaak gebruikt in biologisch onderzoek56 omdat het het cellulaire metabolisme snel stopt zonder niet-vluchtige zouten achter te laten, waardoor het goed geschikt is voor SCMS. Het kan echter celmembranen beschadigen, wat problematisch is voor SCMS 57,58. Om deze schade te verminderen, gebruikten sommige onderzoeken een methode met snelle filtratie, koud NaCl-wassen en LN 2-bevriezing, wat helpt om metabolieten met snelle omzette behouden 53,59. Toch is deze methode niet ideaal voor SCMS vanwege moeilijkheden bij het isoleren van individuele cellen en mogelijke matrixeffecten van zoutresten. Opslag bij -80 °C is een andere veelgebruikte conserveringsmethode, maar de effecten ervan op de profielen van eencellige metabolieten blijven onduidelijk. We hebben eerder studies gerapporteerd om deze beperkingen aan te pakken door meerdere belangrijke stappen te combineren: cellen worden eerst gewassen met een vluchtige, MS-compatibele AF-oplossing, vervolgens geblust met LN2, vacuüm gevriesdroogd en bewaard bij lage temperatuur (-80 °C)60. De huidige aanpak minimaliseert celbeschadiging en metabolietafbraak, waardoor nauwkeurigere SCMS-metingen mogelijk zijn. Dit werk is gericht op experimentele details, met als doel de acceptatie van deze celbereidingsmethode voor robuuste SCMS-technieken te bevorderen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voer elke stap uit in een gecertificeerd bioveiligheidslaboratorium van klasse II en onder steriele omstandigheden. In deze studie werd de HCT-116-cellijn gebruikt als modelsysteem en werden cellen gekweekt in een compleet kweekmedium. De regenten en de gebruikte uitrusting staan vermeld in de Materialentabel.

1. Celcultuur

  1. Bereid het volledige medium voor. Vul McCoy's 5A medium aan met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine. Verwarm het tot 37 °C.
  2. Incubeer de cellen bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2 . Bewaak de samenvloeiing dagelijks en de doorgang wanneer culturen ~80% samenvloeiing bereiken.
  3. Passage de cellen (elke ~2 dagen).
    1. Zuig het medium op en spoel één keer met 5 ml 1x PBS.
    2. Voeg 2 ml 0,25% trypsine-EDTA toe aan het kweekschaaltje en incubeer gedurende 3 minuten bij 37 °C om de celloslating te vergemakkelijken.
    3. Neutraliseer trypsine door 8 ml voorverwarmd volledig medium toe te voegen en voorzichtig te pipetteren om de cellen te dispergeren.
    4. Breng 1 ml van de suspensie over in 9 ml vers volledig medium.
    5. Tel de cellen.
      OPMERKING: Cellen zijn geteld met behulp van een TC20 geautomatiseerde cellenteller volgens de instructies van de fabrikant. Trypanblauw of andere kleurstoffen werden niet gebruikt.
  4. Zaadcellen op de dekglaasjes.
    1. Verdun de cellen tot een eindconcentratie van ~1 × 106 cellen/ml.
    2. Plaats de afzonderlijke 18 mm glazen dekglaasjes in putjes van een plaat met 12 putjes.
      OPMERKING: Glazen dekglaasjes moeten worden geautoclaveerd voordat ze voor celkweek worden gebruikt.
    3. Voeg 2 ml van het volledige medium en 200 μl van de celsuspensie toe (~2 × 105 cellen/putje).
    4. Incubeer de cellen een nacht om celhechting mogelijk te maken.
      OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat cellen zich in een normale groeistatus bevinden, moet u routinematig de morfologie en hun groeistatus van cellen controleren (met behulp van een microscoop) en mogelijke mycoplasma-besmetting onderzoeken (met behulp van een mycoplasma-detectiekit).

2. Celspoeling met ammoniumformiaat (AF)-oplossing

OPMERKING: Bereid elke keer verse AF-oplossing voor.

  1. Bereid de AF-wasbuffer voor. Weeg 0,45 g ammoniumformiaat af en los op in 50 ml water van LC/MS-kwaliteit. De uiteindelijke concentratie van ammoniumformiaat is 0,14 M (0,9% w/w).
    OPMERKING: Houd de oplossing ijskoud (0-4 °C) tot gebruik.
  2. Voeg 2 ml koude AF-oplossing toe aan elk putje van de plaat met 12 putjes.
  3. Spoel de dekglaasjes af. Gebruik een steriele tang om elk dekglaasje met aanhangende cellen voorzichtig uit het putje te tillen en plaats het vervolgens kort (gedurende 2-3 s) in een apart putje dat vooraf is gevuld met 2 ml koude 0,9% ammoniumformiaat (AF) oplossing. Herhaal het spoelproces.
    OPMERKING: Om te voorkomen dat de cellen tijdens de wasstap worden verstoord, moet u de cellen heel voorzichtig spoelen.

3. Celdoven door vloeibare stikstof (LN2)

  1. Plaats elk AF-gespoeld dekglaasje (cellen naar boven) in de petrischaal in de aluminiumfoliecontainer.
    OPMERKING: Draag cryogene handschoenen, een veiligheidsbril en een laboratoriumjas. Voer alle LN2-handelingen uit in een goed geventileerde ruimte. Aluminiumfolie kan worden gebruikt om een container te vouwen voor LN2 blussen.
  2. Giet langzaam 10-20 ml vloeibare stikstof over de dekglaasjes en zorg voor een volledige dekking.
  3. Kantel de petrischaal onmiddellijk met een pincet om de resterende vloeibare stikstof te decanteren.
    OPMERKING: Voltooi deze actie binnen enkele seconden om te voorkomen dat er grote ijskristallen worden gevormd door achtergebleven wasvocht.

4. Vriesdrogen in cellen in vacuüm

  1. Vriesdroog onmiddellijk na LN2 blussen om ontdooien te voorkomen.
    NOTITIE: Verwijder de rotor van de SpeedVac om een plat platform te creëren dat plaats biedt aan een petrischaal van 100 mm.
  2. Plaats met cryogene handschoenen en een geïsoleerd pincet de petrischaal met de LN2 gekoelde dekglaasjes op de vacuümconcentratorkamer.
  3. Verwerk met behulp van de standaard vacuüminstellingen en ga 5-7 minuten door totdat zichtbare LN2 is verdampt en dekglaasjes droog lijken. Gedroogde dekglaasjes mogen geen LN2-resten en ijskristallen bevatten.

5. Celopslag in een vriezer van -80 °C

  1. Wikkel de container in een papieren handdoek en breng deze gedurende 48 uur over naar een vriezer van -80 °C.
  2. Breng na opslag de dekglaasjes met de petrischaal onmiddellijk over in een exsiccator op kamertemperatuur gedurende ~10 min. Zorg ervoor dat gecondenseerde rijp of water op dekglaasjes volledig is verdwenen voordat u ze uit de exsiccator haalt.
    OPMERKING: Door de dekglaasjes snel over te brengen naar de exsiccator wordt condensatie tot een minimum beperkt; Zelfs een kleine bevochtiging van het oppervlak kan gedroogde metabolieten oplossen.
  3. Verdeel de monsters na het wassen met AF in twee groepen (groep 1 en groep 2). Pas de volgende verwerkingsprotocollen toe.
    Groep 1: LN2 blussen → vriesdrogen → SCMS-analyse (geen opslag).
    Groep 2: LN2 blussen → gevriesdroogd → -80 °C 48 uur bewaren → SCMS-analyse.
  4. Ga verder met de SCMS-analyse zoals hieronder beschreven.
    OPMERKING: Onder andere omstandigheden kunnen meer celgroepen worden bereid. Groep 1 en Groep 2 worden gebruikt om de algemene protocollen te illustreren.

6. Fabricage met één sonde en SCMS-opstelling

OPMERKING: De enkelvoudige sonde is vervaardigd in overeenstemming met de vastgestelde procedures 21,24,60,61, en hier worden alleen korte protocollen gegeven.

  1. Trek aan de kwartsnaald met dubbele boring met behulp van een lasertrekker en genereer een punt van ~10 μm. Monteer een enkele sonde door de gesmolten silica-capillaire en nano-ESI-straler in de kwartsnaald met dubbele boring te plaatsen. Bevestig alle componenten op een glasplaatje met snelhardende epoxy.
  2. Monteer de enkele sonde op de XYZ-tafel. Bevestig de enkele sonde op een gemotoriseerde XYZ-manipulator die onder een digitale microscoop is geplaatst.
  3. Koppel de opstelling aan een massaspectrometer voor SCMS-analyse.
  4. Gebruik acetonitril (≥99,9%) met 0,1 % mierenzuur als extractieoplosmiddel bij een debiet van 150 nL/min toegediend door een spuitpomp.
  5. Stel de MS-parameters in.
    Positieve ionenmodus: m/z 200-1500, +2,9 kV, massaresolutie 120 k (bij m/z 200).
    Negatieve ionenmodus: m/z 70-900, -2,1 kV, massaresolutie 120 k (bij m/z 200).
    OPMERKING: Omdat negatieve ionen over het algemeen worden gedetecteerd in het m/z-bereik dat lager is dan dat van positieve ionen, kunnen verschillende m/z-bereiken worden gebruikt voor deze twee ionenmodi. Aanvullende MS-instellingen zijn onder meer een maximale injectietijd van 100 ms, één microscan, standaard automatische versterkingsregeling (AGC), volledige scanmodus (voor MS-analyse), botsingsdissociatie met hogere energie (HCD) (voor MS/MS-analyse) met 10-35 genormaliseerde botsingsenergie (NCE) en 320 °C voor de temperatuur van de ionenoverdrachtsbuis. Op elk scan/tijdstip werd een totaal ionchromatogram (TIC) gegenereerd om de signaalstabiliteit en de detectie van één cel te bewaken.

7. SCMS-experimenten met één sonde

  1. Plaats de twee dekglaasjes (Groep 1 en Groep 2) samen op de gemotoriseerde XYZ-trap van de SCMS-opstelling met enkele sonde 21,24,61.
  2. Als u batcheffecten wilt minimaliseren, selecteert u de cellen willekeurig onder de microscoop.
  3. Verkrijg positieve en negatieve ionenmodus massaspectra. Analyseer meerdere (bijv. ~30) cellen per groep met dezelfde enkele sonde, oplosmiddeldebiet en ionisatiespanning.
    OPMERKING: Gebruik voor elk experiment dezelfde enkele sonde, oplosmiddeldebiet en ionisatiespanningen om de vergelijkbaarheid van de gegevens te garanderen. Kalibreer de Orbitrap dagelijks voor de aanschaf. Zowel MS- als MS/MS-analyses kunnen op eencellig niveau worden uitgevoerd. Verzamel MS-gegevens om nauwkeurige m/z-waarden te verkrijgen voor studies van metabolietprofielen en voorlopige labels in niet-gerichte analyse. Voer MS/MS-analyse uit van geselecteerde ionen voor moleculaire identificatie in gerichte analyse. De gegevens werden verkregen met behulp van een compatibele software voor gegevensverzameling en -interpretatie.

8. Gegevensanalyse

  1. Verwerk de onbewerkte SCMS-gegevens vooraf met behulp van een aangepast R-script. Voorbewerkingsstappen omvatten achtergrond- en ruisverwijdering en normalisatie van de ionenintensiteit naar TIC 11,12,23.
  2. Deisotoop de SCMS-gegevens met behulp van het Python-pakket ms_deisotope.
  3. Voer piekuitlijning uit met behulp van een intern Python-script60. Gebruik een bakbreedte van 0,01 m/z voor het trommelen. Gebruik een massatolerantie van 0,01 m/z of 5 ppm voor piekuitlijning.
  4. Voer statistische gegevensanalyse uit met behulp van MetaboAnalyst 6.062. Voer een t-test uit en genereer een heatmap (voor relatieve metabolietniveaus). Selecteer Gebruik top 100 in T-test/ANOVA om de top 100 metabolieten te genereren, gerangschikt op p-waarden van laag naar hoog, met een significant verschil (p < 0,05) ten opzichte van de vergelijking. Plot een heatmap met behulp van deze top 100 metabolieten.
  5. Zoek nauwkeurige m/z-waarden en MS/MS-spectra in de Human Metabolome Database (HMDB63). Gebruik een massatolerantie van 10 ppm bij het doorzoeken in MS-databases.
    OPMERKING: Andere databases, zoals LipidMaps64, kunnen worden gebruikt voor het doorzoeken van databases.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit rapport beschrijft een methodologie die het wassen van cellen, snel afschrikken van cellen, vacuümdrogen en opslag bij -80 °C integreert (Figuur 1). Deze benadering is met name bedoeld om de metabolomische toestand van cellen te behouden voorafgaand aan SCMS-analyse. De effectiviteit van dit protocol werd getest door cellen onder twee verschillende omstandigheden te bereiden: vers gebluste en gedroogde cellen (groep 1, die als controle dient) en gedoofde, gedroogde en -80 °C opgeslagen cellen (groep 2). Elke groep werd geanalyseerd met behulp van de Single-probe SCMS-methode in zowel positieve als negatieve ionenmodi. Principal Component Analysis (PCA) en heatmap-visualisatie werden gebruikt om de verschillen in metabolomische profielen tussen groepen te evalueren.

PCA-resultaten in de positieve ionenmodus (Figuur 2A) toonden aan dat Groep 1 en Groep 2 vergelijkbare algemene metabolietprofielen hadden. De bijna identieke profielen van groep 1 en groep 2 tonen aan dat een opslag van -80 °C gedurende 48 uur het metaboloom niet significant verandert als de cellen goed worden geblust voordat ze worden gedroogd. In de negatieve ionenmodus (Figuur 2B) wordt een vergelijkbaar patroon waargenomen, hoewel Groep 2 iets duidelijker lijkt - mogelijk als gevolg van ionisatieverschillen tussen specifieke metabolietklassen, bijvoorbeeld fosfatidylcholines worden beter gedetecteerd in positieve modus, terwijl vetzuren efficiënter ioniseren in negatieve modus60. Ondanks deze variatie ondersteunt de consistente clustering tussen groep 1 en 2 in beide modi de conclusie dat het geïntegreerde protocol voor afschrikken-drogen-bewaren de metabole integriteit behoudt.

Heatmap-analyse valideerde de PCA-bevindingen verder door relatieve abundanties van de top 100 metabolieten in twee groepen weer te geven. Zoals te zien is in figuur 3, vertonen de top 100 metabolieten zeer consistente abundantiepatronen tussen groep 1 en groep 2 in beide ionenmodi. Er worden geen grote verschuivingen of groepsspecifieke clustering waargenomen, hoewel kleine variaties in enkele metabolietclusters verschillen in ionisatie-efficiëntie of metabolietstabiliteit kunnen weerspiegelen. Deze resultaten tonen samen aan dat de workflow voor afschrikken-drogen-bewaren cellulaire metabolomische profielen met hoge getrouwheid behoudt, waardoor het zeer geschikt is voor SCMS-toepassingen in de omgeving.

figure-results-1
Figuur 1: Algemene workflow voor analyse van eencellige massaspectrometrie (SCMS) waarin wordt onderzocht hoe LN 2-afschrikking en 48-uurs opslag bij -80 °C de metabolietprofielen in afzonderlijke cellen beïnvloeden. (A) Cellen werden gezaaid, geïncubeerd en gespoeld met behulp van ammoniumformaat (AF)-oplossing. (B) Er werden twee celgroepen bereid: Groep 1: cellen werden gewassen, geblust en gevriesdroogd voor onmiddellijke SCMS-experimenten zonder opslag; Groep 2: cellen werden gewassen, geblust, gevriesdroogd en bewaard bij -80 °C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Principal Component Analysis (PCA) van SCMS-gegevens van HCT-116-cellen in experimentele groepen in (A) positieve ionenmodus en (B) negatieve ionenmodus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Heatmaps met de relatieve niveaus van de top 100 metabolieten gedetecteerd in afzonderlijke HCT-116-cellen die onder verschillende omstandigheden zijn geprepareerd, gepresenteerd voor (A) positieve ionenmodus en (B) negatieve ionenmodus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een cruciale stap in dit protocol is het onmiddellijk blussen van levende cellen met behulp van LN2 na wassen met AF, waardoor de enzymatische activiteit aanzienlijk wordt verminderd en de lopende metabolische processen worden stopgezet. Bovendien verhoogde het wassen van cellen met AF voorafgaand aan het blussen de ionenintensiteit en verminderde het matrixeffecten, wat de opname ervan ondersteunt als een voorbereidende stap om de SCMS-gevoeligheid te verbeteren. In de huidige onderzoeken werden cellen in verschillende groepen (d.w.z. Groep 1 en Groep 2) gekweekt met behulp van dezelfde initiële batch om hun biologische variantie te minimaliseren. Er is gekozen voor een opslagtijd van 48 uur omdat cellen met een extra groeitijd (groep 1) nog steeds geschikte celdichtheden kunnen behouden (bijvoorbeeld om celaggregaten te vermijden) voor vergelijkende SCMS-analyse met opgeslagen cellen (groep 2). Voorzichtigheid is echter geboden bij het gebruik van gekoelde opslag, zelfs gedurende 48 uur, aangezien er nog steeds significante metabolische veranderingen werden waargenomen in vergelijkingen tussen vers gedroogde en opgeslagen monsters (Groep 1 vs. Groep 2). Hoewel in feitelijke studies cel- en weefselmonsters gewoonlijk voor langere perioden (bijvoorbeeld weken en maanden) worden bewaard in een vriezer van -80 °C, wordt voorgesteld de bewaartijd te verkorten om veranderingen in metabolieten te minimaliseren.

Het oplossen van problemen moet daarom gericht zijn op het minimaliseren van de tijd tussen drogen en SCMS-analyse, om ervoor te zorgen dat ontdooiomstandigheden condensatie of gedeeltelijke rehydratatie voorkomen. Het restwatergehalte en de condensatie van water tijdens monsterovergangen kunnen cellen gedeeltelijk rehydrateren en enzymatische en chemische reacties mogelijk maken, zoals hydrolyse, oxidatie en proteolyse, die metabolieten afbreken65, wat leidt tot kunstmatige veranderingen in de samenstelling van de metabolieten. Grondig gedroogde monsters stoppen deze processen effectief en behouden de moleculaire integriteit66. Zorgen voor een vochtvrije uitdrogingsomgeving en een snelle overgang naar SCMS is de sleutel tot het vermijden van deze valkuilen.

Ondanks het succes van deze methode bij het behouden van metabolietprofielen, blijven er beperkingen. De methode vereist toegang tot een vacuümdroogsysteem en een vriezer van -80 °C, en is niet volledig effectief voor langdurige opslag. Bovendien, hoewel snel drogen op kamertemperatuur metabolieten tijdelijk bewaart, is het geen vervanging voor LN 2-afschrikken. Opslaggerelateerde veranderingen kunnen nog steeds optreden als gevolg van onvolledige verwijdering van water en het risico van rehydratatie tijdens de behandeling van het monster. Deze beperkingen benadrukken de noodzaak van verfijning van de methode als langere opslag of een hogere doorvoer gewenst is.

Protocollen die in dit werk worden gerapporteerd, bieden een vereenvoudigde en effectieve benadering voor het behoud van het eencellige metaboloom voor omgevings-SCMS. In tegenstelling tot methoden die uitgebreide cryoprotectanten of in-situ bevriezing vereisen, is onze workflow gemakkelijk compatibel met bestaande omgevingsionisatietechnieken en maakt het flexibele tijdlijnen voor bemonstering en analyse mogelijk. De integratie van het wassen, blussen, drogen en kortstondige opslag van cellen zonder substantieel verlies van metabolomische getrouwheid biedt een praktische oplossing voor laboratoria die geen on-demand toegang hebben tot massaspectrometers. Deze benadering heeft een groot potentieel voor het bevorderen van onderzoek op het gebied van de biologie van eencellige systemen, kankermetabolisme, heterogeniteit van de geneesmiddelrespons en metabole fenotypering van zeldzame celpopulaties. De brede toepasbaarheid van deze protocollen, met name voor op omgevingsionisatie gebaseerde SCMS-platforms, maakt ze tot een belangrijke bijdrage op het gebied van single-cell analytische technieken. In toekomstige studies kunnen deze protocollen worden aangepast en verfijnd om plaats te bieden aan een grotere verscheidenheid aan celtypen. Met extra stappen voor de voorbereiding van het monster (bijv. matrixtoepassing) kunnen de verwerkte cellen mogelijk worden geanalyseerd met andere SCMS-technieken (bijv. MALDI en SIMS), met een hogere ruimtelijke resolutie en doorvoer voor analyse van grotere aantallen cellen (bijv. sterk confluente cellen). De resultaten suggereren ook dat deze protocollen voor afschrikken-drogen-opslag mogelijk kunnen worden gebruikt om cellen voor te bereiden op verzending (bijvoorbeeld in droogijscontainers), waardoor gezamenlijke SCMS-studies op verschillende locaties mogelijk zijn.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door de National Science Foundation (2305182), National Institutes of Health (1R01AI177469) en Chan Zuckerberg Initiative. Figuur 1 is gemaakt in BioRender (https://BioRender.com/yqn5isk).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
-80 °C vriezerEppendorf New BrunswickU700Monstervoorbereiding
AcetonitrilThermoFisher Scientific240744SCMS experiment opzet
Ammoniumformiaat ThermoFisher Scientific401152500Monstervoorbereiding
Dekglas 18 mmVMR micro dekglas48380046Celcultuur
Digitaal stereomicroscoopShenzhen D&F Co.Supereyes T004Analyse
Kwartsbuis met dubbele boring, 1.120"x0.005"x12"Friedrich & Dimmock, Inc.MBT-005-020-2QEenvoudige sondefabriek
EpoxyharsDevconOnderdeel nr. 20945Eenvoudige sondefabriek
MierenzuurWard's Science 470301-120 500mLSCMS experiment opzet
Gefuzeerde silica capillair, ID: 40 µm, OD: 100 µmPolymicro TechnologiesTSP040105Eenvoudige sondefabriek
Gefuzeerde silica capillair, ID: 50 µm, OD: 150 µmPolymicro Technologies1068150015SCMS experiment opzet
Glazen dekglazen, 18mmVWR 48380046Celcultuur
HyClone synthetisch serum (FBS)HycloneSH3006603Celcultuur
Incubator HeraCell (Heraeus)Celcultuur
Laser pullerSutter Instrument Co.Model P-2000Eenvoudige sondefabriek
LED UV-lampFoshan Liang Ya Dental EquipmentLY-C240Eenvoudige sondefabriek
McCoy's 5A Gibco 2537128Celcultuur
MicrounionIDEX Health & Science LLCM-539SCMS experiment opzet
Gewijzigde FAIMS pro interface Thermo Fisher 98100-20046Analyse
MycoAlert PLUS Mycoplasma Detectie KitLonzaLT07-703Celcultuur
Optische board Thorlabs Inc., NewtonAnalyse
Optima LC/MS-kwaliteitswater (Fisher Chemical, USA)ThermoFisher ScientificW6500Monstervoorbereiding
Orbitrap Exploris 240 massaspectrometer ThermoFisher ScientificSCMS experiment opzet
Penicilline/StreptomycineGibco15140-122Celcultuur
Fosfaatbufferoplossing (PBS)VWR0780-50LCelcultuur
SpeedVac Concentrator (Savant)ThermoFisher Scientific SPD111 VMonstervoorbereiding
Spuitpomp (SKE10)Chemyx Inc.80561SCMS experiment opzet
Spuit, 250 µLHamilton1725LTN250ULSCMS experiment opzet
TC20 Automatisch CeltellerBio-Rad Laboratories 1450102EDUCeltelling
Weefselcultuurschaal, 100mmFisher scientific FB012924Celcultuur
Trypsine-EDTAThermoFisher Scientific25200-072Celcultuur
USB digitaal microscoop ("Scorpio" 500 Zoom)Chinavasion, Wholesale Ltd.Analyse
UV-hardende harsPrime DentalArtikelnr. 006.030Eenvoudige sondefabriek
Xcalibur softwareThermoFisher Scientific
XYZ-stage (CONEX- MFACC)Newport Corp.Analyse

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, S., Vu, H. M., Lee, J. H., Lim, H., Kim, M. S. Advances in mass spectrometry-based single cell analysis. Biology (Basel). 12 (3), 393(2023).
  2. Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nat Methods. 8 (4 Suppl), S20-S29 (2011).
  3. Kanter, I., Kalisky, T. Single cell transcriptomics: Methods and applications. Front Oncol. 5, 53(2015).
  4. Newman, J. R., et al. Single-cell proteomic analysis of s. Cerevisiae reveals the architecture of biological noise. Nature. 441 (7095), 840-846 (2006).
  5. Rubakhin, S. S., Lanni, E. J., Sweedler, J. V. Progress toward single cell metabolomics. Curr Opin Biotechnol. 24 (1), 95-104 (2013).
  6. Yang, Y., et al. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 14-26 (2017).
  7. Johnson, C. H., Gonzalez, F. J. Challenges and opportunities of metabolomics. J Cell Physiol. 227 (8), 2975-2981 (2012).
  8. By B Alberts, D. B., Lewis, J., Raft, M., Roberts, K., Watson, J. D. Molecular biology of cell. 1361, Garland Publishing. (1994).
  9. Zhang, L., Vertes, A. Single-cell mass spectrometry approaches to explore cellular heterogeneity. Angew Chem Int Ed Engl. 57 (17), 4466-4477 (2018).
  10. Duncan, K. D., Fyrestam, J., Lanekoff, I. Advances in mass spectrometry-based single-cell metabolomics. Analyst. 144 (3), 782-793 (2019).
  11. Lan, Y., Zou, Z., Yang, Z. Single cell mass spectrometry: Towards quantification of small molecules in individual cells. TrAC Trends Anal Chem. 174, 117657(2024).
  12. Renmeng Liu, Z. Y. Single cell metabolomics using mass spectrometry- techniques and data analysis. Analytica Chimica Acta. 1143, 11(2021).
  13. Chen, Z. Y., et al. Metabolomics studies of cell-cell interactions using single-cell mass spectrometry combined with fluorescence microscopy. Chem Sci. 13, 6687-6695 (2022).
  14. Ibanez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  15. Niehaus, M., Soltwisch, J., Belov, M. E., Dreisewerd, K. Transmission-mode MALDI-2 mass spectrometry imaging of cells and tissues at subcellular resolution. Nat Methods. 16 (9), 925-931 (2019).
  16. Passarelli, M. K., et al. The 3D orbisims-label-free metabolic imaging with subcellular lateral resolution and high mass-resolving power. Nat Methods. 14 (12), 1175-1183 (2017).
  17. Suvannapruk, W., et al. Single-cell metabolic profiling of macrophages using 3D orbisims: Correlations with phenotype. Anal Chem. 94 (26), 9389-9398 (2022).
  18. Tsuyama, N., Mizuno, H., Tokunaga, E., Masujima, T. Live single-cell molecular analysis by video-mass spectrometry. Anal Sci. 24 (5), 559-561 (2008).
  19. Zhang, H., Shi, X., Lu, H., Li, L. Delineation of subcellular molecular heterogeneity in single cells via ultralow-flow-rate desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging. Anal Chem. 97 (18), 9985-9991 (2025).
  20. Bergman, H. -M., Lanekoff, I. Profiling and quantifying endogenous molecules in single cells using nano-desi ms. Analyst. 142 (19), 3639-3647 (2017).
  21. Pan, N., et al. The single-probe: A miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis. Anal Chem. 86 (19), 9376-9380 (2014).
  22. Liu, R., Zhang, G., Yang, Z. Towards rapid prediction of drug-resistant cancer cell phenotypes: Single cell mass spectrometry combined with machine learning. Chem Commun (Camb). 55 (5), 616-619 (2019).
  23. Bhusal, D., Wije Munige, S., Peng, Z., Yang, Z. Exploring single-probe single-cell mass spectrometry: Current trends and future directions. Anal Chem. 97 (9), 4750-4762 (2025).
  24. Rao, W., Pan, N., Yang, Z. Applications of the single-probe: Mass spectrometry imaging and single cell analysis under ambient conditions. J Vis Exp. (112), e53911(2016).
  25. Pan, N., et al. Quantification of drug molecules in live single cells using the single-probe mass spectrometry technique. Anal Chem. 91 (14), 9018-9024 (2019).
  26. Sun, M., Yang, Z. Metabolomic studies of live single cancer stem cells using mass spectrometry. Anal Chem. 91 (3), 2384-2391 (2019).
  27. Lan, Y., Chen, X., Yang, Z. Quantification of nitric oxide in single cells using the single-probe mass spectrometry technique. Anal Chem. 95 (51), 18871-18879 (2023).
  28. Chen, X., Sun, M., Yang, Z. Single cell mass spectrometry analysis of drug-resistant cancer cells: Metabolomics studies of synergetic effect of combinational treatment. Anal Chim Acta. 1201, 339621(2022).
  29. Sun, M., Chen, X., Yang, Z. Single cell mass spectrometry studies reveal metabolomic features and potential mechanisms of drug-resistant cancer cell lines. Anal Chim Acta. 1206, 339761(2022).
  30. Bensen, R. C., et al. Single-cell mass spectrometry quantification of anticancer drugs: Proof of concept in cancer patients. ACS Pharmacol Transl Sci. 4 (1), 96-100 (2021).
  31. Liu, R., Zhang, G., Sun, M., Pan, X., Yang, Z. Integrating a generalized data analysis workflow with the single-probe mass spectrometry experiment for single cell metabolomics. Anal Chim Acta. 1064, 71-79 (2019).
  32. Nguyen, T. D., et al. Single-cell mass spectrometry enables insight into heterogeneity in infectious disease. Anal Chem. 94 (30), 10567-10572 (2022).
  33. Liu, R., et al. Quantifying cell heterogeneity and subpopulations using single cell metabolomics. Anal Chem. 95 (18), 7127-7133 (2023).
  34. Pan, N., Rao, W., Standke, S. J., Yang, Z. Using dicationic ion-pairing compounds to enhance the single cell mass spectrometry analysis using the single-probe: A microscale sampling and ionization device. Anal Chem. 88 (13), 6812-6819 (2016).
  35. Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Mass spectrometry measurement of single suspended cells using a combined cell manipulation system and a single-probe device. Anal Chem. 91 (3), 1738-1742 (2019).
  36. Chen, X., Peng, Z., Yang, Z. Metabolomics studies of cell-cell interactions using single cell mass spectrometry combined with fluorescence microscopy. Chem Sci. 13 (22), 6687-6695 (2022).
  37. Bergman, H. M., Lanekoff, I. Profiling and quantifying endogenous molecules in single cells using nano-desi ms. Analyst. 142 (19), 3639-3647 (2017).
  38. Portero, E. P., Nemes, P. Dual cationic-anionic profiling of metabolites in a single identified cell in a live Xenopus laevis embryo by microprobe CE-ESI-MS. Analyst. 144 (3), 892-900 (2019).
  39. Zhang, X. C., et al. Combination of droplet extraction and pico-ESI-MS allows the identification of metabolites from single cancer cells. Anal Chem. 90 (16), 9897-9903 (2018).
  40. Guo, S., Zhang, C., Le, A. The limitless applications of single-cell metabolomics. Curr Opin Biotechnol. 71, 115-122 (2021).
  41. Buziol, S., et al. New bioreactor-coupled rapid stopped-flow sampling technique for measurements of metabolite dynamics on a subsecond time scale. Biotechnol Bioeng. 80 (6), 632-636 (2002).
  42. Sake, C. L., Newman, D. M., Boyle, N. R. Evaluation of quenching methods for metabolite recovery in photoautotrophic Synechococcus sp. Pcc 7002. Biotechnol Prog. 36 (5), e3015(2020).
  43. Wang, T. X. Y. G., Zhuang, Y., Wang, G. A systematic evaluation of quenching and extraction procedures for quantitative metabolome profiling of HeLa carcinoma cell under 2D and 3D cell culture conditions. Biotechnol J. 18 (5), e2200444(2023).
  44. Hernandez Bort, J. A., et al. Reduced quenching and extraction time for mammalian cells using filtration and syringe extraction. J Biotechnol. 182 - 183 (100), 97-103 (2014).
  45. House, R. R. J., et al. A diverse proteome is present and enzymatically active in metabolite extracts. Nat Commun. 15 (1), 5796(2024).
  46. Amantonico, A., Urban, P. L., Fagerer, S. R., Balabin, R. M., Zenobi, R. Single-cell MALDI-MS as an analytical tool for studying intrapopulation metabolic heterogeneity of unicellular organisms. Anal. Chem. 82, 6(2010).
  47. Sellick, C. A., et al. Effective quenching processes for physiologically valid metabolite profiling of suspension cultured mammalian cells. Anal Chem. 81 (1), 174-183 (2008).
  48. Dietmair, S., Timmins, N. E., Gray, P. P., Nielsen, L. K., Kromer, J. O. Towards quantitative metabolomics of mammalian cells: Development of a metabolite extraction protocol. Anal Biochem. 404 (2), 155-164 (2010).
  49. Faijes, M., Mars, A. E., Smid, E. J. Comparison of quenching and extraction methodologies for metabolome analysis of Lactobacillus plantarum. Microb Cell Fact. 6, 27(2007).
  50. Pabst, M. G. J., et al. Nucleotide and nucleotide sugar analysis by liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry on surface-conditioned porous graphitic carbon. Anal. Chem. 82 (23), 6(2010).
  51. Lorenz, M. A., Burant, C. F., Kennedy, R. T. Reducing time and increasing sensitivity in sample preparation for adherent mammalian cell metabolomics. Anal Chem. 83 (9), 3406-3414 (2011).
  52. Wahrheit, J., Heinzle, E. Quenching methods for the analysis of intracellular metabolites. Methods Mol Biol. 1104, 211-221 (2014).
  53. Volmer, M., Gettmann, J., Scholz, S., Buntemeyer, H., Noll, T. A method for metabolomic sampling of suspended animal cells using fast filtration. BMC Proc. 5 (Suppl 8), P93(2011).
  54. Richard King, R. B., Fernandez-Metzler, C., Cynthia Miller-Stein, A. T. O. Mechanistic investigation of ionization suppression in electrospray ionization. J Am Soc Mass Spectrom. 11, 8(2000).
  55. Dunn, W. B. Current trends and future requirements for the mass spectrometric investigation of microbial, mammalian and plant metabolomes. Phys Biol. 5 (1), 011001(2008).
  56. Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: Quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), 53(2017).
  57. Krismer, J., et al. Screening of Chlamydomonas reinhardtii populations with single-cell resolution by using a high-throughput microscale sample preparation for matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. Appl Environ Microbiol. 81 (16), 5546-5551 (2015).
  58. Ye, D., et al. Improved sample preparation for untargeted metabolomics profiling of Escherichia coli. Microbiol Spectr. 9 (2), e0062521(2021).
  59. Volmer, M., et al. Fast filtration for metabolome sampling of suspended animal cells. Biotechnol Lett. 33 (3), 495-502 (2011).
  60. Wije Munige, S., Bhusal, D., Peng, Z., Chen, D., Yang, Z. Developing a cell quenching method to facilitate single cell mass spectrometry metabolomics studies. JACS Au. 5 (5), 2379-2387 (2025).
  61. Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Integrated cell manipulation platform coupled with the single-probe for mass spectrometry analysis of drugs and metabolites in single suspension cells. J Vis Exp. (148), e59875(2019).
  62. Pang, Z., et al. Metaboanalyst 6.0: Towards a unified platform for metabolomics data processing, analysis and interpretation. Nucleic Acids Res. 52 (W1), W398-W406 (2024).
  63. Wishart, D. S., et al. Hmdb 5.0: The human metabolome database for 2022. Nucleic Acids Research. 50 (D1), D622-D631 (2022).
  64. Conroy, M. J., et al. Lipid maps: Update to databases and tools for the lipidomics community. Nucleic Acids Res. 52 (D1), D1677-D1682 (2024).
  65. Pinu, F., Villas-Boas, S. Extracellular microbial metabolomics: The state of the art. Metabolites. 7 (3), 43(2017).
  66. Rockinger, U., Funk, M., Winter, G. Current approaches of preservation of cells during (freeze-) drying. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (8), 2873-2893 (2021).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Cellulaire metabolietencelquenchingwassen met ammoniumformiaatvacu mvriesdrogenmassaspectrometrische analysebehoud van metabolietenstatistische data analyse

Gerelateerde artikelen