Onderzoeksartikel

Snelle detectie van Staphylococcus aureus en meticilline-resistente Staphylococcus aureus door multiplex real-time fluorescerende PCR

DOI:

10.3791/69004

⸱

19 september 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiac Surgery, Guangdong Cardiovascular Institute, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University, 2Department of Laboratory, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol maakt gebruik van multiplex real-time PCR met primers/sondes gericht op SA-specifieke nuc- en MRSA-mecA-genen. Het maakt een snelle (<1 uur), kwalitatieve detectie van SA/MRSA-nucleïnezuren in menselijke sputummonsters mogelijk, waardoor de beperkingen van op cultuur gebaseerde methoden worden overwonnen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Staphylococcus aureus (S.aureus) is een veel voorkomende Gram-positieve menselijke ziekteverwekker die buiten het ziekenhuis opgelopen en nosocomiale infecties veroorzaakt, met diverse klinische manifestaties, variërend van lokale oppervlakkige laesies en voedselvergiftiging tot fatale systemische infecties. De ontdekking van antibiotica verminderde het sterftecijfer aanzienlijk, maar het probleem van resistentie tegen geneesmiddelen is sindsdien steeds prominenter geworden. Sinds de eerste identificatie van MRSA in 1960 is deze stam uitgegroeid tot een wereldwijde bedreiging voor de volksgezondheid. MRSA is een belangrijke ziekteverwekker van nosocomiale infecties, die verschillende ernstige ziekten kan veroorzaken, zoals endocarditis, chronische osteomyelitis, longontsteking, pyogene artritis en bacteriëmie. Daarom is een snelle en nauwkeurige detectie van S. aureus en zijn geneesmiddelresistentie cruciaal voor het begeleiden van de klinische behandeling.

De huidige routinematige detectiemethoden voor S.aureus en MRSA hebben aanzienlijke beperkingen. De traditionele bacteriecultuurmethode, die decennialang als de "gouden standaard" dient, kan definitieve resultaten opleveren voor soortidentificatie en geneesmiddelgevoeligheid, maar het proces is tijdrovend en duurt 48 tot 72 uur. Bovendien is deze methode gevoelig voor besmetting en vertrouwt het op gespecialiseerde laboratoriumfaciliteiten en bekwame technici. Serologisch testen bereiken een niet-invasieve diagnose door S.aureus-antilichamen in het serum van de patiënt te detecteren, maar het kan geen onderscheid maken tussen actieve infecties en eerdere infecties, noch kan het geneesmiddelresistente stammen (zoals MRSA) identificeren.

Deze studie richt zich op het ontwikkelen van een nieuwe multiplex real-time fluorescentie PCR-detectiemethode om de bovengenoemde beperkingen te overwinnen. Deze methode ontwerpt specifieke primers en TaqMan fluorescerende sondes gericht op het soortspecifieke nuc-gen van S.aureus en het mecA-gen dat methicillineresistentie medieert, waardoor gelijktijdige amplificatie en detectie van S.aureus en MRSA in een enkel reactiesysteem mogelijk is. Deze technologie verkort de detectietijd aanzienlijk en biedt een snelle, nauwkeurige en kosteneffectieve oplossing voor S.aureus - en MRSA-detectie. Deze innovatieve aanpak verbetert de klinische diagnostische efficiëntie aanzienlijk en vergemakkelijkt de vroege implementatie van gerichte antibioticatherapie, waardoor een belangrijke bijdrage wordt geleverd aan de beheersing van geneesmiddelresistente bacteriële infecties.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S. aureus is een wijdverspreide Gram-positieve voorwaardelijke ziekteverwekker die het neusslijmvlies van gezonde individuen koloniseert 1,2. Wanneer de immuniteit van de gastheer in het gedrang komt, kan dit lokale huidinfecties, diepe weefselinvasie of systemische ziekten veroorzaken (bijv. longontsteking, endocarditis, osteomyelitis en bacteriëmie)3. Methicilline, een semisynthetische penicilline, werd in 1959 klinisch toegepast voor S. aureus-infecties, en twee jaar later dook MRSA op in het VK en verspreidde zich snel naar Europese landen, waaronder Denemarken, Frankrijk en Zwitserland4. MRSA-resistentie tegen β-lactam-antibiotica bemoeilijkt niet alleen de klinische behandeling, maar verhoogt ook het infectierisico aanzienlijk5. Meerdere factoren, waaronder oncontroleerbare kolonisatie/verspreiding, hoge preventiekosten en overmatig gebruik van antibiotica, hebben gezamenlijk de MRSA-infectiepercentages opgedreven6. Vanwege de snelle overdracht en complexe resistentiemechanismen worden MRSA-infecties in verband gebracht met hoge sterftecijfers, met bijna 150.000 gemelde gevallen en >7.000 sterfgevallen per jaar in EU-landen7. Volgens surveillancegegevens van CHINET zijn de MRSA-infectiepercentages in China de afgelopen vijf jaar boven de 30% gebleven8. Het hoge risico op nosocomiale kruisbesmetting verhoogt de lasten voor de volksgezondheid verder en belast de gezondheidszorgstelsels 9,10. Daarom is de ontwikkeling van efficiënte en nauwkeurige snelle MRSA-detectietechnologieën klinisch urgent voor het bereiken van een vroege diagnose, gepersonaliseerde therapie, het verminderen van mortaliteit en het onderbreken van transmissieketens.

De huidige detectietechnologieën voor S.aureus en MRSA bestrijken meerdere gebieden, waaronder fenotypische detectie, genomische detectie, transcriptomische detectie, proteomische detectie, massaspectrometrietechnologie en op bio-informatica gebaseerde analyses11.

Fenotypische detectiemethoden, zoals de schijfdiffusiemethode (KB-methode) en de minimale remmende concentratiemethode (MIC-methode), worden aanbevolen als "gouden standaarden" door het Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) en het Europees Comité voor antimicrobiële gevoeligheidstests (EUCAST). Deze methoden hebben het voordeel dat er geen gespecialiseerde instrumenten nodig zijn, omdat ze veel worden gebruikt voor bewaking van het resistentiespectrum en epidemiologisch onderzoek. Hun nadelen zijn echter ook duidelijk: lange kweekperioden (meer dan 24 uur) en de resultaten van de KB-methode voor sommige nieuwe antibiotica vereisen validatie door MIC-waarden, waarbij de resultaten voor breekpuntstammen gevoelig zijn voor menselijke factoren12,13.

Van de detectiemethoden op genoomniveau heeft conventionele PCR de kenmerken van hoge gevoeligheid en sterke specificiteit, waardoor een voorlopige beoordeling van de resistentie mogelijk is en de experimentele tijd wordt verkort, met lage kosten en hoge efficiëntie. Maar de beperkingen liggen in het kunnen detecteren van alleen bekende resistentiegenen en het vertrouwen op gespecialiseerde instrumenten14. Het mechanisme van microbiële resistentie is zeer complex, waardoor het van cruciaal belang is om technische methoden te ontwikkelen die onbekende resistente fenotypes kunnen dekken en snelle identificatie mogelijk maken. De opkomende GoPhAST-R-technologie (Combined genotypic and fenotypic AST through RNA detection) bepaalt resistentiefenotypes door mRNA-expressieniveaus te detecteren, waardoor gelijktijdige detectie van verschillende resistentiegerelateerde genen in meerdere pathogenen mogelijk is, de experimentele doorlooptijd wordt verkort en een nauwkeurigheid van 94-99% wordt bereikt in combinatie met machine learning15.

Onder de detectiemethoden op proteomisch niveau is de PBP2a-latexagglutinatiemethode gebaseerd op antigeen-antilichaamspecifieke binding, met eenvoudige bediening en snelle resultaten, met een hoge specificiteit en gevoeligheid voor MRSA. Er kan echter geen onderscheid worden gemaakt tussen verschillende soorten stafylokokken en de detectiegevoeligheid van in de handel verkrijgbare kits is enigszins afgenomen, waardoor na inductie met oxacilline8 opnieuw moet worden getest.

MALDI-TOF MS-gebaseerde detectiemethoden, zoals de DOT-MGA (DNA Oligonucleotide Tag-Microarray Detection of Genomic Amplification) methode, bereiken optimale analytische prestaties na 6-8 uur incubatie, met een detectiepercentage van maar liefst 96,4%, en zowel de gevoeligheid als de specificiteit zijn 100%. Maar de kosten zijn hoog en de beperkte posities op de doelplaat maken het moeilijk om honderden monsters tegelijkertijd te detecteren16,17.

Onder de bio-informatica-analysetechnologieën in combinatie met omics-gegevens voor resistentievoorspelling, onderscheidt de sequencingtechnologie van het hele genoom zich door zijn hoge resolutie en uitgebreide informatie-analysemogelijkheden. In combinatie met databases voor resistentiegenanalyse zoals Resfinder, kan het analyseren of stammen specifieke resistentiegenen dragen, resistentiepotentieel voorspellen, single-nucleotide polymorfismen (SNP's) en resistentie-geassocieerde genmutanten detecteren, terwijl het de opslag en heranalyse van gegevens van het hele genoom ondersteunt18. Deze methode vereist echter bediening door professionals met een bio-informaticaachtergrond, wordt zelden gebruikt bij dagelijkse tests en wordt vaak gebruikt voor epidemiologische analyse of moleculaire surveillance van ziekteverwekkers19.

De bovengenoemde methodologieën zijn ofwel hoog in kosten, tijdrovend of bevinden zich nog in de onderzoeks- en ontwikkelingsfase. Klinisch gezien is er dringend behoefte aan een oplossing die een evenwicht vindt tussen "directheid" en "nauwkeurigheid" - een nieuwe multiplex fluorescerende PCR-technologie vult deze leemte op door gelijktijdig nuc/mecA-genen in een enkele buis te amplificeren, waardoor de detectiecyclus wordt gecomprimeerd tot 1 uur. Het overbrugt nauwkeurig het tijdsbestekgat in het traditionele proces van "noodscreening - resistentietypering" en biedt een tijdefficiënter moleculair diagnostisch hulpmiddel voor de preventie en bestrijding van nosocomiale infecties. Deze specifieke PCR-test wordt voornamelijk gebruikt voor de detectie van respiratoire monsters, met sputummonsters als typisch voorbeeld. Het vertoont een gevoeligheid van 500 kopieën/ml en een hoge specificiteit, terwijl het niet wordt aangetast door antibacteriële middelen. Vanwege deze gunstige prestatiekenmerken heeft deze PCR-test een substantiële toepassingswaarde voor de diagnose van luchtweginfecties en de bewaking van nosocomiale infecties veroorzaakt door MRSA.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Guangdong Provincial People's Hospital (ethiek nr.: KY2025-510-01). Gedetailleerde informatie over de materialen die in dit onderzoek zijn gebruikt (reagentia, chemicaliën, apparatuur en software) is te vinden in de Materiaaltabel.

1. Protocol voor het verzamelen en bewaren van specimens

  1. Inclusiecriteria: Met uitzondering van kwaliteitscontrolematerialen, identificeer alle verzamelde monsters als positieve monsters met behulp van de gouden standaardmethode (op cultuur gebaseerde test).
  2. Verzameling van menselijk sputum
    1. Verzamel 1-3 ml diep gehoest sputum uit de onderste luchtwegen van proefpersonen met behulp van steriele bemonsteringsbuisjes. Buizen onmiddellijk afdichten en transporteren voor analyse. Verwerk de monsters onmiddellijk om te testen.
  3. Opslag van monsters:
    1. Analyseer de monsters die via de bovenstaande methode zijn verzameld onmiddellijk. Kortstondige opslag is toegestaan onder de volgende voorwaarden:
      2-8 °C: ≤7 dagen
      -20 °C ± 5°C: ≤6 maanden
      -70 °C ± 5°C: ≤24 maanden
      OPMERKING: In dit onderzoek werden sputummonsters niet behandeld met conserveermiddelen (zoals BHI-bouillon + glycerol, enz.). Na verzameling werden ze opgeslagen onder de hierboven beschreven omstandigheden en herhaaldelijk invriezen en ontdooien werd strikt vermeden. Vermijd herhaalde vries-dooicycli. Maximaal toegestane vries-dooicycli: ≤3.

2. Extractie van nucleïnezuur

OPMERKING: Voltooi alle procedures in een bioveiligheidskast om besmetting te voorkomen.

  1. Voor de voorbehandeling van sputummonsters mengt u het monster met 4% NaOH-oplossing in een verhouding van 1:4 (sputummonster: 4% NaOH-oplossing) om viskeuze sputummonsters vloeibaar te maken en storende onzuiverheden te verwijderen, vervolgens grondig te vortex (30 s) en te incuberen bij kamertemperatuur (22-25 °C) gedurende 30 minuten om vloeibaarmaking te bereiken.
  2. Bereiding van nucleïnezuurextractiereagentia
    1. Haal de voorverpakte plaat met 96 putjes uit de set. Veeg lichtjes op de plaat met 96 putjes om de reagentia en magnetische kralen op de bodem van de plaat met 96 putjes te concentreren.
    2. Scheur de afdichtingsfilm van aluminiumfolie voorzichtig af en vermijd het trillen van de plaat met 96 putjes om te voorkomen dat er vloeistof uit spat.
    3. In de oplossingen van kolom 1 en kolom 7 van de plaat met 96 putjes: Voeg eerst 20 μL proteïnase K toe en voeg vervolgens 200-300 μL monster toe dat moet worden geëxtraheerd.
  3. Geautomatiseerde nucleïnezuurextractie (methode op basis van magnetische kralen)
    1. Plaats de voorverpakte plaat met 96 putjes met toegevoegde monsters in de overeenkomstige gleuf van het geautomatiseerde nucleïnezuurextractie-instrument.
    2. Volg het nucleïnezuurextractieproces zoals hieronder beschreven.
      1. Gebruik de magneetstok op de laboratoriumkamer om de magnetische kralen geadsorbeerd met nucleïnezuur over te brengen in verschillende reagensgaten.
      2. Gebruik de roerset om de vloeistof snel en herhaaldelijk te mengen, zodat de vloeistof en magnetische kralen gelijkmatig mengen.
      3. Terwijl de vloeibare en magnetische kralen harmonieus worden gecombineerd, doorloopt de geautomatiseerde nucleïnezuurextractiemachine de opeenvolgende stadia van cellyse, nucleïnezuuradsorptie (70 °C, 15 min, 3 keer magnetische adsorptie), wassen (3 keer, meng elke keer 2 minuten, voer dan twee keer magnetische adsorptie uit (elk 15 s) en elutie (2 keer, meng elke keer 5 minuten, 3 keer magnetische adsorptie), krijgt het uiteindelijk nucleïnezuur van hoge zuiverheid.
      4. Valideer de nucleïnezuurconcentratie en -zuiverheid met behulp van een spectrofotometer. Het volume van het nucleïnezuurmonster was 50 μL, met een concentratie variërend van 50 tot 100 ng/μL, en de A260/A280-verhouding was 1,8 ± 0,2.
    3. Nadat het programma is afgelopen, zuigt u de elutieoplossing met nucleïnezuur direct op uit kolom 6 en kolom 12 voor vervolgonderzoek. Bewaar indien nodig de resterende geëxtraheerde nucleïnezuurmonsters bij -20 °C voor langdurige bewaring en toekomstig gebruik.

3. qPCR Detectie van S. aureus nucleïnezuren en MRSA nucleïnezuren

  1. Bereiding van amplificatiereagentia
    1. Haal de nucleïnezuuramplificatiereactieoplossing en de nuc/mecA-reactieoplossing uit de set (nuc-genspecifieke primers/sonde voor S. aureus en mecA voor MRSA). Na ontdooien bij 22-25 °C, volledig oscilleren en gelijkmatig mengen, en vervolgens onmiddellijke centrifugatie uitvoeren (~6000 g, 15 s, 22-25 °C).
    2. Afhankelijk van het aantal te testen monsters, N, bereidt u reagentia voor op basis van de totale hoeveelheid N+2 (N is het aantal monsters en 2 zijn de negatieve en positieve kwaliteitscontroles). Specifieke stappen zijn als volgt:
      1. Bereid de mix van het reactiesysteem voor (16 μL nucleïnezuuramplificatie reactieoplossing (Buffer, dNTP's, DNA-polymerase, UDG-enzym) + 4 μL nuc/mecA reactieoplossing (Primers en sondes voor de doeldetectiegenen nuc, mecA en de interne referentie GAPDH).
      2. Voeg het toe aan een centrifugebuis van de juiste grootte, oscilleer volledig en meng gelijkmatig, en voer onmiddellijke centrifugatie uit (~6000 g, 15 s, 22 °C-25 °C). Doseer vervolgens 20 μL per buisje in PCR-reactiebuisjes.
  2. Voeg nucleïnezuur en kwaliteitscontrolemonsters toe:
    1. Voeg in de hierboven voorbereide PCR-reactiebuisjes (20 μl) respectievelijk 5 μl nucleïnezuur van de geteste monsters, positieve controle en negatieve controle toe, waardoor een eindvolume van 25 μl per buis wordt bereikt.
    2. Sluit de buisjes goed af en voer onmiddellijke centrifugatie uit (~6000 × g, 15 s, 22-25 °C) en plaats de buisjes vervolgens in het PCR-instrument.
  3. PCR-amplificatie:
    1. Stel het cyclusprogramma als volgt in: Pre-denaturatie: 97 °C, 90 s, 1 cyclus; de volgende 2 stappen gedurende 42 cycli: 97 °C denaturatie gedurende 2 s en 55 °C gloeien gedurende 15 s.
    2. Stel de detectieparameters voor het fluorescentiesignaal als volgt in: gebruik FAM fluorescerende labeling van nuc-genen ; VIC fluorescerende labeling van mecA-genen ; en CY5 fluorescerende labeling van het GAPDH-gen als de interne controle van de kit. Verzamel gegevens bij 55 °C. Zorg er na voltooiing van de reactie voor dat de gegevens worden opgeslagen voor toekomstige analyse.
    3. Analyseer gegevens met behulp van qPCR-specifieke software (SLAN 96P):
      1. Voorbeeldinformatie: Label in het lay-outdiagram van de putplaat van de software de monstertypen (bijv. positieve controle, negatieve controle, onbekend monster, intern referentiegen, enz.) die overeenkomen met de laadposities van het monster.
      2. Plaatsen van de reactiebuisjes: Open het deksel van de verwarmingsmodule van het instrument, plaats de verzegelde PCR-plaat(en) er stevig in, zorg ervoor dat ze goed aansluiten op de verwarmingsmodule en sluit het deksel van de module goed (om temperatuuroneffenheden te voorkomen)
      3. De reactie starten: Nadat u hebt gecontroleerd of de programma-instellingen in de software correct zijn, klikt u op Start Run en noteert u de experiment-ID voor toekomstig gebruik.
      4. Stoppen met hardlopen en buisjes verwijderen: Nadat het programma is afgelopen, wacht u tot de temperatuur van de verwarmingsmodule onder de 50 °C is gedaald, opent u vervolgens het deksel om de PCR-plaat(s) te verwijderen en behandelt u de monsters op de juiste manier.
  4. Gegevensanalyse
    1. Bevestig vóór de gegevensanalyse drie visuele resultaten: 1) Versterkingscurven van alle monsters (inclusief interne controle) vertonen een typische S-vorm, zonder vlakke of abnormaal vertraagde stijgende curves; 2) De fluorescentiedrempellijn kruist de exponentiële fase van de curven en de Ct-waarden van de interne controle (bijv. GAPDH) liggen binnen ≤ 38 cycli (variatiecoëfficiënt < 5%); 3) Negatieve/positieve controles worden gedurende het hele experiment opgenomen om de mogelijkheid van besmetting te controleren.
      1. Als het experiment uit de hand loopt, controleert u de hele batch opnieuw. Als een monster een abnormale versterking vertoont (zoals een atypische S-curve of een Ct-waarde binnen het kritische bereik), controleer dan dat specifieke monster opnieuw.
    2. Roep de experimentele gegevens op in de software, stel de drempel en basislijn in en bereken de Ct-waarden automatisch of handmatig, aangezien het instrument automatisch de basislijndrempel selecteert. Stel de uiteindelijke positieve bepalingswaarde in op Ct ≤ 36; het referentiebereik voor het interne referentiegen vereist Ct ≤ 38. Controleer of hun versterkingscurven karakteristieke S-vormige profielen vertonen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Detectie van S. aureus en MRSA met behulp van qPCR
Op basis van het soortspecifieke nuc-gen van S. aureus en het mecA-geneesmiddelresistentiegen van MRSA, hebben we primers en sondes ontworpen die zijn gelabeld met verschillende fluoroforen voor qPCR-detectie. Alle resultaten van kwaliteitscontrole tijdens qPCR-experimenten vielen consequent binnen de aanbevolen drempels, wat de betrouwbaarheid van de detectieresulta...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nauwkeurige en vroege detectie van methicillineresistentie is van cruciaal belang voor de prognose van infecties veroorzaakt door S. aureus. Vroege identificatie van S. aureus en MRSA kan het misbruik van breedspectrumantibiotica verminderen en de selectiedruk verminderen die leidt tot het ontstaan en de verspreiding van bacteriële resistentie.

Traditionele fenotypische detectiemethoden, zoals de diffusie van cefoxitineschijven, vereisen een ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd gefinancierd door de Guangdong Medical Research Foundation (A2025034). Dit werk werd ondersteund door Shanghai BioGerm Medical Technology Co., Ltd. De financiers hadden geen rol in de opzet van het onderzoek, het verzamelen en analyseren van gegevens, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Automated nucleic acid extractorDAANSmart 32Voor DNA-extractie
BSC-1500IIA2-XBIOBASESEDA 20143222263Bioveiligheidskast
E-CentrifugeWEALTECCentrifugeer het resterende vloeistof van de wand van de buis
Methicilline-resistente Staphylococcus aureus-geneesmiddelresistentiegendetectiekitBOJIEZC-HX-38-2Detectie van methicilline-resistente Staphylococcus aureus-resistentiegenen
NucleïnezuurextractiekitBOJIETQ-BG-001-96BExtracteer nucleïnezuur
SLAN Volledig automatisch medisch PCR-analysesysteemHONGSHIGegevensanalyse
SLAN-96S Real-Time PCR-machineHONGSHISLAN-96SFluorescentie-kwantitatieve PCR-amplificatie
Thermo Scientific NanoDropThermo ScientificNanoDrop OneKwantitatieve analyse van DNA, RNA en eiwitten
Ultra-lage temperatuurvriezer (DW-YL450)MELINGSEDA 20172220091-20 °C voor het opslaan van reagentia
Vortex-5Kylin-bellVoor het mengen van reagens

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gherardi, G. Staphylococcus aureus infection: pathogenesis and antimicrobial resistance. Int J Mol Sci. 24 (9), Int J Mol Sci(2023).
  2. Linz, M. S., Mattappallil, A., Finkel, D., Parker, D. Clinical impact of Staphylococcus aureus skin and soft tissue infections. Antibiotics. 12 (3), 557(2023).
  3. Gao, Y., Chen, Y., Cao, Y., Mo, A., Peng, Q. Potentials of nanotechnology in treatment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Eur J Med Chem. 213, 113056(2021).
  4. Barber, M. Methicillin-resistant staphylococci. J Clin Pathol. 14 (4), 385-393 (1961).
  5. Arêde, P., Milheiriço, C., de Lencastre, H., Oliveira, D. C. The anti-repressor MecR2 promotes the proteolysis of the mecA repressor and enables optimal expression of β-lactam resistance in MRSA. PLoS Pathog. 8 (7), e1002816(2012).
  6. Ayliffe, G. A. The progressive intercontinental spread of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Clin Infect Dis. 24 (Suppl 1), S74-S79 (1997).
  7. Borg, M. A., Camilleri, L. What is driving the epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in Europe. Microb Drug Resist. 27 (7), 889-984 (2021).
  8. Wang, B., et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in China: a multicentre longitudinal study and whole-genome sequencing. Emerg Microbes Infect. 11 (1), 532-542 (2022).
  9. Wang, X., et al. Phylogenetic analysis and virulence characteristics of methicillin-resistant Staphylococcus aureus ST45 in China: a hyper-virulent clone associated with bloodstream infections. mSystems. 8 (2), e0002923(2023).
  10. Tong, S. Y., et al. Genome sequencing defines phylogeny and spread of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a high transmission setting. Genome Res. 25 (1), 111-118 (2015).
  11. Sanchini, A. Recent developments in phenotypic and molecular diagnostic methods for antimicrobial resistance detection in Staphylococcus aureus: a narrative review. Diagnostics. 12 (1), 208(2022).
  12. Humphries, R. M., et al. The continued value of disk diffusion for assessing antimicrobial susceptibility in clinical laboratories: report from the Clinical and Laboratory Standards Institute Methods Development and Standardization Working Group. J Clin Microbiol. 56 (8), e00437-e00518 (2018).
  13. Schön, T., et al. Multicentre testing of the EUCAST broth microdilution reference method for MIC determination on Mycobacterium tuberculosis. Clin Microbiol Infect. 27 (2), 288.e1-288.e1 (2021).
  14. Pancholi, P., et al. Multicenter evaluation of the Accelerate PhenoTest BC kit for rapid identification and phenotypic antimicrobial susceptibility testing using morphokinetic cellular analysis. J Clin Microbiol. 56 (4), e01329-e01417 (2018).
  15. Martinsen, M. A., Jaramillo Cartagena, A., Bhattacharyya, R. P. Core antibiotic-induced transcriptional signatures reflect susceptibility to all members of an antibiotic class. Antimicrob Agents Chemother. 65 (6), e02296-e02320 (2021).
  16. Josten, M., et al. Identification of agr-positive methicillin-resistant Staphylococcus aureus harbouring the class A mec complex by MALDI-TOF mass spectrometry. Int J Med Microbiol. 304 (8), 1018-1023 (2014).
  17. Nix, I. D., et al. Detection of methicillin resistance in Staphylococcus aureus from agar cultures and directly from positive blood cultures using MALDI-TOF mass spectrometry-based direct-on-target microdroplet growth assay. Front Microbiol. 11, 232(2020).
  18. Bortolaia, V., et al. ResFinder 4.0 for predictions of phenotypes from genotypes. J Antimicrob Chemother. 75 (12), 3491-3500 (2020).
  19. Cunningham, S. A., Jeraldo, P. R., Schuetz, A. N., Heitman, A. A., Patel, R. Staphylococcus aureus whole genome sequence-based susceptibility and resistance prediction using a clinically amenable workflow. Diagn Microbiol Infect Dis. 97 (3), 115060(2020).
  20. Skov, R., et al. Phenotypic detection of methicillin resistance in Staphylococcus aureus by disk diffusion testing and Etest on Mueller-Hinton agar. J Clin Microbiol. 44 (12), 4395-4399 (2006).
  21. Bhowmik, D., Das, B. J., Pandey, P., Chetri, S., Chanda, D. D., Bhattacharjee, A. An array of multiplex PCR assays for detection of staphylococcal chromosomal cassette mec (SCCmec) types among staphylococcal isolates. J Microbiol Methods. 166, 105733(2019).
  22. Pereira, E. M., et al. Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus haemolyticus: methicillin-resistant isolates are detected directly in blood cultures by multiplex PCR. Microbiol Res. 165 (3), 243-249 (2010).
  23. Vandenbussche, F., Vandemeulebroucke, E., De Clercq, K. Simultaneous detection of bluetongue virus RNA, internal control GAPDH mRNA, and external control synthetic RNA by multiplex real-time PCR. Methods Mol Biol. 630, 97-108 (2010).
  24. Cui, C., Ba, X., Holmes, M. A. Prevalence and characterization of mecC MRSA in bovine bulk tank milk in Great Britain, 2017–18. JAC Antimicrob Resist. 3 (1), dlaa125(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Staphylococcus AureusMethicillin Resistant StaphylococcusMRSA DetectionMultiplex Real Time PCRFluorescent PCRBacterial Drug ResistanceRapid Pathogen DetectionmecA Genenuc GeneNosocomial Infections

Gerelateerde artikelen