Precisie-inductie en onderscheid van hoest- en niesreflexen bij muizen

Samenvatting

Deze studie stelde hoest- en niesmodellen bij muizen vast door specifieke stimuli toe te passen op de luchtpijp en de neusholte, en ontwikkelde een op audio gebaseerde methode om onderscheid te maken tussen hoesten en niezen van muizen door verschillen in hun akoestische signalen te analyseren.

Samenvatting

Hoesten en niezen, als vitale respiratoire verdedigingsreflexen, hebben geleid tot onderzoek naar hun mechanismen die worden beperkt door de niet-specifieke stimulatie die inherent is aan traditionele modellen. Bestaande methoden, zoals capsaïcine- of citroenzuurverneveling, kunnen tegelijkertijd hoesten (gemedieerd door tracheale C-vezels) en niezen (gemedieerd door nasale trigeminuszenuwen) activeren, wat leidt tot verwarde gedragsobservaties. Hoewel eerdere studies hebben geprobeerd hoesten en niezen te onderscheiden door ademhalingspatronen of akoestische handtekeningen te analyseren, missen deze studies modellen die specifiek de luchtpijp en neusholte kunnen stimuleren. Hier hebben we een muizenmodel ontwikkeld dat gebruik maakt van plaatsspecifieke stimulatie van de luchtpijp (om hoest op te wekken) en de neusholte (om niezen op te wekken). Met behulp van gesynchroniseerde multimodale opnames, plethysmografie van het hele lichaam (WBP), breedband ultrasone microfoons (0-250 kHz) en hogesnelheidsvideografie (160 fps), kwantificeerden we verschillende fysiologische handtekeningen van hoesten en niezen. Onze bevindingen toonden aan dat zowel hoesten als niezen ademhalingspatronen met enkele en dubbele pieken vertonen, met significante verschillen in de samenstelling van hun audiofrequentiespectra. Door een coördinatensysteem te construeren op basis van audiofuncties, konden we hoesten en niezen effectief onderscheiden en ze in kaart brengen in verschillende kwadranten van de coördinatenas. Deze studie heeft, door middel van anatomisch specifieke stimulatie en akoestische functieanalyse, een muismodel opgesteld dat in staat is om kwantitatief onderscheid te maken tussen hoesten en niezen, en biedt een zeer nauwkeurige experimentele methode voor het onderzoek naar luchtwegafweerreflexen en gerichte therapeutische ontwikkeling.

Inleiding

Hoesten en niezen zijn cruciale verdedigingsreflexen voor het lichaam om vreemde stoffen uit de luchtwegen te verwijderen, en afwijkingen in de gerelateerde neurale paden veroorzaken vaak chronische ziekten, zoals chronische hoest en rhinitis. Beide reflexen omvatten een inspiratoire fase, een compressieve fase en een expiratoire fase ^1,2. De hoestreflex wordt voornamelijk gemedieerd door sensorische neuronen in de luchtwegen die worden geïnnerveerd door de nervus vagus ^3,4,5. Nervusneuronen ontvangen mechanische, chemische of elektrische prikkels van de luchtwegen en geven de signalen door aan de nucleus tractus solitarius (NTS) in de medulla oblongata⁶. De NTS integreert deze informatie en projecteert deze vervolgens naar de ademhalingscentra in het merg en pons⁷. Deze centra coördineren uiteindelijk relevante ademhalingsspiergroepen (zoals het middenrif, de intercostale spieren en de strottenhoofdspieren) om de hoestactie uit te voeren, waardoor mogelijk schadelijke irriterende stoffen en slijm via de mondholte uit de luchtwegen worden verdreven ^8,9,10. De niesreflex wordt voornamelijk gemedieerd door nasale sensorische neuronen in het ganglion trigeminus^11,12. Hun mechanische of chemische stimuli worden doorgegeven aan de spinale trigeminuskern (SP5), die de informatie vervolgens doorgeeft aan de ademhalingscentra 13,14,15,16. Deze centra reguleren relevante spieren (zoals ademhalingsspieren, palatinale spieren en gezichtsspieren) om een niesbui op gang te brengen¹⁷. De krachtige uitademingsstoot van het niezen dwingt het grootste deel van de lucht door de neus naar buiten om de irriterende stoffen te verdrijven ^9,18. Onderzoek naar hoesten en niezen helpt niet alleen bij het ophelderen van de neurale mechanismen van de respiratoire afweer, maar biedt ook therapeutische doelen voor chronische hoest en rhinitis. Hiervoor is het van het grootste belang om een robuust en betrouwbaar diermodel op te zetten.

In de afgelopen jaren zijn muizen naar voren gekomen als een cruciaal modelorganisme voor het bestuderen van de neurale paden van hoesten en niezen 19,20,21. De overheersende huidige methodologie omvat nog steeds het induceren van dit reflexgedrag via inademing van vernevelde stimulerende stoffen ^8,20,22. Een belangrijke beperking van deze inhalatiebenadering is dat de stimuli tegelijkertijd inwerken op zowel de neusholte als de luchtpijp, en niet-specifiek de verschillende sensorische afferente systemen activeren die niezen (via de trigeminusroute) en hoesten (via de vagale route) bemiddelen. Dit vormt een substantiële uitdaging voor de precieze differentiatie van het uitgelokte gedragstype in experimenten. Deze discrepantie is duidelijk in de literatuur: sommige onderzoeken definiëren door capsaïcine geïnduceerde ademhalingsreflexen bij muizen als niezen²¹, terwijl andere melden dat deze reflexen zowel hoest- als niescomponenten omvatten ^8,22.

Om deze uitdaging aan te gaan, zijn geavanceerde methodologieën ontwikkeld, waaronder de analyse van ademhalingspatronen en trajecten om verschillende reflexgedragingen te classificeren⁸. Een andere studie toont aan dat hoesten en niezen duidelijke verschillen vertonen in temporele en spectrale kenmerken, zoals duur, frequentiemodulatie²². Hun werk benadrukte dat hoesten een energieconcentratie vertoont in lagere piekfrequentiebereiken (20-80 kHz), terwijl niezen componenten vertoont die verder reiken dan 90 kHz²². Deze akoestische divergenties bieden een nieuw, niet-invasief kader voor gedragsdiscriminatie, als aanvulling op traditionele respiratoire golfvormanalyses. Ondanks deze innovaties blijft er een kritieke kloof bestaan: bestaande modellen missen anatomische specificiteit bij de toediening van stimulus, waardoor tracheale en nasale reflexroutes vaak in de war raken. Deze beperking laat zien dat we betere manieren nodig hebben om ademhalingsreflexen te richten en te bestuderen.

Onderzoek naar de mechanismen die ten grondslag liggen aan hoesten en niezen veroorzaakt door mechanische en chemische stimulatie van de luchtwegen is uitgebreid uitgevoerd in grote diermodellen (bijv. katten)¹⁷. In modellen met kleine dieren (bijv. cavia's, ratten en muizen) hebben technische beperkingen echter doorgaans een beroep op vernevelde verbindingen (zoals capsaïcine of citroenzuur) noodzakelijk gemaakt om chemische stimulatie te bereiken.

Dit protocol stelt een nieuwe methode voor om hoestachtig en niesachtig gedrag bij muizen op te wekken en stelt een nieuwe reeks methoden vast om deze ademhalingsreflexen te kwantificeren en te karakteriseren. Deze benadering stelt een strategie vast om hoestachtig en niesachtig gedrag bij muizen te onderscheiden door karakteristieke vocalisaties te identificeren en hun spectrale kenmerken en akoestische intensiteit te analyseren. Deze nieuwe methodologie heeft het potentieel om de kwantificering van ademhalingsreflexen bij muizen te standaardiseren, de experimentele reproduceerbaarheid te verbeteren en het mechanistische begrip van de neurofysiologie van hoesten en niezen te verdiepen.

Protocol

Alle experimenten zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Animal Use and Care Protocol van Guangzhou Lab (GZLAB-AUCP- 2024-04-A10). In deze studie werden vrouwelijke en mannelijke muizen gebruikt die specifiek pathogeenvrij zijn van C57BL/6 muizen in de leeftijd van 8-10 weken.

1. Experimentele voorbereiding

1. Voorbereiding van proefdieren
   1. Huisvest muizen in kooien met vrije toegang tot voedsel en water, en houd ze op 22 ± 1 °C onder een standaard licht/donkercyclus van 12 uur.
2. Bereiding van capsaïcine-oplossing
   1. Los 30,5 mg capsaïcinepoeder op in PBS met 10% ethanol en 10% Tween-80 om een stockoplossing van 10 mM te bereiden.
   2. Verdun de stockoplossing 1:100 in een fysiologische zoutoplossing om 100 μM werkoplossing te bereiden.
3. Bereiding van tribroomethanol (Avertin)
   1. Weeg 0,5 g tribroomethanol af in een Eppendorf-tube van 1,5 ml. Voeg 1 ml 2-methyl-2-butanol toe.
   2. Incubeer bij 55 °C met agitatie (400-600 tpm) in het donker tot het volledig is opgelost (~20 min).
   3. Doe 40 ml fysiologische zoutoplossing in een bekerglas. Voeg al roerend de opgeloste tribroomethanoloplossing druppelsgewijs toe. Blijf roeren tot de opgeloste kristallen volledig zijn verdwenen (~40 min).
   4. Pas de pH aan op 7.0-7.3 met behulp van NaOH.

2. Opstellen en vastleggen van hoestachtig gedragsmodel

1. Voorbereiding van de implantatiecanule
   1. Knip een naald van 28 g (ID: 0,19 mm, OD: 0,35 mm) in een canule van ~5 mm. Strijk beide uiteinden glad met schuurpapier met behulp van een tang. Bevestig het ene uiteinde aan de siliconenslang (ID: 0,3 mm, OD: 0,8 mm). Sluit hem aan op een spuit van 1 ml en spoel de canule door met water om de doorgankelijkheid te controleren.
   2. Buig de canule onder een hoek van 90° met een armverhouding van 2:3. Steek de langere arm in de siliconenslang (ID: 0,3 mm, OD: 0,8 mm, 5 cm lengte; Figuur 1A). Wijs het gebogen uiteinde aan voor tracheale implantatie. Verleng de siliconenslang van de luchtpijp naar de schedel voor fixatie (Figuur 1B).
2. Voorbereiding van de installatie van de opnameapparatuur
   1. Bereid een plethysmografiesysteem voor het hele lichaam (WBP), ultrasone recorder, hogesnelheidscamera, micro-injectiepomp voor.
3. Toewijzing van muisgroepen
   1. Wijs muizen willekeurig toe aan drie groepen (n = 6/groep): i) Controlegroep: behoud de normale onbehandelde status. ii) Schijngroep: Implanteer de tracheale canule zonder stimulatie. iii) Stimulatiegroep: Implanteer de tracheacanule en dien capsaïcine toe om hoest op te wekken.
4. Chirurgische ingreep
   1. Verdoof de muizen door intraperitoneale injectie van tribroomethanol (125-250 mg/kg) en bevestig volledige anesthesie door het uitblijven van een reactie op een teenbeknelling.
   2. Zet de verdoofde muis in rugligging vast. Scheer craniaal en cervicaal haar. Desinfecteer met jodofoor. Knip met een chirurgische schaar een cirkelvormig deel van de hoofdhuid met een diameter van ongeveer 5 mm af om de schedel bloot te leggen.
   3. Onder microscoop: Incise cervicale huid voor ongeveer 1 cm. Ontleed botweg weefsels en spieren om de luchtpijp bloot te leggen. Prik zacht weefsel tussen het ringkraakbeen en het tracheale kraakbeen aan met behulp van een naald van 32 G. Creëer een minimale tracheale opening met een oogheelkundige schaar.
      NOTITIE: Houd de openingsgrootte net groot genoeg voor de diameter van de canule om weefselbeschadiging te voorkomen.
   4. Steek de metalen canule (met siliconenmantel) ~1 mm in het tracheale lumen. Veilige canule-trachea-overgang met 7-0 hechting.
      OPMERKING: Beperk de insteekdiepte tot 1 mm om ademhalingsproblemen te voorkomen.
   5. Botweg onderhuids tunnelen van nek naar schedel. Leid de siliconenslang naar de schedel en bevestig deze met tandheelkundig cement.
   6. Hechtdraad cervicale incisie. Plaats de muis op een verwarmingskussen totdat hij bij bewustzijn is. Huis in een kooi voor 5 dagen.
   7. Spoel de tracheale canule/slang dagelijks door met een luchtspuit van 1 ml.
      OPMERKING: Laat spoelen achterwege binnen 24 uur voorafgaand aan de hoestinductie.
5. Hoest opname
   1. Voorzie de ultrasone sonde van een poortcompatibele afdichtring. Steek de sonde in de WBP-kamerpoort om luchtdicht contact te garanderen.
   2. Sluit de WBP-kamer, debietsensor en diaaas aan. Kalibreren via software.
   3. Bevestig een met een schedel bevestigde siliconen slang aan een verlengslang van 30 cm. Plaats de muis in de WBP-kamer. Verleng de buis door de bovenste poort. Sluit de poort af met boetseerklei. Controleer de luchtdichtheid van de kamer door te bevestigen dat de pieken van de ademhalingsgolfvorm binnen 4 ± 2 vallen.
   4. Vul de spuit van 1 ml met 5 ml capsaïcineoplossing. Elimineer luchtbellen. Sluit aan op de verlengbuis. Monteer de spuit op de micro-injectiepomp en stel de stroom in op 10 μL ^min-1.
      OPMERKING: Overmatige bloeding kan capsaïcine naar de neusholte brengen.
   5. Plaats een hogesnelheidscamera naar de kamer gericht. Pas de afstand en focus aan. Stel de samplefrequentie in op 160 fps (maximaal).
   6. Start tegelijkertijd de WBP-, echo- en camerasoftware; Activeer de pomp om de capsaïcine te infuseren. Registreer het aantal hoestbuien gedurende 10 minuten.

3. Opstellen en vastleggen van niesachtig gedragsmodel

1. Voorbereiding van experimentele apparatuur
   1. Bereid een steriele PE-buis (ID: 0,5 mm, OD: 1 mm) voor op fixatie als stimulatiecanule op het neusbot van de muis.
   2. Bereid een gesteriliseerd nylon filament met een diameter van 0,25 mm voor op nasale stimulatie van de transcanule. Teken op de kalibratiemethode van Vonfrey, wanneer het 5 cm lange filament verticaal op een balans wordt gedrukt totdat het buigt tot ongeveer 45°, is de gemeten kracht 0,6 g.
2. Instelling van de opnameapparatuur
   1. Klaar voor één plethysmografiesysteem voor het hele lichaam (WBP), één ultrasone recorder en één hogesnelheidscamera.
3. Toewijzing van muisgroepen
   1. Wijs muizen willekeurig toe aan drie groepen (n = 6/groep): i) Controlegroep: behoud de onbehandelde basislijnstatus. ii) Schijngroep: Fixeer neuscanule zonder stimulatie. iii) Stimulatiegroep: Fixeer neuscanule + roep niesgeluid op via filamentstimulatie.
4. Chirurgische ingreep
   1. Verdoof de muizen door intraperitoneale injectie van tribroomethanol (125-250 mg/kg) en bevestig volledige anesthesie door het uitblijven van een reactie op een teenbeknelling.
   2. Scheer haar op de schedelschedel en neusbrug.
   3. Zet de muis vast in een stereotactisch frame. Desinfecteer met jodofoor. Snijd de huid in over de schedel en het neusbot. Leg het neusbot bloot.
   4. Maak met een microboor een gat van 0,5 mm in de overgang tussen het neusbot en de processus lateralis van het neustussenschotkraakbeen. Leg het neusslijmvlies bloot.
      NOTITIE: Beperk de gatgrootte tot 0.5 mm om weefselbeschadiging te voorkomen.
   5. Til het neusslijmvlies voorzichtig op met een naald van 32 G. Leg de neusholte bloot.
   6. Monteer de PE-buis in de stereotactische arm. Plaats de buispunt gelijk met het braamgat. Bevestig de buis aan het neusbot met tandcement.
   7. Plaats de muis op een verwarmingskussen totdat het bewustzijn terugkeert.
5. Niezen opname
   1. Sluit de WBP-kamer, debietsensor en biasstroom aan volgens de handleiding. Kalibreren met behulp van software.
   2. Voorzie de ultrasone sonde van een aan de poort aangepaste pakking. Steek de sonde in de kamer. Controleer of de afdichting luchtdicht is.
   3. Breng de muis over naar de WBP-kamer. Verleng de PE-buis via de bovenste poort. Sluit de poort af met boetseerklei rond de buis. Controleer de luchtdichtheid van de kamer door te bevestigen dat de pieken van de ademhalingsgolfvorm binnen 4 ± 2 vallen.
   4. Plaats een hogesnelheidscamera naar de kamer gericht. Pas de afstand en focus aan. Stel de samplefrequentie in op 160 fps (maximaal).
   5. Beweeg een nylonfilament met een diameter van 0.25 mm door een zachte buis in de neusholte tot een diepte van 0-3 mm. Het deel van het filament dat uit de handbuis steekt, is 5 cm lang. Druk tijdens de stimulatie op dit vrije uiteinde totdat het buigt tot 45°, waarbij ~0,6 g kracht wordt uitgeoefend op het neusslijmvlies gedurende 1 s, herhaal dit eens per 30 s. Noteer de niesreacties gedurende 10 minuten.

4. Door capsaïcine geïnduceerde hoest en niezen bij muizen

1. Groepsopdracht
   1. Verdeel muizen in schijnchirurgie- en operatiegroepen (n = 5/groep). Schijngroep: Leg bilaterale voorste ethmoïdale en infraorbitale zenuwen bloot. Chirurgie groep: Transect bilaterale voorste ethmoïdale en infraorbitale zenuwen.
2. Ultrasone verneveling
   1. Bereid de gedragskamer voor (20 cm × 14 cm × 17 cm).
   2. Plaats de ultrasone recorder en camera voor een optimale bewaking.
   3. Laad de vernevelaar met 100 μM capsaïcineoplossing. Lever 30 s aërosolpulsen om de 2 minuten gedurende 10 minuten.
   4. Neem continu gedrag op met behulp van de ultrasone recorder en de camera.

5. Proces voor gegevensanalyse

1. Analyse van respiratoire tracering van het hele lichaam (WBP)
   1. Importeer de WBP opgenomen tekstbestanden in de Spike2-software en synchroniseer ze met audiosignalen.
   2. Analyseer de audiosignalen die overeenkomen met ademhalingspatronen met enkele piek en dubbele piek en registreer de duur van de compressiefase voor elk patroon.
   3. Selecteer het laagste punt van de expiratoire fase als middelpunt en neem de gegevens van een halve seconde ervoor en erna voor het berekenen van de gemiddelde waarde.
2. Analyse van audiogolfvormen
   1. Importeer audiobestanden in Spike2-software, selecteer individuele hoest- of niesaudio en exporteer ze als TXT-formaat (met een bemonsteringsfrequentie ingesteld op 100 kHz en een duur van 0,1 s).
   2. Importeer de TXT-bestanden in Excel en converteer ze naar de absolute waarden van de audiosignalen.
   3. Gebruik de GraphPad Prism-software om de absolute waarden van de audiogolfvormen vloeiend te maken met behulp van een afvlakkende spline met 50 punten.
      OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat de curve de originele gegevens dicht benadert en tegelijkertijd overmatige buigpunten vermijdt, is het optimaal om een afvlakkende spline van 50 punten te selecteren; Curven die zijn gegenereerd met waarden groter dan 50 punten vertonen een verwaarloosbare afwijking van de curve met 50 parameters.
   4. Bereken op basis van de afgevlakte audiogolfvormen de helling k van het startpunt naar het hoogste punt.
3. Audio spectrale analyse
   1. Importeer audiobestanden in de Spike2-software.
   2. Selecteer de begin- en eindtijd van individuele hoest- of niesaudio voor spectrale analyse en exporteer de spectrale analyseresultaten.
   3. Gebruik GraphPad Prism om spectrale analysecurven te genereren en het gebied onder de curven te berekenen.
   4. Bereken de verhouding van het gebied onder de curve tussen de frequentiebanden 30-60 kHz en 0-30 kHz om onderscheid te maken tussen hoesten en niezen.
4. Berekening van de samengestelde index
   1. Voer een natuurlijke logaritmetransformatie (ln) uit op de helling k en de verhouding van het gebied onder de spectrale analysecurve om de onderscheidbaarheid van de gegevens te verbeteren.

6. Statistische analyse

1. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM. Statistische vergelijkingen tussen twee groepen werden uitgevoerd met behulp van de t-toets en tweerichtings-ANOVA, waarbij een P < 0,05 als statistisch significant werd beschouwd. Alle analyses zijn uitgevoerd met de GraphPad Prism-software.

Resultaten

In deze studie hebben we een gedetailleerde analyse uitgevoerd van de ademhalingspatronen van hoest- en niesgedrag van muizen met behulp van plethysmografie van het hele lichaam (WBP) en echografie-opnametechnieken. De resultaten toonden aan dat muizen die een tracheale of neusoperatie ondergingen, een vergelijkbare hoest- en niesrespons vertoonden als naïeve controles. Capsaïcine (chemisch) en mechanische stimulatie roepen echter effectief hoest- en niesreflexen op bij deze chirurgisch bereide dieren (Figuur 2A,B). WBP-resultaten toonden aan dat beide gedragingen patronen met enkele en dubbele pieken vertoonden, waarbij hun geluidssignalen verschenen tijdens de uitdrijvingsfase van het ademhalingspatroon (Figuur 3A, C, E, G). Verdere echografie onthulde verschillende akoestische profielen: hoestgeluiden vertoonden een abrupt begin met een onmiddellijke piekintensiteit, voornamelijk binnen het frequentiebereik van 0-30 kHz, en een kortere duur (Figuur 3B,D; Ondersteunende video S1). Niesgeluiden vertoonden een progressieve intensiteitsopbouw tot maximale amplitude, breedbandfrequentieverdeling (0-80 kHz) en langere duur (Figuur 3F,H; Ondersteunende Video S2). Statistische analyse toonde aan dat de gemiddelde compressiefase van hoestgedrag met één piek 32,39 ± 0,73 ms was, significant korter dan die van hoestgedrag met dubbele piek van 53,17 ± 2,29 ms (Figuur 4A,B,C). De gemiddelde compressiefase van niesgedrag met één piek was 44,03 ± 1,84 ms, lager dan de gemiddelde waarde van hoestgedrag met dubbele piek, terwijl de gemiddelde compressiefase van niesgedrag met dubbele piek 74,24 ± 1,29 ms was, significant langer dan die van niesgedrag met één piek (Figuur 4E,F,G). Bovendien was de incidentieratio van een enkelvoudig piekpatroon in hoestgedrag 77,55 ± 2,10% (Figuur 4D), terwijl bij niesgedrag het patroon met één piek slechts 32,42 ± 5,88% uitmaakte, waarbij het patroon met dubbele piek 67,58 ± 5,88% uitmaakte (Figuur 4H). De statistische analyse van de audioduur gaf significante verschillen aan tussen de audiotijden van hoesten en niezen, maar er was een aanzienlijke overlap tussen de twee (Figuur 5A). Door spectrale analyse van de ultrasone audio van hoesten en niezen, ontdekten we dat het frequentiespectrum van hoestaudio voornamelijk geconcentreerd was in het bereik van 0-30 kHz, terwijl niesgeluid een hoger aandeel had in het bereik van 0-60 kHz (Figuur 5B). Hoewel hoestgeluid ook frequenties had in het bereik van 30-120 kHz, was het aandeel lage frequenties altijd hoger dan dat van hoge frequenties. Daarom gebruikten we de helling van de geluidsintensiteit van het startpunt tot de maximale waarde (Figuur 5C) als de verticale coördinaat en de energieverhouding van 30-60 kHz tot 0-30 kHz (Figuur 5D) als de horizontale coördinaat om een coördinatensysteem op te zetten, dat hoest- en niesgeluid effectief kon onderscheiden. Bovendien waren er geen significante verschillen tussen hoesten met enkele en dubbele piek en niezen met enkele en dubbele piek in dit coördinatensysteem (Figuur 5E).

Vervolgens hebben we de bovengenoemde classificatiemethoden gebruikt om het hoest- en niesgedrag veroorzaakt door capsaïcineverneveling bij muizen te categoriseren. We ontdekten dat het hoest- en niesgedrag veroorzaakt door capsaïcineverneveling overlappen met het gedrag dat wordt opgeroepen door specifieke stimulatie op dezelfde coördinaatposities (Figuur 5F,G). Na doorsnijding van nasale sensorische afferente zenuwen (voorste ethmoïdale en infraorbitale zenuwen) verminderde capsaïcineverneveling de niesgeassocieerde akoestische signalen aanzienlijk, terwijl hoestgerelateerde audioprofielen onaangetast bleven (Figuur 5H,I).

Figuur 1: Schematisch schema van de operatie in het model van de gestimuleerde luchtpijp en neusholte. (A) Schematische weergave van de katheter die in de luchtpijp is geïmplanteerd. (B) Frontale (links) en coronale (rechts) vlakken tonen de positie van de katheter die in de luchtpijp van de muis is geïmplanteerd. (C) Het sagittale vlak toont de positie van katheterimplantatie in de neusholte en de positie van filamentvezelstimulatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Kwantificering van hoest- en niesachtig gedrag uitgelokt door plaatsspecifieke stimulatie. (A) Kwantificering van niezen van de normale controlegroep, schijngroep en mechanische neusstimulatiegroep. De schijngroep vertoonde een vergelijkbare niesfrequentie als controles. Mechanische neusstimulatie veroorzaakte een significante toename van niesbuien. (B) Kwantificering van hoest van de normale controlegroep, de schijngroep en de capsaïcine tracheale provocatiegroep. De schijngroep vertoonde geen significant verschil in hoestfrequentie in vergelijking met controles. Capsaïcine tracheale stimulatie verhoogde het aantal hoesten aanzienlijk. De gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: De ademhalingssporen en het geluidsoscillogram van hoesten en niezen. (A) Representatieve beelden van het enkele piekademhalingsspoor en audio-opname tijdens een hoest veroorzaakt door capsaïcine. (B) Het geluidsoscillogram (boven) en spectrogram (onder) van de hoestaudio-opname in A. (C) Representatieve beelden van de dubbele pieken, ademhalingssporen en audio-opname tijdens een hoest veroorzaakt door capsaïcine. (D) Het geluidsoscillogram (boven) en spectrogram (onder) van hoestaudio-opname in C. (E) Representatieve beelden van het enkele piekademhalingsspoor en audio-opname tijdens een niesbui veroorzaakt door mechanische stimulatie. (F) Het geluidsoscillogram (boven) en spectrogram (onder) van de niesaudio-opname in E. (G) Representatieve beelden van de dubbele pieken, ademhalingssporen en audio-opname tijdens een niesbui veroorzaakt door mechanische stimulatie. (H) Het geluidsoscillogram (boven) en spectrogram (onder) van de niesaudio-opname in G. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: De enkele en dubbele pieken van de ademhalingssporen van hoestachtig en niesachtig gedrag. (A) Gemiddelde (rood) en individuele (grijs) en gemiddelde (rood) ademhalingssporen van hoestachtig gedrag met een enkele ademhalingspiek (n = 52). (B) Gemiddelde (rood) en individuele (grijs) en gemiddelde (rood) respiratoire sporen van hoestachtig gedrag met dubbele ademhalingspieken (n = 29). (C) Duur van enkele en dubbele ademhalingspieken compressiefasen voor hoest veroorzaakt door capsaïcine (enkele piek n = 52, dubbele pieken n = 29). (D) De gemiddelde verhouding van enkele en dubbele respiratoire pieksporen bij hoest (n = 6 muizen). (E) Gemiddelde (rood) en individuele (grijs) en gemiddelde (rood) ademhalingssporen van niesachtig gedrag met enkele ademhalingspieken (n = 40). (F) Gemiddelde (rood) en individuele (grijs) en gemiddelde (rood) respiratoire sporen van niesachtig gedrag met dubbele ademhalingspieken (n = 74). (G) Duur van enkele en dubbele ademhalingspieken compressiefasen voor niezen veroorzaakt door mechanische stimulatie (enkele piek n = 40, dubbele piek n = 74). (H) De gemiddelde verhouding van enkele en dubbele respiratoire pieksporen bij niezen (n = 6 muizen). Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM, ****P < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: De frequentie en golfvormclassificatie van het hoest- en niesgeluidoscillogram. (A) Kwantificering van de echoduur van hoesten en niezen. (B) De gemiddelde spectrogramanalyse van door mechanische stimulatie geïnduceerde niesbuien (n = 69, zwart) en door capsaïcine geïnduceerde hoest (n = 140, rood). (C) Een representatief schematisch diagram voor het berekenen van de helling van een geluidsoscillogram. Vergelijkende analyse van de afvlakkende spline laat zien dat bij 25 punten overmatige afvlakking de originele gegevenskenmerken verdoezelt, terwijl waarden van meer dan 50 punten (bijv. 75 punten) een aanzienlijke overlap vertonen met de 50-spline-curve, maar extra buigpunten introduceren. (D) Een representatief schematisch diagram van de berekening van de oppervlakteverhouding, waarbij spectrale analyseresultaten worden gebruikt om het gebied te berekenen onder verschillende frequentiecurven in GraphPad Prism. De gebiedsverhouding is gelijk aan het gebied onder de 30-60 kHz-curve en het gebied onder de 0-30 kHz-curve. (E) De frequentie- en golfvormclassificatie van door mechanische stimulatie geïnduceerd niezen en door capsaïcine geïnduceerde hoest geluidsoscillogram, waarbij de y-as de exponent is van de helling van de geluidsgolfvorm van basislijn tot piek, en de x-as de exponent van de verhouding van geluidsgolven tussen 30-60 kHz en 0-30 kHz. (F) De gemiddelde spectrogramanalyse van door capsaïcineverneveling geïnduceerde niesbuien (n = 36, zwart) en door capsaïcineverneveling geïnduceerde hoest (n = 42, rood). (G) De frequentie- en golfvormclassificatie van door capsaïcineverneveling geïnduceerde niesbuien (n = 36, zwart) en door capsaïcineverneveling geïnduceerde hoest (n = 42, rood) geluidsoscillogram, waarbij de y-as de exponent van de helling van de geluidsgolfvorm van basislijn tot piek vertegenwoordigt, en de x-as de exponent van de verhouding van geluidsgolven tussen 30-60 kHz en 0-30 kHz. (H) Statistische gegevens over door capsaïcine geïnduceerde niesreflex in groepen met doorgesneden anterieure ethmoïdale en infraorbitale zenuwen versus de groep met schijnoperaties. (I) Statistische gegevens over door capsaïcine geïnduceerde hoestreflex in groepen met doorgesneden anterieure ethmoïdale en infraorbitale zenuwen versus de groep met schijnoperaties. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM, **P < 0,01, ****P < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende video 1: Video van hoestachtig gedrag gesynchroniseerd met het audiospectrogram, weergegeven met normale en 0,1x snelheid. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video 2: Video van niesachtig gedrag gesynchroniseerd met het audiospectrogram, weergegeven met normale en 0,1x snelheid. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

In deze studie hebben we met succes hoest- en niesgedrag bij muizen geïnduceerd door specifiek de luchtpijp te stimuleren met capsaïcine en de neusholte mechanisch te stimuleren ^8,17. We verzamelden synchroon gegevens van plethysmografie van het hele lichaam (WBP), audio- en video-opnamen, en ontdekten dat audiofrequentieverhoudingen en geluidsintensiteitshellingen effectief onderscheid konden maken tussen hoest- en niesgedrag bij muizen ^8,23.

Gezien de delicate aard van de betrokken chirurgische ingrepen, moet speciale aandacht worden besteed aan verschillende kritieke stappen. Ten eerste moet de geïmplanteerde intratracheale canule tijdens een tracheale operatie zo dun mogelijk zijn en op een ondiepe diepte worden ingebracht om luchtwegobstructie te voorkomen, wat kan leiden tot ademnood of zelfs mortaliteit. Bovendien, aangezien secreties in de luchtpijp de katheter gemakkelijk kunnen blokkeren, is dagelijkse katheterklaring cruciaal. Bij toediening van capsaïcine moet de injectiesnelheid zorgvuldig worden gecontroleerd om te voorkomen dat er retrograde in de neusholte stroomt, die niesreflexen zou kunnen veroorzaken. Ten tweede is tijdens de neusbotimplantatieoperatie de grootte van het geboorde gat cruciaal om overmatige schade aan de muis te voorkomen. De katheter moet ter hoogte van het neusbot worden geplaatst zonder te diep te worden ingebracht, om overmatige irritatie van de neusholte of interferentie met de normale ademhaling te voorkomen. Uiteindelijk is de uitvoering van nauwkeurige chirurgische ingrepen essentieel voor het experiment. Door letsel aan de muis tot een minimum te beperken, kan niet alleen het herstel worden versneld, maar kunnen ook nauwkeurigere experimentele gedragsreacties worden geregistreerd. Dergelijke chirurgische methoden helpen de betrouwbaarheid van het model te vergroten en zorgen voor gegevens van hoge kwaliteit, waardoor een solide experimentele basis wordt gelegd voor het bestuderen van ademhalingsreflexgedrag zoals hoesten en niezen.

Traditioneel is het modelleren van hoestgedrag gebaseerd op verneveling van verbindingen zoals capsaïcine en citroenzuur om hoesten op te wekken^24,25. Deze aanpak heeft echter opmerkelijke beperkingen: het lokt niet alleen hoesten uit, maar kan tegelijkertijd ook niesreflexen veroorzaken ^8,22. Bovendien is er een significante interindividuele variabiliteit in gevoeligheid voor vernevelde stimuli waargenomen²⁶, en een subgroep van muizen vertoonde helemaal geen hoestreactie. Daarentegen bereikt het nieuwe mechanische stimulatieparadigma dat in deze studie is ontwikkeld, stabiel hoestachtig gedrag, terwijl flexibele aanpassing van stimuli mogelijk is via verwisselbare actuatoren. Evenzo lijden conventionele niesmodellen die gebruik maken van vernevelde middelen aan een slechte gedragsspecificiteit, omdat ze vaak collateral hoesten^{oproepen 22}, waardoor de differentiatie tussen deze verschillende ademhalingsreflexen wordt bemoeilijkt.

Eerdere studies hebben hoest- en niesmodellen bij muizen opgesteld met behulp van capsaïcine, en de twee gedifferentieerd op basis van de kenmerken van ademhalingspatronen (enkele of dubbele pieken) geregistreerd door plethysmografie van het hele lichaam (WBP)⁸. Onze onderzoeksgegevens geven aan dat bij geïnduceerd hoestgedrag het ademhalingspatroon met één piek goed was voor 77,55 ± 2,10% van de voorvallen, terwijl bij niesgedrag het patroon met één piek goed was voor 32,42 ± 5,88%. Deze resultaten bevestigen dat de classificatiemethode op basis van WBP-ademhalingspatronen in de meeste gevallen effectief is, maar beperkingen vertoont en geen perfect onderscheid tussen de twee gedragingen mogelijk maakt. Bovendien hebben sommige onderzoeken geprobeerd hoesten van niezen te onderscheiden aan de hand van de duur- en frequentiekenmerken van audiosignalen²². Hoewel de gemiddelde duur van audiosignalen voor niesgedrag doorgaans langer is dan voor hoesten, bestaat er een aanzienlijke overlap tussen de duur van individuele gebeurtenissen. Daarom kan het zijn dat het vertrouwen op de audioduur als onderscheidende indicator onvoldoende discriminatie biedt. Bovendien heeft spectrale analyse van hoesten en niezen geen duidelijke grens aan het licht gebracht: milde hoest kan zich alleen manifesteren als laagfrequente signalen, terwijl krachtig hoesten geluiden kan produceren die significante hoogfrequente componenten bevatten, met spectrale kenmerken die vergelijkbaar zijn met die van niezen. Met name hoestbuien vertonen consequent een hoger aandeel laagfrequente energie. Daarentegen kan de verhouding tussen hoogfrequente en laagfrequente energie (High-to-Low Frequency Energy Ratio) een meer onderscheidende akoestische functie bieden om onderscheid te maken tussen hoest- en niesgedrag.

Onze innovatie pakt deze beperkingen aan door middel van ruimtelijk beperkte mechanische stimulatie. Het verfijnde gedragsmodel laat dubbele voordelen zien: (1) precisie op millimeterniveau in gestabiliseerde sondes voor stimulustoepassing, en (2) verbeterde gedragsspecificiteit. Bovendien blijkt uit onze uitgebreide analyse van de akoestiek van hoesten en niezen dat dit gedrag verschillende geluidsintensiteitsprofielen vertoont, met statistisch significante verschillen in hun energieverhoudingen tussen hoge en lage frequenties. Bovendien onthult onze uitgebreide akoestische analyse van hoest- en niesbuien onderscheidende geluidsintensiteitsprofielen tussen deze gedragingen, vergezeld van statistisch significante verschillen in hun energieverhoudingen tussen hoge en lage frequenties. Bovendien is deze classificatiemethode ook haalbaar in de akoestische opnames van hoest- en niesgedrag veroorzaakt door capsaïcineverneveling. Samen maakten deze akoestische parameters de ontwikkeling mogelijk van een multidimensionale functieruimte die een objectieve, kwantificeerbare standaard vaststelt voor het onderscheiden van hoest en niezen. Het resultaat stelt een goede standaard vast voor het onderzoeken van luchtwegafweermechanismen met minder verstorende factoren en verbeterde reproduceerbaarheid. Dit lost niet alleen langdurige uitdagingen in het onderzoek naar ademhalingsreflexen op, maar opent ook wegen voor nauwkeurige neuromodulatiestudies van neurale circuits bij hoesten en niezen.

Hoewel deze methode effectief hoest- en niesgedrag bij muizen induceert, heeft het nog steeds enkele beperkingen. In vergelijking met vernevelingsinductie kan een operatie een zekere mate van letsel bij muizen veroorzaken, ook al streven we ernaar om schade tijdens de procedure tot een minimum te beperken. Desalniettemin kan de operatie nog steeds stabiel hoest- en niesgedrag uitlokken, wat aangeeft dat de operatie zelf de gevoeligheid van muizen voor deze stimuli niet vermindert. Technische uitdagingen kwamen ook naar voren bij gedragsfenotypering. Akoestische signaalgetrouwheid vereiste een nauwkeurige kalibratie van de plaatsing van de microfoon ten opzichte van het onderwerp om de signaal-ruisverhoudingen in evenwicht te brengen en tegelijkertijd amplitudeverzadiging te vermijden. Bovendien vereiste de integratie van katheters voor stimulustoediening met plethysmografiekamers voor het hele lichaam (WBP) gespecialiseerde ontwerpen: de katheter moet vanaf de bovenkant van de kamer uitsteken zonder de natuurlijke bewegingen van de muis of de toediening van de stimulus te belemmeren. Samenvattend, ondanks de beperkingen van de chirurgische methode, biedt het een effectief middel om stabiel hoest- en niesgedrag bij muizen op te wekken, en met een zorgvuldig ontworpen experimenteel proces kan letsel aan de muis worden geminimaliseerd om nauwkeurige verzameling van gedragsgegevens te garanderen.

Concluderend hebben we door deze delicate chirurgische manipulaties en rigoureus experimenteel ontwerp een model opgesteld dat stabiel hoest- en niesgedrag bij muizen induceert, wat een betrouwbare experimentele basis biedt voor verdere studie van deze twee respiratoire reflexgedragingen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.25mm nylon filament			https://item.taobao.com/item.htm?app =weixin&bc_fl_src=share-1041234389 826863-2-1&bxsign=scdVy4Xlh07ZND yojKnPqZ8vQnR_0pjarQFoQH9h636l au-W1sONf-RPbGobT6VinB8J0CrFC xRXoB-tghl13JMFQh3DrBLpqflgMRg DY2repq1fcQGIoPm4AuDfQSUQXE p&cpp=1&h5_spm=a-tb-item.b-tb-ite m&id=595514372480&share_crt_ v=1&shareurl=true&short_name=h .hIi5xvPc8rHTjez&sp_tk=eDdVczR SSG1vODU%3D&spm=a2159r.13 376460.0.0&tbSocialPopKey=shar eItem&tk=x7Us4RHmo85&un=b3 859eab62ef44248bd7bab98ffeb2 63&un_site=0&ut_sk=1.ZZv9EYy wWWkDAI%2FaThaoYLYt_2164 6297_1755074424775.TaoPassw ord-WeiXin.1&wxsign=tbwr_qqSc esj7OBC_MTN-urBRm3r6GFm9t SERXxmOXNfgDGI3usP8mgVRu QmtuQ3LRrt9OkMGFP3XV55Hpp DzZZUQ4jUaki80cL79BKkrc85YE 5VYZfdiqppGkhao6kzkKF&x-ssr=true
28G needle			https://item.taobao.com/item.htm? app=weixin&bc_fl_src=share-1041 234389566731-2-1&bxsign=scdfvM o7l21o6H5xXAgtKjf4TGT54QtHpk ED6yQRvvPvkGUKWiNyteUooM8e 6wcMmSKQpRsUCHjVo1q6Cliyp61 S3Nr1VadjTYKEJ1_SxSFZln_zI-0U omdKkkegvM6O5Rr&cpp=1&h5_sp m=a-tb-item.b-tb-item&id=670272 286239&share_crt _v=1&shareurl=true&short_name= h.hIiUFWFOj35n1LJ&sp_tk=eHFJ QTRSSE9xZDc%3D&spm=a2159 r.13376460.0.0&tbSocialPopKey= shareItem&tk=xqIA4RHOqd7&un =b3859eab62ef44248bd7bab98ff eb263&un_site=0&ut_sk=1.ZZv9 EYywWWkDAI%2FaThaoYLYt_2 1646297_1755074424775.TaoPa ssword-WeiXin.1&wxsign=tbwwJc wF20yLPkLax6kR7BPCJ3uPXx_ KPLTBjHUIph1nmN96mu0vYRC 0-DQxpG6mWPKWPZwSElseb HTR6nMzL7zthSG_67CIodTi_3i bFk7SKNFmbLeg1MVSDl9YzKs axPI&x-ssr=true
2-methyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	240486-100ML
Avisoft RECORDER USGH	Avisoft		Voor ultrasoon opnemen
Brain Stereotactic Injector	RWD	68801
Capsaicin	MCE	HY-10448
Elektronische weegschaal	Shanghai ZhuoJing	BSM-220.4
GraphPad Prism	GraphPadSoftware		Gebruikt voor grafieken en gegevensanalyse
High Speed Camera System	Filr	20102748
Iodophor	LIRCON		https://www.lircon.cn/products_details/218.html
Microinjectiepomp	XIMAINANOTECH	XMSP-C
Modelleringsklei			https://detail.tmall.com/item.htm? app=weixin&bc_fl_src=share-10 41234985980666-2-1&bxsign=s cdTRuE_YDJUf3ImFGBBqpft8S OgQqVocuYNmXEUcLyxiJX85R eVH8uZxdnVBKeXGONiCQ_Fc UDXoNcDga8mP3sClXi1CKRn R6SHFSitGVUGOFOA7eGoZT 38cLXHb8wUW-S&cpp=1&h5_ spm=a-tb-item.b-tb-item&id=61 1429671875&share _crt_v=1&shareurl=true&short _name=h.hs0LTq88ockDBN6& sp_tk=cldZNjRSREhKUDU%3 D&spm=a2159r.13376460.0.0 &tbSocialPopKey=shareItem& tk=rWY64RDHJP5&un=b385 9eab62ef44248bd7bab98ffeb 263&un_site=0&ut_sk=1.ZZv9 EYywWWkDAI%2FaThaoYLYt _21646297_1755091386