Methodenartikel

Geoptimaliseerde RNA-extractie op basis van heet fenol uit mycobacteriën: een robuuste aanpak voor betrouwbare genexpressieanalyse

176 weergaven

⸱

11 september 2026

 ,  ,  , 
1Amity Institute of Molecular Medicine and Stem Cell Research, Amity University Uttar Pradesh, 2Amity Institute of Genome Engineering, Amity University Uttar Pradesh

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie optimaliseert een RNA-extractiemethode op basis van heet fenol voor Mycobacterium, wat resulteert in RNA van hoge kwaliteit dat geschikt is voor transcriptomische analyses. Bij vergelijking met TRIzol en RNeasy onder identieke omstandigheden leverde deze methode een hogere opbrengst, een vergelijkbare integriteit en een verbeterde kosteneffectiviteit, waardoor het een praktisch alternatief biedt voor grootschalige genexpressiestudies.

Samenvatting

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) blijft een grote wereldwijde bedreiging voor de volksgezondheid, wat de noodzaak benadrukt van betrouwbare transcriptomische studies om de biologie en de mechanismen van drugresistentie te begrijpen. Dergelijke analyses zijn afhankelijk van het verkrijgen van RNA met een hoge kwaliteit en een hoog rendement. Hoewel er verschillende methoden voor RNA-extractie beschikbaar zijn, vereisen veel daarvan dure reagentia, grote cultuurvolumes of gespecialiseerde apparatuur, wat hun geschiktheid voor grootschalige studies beperkt, in het bijzonder in omgevingen met beperkte middelen. Hier wordt een geoptimaliseerde RNA-extractiemethode op basis van heet fenol gepresenteerd, specifiek afgestemd op mycobacteriën. De methode maakt gebruik van een minimaal cultuurvolume en algemeen beschikbare reagentia om consistent hoogwaardig RNA op te brengen dat geschikt is voor high-throughput transcriptomische toepassingen. De RNA-kwantiteit en -integriteit werden beoordeeld via gelelektroforese en RNA-integriteitsanalyse (RIN), en de geschiktheid voor downstream toepassingen werd bevestigd met qPCR en Qubit 4. Om de prestaties van de geoptimaliseerde methode te benchmarken, werd een parallelle RNA-extractie uitgevoerd met TRIzol en RNeasy onder identieke experimentele omstandigheden, inclusief dezelfde Mycobacterium-soorten, cultuurvolume, groeifase (logaritmisch en stationair) en lysisecondities. Dit maakte een directe vergelijking mogelijk van rendement, kwaliteit, haalbaarheid en kosten. De geoptimaliseerde methode met heet fenol vertoonde een vergelijkbaar of verbeterd RNA-rendement en -kwaliteit, terwijl de kosten voor reagentia en de afhankelijkheid van gespecialiseerde apparatuur aanzienlijk werden verminderd. Vanwege de efficiëntie, reproduceerbaarheid en betaalbaarheid biedt dit protocol een praktisch alternatief voor grootschalige genexpressie- en transcriptomische studies bij Mtb en andere mycobacteriële soorten.

Inleiding

M. tuberculosis (Mtb), het veroorzakende agens van tuberculose (TB), blijft de belangrijkste doodsoorzaak door een enkel infectieus pathogeen, waarmee het HIV/AIDS overtreft. In 2024 was TB verantwoordelijk voor ongeveer 1,3 miljoen sterfgevallen wereldwijd1. Deze last wordt verergerd door de toenemende prevalentie van multidrug-resistente (MDR) en extensief drug-resistente (XDR) stammen. Daarom is er een dringende behoefte om de moleculaire basis van de pathogenese van TB te begrijpen en nieuwe therapeutische doelwitten te identificeren2.

Transcriptionele profilering van Mtb is een belangrijk instrument geworden voor het ontrafelen van functionele elementen die betrokken zijn bij gastheer-pathogeeninteracties3, adaptatie aan omgevingsstress4 en mechanismen die ten grondslag liggen aan drugresistentie5. Geavanceerde methodologieën zoals real-time PCR, microarrays en RNA-sequencing (RNA-seq) hebben het vermogen om het mycobacteriële transcriptoom te analyseren aanzienlijk verbeterd6. Het succes van deze methoden is echter sterk afhankelijk van de beschikbaarheid van RNA van hoge kwaliteit, wat op zijn beurt afhangt van een efficiënte cellyse tijdens de extractie. De complexe mycolyl-arabinogalactaan-peptidoglycaan celwand van Mtb maakt RNA-extractie bijzonder moeilijk7. Bestaande lysetechnieken, waaronder enzymatische hydrolyse8, sonicatie9 en bead-beating10, vereisen vaak kostbare apparatuur en grote cultuurvolumes, wat de praktische toepasbaarheid in veel BSL-3 laboratoria beperkt. Daarnaast maakt de langzame groeisnelheid van Mtb langere cultuurtijden noodzakelijk om voldoende biomassa te verkrijgen11.

Om deze beperkingen te overwinnen, is een geoptimaliseerde RNA-extractiemethode op basis van heet fenol ontwikkeld die snel en economisch is. Met gebruik van slechts 3 mL kweek in de mid-log fase levert de methode 45–60 µg hoogwaardig RNA op dat geschikt is voor downstream transcriptomische analyses. Cellyse wordt bereikt met een compacte handmatige weefselmaler en algemeen beschikbare reagentia, waardoor dure instrumenten overbodig zijn. Hoewel de heet-fenolmethode eerder is beschreven11,12, verbetert de geoptimaliseerde heet-fenolmethode het gebruiksgemak, de kostenefficiëntie en de RNA-opbrengst. De optimalisatie is uitgevoerd met M. smegmatis mc2155 (Msmeg) en succesvol gevalideerd met Mtb H37Rv.

Protocol

De gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de Tabel met Materialen.

1. Kweken van Mycobacterium

  1. Inoculeer 1 mL van de glycerolvoorraad Msmeg of Mtb in 10 mL Middlebrook 7H9-medium aangevuld met 0,2% glycerol, 0,05% Tween 80 en 10% ADC bij 37 °C met schudden op 150 rpm totdat de OD 1–1,5 bereikt.
  2. Kweek de secundaire cultuur door 1% van de primaire cultuur toe te voegen aan 10 mL 7H9-medium tot de mid-log fase, OD600nm = 0,6–0,7.
  3. Verdeel in aliquots van 3 mL en centrifugeer de culturen op 2000 x g gedurende 5 min bij kamertemperatuur (23–25 °C).
  4. Bewaar de pellets bij -80 °C tot de RNA-extractie.
    WAARSCHUWING: Volg voor Mtb-culturen de juiste BSL3-richtlijnen en inactiveer de pellet door verhitting bij 95 ˚C gedurende 20–25 min.
    OPMERKING: Figuur 1 toont het stroomdiagram van de basisstappen die worden gevolgd tijdens RNA-extractie via de Hot Phenol-methode.

Diagram van RNA-extractie met heet fenol; workflow toont centrifugatie, fasescheiding, analyse van RNA-integriteit.
Figuur 1: Een schematische weergave van de heet-fenolmethode en de analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. RNA-extractie

  1. Hot-Phenol methode (HP-methode)
    1. Voeg 200 µL TES-buffer (100 mM Tris-HCl, pH 8.0; 5 mM EDTA, pH 8.0; 0.1 M NaCl; % SDS; 1% β-mercaptoethanol) toe aan de celpellet en resuspendeer de pellet door middel van vortexen.
    2. Voeg ongeveer 0.1 g 0.1 mm silicakralen toe aan het monster. Gebruik een handheld weefselhomogenisator gedurende 10–15 s totdat de pellet volledig is ontdooid op ijs. Herhaal deze stap nog 2 keer, gevolgd door snap-bevriezing in vloeibare stikstof na elke herhaling.
    3. OF gebruik een high-speed tabletop bead ruptor gedurende 1 min bij een snelheidsinstelling van 5 (5.0 m/s) bij kamertemperatuur. Herhaal deze stap gedurende 3 cycli en incubeer het monster op ijs na elke cyclus om opwarming te voorkomen.
      OPMERKING: Herhaal de Mtb-celiysis gedurende 6–8 cycli (elke cyclus 1 min) met een handheld weefselhomogenisator of een bead ruptor, en koel tussentijds op ijs na elke cyclus. Gebruik DEPC (diethylpyrocarbonaat) behandeld water voor de bereiding van alle buffers en reagentia die nodig zijn voor de RNA-extractie.
    4. Voeg nogmaals 200 µL TES-buffer toe (voorverwarmd tot 65 °C) aan elk monster om het volume aan te vullen tot 400 µL. Voeg aan elk monster 200 µL zuur fenol toe (fenol geëquilibreerd met 100 mM citraatbuffer, pH 4.5) en 200 µL chloroform (meng het zure fenol en de chloroform in een gelijke verhouding voordat u deze aan het monster toevoegt).
    5. Incubeer het monster bij 65 °C op een heatblock met schudden op 900 rpm gedurende 30 min en centrifugeer bij 12000 x g gedurende 15 min bij kamertemperatuur. Zorg voor een correcte fasescheiding na centrifugatie (er zal een heldere bovenste waterige fase zichtbaar zijn die RNA bevat, een duidelijke interfase van DNA en een onderste organische fase die eiwitten en lipiden bevat).
    6. Verwijder de bovenste waterige fase en breng deze over in een nieuwe microcentrifugebuis van 1.5 mL. Voeg opnieuw een gelijk volume zuur fenol: chloroform toe. Centrifugeer bij 12,000 x g gedurende 15 min bij kamertemperatuur. Zorg voor een correcte fasescheiding.
    7. Breng de bovenste waterige laag over in een verse microcentrifugebuis van 1.5 mL, voeg vervolgens 30 µL 3 M natriumacetaatbuffer (pH 5.3) en 240 µL gekoelde isopropanol toe. Incubeer bij −80 °C gedurende 30 min tot 1 u.
      OPMERKING: De microcentrifugebuis kan in deze stap overnacht bij -80 °C worden bewaard. Sluit de microcentrifugebuis af met meerdere lagen parafilm om te voorkomen dat deze bij 65 °C tijdens de incubatie openspringt.
      WAARSCHUWING: Fenol en chloroform zijn gevaarlijke chemicaliën; daarom moeten passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), technische maatregelen zoals zuurkasten en specifieke procedures voor afvalverwijdering worden nageleefd.
    8. Centrifugeer bij 12,000 x g gedurende 1 u bij kamertemperatuur. Controleer of er een pellet is gevormd en verwijder voorzichtig de supernatant zonder de pellet te verstoren.
    9. Resuspendeer de pellet in 1 mL 75% ethanol en centrifugeer bij 12,000 x g gedurende 1 min bij kamertemperatuur. Voer deze stap twee keer uit en laat de pellet aan de lucht drogen.
    10. Resuspendeer de pellet in 50 µL nuclease-vrij water.
      ​OPMERKING: Om RNA op te lossen, dient u het 10–30 min bij kamertemperatuur in RNase-vrij water te incuberen.
  2. TRIzol methode
    1. Voeg 200 µL TRIzol-reagens toe aan de celpellet.
      WAARSCHUWING: TRIzol is een gevaarlijke chemische stof; daarom moeten passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), technische maatregelen zoals zuurkasten en specifieke procedures voor afvalverwijdering worden nageleefd.
    2. Volg de methode voor celiysis zoals beschreven in stappen 2.1.2 - 2.1.3.
    3. Voeg nogmaals 200 µL TRIzol-reagens toe, gevolgd door 200 µL chloroform, en vortex gedurende 1 min. Centrifugeer bij 13,400 x g gedurende 15 min bij 4 °C. Zorg voor een correcte fasescheiding na centrifugatie.
    4. Breng de waterige fase voorzichtig over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1.5 mL.
    5. Precipiteer het RNA door 500 µL isopropanol aan de waterige fase toe te voegen en dit bij −80 °C gedurende 30 min tot 1 u te incuberen.
    6. Pelleteer het RNA door centrifugatie bij 15,000 x g gedurende 20 min bij 4 °C. Observeer de pellet zorgvuldig en verwijder de supernatant zonder de pellet te verstoren.
    7. Resuspendeer de pellet met 1 mL 75% ethanol en centrifugeer bij 13,400 x g gedurende 1 min bij 4 °C. Herhaal deze stap twee keer, laat de pellet 30 min bij kamertemperatuur aan de lucht drogen en resuspendeer in 50 µL nuclease-vrij water.
  3. Methode met commercieel verkrijgbare RNA-extractiekit
    1. Resuspendeer de celpellet in 200 µL resuspensiebuffer (meegeleverd in de kit).
    2. Volg de methode voor celiysis zoals beschreven in stappen 2.1.2 - 2.1.3.
    3. Voer de daaropvolgende experimenten uit volgens de instructies van de fabrikant.

3. DNase-behandeling, kwantificering en visualisatie

  1. Voeg 1 µL DNase I (10units) en 5 µL RDD-buffer (1x) toe aan elk RNA-monster om genomische DNA-contaminatie te verwijderen en laat dit 30 min bij kamertemperatuur incuberen.
  2. Kwantificeer het RNA-monster spectrophotometrisch met Nanodrop en bepaal de RNA-integriteit met een Qubit4. De geaccepteerde RIN-waarde ligt tussen 7,5 - 10. De geaccepteerde waarden voor A260/A280 en A260/A230 liggen respectievelijk in het bereik 1,8–2,0 en 2,0–2,2.
  3. Visualiseer het RNA op een 1% agarosegel met behulp van 1X RNA-laadkleurstof.

4. cDNA-synthese en kwantitatieve real-time PCR

  1. Stel een reactie van 20 µL op voor de cDNA-preparatie met behulp van de cDNA Reverse Transcription kit en 1 µg RNA, volgens de instructies van de fabrikant in een thermocycler.
  2. Stel een real-time PCR-reactie van 10 µL op met 50 ng cDNA, 0,4 µM van elke primer en SYBR volgens de instructies van de fabrikant. Run het monster in de Real-Time PCR thermocycler.
    OPMERKING: De volgende primers werden gebruikt voor de qPCR-analyse:
    Mtb sigA Fw 5' cctcaaacagatcggcaagg 3', Mtb sigA Rv 5' cagatccacatcatgtcgcg 3'
    Mtb hsp70 Fw 5’ gctggtggacaagttcaagg 3', Mtb hsp70 Rv 5' ggtcagctgctcgtctaaga 3'
    Mtb16srRNA Fw 5' gcgatacgggcagactagag 3', Mtb16srRNA Rv 5' aaggaaggaaacccacacct 3'
    Ms. sigA Fw 5' gaagacaccgacctggaact 3', Ms.sigA ms Rv. 5' gactcttcctcgtcccacac 3'
    Ms. sigH Fw 5' gaagggttcccgtacaagg 3', Ms sigH Rv. 5' tcatgacgtcacctcctcg 3'
    Ms. sigE Fw 5' caccaccaaccttttcctcg 3', Ms. sigE Rv. 5' accctcgatgtcacacagg 3'

5. Statistische analyse

  1. Voer de Student's t-test uit met alle biologische replica's met behulp van Graph Pad Prism; P ≤ 0,05 werd beschouwd als statistisch significant. Foutenbalken representeren de standaardfout van ten minste drie biologische replica's.

Resultaten

RNA-kwaliteit en opbrengst

De RNA-kwaliteit en -kwantiteit werden beoordeeld via agarosegelelektroforese (Figuur 2). Voor alle extractiemethoden werden duidelijke, scherpe banden waargenomen die overeenkwamen met 23S en 16S rRNA, wat de succesvolle isolatie van totaal RNA bevestigt. De Hot Phenol- en TRIzol-methoden vertoonden drie duidelijke banden die 23S (~2900 bp), 16S (~1500 bp) en 5S rRNA (~120 bp) representeren, wat duidt op intact, hoogwaardig RNA. In tegenstelling hiermee vertoonde de kolomgebaseerde kitmethode alleen de 23S- en 16S-banden; de 5S rRNA-band was afwezig of lag onder de detectielimiet, waarschijnlijk door preferentieel verlies van kleine RNA's tijdens de kolomzuivering. Kwantitatief leverde de Hot Phenol-methode 1,5–2 keer meer RNA op dan respectievelijk TRIzol en RNeasy (Figuur 2A,C). De gemiddelde opbrengsten waren ~60 µg voor Hot Phenol, ~45 µg voor TRIzol en ~30 µg voor RNeasy, waarbij dit laatste een ongeveer 50% lagere opbrengst representeert dan Hot Phenol. Ondanks de verschillen in opbrengst waren de RNA-integriteit en -zuiverheid vergelijkbaar tussen de methoden (Figuur 2D,E).

Om de efficiëntie van de lysismethode te evalueren, werd RNA ook geëxtraheerd met behulp van een bead ruptor. Er werden vergelijkbare opbrengsten, kwaliteit en integriteit verkregen, wat aantoont dat effectieve lysis kan worden bereikt met een eenvoudige handmatige weefselmaler zonder afhankelijk te zijn van gespecialiseerde apparatuur zoals een bead ruptor/beater (Figuur 2B,F–H).

Aangezien Mtb resistenter is tegen lysis dan Msmeg, hebben we de geoptimaliseerde Hot Phenol-methode verder gevalideerd met behulp van de Mtb H37Rv-stam. Cellysis met zowel de weefselmolen als de bead ruptor resulteerde in RNA met een goede opbrengst, kwaliteit en integriteit (Figuur 3A–D), wat de robuustheid van de methode bevestigt. Hoewel RNA-extractie met een handmatige weefselmolen een lagere opbrengst had (~35–45 µg/3 mL cultuur) in vergelijking met de bead ruptor (50–60 µg/3 mL), bleek dit verschil niet statistisch significant te zijn, en de hoeveelheid lag binnen het acceptabele bereik voor grootschalige genexpressiestudies. Alle RNA-extracties zijn meerdere keren herhaald, en alle onafhankelijke biologische replica's zijn weergegeven. Er is densitometrische analyse uitgevoerd op de gelbeelden, wat de statistische verschillen in de RNA-opbrengst tussen de verschillende methoden verder valideert, waarbij Hot Phenol de hoogste opbrengst gaf (Supplementaire Figuur 1A–D).

RNA-zuiverheid en integriteit

Alle methoden leverden RNA op met acceptabele A260/A280-ratio's rond de 2,0, wat duidt op minimale proteïnecontaminatie (Figuur 2D). De RNA-integriteit (RIN) was vergelijkbaar voor alle methoden, waarbij de waarde varieerde van 7,5 tot 10 (Figuur 2D–H, Aanvullende Figuur 2, onderpaneel). Dit wijst op een goede kwaliteit, integriteit en minimale degradatie.

Kwantitatieve PCR-analyse om de RNA-kwaliteit te controleren

Om de geschiktheid van het met elke methode geëxtraheerde RNA voor downstream genexpressiestudies te evalueren, werd qRT-PCR uitgevoerd. We hebben de genexpressie van het Msmeg housekeeping-gen bestudeerd, mysA (MSMEG 2758) en twee transcriptionele regulatoren, sigE (MSMEG 5072) en sigH (MSMEG 1914), waarbij gebruik wordt gemaakt van equivalente hoeveelheden input-RNA. De verkregen Ct-waarden (cycle threshold) weerspiegelen de relatieve abundantie van intact, amplificeerbaar RNA in elk monster. Zoals aangetoond in (Figuur 2I), RNA geëxtraheerd met hete fenol en TRIzol gaf vergelijkbare Ct-waarden in het bereik van ongeveer 22–25, wat wijst op een hogere RNA-integriteit en compatibiliteit met reverse transcriptie en amplificatie. Hoewel de kitmethode iets hogere Ct-waarden vertoonde (~27–30), wat duidt op lagere niveaus van detecteerbaar transcript. Smeltcurveanalyse toonde specifieke amplificatie van mysA, sigE, en sigH genen, die de qPCR-specificiteit en -efficiëntie aantonen (Aanvullende figuur 2, bovenste paneel). qPCR-analyse met gebruik van Mtb-genen toonde eveneens acceptabele Ct-waarden (~20–25), wat de geschiktheid bevestigt voor downstream genexpressiestudies (Figuur 3E).

Vergelijking van RNA-extractie; gelelektroforese (28S, 18S, 5S) en staafdiagrammen van opbrengst, Ct en zuiverheid.
Figuur 2Vergelijking van RNA-extractiemethoden voor Mycobacterium. (A) Agarosegelelektroforese die het totale RNA laat zien dat is geëxtraheerd met de Hot Phenol-, TRIzol- en RNeasy-methoden. In alle monsters zijn duidelijke 23S- en 16S-rRNA-banden zichtbaar, wat duidt op intact RNA. (B) Agarosegelelektroforese die het totale RNA laat zien dat is geëxtraheerd met behulp van heet fenol via verschillende lysismethoden, namelijk een bead ruptor en een handmatige weefselmaler. (C) Totale RNA-opbrengst, waarbij de hoogste opbrengst wordt behaald met heet fenol, gevolgd door TRIzol en de kit-methode. (DDe RNA-zuiverheid werd beoordeeld aan de hand van A260/A280-ratio's, waarbij alle methoden waarden rond de ~2,0 opleverden, wat duidt op minimale proteïnecontaminatie.E) RNA-integriteitsgetal (RIN) dat een vergelijkbare integriteit laat zien. (F–H) Vergelijking van de RNA-opbrengst, de 260/280-ratio en de RNA-integriteit tussen monsters gelyseerd met een handmatige weefselmolen en een Bead Ruptor en geïsoleerd met de hete fenolmethode. (I) Ct-waarden uit qRT-PCR gericht op een housekeepinggen (bijv. mysA) en transcriptiefactoren (sigE en sigH). Foutenbalken vertegenwoordigen de standaardfout van drie biologische replica's (n = 3). P-waarde berekend met behulp van de Student's t-toets. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Vergelijking van RNA-extractie uit Mycobacterium, gelelektroforese en staafdiagrammen die de opbrengst en zuiverheid analyseren.
Figuur 3: RNA-isolatie uit Mtb met behulp van de hete fenolmethode. (A) Agarosegelelektroforese die het totale RNA toont, geëxtraheerd met een bead ruptor en een handmatige weefselmaler met de geoptimaliseerde Hot Phenol-methode uit de Mtb H37Rv-stam. (B–D) Vergelijking van het geïsoleerde RNA in termen van opbrengst, 260/280-ratio en schatting van de RNA-integriteit (RIN). (E) Ct-waarden uit qRT-PCR gericht op de sigA, 16s rRNA en hsp70 genen. De foutenbalken vertegenwoordigen de standaardfout van drie biologische replica's (n = 3). P-waarde berekend met de Student's t-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Warm fenolTrizolRNeasy-kit
Opbrengst60 -70 μg35 -50 μg30 - 45 μg
Tijd2,5-3 u2-2,5 u30-45 min
Kosten per reactie$0.10 – $0.20$1.500 – $2.00$7.00 – $10.00
Beperkingen Tijdrovende, sterke denatureringsmiddelen (fenol/SDS) Tijdrovend, zeer toxische reagentia zoals Trizol, vereiste van een gekoelde centrifuge, 15 keer duurder dan de hete fenolmethodeDuurder (72 keer duurder dan Hot Phenol), lagere opbrengst, verstopping van de kolom
VoordelenHogere opbrengst uit een lager volume, lage kosten, geen beadbeater nodig voor cellyse, geen koude centrifugatie vereistMatige opbrengst en matige kosten, vereiste van koude centrifugatieMatige opbrengst, zeer kostbaar
Belangrijkste kostenfactorVeelgebruikte laboratoriumreagentia (TES-buffercomponenten, zuur fenol, chloroform, isopropanol, ethanol)Commercieel TRI Reagent®, chloroform of chloroform:isoamylalcohol, isopropanol, ethanolGepatenteerde Qiagen spin-kolommen en buffers
RIN8-10 RIN7,5-10 RIN9-10 RIN

Tabel 1: Vergelijking van kosten, tijd en beperkingen van 3 verschillende RNA-extractieprocedures (Hot Phenol-, TRIzol- en RNeasy-methoden).

Aanvullende Figuur 1: Optimalisatie van RNA-extractie. (A) RNA-extractie met behulp van heet fenol en lysis met een handmatige weefselmaler. (B) RNA-extractie met behulp van TRIzol. (C) RNA-extractie met behulp van de RNeasy-methode. (D) Densitometrische analyse van gelafbeeldingen van RNA-extractie uit Msmeg met behulp van verschillende methoden. Foutenbalken representeren de standaardfout berekend met GraphPad Prism (n = 8). (E) RNA-extractie met behulp van heet fenol uit de Mtb-stam. Alle gelafbeeldingen zijn onafhankelijke biologische replica's. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: (Bovenste paneel) Smeltcurveanalyse van mysA, sigE, en sigH van M. smeg, n = 3; (Onderste paneel) RNA-integriteitsanalyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Om een eenvoudige en robuuste RNA-extractiemethode voor Mycobacterium te ontwikkelen, is de Hot Phenol-methode geoptimaliseerd. Vervolgens werd het geëxtraheerde RNA vergeleken met twee veelgebruikte benaderingen: TRIzol en een kolomgebaseerde kitmethode12,13. Deze technieken werden vergeleken op basis van RNA-opbrengst, zuiverheid, integriteit, kosten en verwerkingstijd om hun praktische bruikbaarheid voor downstream moleculaire toepassingen te beoordelen. Zowel de Hot Phenol- als de TRIzol-methode produceerden, hoewel relatief tijdrovend in vergelijking met de kitgebaseerde methode, intact RNA van hoge kwaliteit. Alle drie de methoden leverden RNA op van vergelijkbare zuiverheid en integriteit; echter, de Hot Phenol-methode zorgde consistent voor een hogere RNA-opbrengst. Bovendien leverde RNA geëxtraheerd met Hot Phenol en TRIzol vergelijkbare Ct-waarden op. Er werd echter een statistisch significant verschil in Ct-waarden waargenomen tussen de Hot Phenol- en de RNeasy-methoden. Aangezien er gelijke hoeveelheden RNA in het experiment werden gebruikt, werden vergelijkbare Ct-waarden over alle methoden verwacht. De waargenomen verschillen in het geval van de RNeasy-methode kunnen worden toegeschreven aan variaties in de chemie van de RNA-extractie. Hot Phenol en TRIzol zijn organische methoden en zijn vaak effectiever bij het solubiliseren van uitdagende transcripten, zoals die die coderen voor intrinsieke membraaneiwitten of transcripten met een hoog GC-gehalte. In contrast hiermee is RNeasy een silica-kolomgebaseerde methode en kan dit resulteren in een lagere terugwinning van bepaalde transcripten die niet efficiënt aan het membraan binden of verloren gaan tijdens wasstappen, vergeleken met fenolgebaseerde methoden (Figuur 2). Belangrijk is dat vergelijkbare RNA-opbrengsten werden behaald met zowel een handmatige weefselmaler als een bead ruptor voor cellyse, wat operationele flexibiliteit biedt bij het uitvoeren van de cellyse. Daarnaast is de extractiemethode geoptimaliseerd om te werken met lage cultuurvolumes en zonder dat koude centrifugatie vereist is. Deze vereenvoudiging verhoogt het algemene gemak en de efficiëntie van de monsterverwerking.

Een belangrijke factor bij het selecteren van een RNA-extractiemethode is het balanceren van kosten, tijd en de kwaliteit van de opbrengst (Tabel 1). De hete fenolmethode blijft, ondanks dat deze enigszins tijdrovend is, zeer kosteneffectief vanwege het gebruik van gangbare laboratoriumchemicaliën en het vermogen om hoge RNA-opbrengsten te genereren (Msmeg RNA 60–70 µg en Mtb RNA 35–45 µg per 3 mL cultuurvolume in de midden-logaritmische fase), zelfs bij een laag cultuurvolume van 3 mL en zonder het gebruik van hoogwaardige bead-ruptor apparatuur zoals in de meeste tot nu toe gepubliceerde methoden wordt gebruikt. Dit maakt de methode bijzonder voordelig voor laboratoria die werken in omgevingen met beperkte middelen. Eerder gepubliceerde RNA-extractiemethoden op basis van heet fenol verschillen op verschillende belangrijke aspecten. Mangan et al. gebruikten bijvoorbeeld M. bovis voor RNA-extractie via de hete fenolmethode en rapporteerden een opbrengst van ongeveer 20 µg RNA per 109 cellen. Kritieke parameters zoals cultuurvolume en extractietemperatuur waren echter niet duidelijk gespecificeerd. Daarnaast bevat hun methode een wasbeurt met detergent met gebruik van Divolab-1 voorafgaand aan de mechanische celdisruptie, een reagens dat niet gemakkelijk verkrijgbaar is, gevolgd door extractie met chloroform en isoamylalcohol11. In een andere hete fenolmethode werd RNA geëxtraheerd uit Mtb-cellen, met een opbrengst van ongeveer 39 µg totaal RNA, wat vergelijkbaar is met de hier beschreven geoptimaliseerde methode. Deze methode vereiste echter een relatief hoog cultuurvolume (25 mL), waardoor de verwerkingstijd toenam en het gebruik van grotere centrifuges noodzakelijk was. Bovendien omvat de extractie een mengsel van chloroform–isoamylalcohol en is de extractietemperatuur niet vermeld12,14. TRIzol wordt ook veel gebruikt om een goede RNA-opbrengst en -kwaliteit te verkrijgen tegen gematigde kosten15; de opbrengst was echter relatief laag. De RNeasy-kit biedt superieur gemak en snelheid, waardoor deze geschikt is voor tijdgevoelige workflows of minder ervaren gebruikers, maar tegen aanzienlijk hogere kosten dan de andere twee methoden, en de opbrengst was significant laag. Samenvattend biedt de hier beschreven methode operationele flexibiliteit bij de lyse van mycobacteriële cellen en de daaropvolgende RNA-extractie. Het stelt gebruikers in staat om de meest geschikte methode te kiezen op basis van hun prioriteiten, of dat nu kosten en opbrengst of verwerkingstijd zijn, terwijl een vergelijkbare RNA-kwaliteit en integriteit behouden blijft bij alle drie de methoden.

Openbaarmakingen

Er waren geen belangenverstrengelingen tussen de auteurs. Alle auteurs hebben de indiening goedgekeurd.

Dankbetuigingen

Ik wil graag de steun erkennen van het Department of Biotechnology (DBT), de Indian Council of Medical Research (ICMR) en de Science and Engineering Research Board (SERB).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.1 mm silicakralenMP BiomedicalsMP116911050
2-propanolSigma278475
Bead Ruptor 4 revvity
ChloroformSigma288306
Gekoelde centrifugeThermoScientific42541217
DNase I qiagen79254
EDTAsigmaE02SS
HClSRL62889
WarmteblokMIULABMU-E02-1049
High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit Thermo Fischer Scientific4368814
Motorgestuurde weefselmolen G10CoronG22616008
NaClsigmaS5886
Nanofotometer N50 IMPLEMT51601
fenol geëquilibreerd met 0.1 M citraatbuffer, pH 4.5SigmaP4682
PowerUP SYBRApplied BiosystemsA25742
Qubit 4 fluorometer Invitrogen2.32262E+12
Real-Time PCR thermocyclerAnalytik Jena AG844-00503-2
RNA easy KitQiagen74104
SDSSigmaS9888
NatriumacetaatSigmaS2889
thermocycler Biorad621BR29739
TRI ReagentSigmaT9424
Tris-baseHimediaMB029
β-mercaptoethanolSigma516732

Referenties

  1. Global tuberculosis report, 2024. , Available from: https://www.who.int/publications/b/74877 (2024).
  2. Lange, C., et al. Drug-resistant tuberculosis: An update on disease burden, diagnosis and treatment. Respirology. 23 (7), 656-673 (2018).
  3. Tailleux, L., et al. Probing host-pathogen cross-talk by transcriptional profiling of both Mycobacterium tuberculosis and infected human dendritic cells and macrophages. PLoS One. 3 (1), e1403(2008).
  4. Voskuil, M. I., et al. Inhibition of respiration by nitric oxide induces a Mycobacterium tuberculosis dormancy program. J Exp Med. 198 (5), 705-713 (2003).
  5. Zhang, Y., Yew, W. W. Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis. 13 (11), 1320-1330 (2009).
  6. Arnvig, K. B., Young, D. B. Identification of small RNAs in Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol. 73 (3), 397-408 (2009).
  7. Brennan, P. J., Nikaido, H. The envelope of mycobacteria. Annu Rev Biochem. 64, 29-63 (1995).
  8. Belisle, J. T., Sonnenberg, M. G. Isolation of genomic DNA from mycobacteria. Methods Mol Biol. 101, 31-44 (1998).
  9. Manganelli, R., et al. Role of the extracytoplasmic-function sigma factor σH in Mycobacterium tuberculosis global gene expression. Mol Microbiol. 45 (2), 365-374 (2002).
  10. Rustad, T. R., et al. Global analysis of mRNA stability in Mycobacterium tuberculosis. Nucleic Acids Res. 41 (1), 509-517 (2013).
  11. Mangan, J. A., Sole, K. M., Mitchson, D. A., Butcher, P. D. An effective method of RNA extraction from bacteria refractory to disruption, including mycobacteria. Nucleic Acids Res. 25 (3), 675-676 (1997).
  12. Venkataraman, B., Gupta, N., Gupta, A. A robust and efficient method for the isolation of DNA-free, pure and intact RNA from Mycobacterium tuberculosis. J Microbiol Meth. 93 (3), 198-202 (2013).
  13. Hiebert, R. M., et al. RNA extraction and RNA-sequencing method for transcriptomic analysis of Mycobacterium tuberculosis. Biotechniques. 77 (1), 23-34 (2025).
  14. Kumar, K., Tharad, M., Ganapathy, S., et al. Phenylalanine-rich peptides potently bind ESAT6, a virulence determinant of Mycobacterium tuberculosis, and concurrently affect the pathogen's growth. PLoS One. 4, e7615(2009).
  15. Alli, A. O., et al. Optimization of RNA extraction in Mycobacterium tuberculosis for studying intracellular gene expression. Afr J Clin Exp Microbiol. 10 (2), 64-79 (2009).

Herprints en machtigingen

Tags

Hot fenolextractieMycobacterium tuberculosistranscriptomische studiesRNA integriteitgelelektroforeseqPCR analyseTRIzol vergelijkingRNeasy vergelijking
Geoptimaliseerde RNA-extractie op basis van heet fenol uit mycobacteriën: een robuuste aanpak voor betrouwbare genexpressieanalyse
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.