Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Voorbereiding en evaluatie van het model voor premature ovariële insufficiëntie bij muizen

1.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69000

⸱

19 september 2025

 , 
1The First Hospital of Anhui University of Science and Technology'

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol schetst een methode voor het construeren van een muismodel voor premature ovariële insufficiëntie via cyclofosfamide-injectie. Het model repliceert effectief, gemakkelijk en aanpasbaar de pathologische progressie van vroegtijdige ovariële insufficiëntie bij de mens, wat een hoge betrouwbaarheid en kosteneffectiviteit aantoont.

Samenvatting

Premature ovariële insufficiëntie (POI) is een kritieke aandoening die leidt tot onvruchtbaarheid bij vrouwen, waardoor betrouwbare diermodellen voor mechanistisch en therapeutisch onderzoek nodig zijn. Hier presenteren we een gestandaardiseerd protocol voor het opstellen en evalueren van een cyclofosfamide (CTX)-geïnduceerd POI-muismodel. Vrouwelijke muizen van zes tot acht weken oud met regelmatige oestruscycli werden geselecteerd en onderworpen aan intraperitoneale CTX-injecties: een startdosis van 100 mg/kg op dag 1, gevolgd door dagelijkse doses van 20 mg/kg gedurende de daaropvolgende 14 dagen. Dynamische veranderingen in oestrische cycli werden gevolgd via vaginale uitstrijkcytologie met Wright-kleuring. Serumspiegels van oestradiol (E2), follikelstimulerend hormoon (FSH) en anti-Mülleriaans hormoon (AMH) werden gekwantificeerd met behulp van ELISA om endocriene veranderingen te beoordelen. Ovariële histopathologie werd geëvalueerd door middel van hematoxyline-eosine (H & E) kleuring van in paraffine ingebedde secties om folliculaire atresie te kwantificeren, terwijl immunohistochemische analyse van gesplitste caspase-3 werd uitgevoerd om apoptose van granulosacellen te detecteren. De resultaten toonden verstoorde oestrische cycliciteit, significant verlaagde E2- en AMH-spiegels, verhoogde FSH-concentraties, verhoogde folliculaire atresie en verbeterde granulosacelapoptose bij met CTX behandelde muizen, wat succesvolle POI-modellering bevestigt. Deze modelbouwmethode kan het mechanisme van door chemotherapie geïnduceerde eierstokbeschadiging sterk nabootsen, met typische pathologische kenmerken zoals uitputting van de follikelreserve en geslachtshormoonstoornissen. Het biedt een betrouwbaar experimenteel platform voor het onthullen van het reproductietoxiciteitsmechanisme van chemotherapie, het screenen van eierstokbeschermende geneesmiddelen en het optimaliseren van strategieën voor het behoud van vruchtbaarheid. Bovendien is dit model relatief eenvoudig te bedienen, goedkoop en heeft het een korte productiecyclus, waardoor het gemakkelijk uit te voeren en populair te maken is. De methodologie sluit aan bij de vereisten van JoVE voor visualiseerbare, stapsgewijze experimentele demonstraties.

Inleiding

Premature ovariële insufficiëntie (POI), de meest voorkomende vorm van reproductieve verouderingsstoornis bij vrouwen, brengt niet alleen de fysieke en mentale gezondheid van patiënten ernstig in gevaar door symptomen van oestrogeendeficiëntie en reproductieve disfunctie, maar verhoogt ook het risico op het ontwikkelen van comorbiditeiten, waaronder fracturen, auto-immuunziekten, hart- en vaatziekten, diabetes mellitus, enz.1. De ontwikkeling van efficiënte en veilige therapeutische strategieën is dus een uiterst urgente prioriteit geworden in de moderne geneeskunde. Gezien de beperkte beschikbaarheid van klinische monsters, multifactoriële etiologie en hoge ethische risico's in verband met POI-onderzoek, is het opstellen van betrouwbare diermodellen die systematisch mechanistisch onderzoek en veiligheidsvalidatie mogelijk maken, onmisbaar geworden.

Momenteel worden door chemotherapie geïnduceerde modellen voor eierstokbeschadiging veel gebruikt voor POI-onderzoeken. Cyclofosfamide (CTX), een alkylerend middel met immunosuppressieve eigenschappen, is geïdentificeerd als een krachtige gonadotoxische verbinding. Het mechanisme omvat DNA-verknopingsschade om cellulaire proliferatie te onderdrukken2, wat leidt tot apoptose van ovariële reservecellen 3,4. Op CTX gebaseerde modellen recapituleren effectief klinische kenmerken van POI, waaronder primordiale follikeldepletie, hypooestrogenemie en verhoogde niveaus van follikelstimulerend hormoon (FSH). Intraperitoneale CTX-injectie bij muizen biedt duidelijke voordelen: hoge biologische beschikbaarheid door snelle peritoneale absorptie, gestandaardiseerde operabiliteit met minimale technische variabiliteit en kosteneffectiviteit voor grootschalige studies. Met name de eierstokstructuur van muizen lijkt sterk op die van mensen, wat de dynamische observatie van folliculaire uitputting en hormonale veranderingen vergemakkelijkt. Bovendien zijn muizen goedkoop en hebben ze een snelle voortplantingssnelheid, waardoor ze voldoen aan de vereisten voor grootschalige steekproefstudies.

Ondanks deze voordelen heeft heterogeniteit in CTX-doseringsregimes (bijv. enkelvoudige bolus versus gefractioneerde injecties) en tijdelijke toedieningsvensters geleid tot inconsistente modelleringsresultaten in verschillende onderzoeken. Om deze kloof te dichten, presenteren we een systematisch protocol dat de CTX-dosering en toedieningsfrequentie voor POI-inductie bij muizen optimaliseert. Deze studie heeft tot doel een reproduceerbaar model op te stellen door middel van kwantitatieve beoordeling van uitputting van de ovariële reserve, hormonale ontregeling en histopathologische correlaten, waardoor een robuust platform wordt geboden voor mechanistische exploratie en therapeutische screening.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol is beoordeeld en goedgekeurd door de ethische commissie van Anhui Shendong Biotechnology Development Co., Ltd. (Ethisch nummer: SDLL202502281). Deze studie voldoet aan de richtlijnen van de National Institutes of Health over de verzorging en het gebruik van laboratoriumknaagdieren in alle dierexperimenten. De vrouwelijke C57BL/6-muizen die in dit experiment werden gebruikt, waren 6-8 weken oud en werden onder specifieke pathogeenvrije (SPF) omstandigheden gehouden. Als een ingeteelde stam en een onderstam van de C57-afstamming, worden C57BL/6-muizen gekenmerkt door hun zwarte vacht. Voorafgaand aan het experimenteren werden de muizen een week lang geacclimatiseerd in het dierlaboratorium onder gecontroleerde temperatuur- en vochtigheidsomstandigheden, met een licht/donker-cyclus van 12 uur om natuurlijke circadiane ritmes na te bootsen. Gedurende de acclimatisatieperiode kregen de muizen ad libitum toegang tot voedsel en water.

1. Voorbereiding van dieren

OPMERKING: Selecteer 24 vrouwelijke SPF-grade C57BL/6 muizen van 6-8 weken met normale oestruscycli. Verzamel vaginale spoelvloeistof van de muizen om 9.00 uur gedurende 10 opeenvolgende dagen om uitstrijkjes van geëxfolieerde vaginale cellen voor te bereiden. Observeer de oestrische cycli en kies de muizen die ten minste één continue en volledige cyclus hebben.

  1. Laat muizen 1 week voorafgaand aan de experimenten acclimatiseren in de omgeving. Markeer muizen met een oorpons na de aanpassingsperiode. Registreer de metingen van het lichaamsgewicht direct na het markeren.
  2. Pak de muizen stevig vast totdat natuurlijk door stress veroorzaakt urineren optreedt. Immobiliseer door de huid van de dorsale nek tussen duim en wijsvinger van de linkerhand samen te knijpen. Plaats de kop van de muis naar beneden om de buikstreek volledig bloot te leggen.
  3. Laad een steriele pipetpunt op een micropipet. Aspireer 10 μL steriele fysiologische zoutoplossing op. Voer drie opeenvolgende spoelcycli uit door het vaginale kanaal. Houd de spoelvloeistof in de pipetpunt vast.
  4. Verdeel de spoelvloeistof gelijkmatig over het glazen microscoopglaasje. Glaasjes volledig aan de lucht drogen bij kamertemperatuur. Fixeer cellen door ze onder te dompelen in 95% ethanol voor conservering. Etiketteer objectglaasjes uitgebreid met experimentele parameters en bewaar ze beschermd in lichtdichte glaasjesdozen bij 4 °C wanneer ze niet worden verwerkt.
  5. Het kleuringsprotocol van Wright
    1. Dompel de dia's onder in 95% ethanol (gedurende 3-10 min). Spoel grondig af onder de gedestilleerde waterstroom.
    2. Breng de dia's over door een bad van 95% ethanol (duur 1 min).
    3. Schraap de geoxideerde film van het oppervlak van de hematoxylineoplossing met schoon filterpapier. Dompel de glaasjes onder in gefilterd hematoxyline (gedurende 5 min).
    4. Spoel de dia's af met gedestilleerd water. Dompel kort (<1 s) in 1% HCl-oplossing. Compleet met een uitgebreide spoeling met gedestilleerd water.
    5. Bereid gemengde beits voor met Orange G- en EA50-oplossingen. De vlek glijdt in het mengsel (gedurende 3 min).
    6. Laat de dia's door drie opeenvolgende 95% ethanolbaden lopen (intervallen van 5 seconden).
    7. Behandel met xyleen in twee fasen (elk 2 minuten).
      NOTITIE: Werk in een zuurkast om inademing van xyleendamp te voorkomen. Sluit de containers direct na gebruik.
    8. Permanent conserveren van samples met behulp van neutraal harsmontagemedium
  6. Wanneer u het objectglaasje onder de microscoop leest, identificeert u de cellen met lichtroze cytoplasma en donkerpaarse kernen als geëpitheelcellen met kern, onregelmatige schilferige lichtroze cellen zonder kern als verhoornde epitheelcellen en kleine ronde blauwe cellen als witte bloedcellen.
    OPMERKING: Bepaal het oestruscyclusstadium op basis van de volgende cytologische kenmerken: (1) Pro-oestrusfase: Overheersende epitheelcellen met kern. Ze worden weergegeven als afzonderlijke cellen en gegroepeerde bladen. Schaarse aanwezigheid van leukocyten (<5% gezichtsveld); (2) Estrusfase: Overvloedige gekretainde epitheelcellen met een kern. Kenmerken: grote afgeplatte morfologie met onregelmatige randen. Nabije afwezigheid van leukocyten en cellen met kern (<2% gecombineerd); (3) Metestrusfase: afnemende verhoornde celpopulatie. Infiltratie van opkomende leukocyten. Opnieuw verschijnende epitheelcellen met kern (20%-40% samenstelling); (4) Diestrus fase: Dominante leukocyten en cellen met kern (>80%). Virtuele afwezigheid van verhoornde cellen (<1%)5. Raadpleeg de gestandaardiseerde cytologische atlas in figuur 1 voor patroonverificatie.
  7. Organiseer en analyseer de gegevens en selecteer 24 muizen met normale oestrische cycli.

2. Bereiding van cyclofosfamide-injectie

OPMERKING: Cyclofosfamide is onstabiel voor licht en moet tijdens het hele proces in het donker worden gehanteerd. Cyclofosfamide is giftig, dus beschermende kleding, dubbellaagse nitrilhandschoenen en maskers moeten tijdens de operatie worden gedragen.

  1. Voeg 200 mg steriel cyclofosfamidepoeder van farmaceutische kwaliteit toe aan 10 ml steriele zoutoplossing. Meng grondig om een cyclofosfamide-oplossing van 20 mg/ml te verkrijgen. Bewaar één portie voor direct gebruik; Bereid extra concentraties voor met de rest.
  2. Breng 200 μL 20 mg/ml bouillon over in een centrifugebuis van 1,5 ml gewikkeld in aluminiumfolie. Voeg 800 μL steriele zoutoplossing toe om een totaal volume van 1 ml te bereiken. Vortex-mix gedurende 30 s om een oplossing van 4 mg/ml te verkrijgen. Bereid 14 identieke aliquots voor (elk 1 ml). Bewaar alle aliquots bij -20 °C in een verticaal rek.

3. Injecteren van de cyclofosfamide-oplossing

OPMERKING: Randomiseer 24 muizen in drie cohorten met behulp van een geautomatiseerd systeem: (1) BLANK: Geen behandeling (n = 8); (2) NS: Controles met zoutoplossing (n = 8); (3) POI: Cyclofosfamide groep (n = 8). Injecteer de muizen elke ochtend om 9.00 uur. Injecteer voor de POI-groep intraperitoneaal 100 mg/kg cyclofosfamideoplossing op de eerste dag en injecteer vervolgens continu 20 mg/kg cyclofosfamideoplossing gedurende de volgende 14 dagen. Injecteer intraperitoneaal een gelijk volume normale zoutoplossing in de NS-groep en laat de BALNK-groep onbehandeld. Weeg alle muizen voor elke injectie, elke dag, en verzamel vaginale geëxfolieerde cellen om na de injectie uit te smeren.

  1. Plaats een met isofluraan doordrenkt watje met een tang in een afsluitbare container. Plaats de muis in de container voor 10 s inhalatie-anesthesie.
    OPMERKING: Isofluraan is een vluchtig verdovingsmiddel met bepaalde toxiciteit en irritatie. Operaties moeten worden uitgevoerd in een goed geventileerde omgeving volgens institutioneel goedgekeurde protocollen.
  2. Bereken het injectievolume: Lichaamsgewicht (g) × 5 = μL. Desinfecteer het rechter onderste kwadrant met een 75% ethanol swab. Steek een naald van 26 G in een hoek van 30-45° (schuine kant naar boven). Beweeg 5 mm door de buikwand tot een "pop" gevoel. Lever de oplossing met een snelheid van 50 μl/s.
  3. Plaats restvloeistoffen en verontreinigde apparatuur in lichtdichte afvalcontainers met het label "LICHTGEVOELIG AFVAL". Gooi de met isofluraan doordrenkte wattenbolletjes weg in daarvoor bestemde verzegelde containers die zijn voorzien van duidelijke etiketten voor GEVAARLIJK AFVAL.
  4. Ontdooi bevroren aliquots van 4 mg/ml in een waterbad van 37 °C (3 min). Bereken de dagelijkse dosis opnieuw: lichaamsgewicht (g) × 5 = μl. Controleer de helderheid van de oplossing voordat u de spuit vult.

4. Serum collectie

OPMERKING: Na 15 dagen injectie met cyclofosfamideoplossing wordt bloed verzameld uit de top van het hart van alle muizen. Centrifugeer om het serum te verkrijgen. Muizen in de controlegroep en de NS-groep moeten tijdens de diestrusfase worden bemonsterd. Muizen uit de POI-groep ondergingen een op de tijd afgestemde bemonstering in combinatie met controle/NS-groepsmuizen, waarvan bevestigd was dat ze in diestrus waren.

  1. De muis verdoven
    1. Plaats de muis in een transparante, luchtdichte kamer met een met isofluraan verzadigd watje.
    2. Observeer het gedrag van de muis. Verlies van oprichtreflex (het niet corrigeren van de houding wanneer deze voorzichtig in rugligging wordt gedraaid) duidt op voldoende anesthesie-inductie. Dit proces duurt meestal 2-3 minuten.
    3. Haal de muis uit de container. Fixeer zijn kop met je linkerhand en druk voorzichtig met je wijsvinger op het bovenste ooglid. Houd een steriel wattenstaafje in uw rechterhand, dompel het in erytromycine-oogzalf om een hoeveelheid met een diameter van 1-2 mm te verzamelen.
      1. Breng de zalf gelijkmatig aan op het oppervlak van de oogbol en het binnenste ooglid. Sluit het ooglid en masseer vervolgens zachtjes met uw vingertop gedurende 10 s om de zalf gelijkmatig te verdelen. Veeg overtollige zalf rond het oog weg met een droog wattenstaafje.
  2. Plaats de muis in rugligging op een schuimrubberen bord. Knip het borsthaar af met een chirurgische schaar. Desinfecteer de borstkas en buikstreek met 75% ethanol.
    1. Snijd de huid en het onderhuidse weefsel langs de middellijn. Snijd de intercostale spieren in de lengterichting langs de linkerkant van het borstbeen. Stel het hart bloot.
  3. Steek een spuit (met de afgeschuinde naald naar boven) in de top van het hart in een hoek van ongeveer 30°. Beweeg de naald langzaam vooruit en aspireer voorzichtig. Injecteer het verkregen bloed in een centrifugebuis van 1,5 ml.
  4. Doe het verkregen bloed in een centrifuge. Stel de centrifuge in op 850 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Gebruik een pipet om het serum van de bovenste laag eruit te halen en plaats het in een centrifugebuis van 0,5 ml. Bewaar het bij -80 °C.

5. Detectie van serumoestrogeen, FSH en AMH

  1. Bewaar het bevroren serum een nacht in de koelkast van 4 °C om het langzaam te ontdooien.
  2. Haal de ELISA-kit 30 minuten van tevoren uit de koelkast om de reagentia erin weer op kamertemperatuur te laten komen.
  3. Voer volgens de instructies van de set seriële verdunningen van de standaard uit met behulp van het standaard verdunningsmiddel. Stel over het algemeen meerdere concentratiegradiënten in, zoals 0, 10, 20, 40, 80, 160 pg/ml, enz.
  4. Voeg de verdunde standaard en de te testen serummonsters toe aan de overeenkomstige putjes van de ELISA-plaat, 100 μL per putje. Plaats tegelijkertijd lege controleputjes en voeg 100 μL van het monsterverdunningsmiddel toe.
  5. Plaats de ELISA-plaat 1-2 uur in een incubator van 37 °C om het antigeen en het antilichaam volledig te laten binden.
  6. Nadat de incubatie is afgelopen, zuigt u de vloeistof in de putjes voorzichtig op. Was de ELISA-plaat 3-5 keer met de wasoplossing. Dep na elke wasbeurt de ELISA-plaat voorzichtig droog om de resterende wasoplossing te verwijderen.
  7. Voeg de enzymgelabelde antilichaamwerkoplossing toe, 100 μL per putje. Blijf gedurende 1 uur incuberen in een broedstoof van 37 °C.
  8. Herhaal de bovenstaande wasstappen, was 3-5 keer en dep de ELISA-plaat droog.
  9. Voeg 100 μL substraatoplossing toe aan elk putje. Meng voorzichtig door te schudden. Incubeer in het donker bij 37 °C gedurende 15-30 minuten tot er een helderblauwe kleur ontstaat.
  10. Voeg 100 μL beëindigingsoplossing toe aan elk putje om de reactie te stoppen. Let op de kleurverandering van blauw naar geel.
  11. Gebruik een microplaatlezer om de absorptiewaarden (A-waarden) van elk putje bij een golflengte van 450 nm af te lezen en noteer de gegevens.
  12. Neem de concentratie van de standaard als de abscis en de bijbehorende absorptiewaarde als de ordinaat om een standaardcurve te tekenen. Gebruik over het algemeen een veeltermaanpassing om ervoor te zorgen dat de correlatiecoëfficiënt r² van de standaardcurve groter is dan 0,99.
    1. Vervang volgens de standaardcurve de absorptiewaarde van het te testen serummonster in de standaardcurvevergelijking om de hormoonconcentratie in het monster te berekenen.

6. Afname van eierstokweefsel

  1. Euthanaseer de nog steeds verdoofde muis door cervicale dislocatie (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen) en gebruik vervolgens een chirurgische schaar om de buik van de muis te openen.
  2. De eierstokken bevinden zich onder de nieren en zijn omwikkeld met witte vetkussentjes. Til de vetkussentjes voorzichtig op met een tang om de eierstokken en eileiders bloot te leggen. Gebruik een schaar om de eierstokken te scheiden van het omliggende bindweefsel.
  3. Plaats het verwijderde eierstokweefsel in 4% paraformaldehyde voor fixatie gedurende 24 uur.

7. Bereiding van paraffinesecties

  1. Uitdroging: Haal de eierstokken eruit en haal ze achtereenvolgens door ethanoloplossingen van verschillende concentraties (75%, 85%, 95%, 100%), waarbij elke stap 1 uur duurt.
  2. Transparantiebehandeling: Behandel eerst de eierstokken gedurende 15 minuten in een mengsel van xyleen en ethanol. Dompel ze vervolgens elk 15 minuten onder in Xyleen I en Xyleen II.
  3. Wax impregnering: Dompel de eierstokken onder in een mengsel van xyleen en paraffine. Breng ze vervolgens over naar paraffine I, paraffine II en paraffine III gedurende elk 0,5 uur.
  4. Inbedding: Plaats de met was geïmpregneerde eierstokken in een inbeddingsvorm. Pas de oriëntatie van de tissues aan (met het snijvlak naar beneden). Giet gesmolten paraffine in de vorm en laat het afkoelen en stollen.
  5. Secties: Snijd het paraffineblok met behulp van een microtoom in secties van 5 μm dik. Voer seriële secties uit en breng het lint voorzichtig over met een borstel, zodat het een uniforme, doorschijnende band vormt die plat ligt zonder vervorming wanneer deze op een waterbad drijft

8. H&E-kleuring

  1. Ontwaxen: Dompel de in paraffine ingebedde delen 10 minuten onder in xyleen I. Breng de secties vervolgens over naar Xyleen II en laat ze nog 10 minuten weken.
  2. Rehydratatie: Haal de secties door een reeks ethanoloplossingen van verschillende concentraties in volgorde: 100% ethanol, 95% ethanol, 85% ethanol en 75% ethanol, met een onderdompelingstijd van 5 minuten voor elk. Spoel de secties ten slotte 1 minuut af met gedestilleerd water.
  3. Hematoxylinekleuring: Dompel de secties 5 minuten onder in hematoxylinekleuringsoplossing. Spoel de secties 30 s af onder stromend water.
  4. Differentiatie: Dompel de secties 1-3 s onder in 1% zoutzuur-ethanoloplossing. Spoel de secties 1-2 minuten af onder stromend water.
  5. Cytoplasmatische kleuring: Dompel onder in eosine Y-oplossing (1 min). Dep overtollige vlekken af met filtreerpapier.
  6. Dehydratatie: Haal de secties door een reeks ethanoloplossingen: 85% ethanol, 95% ethanol en 100% ethanol (tweemaal), met een onderdompelingstijd van 5 s voor elk.
  7. Klaren: Dompel de secties 5 minuten onder in Xyleen I. Breng de secties vervolgens over naar Xyleen II en laat ze nog 5 minuten weken.
  8. Montage: Laat neutrale hars op het bevlekte gedeelte vallen. Leg voorzichtig een dekglaasje over het gedeelte.
  9. Follikel tellen: Bekijk de bevlekte secties onder een microscoop. Tel en registreer het aantal follikels in verschillende ontwikkelingsstadia.

9. Immunohistochemie voor Caspase-3 in eierstokweefsel

  1. Antigeenafzuiging: Plaats de van was ontdane en gerehydrateerde delen in de natriumcitraatbuffer (pH 6,0). Verwarm de partjes 5 minuten in een magnetron op hoog vermogen. Haal ze er dan uit en laat ze afkoelen.
    1. Herhaal het verwarmingsproces nog 2 keer, voor een totaal van 3 verwarmingscycli. Was de secties na natuurlijke afkoeling 3 keer met PBS, telkens gedurende 5 minuten.
  2. Eliminatie van endogene peroxidase: Voeg druppelsgewijs 3% H₂O₂ toe aan de secties. Incubeer de coupes 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Was de secties 3 keer met PBS, telkens gedurende 3 minuten.
  3. Serumblokkering en incubatie van antilichamen: Voeg konijn anti-caspase-3 primair antilichaam druppelsgewijs toe aan de secties. Incubeer de coupes een nacht in een natte bak bij 4 °C. Laat de secties de volgende dag 30 minuten weer op kamertemperatuur komen. Was de secties 3 keer met PBS, telkens gedurende 5 minuten.
  4. Kleurontwikkeling, tegenvlekken en montage: Gebruik DAB voor kleurontwikkeling, wat meestal ongeveer 1-5 minuten duurt. Bestkleur de secties met hematoxyline gedurende 2 min. Was de secties na het tegenbeitsen 5 min.
    1. Plaats de secties vervolgens 1 minuut in ammoniakwater om ze blauw te kleuren. Voer ten slotte uitdroging uit door een gradiënt van ethanol, maak de secties vrij en monteer ze.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het proces van het opzetten van het POI-muismodel wordt geïllustreerd in figuur 2. Het lichaamsgewicht en de oestrische cyclus van de muizen werden geregistreerd vanaf de eerste dag van de injectie van het geneesmiddel. Na 15 dagen CTX-injectie was het gemiddelde lichaamsgewicht van de muizen in de POI-groep (3,717% ± 1,463%) significant hoger dan dat in de BLANK-groep (0,2526% ± 0,1469%) en de NS-groep (0,4305% ± 0,2494%) (p < 0,0001). Er was geen ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Voortijdige ovariële insufficiëntie (POI) heeft ernstige gevolgen voor de lichamelijke gezondheid en kwaliteit van leven van vrouwen, en de wereldwijde prevalentie neemt jaar na jaar toe. Op dit moment is er echter nog steeds een gebrek aan veilige en effectieve behandelmethoden voor POI. Het opzetten van een betrouwbaar en reproduceerbaar diermodel is cruciaal voor het bevorderen van onderzoek naar POI. Klinisch zijn de oorzaken van POI divers en zijn geneesmiddelen voor chemotherapie b...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs zijn dankbaar voor de financiële steun die ze hebben ontvangen van de Wu Jieping Medical Foundation via haar Clinical Research Special Funding Program (subsidienr. 320.6750.17067). We erkennen ook dankbaar het onderzoeksplatform en de technische ondersteuning die Anhui Shendong Biotechnology Development Co., Ltd heeft geboden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4% paraformaldehydeSangon Bioengineering Co., LtdA500684-0500
75% alcoholShandong Dexinkang Medical Technology Co., Ltd200603
Anhydrous ethanolBengbu Chemical Reagent Factory
Centrifuge tubesbiosharpBS-15-M
Cold tableQuanlin MedicalQL-LT20230003
Cotton ballsShandong Brilliance Co., Ltd20241008
CoverslipsJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd80312-3412
CyclophosphamideBaxter Oncology GmbH3K645A
DehydratorHubei Xiaogan Haikuo Medical Technology Co., LtdKH-TS
Dyeing machineHubei Xiaogan Haikuo Medical Technology Co., LtdKH-S101 
EA50 staining solutionHubei Taikang Medical Equipment Co., LtdJ7EC20
Ear tag pliersShenzhen Ruiwode Life Science and TechnologyC22002-10
Efficient sectioning of paraffinTongxiang Hualing Wax Industry Co., Ltd20241018
Electric blast drying oven (oven)Shanghai Yuejin Medical Equipment Co., LtdHCZF-11
Electrically heated thermostatic water incubatorShanghai Yuejin Medical Equipment Co., LtdHSW-600
Embedding machinePrisstar Changzhou Medical Device Co., LtdPMB-A
Eosin stainSewell Biotechnology Co., LtdG1005-2
Hematoxylin differentiation solutionSewell Biotechnology Co., LtdG1039-500ML
Hematoxylin staining solutionSewell Biotechnology Co., LtdG1005-1
IsofluraneShandong Ante Animal Husbandry Technology Co., Ltd2024101501
microscopeAnhui Jiashang Biotechnology Co., LtdSQS-12P
Mouse anti-Mullerian hormone (AMH) ELISA kitHengyuan BiotechnologyHB1334-Mu
Mouse estradiol (E2) enzyme-linked immunoassay kitHengyuan BiotechnologyHB975-Mu
Mouse follicle-stimulating hormone (FSH) ELISA kitHengyuan BiotechnologyHB967-Mu
Neutral gumNanchang Yulu Experimental Equipment Co., Ltd240504
Pathological tissue bleaching apparatusPrisstar Changzhou Medical Device Co., LtdPHY-III
PBS bufferbiosharpBL302A
Pipette tipsbiosharpBS-10-T
PipettesDalong Medical Equipment Co., LtdYE213AT0257922
Rapid tissue dehydratorHubei Xiaogan Haikuo Medical Technology Co., LtdKH-TS
slicerGheddyYD-315
SlidesJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd80312-3161
Smear machineHubei Taikang Medical Equipment Co., Ltd131001305
Sodium chloride injectionWuhan Binhu Shuanghe Pharmaceutical Co., Ltd240525K04
syringeJiangsu Zhiyu Medical Device Co., Ltd
Vibrating slicerShanghai Zhixin Instrument Co., LtdZQP-86
XyleneTianjin Kaitong Chemical Reagent Co., Ltd20240102

Referenties

  1. Federici, S., et al. Primary ovarian insufficiency: update on clinical and genetic findings. Front Endocrinol. 15, 1464803(2024).
  2. Soleimani, R., Heytens, E., Darzynkiewicz, Z., Oktay, K. Mechanisms of chemotherapy-induced human ovarian aging: Double-strand DNA breaks and microvascular compromise. Aging (Albany NY). 3 (8), 782-793 (2011).
  3. Bellusci, G., et al. Kinase-independent inhibition of cyclophosphamide-induced pathways protects the ovarian reserve and prolongs fertility. Cell Death Dis. 10 (10), 726(2019).
  4. Yuksel, A., et al. The magnitude of gonadotoxicity of chemotherapy drugs on ovarian follicles and granulosa cells varies depending upon the category of the drugs and the type of granulosa cells. Hum Reprod. 30 (12), 2926-2935 (2015).
  5. Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertil Re Pract. 6, 5(2020).
  6. Wang, Z., Wang, Y., Yang, T., Li, J., Yang, X. Study of the reparative effects of menstrual-derived stem cells on premature ovarian failure in mice. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 11(2017).
  7. Shen, J., et al. Transplantation of the LRP1(high) subpopulation of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells improves ovarian function in mice with premature ovarian failure and aged mice. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 64(2024).
  8. Letourneau, J. M., et al. Acute ovarian failure underestimates age-specific reproductive impairment for young women undergoing chemotherapy for cancer. Cancer. 118 (7), 1933-1939 (2012).
  9. Nynca, A., et al. Tamoxifen decreases ovarian toxicity without compromising cancer treatment in a rat model of mammary cancer. BMC Genomics. 24 (1), 325(2023).
  10. Feng, Y., et al. Protective effect of Luffa cylindrica fermentation liquid on cyclophosphamide-induced premature ovarian failure in female mice by attenuating oxidative stress, inflammation and apoptosis. J Ovarian Res. 17 (1), 24(2024).
  11. Huang, Y., et al. Bushen Huoxue recipe ameliorates ovarian function via promoting BMSCs proliferation and homing to ovaries in POI mice. Phytomedicine. 129, 155630(2024).
  12. Ai, G., et al. Adipose-derived stem cells promote the repair of chemotherapy-induced premature ovarian failure by inhibiting granulosa cells apoptosis and senescence. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 75(2023).
  13. Anderson, R. A., et al. Anti-Müllerian hormone as a marker of ovarian reserve and premature ovarian insufficiency in children and women with cancer: A systematic review. Hum Reprod Update. 28 (3), 417-434 (2022).
  14. Jiao, X., et al. Ovarian reserve markers in premature ovarian insufficiency: within different clinical stages and different etiologies. Front Endocrinol. 12, 601752(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

POI muismodelinductie met cyclofosfamidemonitoring van de oestruscyclusvaginaal uitstrijkcytologieWright kleuringserumhormoonanalysehistopathologie van de eierstokkenfolliculaire atresieapoptose van granulosacellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.