Methodenartikel

Een geoptimaliseerde LIVE/DEAD-test in combinatie met flowcytometrie voor het kwantificeren van overleving na stress in gistcellen

DOI:

10.3791/69005

⸱

29 augustus 2025

 ,  , 
1Department of Biology, University of Iowa, 2Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om de overleving na stress in gistmonsters te kwantificeren. De test maakt gebruik van twee fluorescerende kleurstoffen, SYTO 9 en propidiumjodide (PI), om de integriteit van het plasmamembraan te kwantificeren. Het maakt gebruik van flowcytometrie om kwantitatieve en reproduceerbare schattingen te geven van de levende, dode en beschadigde celfracties voor monsters na oxidatieve stress.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het kwantificeren van overleving is een veel voorkomende en cruciale taak in gistonderzoek. LIVE/DEAD-kleuringen op basis van plasmamembraanintegriteit zorgen voor een snelle en high-throughput test voor gistoverleving in combinatie met flowcytometrie. Variaties in kleuringsbuffer, kleurstofconcentratie, incubatietijd en flowcytometrie-instellingen kunnen echter van invloed zijn op de gegevenskwaliteit en reproduceerbaarheid. Dit protocol presenteert een gestandaardiseerde LIVE/DEAD-test voor kwantificering van overleving na stress in gist met behulp van flowcytometrie. Na behandeling van Candida glabrata, een opportunistische gistpathogeen, met verschillende doses waterstofperoxide, werden de post-stressmonsters gekleurd met een tweecomponenten LIVE/DEAD-kleuring bestaande uit SYTO 9 en propidiumjodide (PI). Flowcytometrie werd gebruikt om levende, beschadigde en dode celpopulaties te onderscheiden en hun percentages in elk monster te kwantificeren. Overlevingsschattingen op basis van de procentuele levende statistiek werden vergeleken met het resultaat van de Colony Forming Unit (CFU) op dezelfde steekproef. De twee methoden leverden consistente resultaten op voor de met namaak- en dodelijke dosis (1 M H2O2) behandelde monsters. Bij de subletale dosis van 100 mM H2O2 schatte SYTO 9/PI een hoger overlevingspercentage dan CFU, wat een belangrijk verschil tussen de twee weerspiegelt, waarbij het hier gepresenteerde protocol de celoverleving onmiddellijk na de stress evalueert, terwijl CFU het percentage cellen kwantificeert dat in staat is om te herstellen en zich voort te planten. Dit protocol meet dus de levensvatbaarheid in een eerder stadium van het celdoodproces. Samenvattend biedt het hier beschreven protocol een snel en schaalbaar alternatief voor CFU voor kwantificering van overleving na stress in gist. De resultaten bieden aanvullende informatie voor CFU door de overleving in een eerder stadium te evalueren en onderscheid te maken tussen dode en beschadigde cellen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het ontluikende gistsubphylum bevat veel belangrijke biologische en biotechnologische modellen. Een veel voorkomende en cruciale taak in gistonderzoek is het kwantificeren van het effect van genetische of omgevingsverstoringen, waarbij dit laatste inclusief stress of medicamenteuze behandelingen is. Bij industriële fermentatie bijvoorbeeld moeten producenten de levensvatbaarheid van gistculturen bewaken om de efficiëntie en kwaliteit van het fermentatieproces te garanderen 1,2. Bij het bestuderen van pathogene gistsoorten is het meten van hun overleving na stress- of antischimmelbehandeling van cruciaal belang voor het begrijpen van de genetische en mechanistische basis voor infectiegerelateerde eigenschappen zoals antischimmelresistentie. Het meten van overleving op katheters en oppervlakken is ook een belangrijke taak in klinische omgevingen3. Deze uiteenlopende scenario's vragen allemaal om kwantitatieve benaderingen die snel en nauwkeurig de uitkomst van medicamenteuze en stressbehandelingen kunnen meten.

Bestaande methoden om het bovenstaande doel te bereiken, vallen in drie hoofdcategorieën op basis van wat ze meten. De eerste categorie meet klonogeniteit, of het vermogen van individuele gistcellen om een enkele kolonie te vormen na de stress. De representatieve methode in deze categorie is de Colony Forming Unit (CFU) test. De tweede categorie meet vitaliteit, die berust op het detecteren van enzymatische activiteiten in levende cellen. Voorbeelden zijn chemische sondes zoals de FUN-1 kleurstof4. De derde categorie methoden meet de integriteit van het plasmamembraan - een onomkeerbaar verlies van de integriteit van het plasmamembraan wordt beschouwd als het "point of no return" voor celdood5. Voorbeelden van deze categorie zijn fluorescerende kleurstoffen zoals propidiumjodide (PI).

Dit werk presenteert een geoptimaliseerde LIVE/DEAD-assay in combinatie met flowcytometrie om een snelle en schaalbare kwantificering van de overleving van gist na stressbehandeling te bereiken. Deze op membraanpermeabiliteit gebaseerde test is sneller dan CFU en vereist 15-30 minuten kleuring in vergelijking met 24-48 uur incubatie om kolonies te vormen. Ook kunnen monsters die zijn gekleurd met een LIVE/DEAD-kleuring gemakkelijk worden getest met behulp van flowcytometrie naast microscopie, die tienduizenden cellen in een paar seconden meet en gemakkelijk monsters met 96 putjes kan verwerken voor tests met hoge doorvoer. Als gevolg hiervan is deze test snel, kwantitatief en schaalbaar. In dit protocol wordt een tweecomponenten LIVE/DEAD-kleuring, bestaande uit SYTO 9 en PI, gebruikt om een verbeterd oplossend vermogen te bereiken. SYTO 9 labelt alle cellen, levend of dood, terwijl PI alleen cellen met gecompromitteerde plasmamembranen binnendringt 6,7. Daarom accumuleren levende cellen alleen SYTO 9, terwijl dode cellen zowel SYTO 9 als PI accumuleren. Omdat PI een hogere affiniteit heeft dan SYTO 9 voor nucleïnezuur, sluit het dit laatste competitief uit in cel8. Ook vormen de twee kleurstoffen een Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -paar, waarbij SYTO 9-emissie wordt geabsorbeerd door PI als excitatie. Als gevolg hiervan vertonen dode cellen gedempte groene en sterke rode fluorescentie. Levende cellen daarentegen vertonen heldergroene fluorescentie8. Dit verschil maakt een beter onderscheid mogelijk tussen levende en dode cellen in aanwezigheid van variaties in fluorescentie-intensiteit binnen elke groep.

Sinds een eerste rapport over de toepassing ervan in gist in 2004 is het gebruik van SYTO 9/PI in giststudies vlekkerig en grotendeels beperkt tot kwalitatieve evaluaties met behulp van microscopie 7,9,10,11,12,13,14,15. Een belangrijke beperking voor de acceptatie ervan als kwantitatieve test voor gistoverleving is het gebrek aan systematische karakterisering en vergelijking met veelgebruikte methoden zoals CFU. Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde test met inbegrip van de kleuringsbuffer, kleurstofconcentratie, kleuringstijd en flowcytometrie-instellingen, waarvan werd vastgesteld dat ze artefacten minimaliseren en reproduceerbare resultaten genereren wanneer ze worden toegepast op C. glabrata en twee andere gistsoorten16. Omdat SYTO 9/PI-kleuring een tussenliggende "beschadigde" populatie van cellen onthult die verschilt van zowel de levende als de dode cellen in hun kleuringspatroon, kan het CFU aanvullen door meer genuanceerde informatie te onthullen over de effecten van stressbehandeling op gistcellen, waardoor mogelijk nieuwe toepassingen mogelijk worden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De details van de reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Toepassing van waterstofperoxidespanning

  1. Innoculeer ten minste een dag voor het experiment een nachtelijke cultuur van C. glabrata van een enkele kolonie op een vers gestreepte plaat in 3 ml synthetische complete (SC) media (1,7 g/l giststikstofbasis, complete aminozuurmix, 2% w/v glucose, water), en kweek het door de glazen buis in een roltrommel te plaatsen en te laten groeien bij 30 °C. Als alternatief kan een orbitale schudder worden gebruikt door de glazen buis in een schuine hoek te plaatsen en de cultuur met 200 tpm te schudden.
    1. Meet de optische dichtheid (OD600) van de nachtcultuur de volgende ochtend en verdun deze met verse SC-media tot OD600 ~ 0,2 in een totaal volume van 10 ml. Laat het twee verdubbelingen groeien, wat ongeveer 4 uur duurt, om de mid-log (OD600 ~1) fase te bereiken.
      VOORBEELD: Als een nachtcultuur een OD600 = 10 heeft, voeg dan 200 μL van deze cultuur toe aan 9,8 ml SC-media.
  2. Bereid binnen 30 minuten voor de stressbehandeling de waterstofperoxide stressmedia voor. Waterstofperoxide uit de 30%-voorraad (9,798 M) serieel verdunnen tot synthetische complete (SC) media tot de gewenste concentratie. Voeg een schijnbehandeling toe (SC zonder toevoeging van waterstofperoxide) en een dodelijke dosis (1 M is geschikt voor C. glabrata).
    VOORBEELD: Om een stressmedium van 100 mM waterstofperoxide te maken, voegt u 10,3 μL van de 9,798 M waterstofperoxide voorraad toe aan 1 ml SC. Piket voorzichtig om te mengen. Om een 10 mM waterstofperoxide stressmedia te maken, verdunt u 500 μL van de 100 mM waterstofperoxide stressmedia tot 4,5 ml SC.
  3. Meet de OD600 van de mid-log cultuur en standaardiseer deze naar bijvoorbeeld OD600 = 1, door SC-media toe te voegen.
    VOORBEELD: De mid-log cultuur is op OD600 = 1,2. Voeg 0,2 ml SC-media toe per 1 ml cultuur.
  4. Breng 600 μL mid-log cultuur per testconditie over in een 96 deep-well plaat. Pelletcellen door centrifugeren bij 3.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het bovenstaande voorzichtig door aspiratie zonder de celpellet te verstoren.
  5. Voeg 600 μl nep- of waterstofperoxide-stressmedia die in stap 1.2 zijn voorbereid, toe aan elk putje en pipetteer voorzichtig om de cellen opnieuw te suspenderen.
  6. Incubeer de plaat gedurende 120 minuten bij 30 °C en schud hem bij 300 tpm.
    OPMERKING: De incubatietijd is afhankelijk van de biologische vraag die van belang is.

2. Aanbrengen van de SYTO 9/PI kleuring

  1. Bereid voorafgaand aan het experiment ten minste 10 ml steriele buffer met 0,85% zoutoplossing voor.
    OPMERKING: We vonden dat een zoutoplossingbuffer van 0,85% minimale kleuringsartefacten produceerde, d.w.z. ongekleurde en dode cellen in nagebootste monsters, vergeleken met gedeïoniseerd water of groeimedia16.
  2. Bereid een werkvoorraadoplossing van PI bij 0,2 mM met steriel, gedeïoniseerd water.
    LET OP: Deze werkvoorraad PI kan tot 6 maanden bewaard worden bij 4 °C.
  3. Bereid onmiddellijk voor het experiment een werkende SYTO 9-voorraadoplossing bij 33,4 μM met steriel, gedeïoniseerd water.
    NOTITIE: Bereid de SYTO 9-werkbouillon vers voor elk experiment. Niet bewaren en opnieuw gebruiken.
  4. Piket voorzichtig om de cellen in elk putje van de behandelingsplaat te mengen. Meet OD600 van elke behandelingsconditie en bereken de hoeveelheid buffer die nodig is om de cellen te suspenderen tot een OD600 van 1.
    OPMERKING: Meerkanaalspipetten kunnen worden gebruikt voor efficiënt en gelijkmatig mengen. Vermijd overmenging van de monsters.
  5. Verzamel gistcellen na de schijn- of stressbehandeling door centrifugatie op 3.000 x g gedurende 5 minuten. Verwijder het bovenstaande voorzichtig door middel van aspiratie. Resuspendeer de cellen in een steriele buffer met een zoutoplossing van 0,85% tot OD600 = 1 (berekend in stap 2.4).
    OPMERKING: Gebruik een meerkanaalspipet om de cellen opnieuw te suspenderen. Ga voorzichtig om met alle nabehandelingsculturen en vermijd overmenging.
  6. Bewaar 50 μL van elk monster om te dienen als de ongekleurde en enkelvoudige kleurstofkleuringscontroles.
    OPMERKING: Minimale autofluorescentie werd gevonden voor wildtype C. glabrata in beide kanalen voor SYTO 9 en PI. Controleer echter altijd ongekleurde monsters op autofluorescentie en voer de juiste achtergrondaftrekking uit of gebruik groeimedia met een lage autofluorescentie.
  7. Aliquoot 16 μL monster na de behandeling geresuspendeerd in 0,85% zoutoplossing buffer tot een 50 μL PCR-buisje. Voeg 2 μL van de 0,2 mM werkvoorraad PI toe aan de celsuspensie. Voeg vervolgens 2 μL van het 33,4 μM werkmateriaal van SYTO 9 toe aan dezelfde buis tot een eindvolume van 20 μL.
    1. De uiteindelijke concentraties van PI en SYTO 9 zijn respectievelijk 20 μM en 3,34 μM. Piket voorzichtig om te mengen en incubeer gedurende 30 minuten in het donker (een zwarte doos kan worden gebruikt) bij kamertemperatuur.

3. Instellen en kalibreren van de flowcytometer

OPMERKING: Dit moet worden gedaan op elk nieuw instrument en ook op nieuwe toepassingen van de SYTO 9/PI-kleuring, ook voor een andere soort/stam, nieuwe stressor of groeiprotocol, enz. Onderstaande instellingen zijn ontwikkeld op een Attune NxT flowcytometer. Raadpleeg de gebruikershandleiding van het in gebruik zijnde instrument voor specifieke instructies.

  1. Kies de juiste fluorescentiekanalen/filters voor de flowcytometer: een 530 nm ± 30 nm banddoorlaatfilter (BL1) en een 600 nm langdoorlaatfilter (> 600 nm, BL3) werden gebruikt om signalen te verzamelen in de groene (SYTO 9) en rode (PI en SYTO 9) kanalen. Beiden waren opgewonden met een blauwe laser van 488 nm.
  2. Stel het debiet in op 200 μL/min en stop wanneer er ten minste 30.000 gebeurtenissen zijn verzameld.
    OPMERKING: Het aantal gebeurtenissen per monster kan worden aangepast met als doel robuuste schattingen van de percentages te maken. Monsters met te weinig voorvallen (cellen) moeten worden uitgesloten. De volgende stap is het aanpassen van de spanningen op de FSC- en SSC-kanalen tijdens de eerste installatie.
  3. Verdun 16 μL nagejaagd, ongekleurd monster tot 200 μL steriele 0,85% zoutoplossing buffer. Piket voorzichtig om te mengen vlak voor de flowcytometrie. Voer deze steekproef uit en pas de spanningen van de FSC- en SSC-kanalen aan, zodat de populatie in het midden van de FSC vs. SSC-dichtheid plot.
    OPMERKING: Voor respectievelijk de FSC en SSC werd een spanning van 345 mV en 399 mV gebruikt. De volgende stappen zijn het aanpassen van de spanningen op de verzamelkanalen (BL1 en BL3) tijdens de eerste installatie.
  4. Meng 24 μL nagejaagd monster met 24 μL 1000 mM waterstofperoxide behandeld of door warmte gedood monster.
  5. Verdeel het gemengde monster van levende en dode cellen in drie buisjes van elk 16 μl. Kleur de drie buisjes 30 minuten lang met (1) 2 μL SYTO 9 en 2 μL water; (2) 2 μL PI en 2 μL water gedurende 30 min; (3) 2 μL SYTO 9 en 2 μL PI gedurende 30 min. Volg het kleuringsprotocol uit het vorige hoofdstuk.
    1. Voeg na de incubatie 200 μL steriele 0,85% zoutoplossingbuffer toe aan elke buis. Ze zijn nu klaar voor flowcytometrie.
  6. Laat de buis (1) draaien om de spanning van het groene fluorescentiekanaal (BL1) aan te passen; laat vervolgens buis (2) draaien om de spanning van de rode fluorescentie (BL3) aan te passen. Het doel is om de modus van de intensiteitsverdeling van elk kanaal ~104-10 5 te laten zijn om het volledige dynamische bereik van het instrument te benutten.
    NOTITIE: Volg de instructies van uw specifieke flowcytometer bij het aanpassen van voltages. Sommige flowcytometers hebben vaste spanningen en deze stap wordt weggelaten.
  7. Laat de buis (3) draaien om te controleren of levende en dode celpopulaties goed gescheiden zijn. Pas indien nodig de BL1- of BL3-kanaalspanningen aan.
    OPMERKING: Er is een spanning van 200 mV gebruikt voor zowel de BL1- als de BL3-kanalen op de Attune NxT.
  8. Voer het nagejaagde, niet-gekleurde monster uit onder de vastgestelde spanningsinstellingen om ervoor te zorgen dat het monster minimale autofluorescentie heeft in de kanalen van belang (<102).

4. Monsters op de flowcytometer laten lopen

  1. Pas de hierboven vastgestelde flowcytometerinstellingen toe en voer eerst het ongekleurde monster uit om ervoor te zorgen dat de autofluorescentiesignalen lager zijn dan 102 in zowel BL1- als BL3-kanalen.
  2. Voeg 200 μL 0,85% zoutoplossingbuffer toe aan elk gekleurd monster en laat het op de flowcytometer lopen.
    OPMERKING: Als er meerdere monsters worden getest, spreid dan de kleuringsstap zodanig dat elk monster 30 minuten wordt gekleurd voordat het op de flowcytometer wordt uitgevoerd.
  3. Exporteer flowcytometrie-uitvoer als .fcs-bestanden (FCS 3.0- of 3.1-standaard).

5. Gegevensanalyse in R

OPMERKING: Een voorbeeldanalysescript wordt geleverd als aanvullend bestand 1. Voorbeelden van poortstrategieën worden gegeven in de sectie Representatieve resultaten.

  1. Installeer en laad de benodigde pakketten: (1) flowCore (2) ggplot2 (3) ggcyto.
  2. Importeer .fcs-bestanden in de huidige R-omgeving.
  3. Pas bestandsnamen aan en specificeer behandelvoorwaarden.
  4. Maak een 2D-dichtheidsgrafiek voor alle evenementen op FSC. H tegen SSC.H. Gebruik een polygoonpoort om niet-celgebeurtenissen uit te sluiten. Noem deze poort "cellen".
    OPMERKING: Op bepaalde flowcytometers wordt de parameter Oppervlakte aanbevolen boven Hoogte. Bekijk instrumentspecifieke aanbevelingen.
  5. Maak voor de "cellen" gated populatie een 2D-dichtheidsplot op FSC. H tegen FSC.W. Meestal zijn er twee clusters zichtbaar met vergelijkbare bereiken van FSC. H maar anders FSC.W. Het cluster met een lager gemiddeld FSC. Het W-niveau bevat de afzonderlijke cellen ("singlets"). Teken een veelhoekige poort om ze te selecteren en noem de poort "singlets".
  6. Maak voor de "singlets" gated population een 2D-dichtheidsplot op BL1. H tegen BL3.H. Teken veelhoekpoorten voor levende, beschadigde en dode populaties op basis van controles voor levende en dode cellen. Een voorbeeld wordt gegeven in de sectie Representatieve resultaten.
  7. Bepaal de overleving aan de hand van de percentages van elke populatie en exporteer de statistieken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De SYTO 9/PI-kleuring onderscheidt levende gistcellen van dode cellen op basis van hun fluorescentiesignalen in de groene (500 nm-560 nm) en rode (>600 nm) kanalen. Levende cellen, die alleen SYTO 9 accumuleren, fluoresceren sterk in het groene kanaal, met minimale rode signalen. Dode cellen accumuleren zowel SYTO 9 als PI en zullen naar verwachting sterk fluoresceren in het rode kanaal, met lagere groene fluorescentiesignalen in vergelijking met levende ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een LIVE/DEAD-test met behulp van twee fluorescerende kleurstoffen, SYTO 9 en PI, en met behulp van flowcytometrie om de overleving na stress in gist te kwantificeren. Hoewel deze twee kleuringen in de literatuur zijn aangebracht om de overleving bij verschillende gistsoorten te beoordelen en beschikbaar zijn als een commerciële kit, biedt noch de handleiding van de fabrikant, noch de literatuur voldoende details over het kleuringsprotocol of de instellingen voor ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen graag Dr. Michael Dailey en het Carver Center for Imaging bedanken voor hun training en ondersteuning voor de microscopie. We willen voormalige en huidige leden van het Gene Regulatory Lab bedanken voor hun waardevolle feedback op het protocol.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
96-Well Deep Well PlateThermo Fisher278606NUNC 96
Attune NxT flow cytometer met plate readerThermo Fisher A24858A24858Autosampler (A42901)
Candida glabrataCG99, labstam afgeleid van klinisch isolaat (Cormack & Falkow, 1999)
FungaLight Yeast LIVE/DEAD KitThermo Fisher A24858L34952Bevat SYTO 9 (3,34 mM) en Propidium Jodide (20 mM). Deze twee componenten kunnen ook afzonderlijk worden gekocht bij verschillende leveranciers.
WaterstofperoxideSigma AldrichH1009
Leica Confocal SP8 MicroscoopLeicaTCS SP8 X
NatriumchlorideSigma AldrichS9888Wordt gebruikt om gesteriliseerde 0,85% NaCl-oplossing te maken
Giststikstofbasis zonder aminozurenSigma AldrichY0626Wordt gebruikt om de synthetische complete media met 2% glucose en aminozuurmix te maken
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lourens-Hattingh, A., Viljoen, B. Growth and survival of a probiotic yeast in dairy products. Food Res Int. 34 (9), 791-796 (2001).
  2. Qiu, X., et al. Stress tolerance phenotype of industrial yeast: industrial cases, cellular changes, and improvement strategies. Appl Microbiol Biotechnol. 103 (16), 6449-6462 (2019).
  3. Welsh, R., et al. Survival, persistence, and isolation of the emerging multidrugresistant pathogenic yeast Candida auris on a plastic health care surface. J Clin Microbiol. 55 (10), 2996-3005 (2017).
  4. Millard, P. J., Roth, B. L., Thi, H. P., Yue, S. T., Haugland, R. P. Development of the FUN1 family of fluorescent probes for vacuole labeling and viability testing of yeasts. Appl Environ Microbiol. 63 (7), 2897-2905 (1997).
  5. WlochSalamon, D. M., Bem, A. E. Types of cell death and methods of their detection in yeast Saccharomyces cerevisiae. J Appl Microbiol. 114 (2), 287-298 (2013).
  6. Boulos, L., Prévost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. LIVE/DEAD BacLight: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water. J. Microbiol. Methods. 37 (1), 77-86 (1999).
  7. Zhang, T., Fang, H. H. P. Quantification of Saccharomyces cerevisiae viability using BacLight. Biotechnol Lett. 26 (12), 989-992 (2004).
  8. Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight. Cytometry A. 61A (2), 189-195 (2004).
  9. Sun, S., Baryshnikova, A., Brandt, N., Gresham, D. Genetic interaction profiles of regulatory kinases differ between environmental conditions and cellular states. Mol Syst Biol. 16 (5), e9167(2020).
  10. Li, Z., et al. Allicin shows antifungal efficacy against Cryptococcus neoformans by blocking the fungal cell membrane. Front Microbiol. 13, 1012516(2022).
  11. Jin, Y., Zhang, T., Samaranayake, Y., Fang, H. H. P., Yip, H. K., Samaranayake, L. P. The use of new probes and stains for improved assessment of cell viability and extracellular polymeric substances in Candida albicans biofilms. Mycopathologia. 159 (3), 353-360 (2005).
  12. Bojsen, R., Regenberg, B., Folkesson, A. Saccharomyces cerevisiae biofilm tolerance towards systemic antifungals depends on growth phase. BMC Microbiol. 14, 305(2014).
  13. Ryan, L. K., et al. Activity of potent and selective host defense peptide mimetics in mouse models of oral candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 58 (7), 3820-3827 (2014).
  14. Chudzik, B., Koselski, M., Czuryło, A., Trębacz, K., Gagoś, M. A new look at the antibiotic amphotericin B effect on Candida albicans plasma membrane permeability and cell viability functions. Eur. Biophys. J. (EBJ). 44 (1-2), 77-90 (2015).
  15. Roscetto, E., Contursi, P., Vollaro, A., Fusco, S., Notomista, E., Catania, M. R. Antifungal and antibiofilm activity of the first cryptic antimicrobial peptide from an archaeal protein against Candida spp. clinical isolates. Sci Rep. 8 (1), 17570(2018).
  16. Tang, H., Liang, J., He, B. Z. An optimized LIVE/DEAD assay using flow cytometry to quantify poststress and antifungaltreatment survival in diverse yeasts. BioRiv. , (2025).
  17. Stiefel, P., SchmidtEmrich, S., ManiuraWeber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiol. 15 (1), 36(2015).
  18. Rego, A., Ribeiro, A., CôrteReal, M., Chaves, S. Monitoring yeast regulated cell death: Trespassing the point of no return to loss of plasma membrane integrity. Apoptosis. 27 (9), 778-786 (2022).
  19. CarmonaGutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
  20. Miller, J., et al. Using colony size to measure fitness in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 17 (10), e0271709(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Overleving van gistintegriteit van het plasmamembraanCandida glabratawaterstofperoxidestressSYTO 9 kleuringpropidiumjodidecolony forming unit

Gerelateerde artikelen