Experimenteel onderzoek naar muscone die de activiteit van de NF-KB-route vermindert door zich te richten op IL-1R1 om oxidatieve stressschade in Schwann-cellen te verminderen

Samenvatting

Dit artikel bestudeert het effect van muscone, het belangrijkste bestanddeel van muskus, op de proliferatie en apoptose van Schwann-cellen. De resultaten illustreren voorlopig het potentiële mechanisme van muskus die de activiteit van de NF-KB-route vermindert door IL-1R1 te remmen om oxidatieve stressschade bij de verlamming van Bell te verminderen.

Samenvatting

Het onderliggende mechanisme van hoe natuurlijke musk de verlamming van Bell behandelt, is niet duidelijk. Deze studie heeft tot doel het potentiële mechanisme van muskus te onthullen bij de behandeling van perifere zenuwbeschadiging in vitro. Om dit te bereiken, werd een model voor oxidatieve stressschade opgesteld in Schwann-cellen (SC's) met behulp van kobaltchloride (CoCl₂). Om de beschermende effecten van Muscone (Mus) op deze verwonding te beoordelen en het mechanisme ervan te onderzoeken, werden cellevensvatbaarheidstests, siRNA-transfectie, enzymgekoppelde immunosorbenttesten (ELISA), kwantitatieve reverse transcriptie polymerasekettingreactie (qRT-PCR), western blotting, immunofluorescentiekleuring en ultrastructurele analyse van cellen gebruikt. Als gevolg hiervan is aangegeven dat Mus-interventie de SC-proliferatie en het S-100b-mRNA onder hypoxie versterkte, terwijl ook reactieve zuurstofspecies (ROS) werden verlaagd en de niveaus van superoxidedismutase (SOD) werden verhoogd. Mus verbeterde oxidatieve stress en ontsteking in hypoxische SC's door IL-1β en TNF-α te verminderen. Bovendien moduleerde Mus belangrijke indicatoren die betrokken zijn bij zuurstofmetabolisme, celherstel en neurometabolisme, waaronder C-JUN en GDNF. IL-1R1, gelokaliseerd in het SC-membraan, werd opgereguleerd door hypoxie, maar significant gedownreguleerd na Mus-interventie. Mus remde ook de expressie van NF-κB-routecomponenten (IRAK1, IKK, p65, p50) en verhoogde IκB-α. Cruciaal was dat het afschaffen van IL-1R1-expressie via siRNA-knockdown een consistent effect vertoonde met Mus. Er wordt geconcludeerd dat door IL-1R1 te onderdrukken, Mus de ontsteking in hypoxische SC's verzwakte door remming van de NF-KB-route. Deze studie wees op de rol van IL-1R1 bij door hypoxie geïnduceerde SC-disfunctie. Bovendien zou Mus een potentieel effectief medicijn kunnen zijn voor de behandeling van de verlamming van Bell.

Inleiding

Muskus (Mus), 3-methylcyclopentadecanon, werd al in 1906 geïsoleerd uit het natuurlijke extract van hertenmuskus¹. Muskus, een waardevolle en effectieve traditionele Chinese geneeskunde (TCM), heeft uitgebreide genezende effecten zoals detumescentie, ontstekingsremming, reanimatie en bevordering van de bloedsomloop². Muskusbevattende TCM is gebruikt voor een verscheidenheid aan veel voorkomende ziekten, waaronder ziekte van het centrale zenuwstelsel³, ontgifting⁴, gastro-intestinale tumoren⁵, virale hepatitis⁶ en coronaire hartziekten⁷, enz. Als het actieve farmaceutische ingrediënt van muskus heeft Mus uitstekende biologische effecten laten zien, waaronder ontstekingsremmend⁸, anti-oxidatie ^8,9, herstel van neuronale schade en myocardinfarctverlichtend¹⁰, enz. Mechanistisch gezien hebben studies aangetoond dat Mus de afgifte van ontstekingscytokines zoals interleukine (IL)-1β, IL-6, tumornecrosefactor (TNF)-α, reactieve zuurstofspecies (ROS)^1,8 kan verminderen en de mitogeen-geactiveerde proteïnekinase (MAPK), nucleaire factor kappa-light-chain-enhancer van geactiveerde B-cellen (NF-κB), AKT/mechanistisch doelwit van rapamycine (mTOR) en CaN/Erk1/2-route¹ kan reguleren^{, 8,11}, enz.

In China is gemeld dat sommige artsen de verlamming van Bell met succes hebben behandeld met natuurlijke musk volgens eerdere literatuurgegevens en klinische ervaring 12,13,14,15. Mus is geen aanbevolen medicijn in de diagnose- en behandelingsrichtlijnen, maar in onderontwikkelde medische gebieden of voor sommige mensen die geen steroïden of antivirale middelen kunnen gebruiken, kan Mus een andere voorkeursoptie zijn. Literatuuranalyse in de afgelopen jaren toont ook aan dat musk de meest gebruikte Chinese geneeskunde is in de gepubliceerde Chinese geneeskunde patchvoorschriften en acupunctuurpuntstudies voor de behandeling van perifere aangezichtsverlamming¹⁶. Hoewel er veel farmacologische en medische studies over Mus zijn, is het nog onbekend hoe muskus de verlamming van Bell precies heeft genezen en wat de onderliggende neurochemische en cellulaire biologische mechanismen zijn.

De verlamming van Bell, een acute idiopathische aangezichtsverlamming, is het gevolg van disfunctie van de perifere aangezichtszenuw, die alle gezichtsspieren innervereert. Het meest opvallende teken van de symptomen van de verlamming van Bell is de zwakte en het hangen van de gezichtsspieren aan één kant. Hoewel de gezichtsverlamming van Bell niet levensbedreigend is, kan het de kwaliteit van leven van de patiënt beïnvloeden en zelfs angst en depressie veroorzaken. Wat vooral verontrustend is, is dat tot 30% van de patiënten last heeft van langdurige gevolgen, waaronder meebewegingen, contractuur, permanente gezichtsparese en asymmetrie in het gezicht, zelfs met de juiste behandeling. Daarom zijn het vinden van de oplossing van de verlamming van Bell en het verminderen van het risico op verlamming onze belangrijkste doelen. De huidige kennis over het pathogene mechanisme van de verlamming van Bell blijft onduidelijk. Recent onderzoek heeft aangetoond dat de reactivering van virussen de belangrijkste oorzaak kan zijn van de verlamming van Bell, en deze virussen kunnen een neuronaal oedeem en ontsteking veroorzaken om de aanval van de verlamming van Bell te veroorzaken.

Voortbouwend op recent bewijs, veronderstelden we dat Mus de symptomen van de verlamming van Bell verlicht door oxidatieve stressschade aan de aangezichtszenuw te verbeteren. Deze studie gaf experimenteel de therapeutische effecten van Mus aan, waaruit bleek dat opgereguleerd IL-1R1 in SC's de NF-KB-route activeert en cellulaire schade veroorzaakt. Cruciaal is dat we hebben aangetoond dat Mus de NF-κB-signalering remt door IL-1R1 te downreguleren. Onze bevindingen identificeerden de rol van IL-1R1-opregulatie in SC's die in vitro werden blootgesteld aan oxidatieve stress en positioneerden Mus-toediening als een nieuwe therapeutische strategie.

Protocol

Dit experimentele onderzoek werd uitgevoerd met goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committee (goedkeuringsnummer: LL-240077).

Celkweek en medicamenteuze interventie
Rat Schwann-cellen (SC's) werden gekweekt in Schwann Cell Medium, bestaande uit basaal medium, 5% foetaal runderserum, 1% Schwann-celgroeisupplement, 1% penicilline en 1% streptomycine. Alle cellen werden bewaard in een atmosfeer van 5% CO₂ bij 37 °C. Wanneer ze mochten groeien tot een dichtheid van 70-80%, werden SC's verdeeld in vier groepen (n = 5 per groep): (1) NC-groep; (2) NC+CoCl_2-groep ; (3) NC+CoCl₂+Mus groep; (4) NC+CoCl₂+siIL-1R1+Mus groep.

Van kobaltchloride (CoCl₂), een vaak gebruikt middel om hypoxie na te bootsen, is bekend dat het reacties veroorzaakt die vergelijkbaar zijn met die van hypoxie, zoals de belemmerende afbraak en stabilisatie van hypoxie-induceerbare factoren en accumulatie van HIF-1α-eiwit¹⁵. Volgens de aangepaste methode op basis van Osuru et ^al.17 werden in de NC+CoCl_2-groep en de NC+CoCl₂+Mus-groep SC's gekweekt in Schwann Cell Medium aangevuld met 240 μM CoCl₂ gedurende 8 uur, bij atmosferische omstandigheden van 95% lucht en 5% CO₂ bij 37 °C in een bevochtigde incubator (21% O₂). Vervolgens werd in de Mus-groepen de interventie van 1,25 μg/ml Mus gedurende nog eens 24 uur toegepast. Ondertussen werden de SC's in de NC+CoCl₂+siIL-1R1+Mus-groep eerst behandeld met 24 uur siRNA-infectie, vervolgens continu gekweekt met 240 μM CoCl₂ gedurende 8 uur, gevolgd door de interventie van 1,25 μg/ml Mus gedurende nog eens 24 uur, zoals in de eerste groepen. Het stroomschema van het experimentele proces is weergegeven in figuur 1.

Test op de levensvatbaarheid van cellen
De levensvatbaarheid van SC's werd bepaald met behulp van het celtellingskit-8 (CCK-8) testreagens volgens de instructies van de fabrikant. Gekweekte SC's met een dichtheid van 5 × 10⁵ cellen/putje werden gezaaid in een celkweekplaat met 96 putjes met 100 μL compleet groeimedium bij 37 °C in een 5% CO₂ bevochtigde atmosfeer. Toen de confluentie 70-80% bereikte, werd 10 μL CCK-8-oplossing aan elk putje toegevoegd en werden de platen gedurende 1 uur bij 37 °C geïncubeerd. De optische dichtheid (OD) van de platen met 96 putjes werd gemeten bij 450 nm met behulp van een microplaatlezer en de levensvatbaarheid van de cel werd berekend. De cellen werden verdeeld in vier groepen: NC-groep, NC+CoCl_2-groep , NC+CoCl₂+Mus-groep en NC+CoCl₂+siIL-1R1+Mus-groep. De experimentele resultaten werden gecorrigeerd met behulp van een blanco putje (medium+CCK8-oplossing). Overlevingspercentage van cellen = [(experimentele groep - lege put)/(NC-groep - lege put)] × 100%.

siRNA-transfectie
De transfectie werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant van een commercieel in vitro siRNA/miRNA transfectiereagens gebruikend synthetisch siRNA duplexen van siIL-1R1 (AUAGUCUUGGAUUUUCCAA, GGAGAAAAUCCAAGACUAUGA) met een concentratie van 100 ng/μL gedurende 24 h. Na siIL-1R1-transfectie werden de siIL-1R1-expressies beoordeeld door RT-qPCR-analyse uit te voeren na 24 uur van transfectie¹⁸, en de efficiëntie moet worden gegarandeerd om hoger dan 80% te zijn

Enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA)
Post-cultuur supernatanten werden verzameld en gecentrifugeerd onder groepsspecifieke omstandigheden (2950 g, 20 min, 25 °C). Extracellulaire niveaus van IL-1β, TNF-α, ROS en SOD werden getest via ELISA volgens de instructies van de kit. De uiteindelijke extinctiewaarden bij 450 nm werden verkregen met behulp van een microplaatlezer.

RNA-isolatie en kwantitatieve real-time PCR (RT-qPCR)
Volgens de instructies van de fabrikant werd totaal RNA geëxtraheerd uit gekweekte cellen met behulp van TRizol-reagens. Doelgenen (IL-1β, TNF-α, S-100b, IL-1R1) werden geamplificeerd in 20 μL SYBR qPCR-mixreacties gedurende 40 cycli op een PCR-instrument. Gegevensnormalisatie gebruikt β-actine, waarbij de PCR-specificiteit werd geverifieerd door analyse van de smeltcurve. De 2^{−ΔΔCt-methode} kwantificeerde relatieve expressie van vijf onafhankelijke monsters die in drievoud werden getest. Primers staan vermeld in Tabel 1.

Westerse vlek
Na de behandeling werden SC's van alle experimentele groepen gedurende 24 uur geïncubeerd en geoogst. Totaal eiwit werd geëxtraheerd met behulp van een totale eiwitextractiekit. Eiwitlysaten werden gecombineerd met natriumdodecylsulfaatpolyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) laadbuffer gedenatureerd bij 98 °C gedurende 5 minuten en gescheiden (20 μg per baan) op 10-12% SDS-polyacrylamidegels. Opgeloste eiwitten werden elektroforetisch overgebracht naar polyvinylideenfluoride (PVDF) membranen. De membranen werden gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur geblokkeerd met 5% magere droge melk en vervolgens een nacht bij 4 °C geïncubeerd in een volume van 6 ml met de volgende primaire antilichamen: anti-HIF-1α-antilichaam (1:1000), anti-GAPDH-antilichaam (1:1000), anti-IL-1R1-antilichaam (1:1000), anti-C-JUN-antilichaam (1:1000), anti-GDNF-antilichaam (1:1000), anti-IRAK1-antilichaam (1:1000), anti-IKK-antilichaam (1:1000), anti-p65-antilichaam (1:800), anti-p50-antilichaam (1:900), anti-IκB-α-antilichaam (1:900) en anti-β-actine-antilichaam (1:1000). Na het wassen werden de membranen gedurende 60 minuten bij 25 °C gesondeerd met mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerde secundaire antilichamen. Eiwitsignalen werden gedetecteerd met behulp van Image Studio Digits Ver 4.0. Bandintensiteiten werden gekwantificeerd met ImageJ-software en genormaliseerd naar β-actine en GAPDH-expressie. Er werden drie onafhankelijke experimenten uitgevoerd.

Immunofluorescentie
IL-1R1-lokalisatie in SC's werd beoordeeld volgens Zhao et ^al.19. Oogst cellen tijdens de logaritmische groeifase door trypsinisatie, suspendeer ze opnieuw in vers volledig medium en trituleer grondig om een uniforme eencellige suspensie te verkrijgen. Zaai de cellen op kweekplaten met steriele dekglaasjes. Zodra de cellen volledige samenvloeiing hebben bereikt, spoelt u ze 1-2 keer af met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), verwijdert u voorzichtig de dekglaasjes en fixeert u de aanhangende cellen met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 10 minuten, permeabiliseert met 0,05% Triton X-100 (10 min) en blokkeert u met 5% geitenserum (1 uur). Primaire incubatie gebruikte konijn anti-rat IL-1R1 mAb. Na PBS-wasbeurten werden de monsters gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met FITC-geconjugeerd geitenanti-konijn IgG. Voeg wateroplosbare bevestigingsmiddelen toe aan de afdekbon voor montage. Immunogelabelde cellen werden gevisualiseerd en gekwantificeerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop met een excitatiegolflengte van 492 nm en een emissiegolflengte van 520 nm.

Ultrastructuur analyse
Volgens protocol¹⁹ van Zhao et al. werden SC's gefixeerd in 2,5% glutaaraldehyde en 's nachts gefixeerd bij 4°C in 1% osmiumtetroxide. Monsters ondergingen een serie ethanol/aceton-dehydratatie. Ultradunne secties (80 nm) werden gekleurd met uranylacetaat en loodcitraat voorafgaand aan ultrastructureel onderzoek met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop.

Verwijdering van gevaarlijke chemische reagentia
Het medium en de oplossingen die CoCl₂ bevatten, worden verzameld in een daarvoor bestemde afvalcontainer voor zware metalen. Alle wegwerpmaterialen die in contact zijn gekomen met de bovengenoemde vloeistoffen, inclusief pipetpunten, centrifugebuisjes en handschoenen, worden geclassificeerd als gevaarlijk afval van zware metalen en worden overgedragen aan een erkend bedrijf voor het beheer van gevaarlijk afval dat door de relevante autoriteiten is goedgekeurd voor correcte verwijdering. Gooi het paraformaldehyde-afvaloplossing weg in een speciale aldehyde-afvalcontainer. Gebruikte verbruiksartikelen moeten worden ingezameld als aldehydeafval en worden verwerkt door hetzelfde erkende bedrijf voor het beheer van gevaarlijk afval.

Statistische analyse
Vergelijkingen met meerdere groepen werden geanalyseerd door eenrichtings-ANOVA met Tukey's post-hoctest in GraphPad Prism 8.0. Statistische significantie werd gedefinieerd als P < 0,05. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ±± standaarddeviatie (SD).

Resultaten

Beschermende effecten van Mus op oxidatieve stressschade van Schwann-cellen in vitro
De expressie van HIF-1α vertoonde veranderingen als reactie op variaties in hypoxische omstandigheden²⁰. Om hypoxie te modelleren, werden SC's blootgesteld aan CoCl₂, dat met succes hypoxie induceerde, zoals bevestigd door verhoogde HIF-1α-eiwitniveaus, een canonieke hypoxiemarker, via western blotting (...

Discussie

De verlamming van Bell is een idiopathische perifere aangezichtszenuwverlamming die wordt gekenmerkt door eenzijdige zwakte van het gezicht. De myelineschede vervult verschillende cruciale functies bij de effectieve werking van neuronen²³. Het zorgt voor een soepele geleiding van zenuwimpulsen, ondersteunt neuronen door voedende factoren te leveren en helpt bij het regeneratieproces²⁴ . Daarom kan verlies van myeline in het perifere zenuwst...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.25% trypsine-verteringsoplossing (zonder EDTA)	Servicebio	G4002
10x TBS	Eubiotech	BF0153
10-180 KDPrestained Color Protein Marker	Eubiotech	P0069
5% vetvrij droge melk	Beyotime Biotechnology, China	P0216-300g
anti-C-JUN-antilichaam	Cell Signaling, USA	#9165T
anti-GAPDH-antilichaam	abcam, UK	ab245355
anti-GDNF-antilichaam	Cell Signaling, USA	#47808
anti-HIF-1α-antilichaam	Cell Signaling, USA	#14179
anti-IKK-antilichaam	Cell Signaling, USA	#2682
anti-IL-1R1-antilichaam	Cell Signaling, USA	#6775	voor WB
anti-IL-1R1-antilichaam	proteintech	84094-6-RR	voor immunofluorescentie
anti-IRAK1-antilichaam	Cell Signaling, USA	#4395
anti-IκB-α-antilichaam	Cell Signaling, USA	#8943
anti-p50-antilichaam	abcam, UK	ab305263
anti-p65-antilichaam	abcam, UK	ab16502
anti-rat IL-1R1 mAb	Beyotime Biotechnology, China	AF7212
anti-β-actin-antilichaam	abcam	ab179467
BCA-eiwitkwantificeringskit	Eubiotech	WB2123
Celtellingskit-8 (CCK-8) assayreagens	Beyotime Biotechnology, China	C0048M
Kobaltchloride (CoCl2)	Macklin, China	C804815
EuECL Star	Eubiotech	WB2131
Foetaal runderserum (FBS)	Bergolin,China	PWL001
Fitc-gelabeld geitenanti-konijn IgG	Servicebio	GB22303
Fluorescentiemicroscoop	Nikon
Hieff Trans in vitro siRNA/miRNA-transfectiereagens	YEASEN, China	40806ES01
Mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerde secundaire antilichamen HRP-gelabeld geitenanti-muis IgG	Servicebio, China	GB23301
IL-1β, TNF-α, ROS en SOD ELISA-kit	BOSTER, China	BES1762K, BES0481K, BES5018K, BES2920K
Muscone (Mus)	Aladdin, China	M141496
PBS-buffer	Servicebio	G4202
Penicilline-Streptomycine-oplossing, 100x	Procell	PB180120
Polyvinylideenfluoride (PVDF)-membranen	Millipore, USA	IPFL00010
Ratten-Schwann-cellen (SCs)	Procell Life Science & Technology China	CM-M111
RIPA-lysebuffer	Eubiotech	WB2116
Schwann-celmedium	ScienCell, USA	1701
SDS-PAGE-laadbuffer	Beyotime Biotechnology, China	P0015
SDS-PAGE Protein l Laadbuffer, 5x	Eubiotech	WB2122
si-IL-1R1	Gene Universal	RX0114371
Natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gelelectroforese(SDS-PAGE) Bereidingskit	Eubiotech	WB2118
SYBR qPCR Mix	Beyotime Biotechnology, China	D7260
Totaal eiwitextractiekit	Beyotime Biotechnology, China	PP123-01
Transmissie-elektronenmicroscoop	Hitachi	HT7800
Trizol	Beyotime Biotechnology, China	R0011
Tween-20	Eubiotech	WB2114
Wateroplosbare montagemiddelen	Absin, China	abs9240
Western Transfer Buffer	Eubiotech	WB2129