Methodenartikel

Nauwkeurige faagmutagenese met NgTET-geassisteerde CRISPR-Cas-systemen

1.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69022

⸱

14 oktober 2025

 ,  , 
1Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, 2Kavli Institute of Nanoscience, Delft University of Technology, 3Department of Bionanoscience, Delft University of Technology, 4Philipps-Universität Marburg, Department of Chemistry, Center for Synthetic Microbiology (SYNMIKRO), 5Institute of Pharmaceutical Biology and Biotechnology, Department of Pharmacy, Marburg University

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om DNA-modificaties in bacteriofagen te verminderen met behulp van het NgTET-enzym, waardoor efficiënte en littekenloze CRISPR-Cas-mutagenese mogelijk wordt. Deze methode vergemakkelijkt de genetische manipulatie van fagen voor toepassingen in de biotechnologie en faagtherapie.

Samenvatting

Bacteriofagen, virussen die zich specifiek richten op hun bacteriële gastheren, hebben een aanzienlijk potentieel voor biotechnologie en geneeskunde, vooral bij het bestrijden van multiresistente infecties. De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan faaginfectie blijven echter grotendeels onderbelicht. Nauwkeurige, plaatsspecifieke mutagenese van fagen is een krachtig hulpmiddel om genfuncties en faag-gastheerinteracties op te helderen.

Een grote uitdaging bij mutagenese van het genoom van fagen is echter de aanwezigheid van DNA-modificaties van fagen die interfereren met conventionele genoombewerkingstools zoals CRISPR-Cas.

Hoewel CRISPR-Cas-systemen met succes zijn gebruikt voor gerichte mutagenese in verschillende organismen, wordt hun effectiviteit bij faagmutagenese vaak beperkt door DNA-modificaties zoals cytosineglycosylering. Om deze barrière te overwinnen, hebben we een efficiënte methode ontwikkeld die de overvloed aan faag-DNA-modificaties tijdelijk vermindert, waardoor efficiënte CRISPR-Cas-targeting en nauwkeurige mutatie-introductie in faaggenomen mogelijk wordt. Concreet gebruiken we de Ten Eleven Translocation (TET) methylcytosinedioxygenase van Naegleria gruberi (NgTET), die iteratief gemethyleerde en hydroxymethyleerde cytosines in DNA demodificeert. Door gehydroxymethyleerde cytosines in faag-DNA te oxideren, voorkomt NgTET latere cytosinemodificatie zoals glycosylering en verbetert het de efficiëntie van Cas-gemedieerde DNA-splitsing aanzienlijk.

Concluderend, de littekenloze en nauwkeurige genoombewerkingsbenadering die hier wordt gepresenteerd, maakt de efficiënte introductie van puntmutaties mogelijk met behoud van de oorspronkelijke genarchitectuur in faaggenomen. Door intacte transcriptionele en translationele kaders te behouden, minimaliseert deze methode onbedoelde verstoringen van complexe regelgevende netwerken. Dit is vooral belangrijk voor het onderzoeken van essentiële of multifunctionele faageiwitten. Het vermogen om gerichte genetische modificaties te genereren zonder externe sequenties te introduceren, breidt de experimentele toolkit voor faagbiologie aanzienlijk uit. Deze strategie vergemakkelijkt niet alleen gedetailleerde functionele studies, maar vergroot ook het potentieel voor rationele engineering van fagen voor therapeutische en biotechnologische toepassingen.

Inleiding

Bacteriofagen zijn virussen die zich specifiek richten op bacteriën. Ze hebben veel belangstelling voor onderzoek getrokken vanwege hun enorme potentieel in de biotechnologie en geneeskunde, met name in de strijd tegen multiresistente bacteriën 1,2,3. Desondanks blijft de biologie van fagen relatief onderbelicht. Een beter begrip van hun moleculaire mechanismen voor het kapen van hun bacteriële gastheren is essentieel om hun therapeutisch en biotechnologisch potentieel ten volle te benutten4. Om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de efficiënte faaginfectie te onderzoeken en de fagen verder te ontwikkelen voor specifieke toepassingen, is het vermogen om faaggenomen genetisch te modificeren essentieel. Toch blijft het een van de belangrijkste uitdagingen op het gebied van faagbiologie 3,5,6.

Faag-DNA wordt vaak gemodificeerd door specifieke chemische veranderingen van de purine- en pyrimidinebasen, bijvoorbeeld cytosineglycosylering en methylering. Deze modificaties beschermen het genetisch materiaal van fagen tegen herkenning en afbraak door gastheernucleasen6. Hoewel deze modificaties cruciaal zijn voor de faagfitness, vormen ze een belangrijk obstakel voor faaggenoomengineeringbenaderingen die afhankelijk zijn van DNA-targetingsystemen 2,3,7.

Bestaande mutagenesestrategieën, waaronder beperkingsmodificatiesystemen en geclusterde regelmatig tussenliggende korte palindromale herhalingen (CRISPR)-CRISPR-geassocieerde (Cas) eiwitgebaseerde technologieën, staan voor aanzienlijke uitdagingen bij het wijzigen van faag-DNA als gevolg van beschermende epigenetische modificaties zoals cytosineglycosylering8. CRISPR-Cas-gemedieerde genoombewerking, die zeer effectief is in bacteriële en eukaryote cellen, is gebaseerd op twee belangrijke stappen: de precieze splitsing van DNA op gerichte genomische loci door de Cas-nuclease, gevolgd door DNA-herstel door homologe recombinatie met donor-DNA met de gewenste mutatie1. In fagen voorkomen DNA-modificaties echter vaak dat Cas-nucleasen het genoom efficiënt binden of splitsen. Bovendien kan de snelle en voorbijgaande aard van faagreplicatie de efficiëntie van homologe recombinatie verder beperken. Deze barrières maken het bijzonder moeilijk om DNA-gerichte CRISPR-Cas-technologie toe te passen voor faagmutagenese. Het is aangetoond dat DNA-modificaties van fagen de targeting van faag-DNA met CRISPR-Cas zowel in vitro als in vivo belemmeren 6,7.

Om de uitdagingen van beschermende DNA-modificaties in fagen aan te pakken, introduceren we een genoommutagenesestrategie die gebruik maakt van de activiteit van de tien-elf translocatie (TET) methylcytosinedioxygenase, met name NgTET. In eukaryoten katalyseren TET-enzymen de stapsgewijze oxidatie van gemethyleerd cytosine door middel van iteratieve processen: methylcytosine (5mdC) wordt eerst omgezet in hydroxymethylcytosine (5hmdC), vervolgens in formylcytosine (5fdC) en ten slotte in carboxycytosine (5cadC) (Figuur 1).

In onze faagmutagenesebenadering wordt NgTET gebruikt om de overvloed aan beschermende DNA-modificaties tijdelijk te verminderen, waardoor de toegankelijkheid van faag-DNA voor genoombewerkingstools zoals Cas-enzymen9 wordt verbeterd. NgTET, werd geselecteerd voor het moduleren van het bacteriofaaggenoom vanwege eerdere meldingen van zijn succesvolle expressie in actieve oplosbare vorm in een heterologe bacteriële gastheer, met name E. coli. Deze eigenschap is essentieel, aangezien NgTET actief moet blijven tijdens faaginfectie10.

figure-introduction-1
Figuur 1: Stapsgewijze oxidatie van 5-methylcytosine door TET-dioxygenase1. De TET-dioxygenase katalyseert de opeenvolgende oxidatie van 5-methyl-2'-deoxycytidine (5mdC) tot 5hmdC, 5-formyl-2'-deoxycytidine (5fdC) en uiteindelijk tot 5-carboxyl-2'-deoxycytidine (5cadC). Het eindproduct, 5cadC, keert spontaan of enzymatisch terug naar ongemodificeerd cytosine (dC) en draagt zo bij aan dynamische epigenetische regulatie. Dit meerstapsproces staat centraal bij actieve DNA-methylering in eukaryoten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aangezien methylcytosine en hydroxymethylcytosine veel voorkomende voorlopers zijn van hypermodificaties van faag-DNA, waaronder omvangrijke beschermende structuren zoals glycosylaties, kan de oxidatieve activiteit van TET-dioxygenase worden benut om de vorming van deze DNA-hypermodificaties te voorkomen9. In deze op TET gebaseerde genoommutagenesebenadering brengen we NgTET heterologisch recombinant tot expressie in E. coli om gehydroxymethyleerde cytosines in het faaggenoom te oxideren bij infectie, waardoor de vorming van omvangrijke glycosylering wordt voorkomen. Door de overvloed aan deze omvangrijke DNA-modificaties te verminderen, kan onze aanpak de toegankelijkheid van faag-DNA tot CRISPR-Cas-nucleasen vergroten. Deze verbeterde toegankelijkheid vergemakkelijkt efficiënte doelherkenning, nauwkeurige DNA-splitsing en de introductie van littekenloze puntmutaties in het faaggenoom, waardoor het zich onderscheidt van traditionele faagmutagenesemethoden die afhankelijk zijn van gendeleties, inserties van reportergenen of de integratie van kunstmatige juncties voor op PCR gebaseerde mutantselectie 1,11. Deze conventionele strategieën zijn tot nu toe de enige beschikbare instrumenten geweest voor gerichte mutagenese in faaggenomen en vormen daarom een belangrijke basis voor de hier gepresenteerde methode. Enkelvoudige faageiwitten kunnen echter meerdere functies hebben. Deletie van het gehele gen dat codeert voor een interessant eiwit verstoort alle geassocieerde functies. Daarentegen maakt de gerichte introductie van puntmutaties de selectieve inactivering van specifieke functies mogelijk, waardoor een gedetailleerde analyse van hun rol mogelijk wordt. Tot op heden blijven de functies van veel faageiwitten grotendeels ongekarakteriseerd; We kunnen dus aanvullende activiteiten over het hoofd zien die verband houden met een bepaald gen. Daarom heeft een minimalistische benadering de voorkeur die erop gericht is slechts één functie te verwijderen en tegelijkertijd minimale veranderingen in het totale eiwit te veroorzaken12,13. De hier beschreven methode maakt nauwkeurige genetische modificaties mogelijk zonder de algehele genomische organisatie of functie te verstoren. Een andere grote uitdaging van eerdere methoden voor faagmutagenese was hun lage efficiëntie, die doorgaans mutatiesnelheden van ongeveer 0,1% opleverde1,11. Met deze techniek presenteren we de eerste mutagenesestrategie die in staat is om veranderingen in één codon te introduceren, waardoor een opmerkelijke zevenvoudige toename van de doelwitticiëntie wordt bereikt. Door het te combineren met een op ONT gebaseerde high-throughput screeningmethode, wordt de detectie van puntmutaties vereenvoudigd, waardoor het niet meer nodig is om grote faagpopulaties te screenen om één mutant te isoleren. De hier beschreven TET-gebaseerde mutagenesestrategie pakt een al lang bestaande beperking in het veld aan en maakt betrouwbaardere genoombewerking mogelijk14.

Over het algemeen kan deze methode niet alleen worden toegepast om ons begrip van bacteriofaaginfectiemechanismen te vergroten, maar is het ook veelbelovend voor de synthetische biologie. Door nauwkeurige en efficiënte genoomengineering van fagen mogelijk te maken, wordt de weg vrijgemaakt voor het afstemmen van de fagen op specifieke toepassingen, waardoor hun potentieel voor biotechnologische en medische toepassingen wordt vergroot.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Een schema dat de generatie van met NgTET behandelde T4-faag aantoont, wordt weergegeven in figuur 2.

figure-protocol-1
Figuur 2: Schematisch overzicht van de vastgestelde workflow voor T4 faag mutagenese en mutant screening. De workflow omvat het genereren van de gehypomodeerde T4-faag met behulp van NgTET, die kan worden gevalideerd door LC-MS-analyse of als alternatief via CRISPR-Cas-splitsingstest. Vervolgens wordt de mutatie van belang in het faaggenoom geïntroduceerd via CRISPR-Cas-gemedieerde plaatsgerichte mutagenese en geïdentificeerd door tegenselectie. De aanwezigheid van de gewenste mutatie kan vervolgens worden bevestigd met behulp van Nanopore-sequencing. Na validatie kan de mutante faag worden vermeerderd om DNA-hypermodificaties te herstellen. Dit maakt het gebruik van de gemanipuleerde faag in downstream-toepassingen mogelijk, waaronder de analyse van infectiefenotypes door middel van lysistests en metingen van de burst-grootte. Elke stap in de figuur is geannoteerd met het bijbehorende protocolnummer tussen haakjes om het koppelen van de protocolstappen aan de respectievelijke delen van de figuur te vergemakkelijken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Verminderen van faag-DNA-modificaties met behulp van NgTET-voorbehandeling (~2 dagen)

OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang voor het mogelijk maken van efficiënte Cas-nuclease-targeting tijdens mutagenese door de overvloed aan faag-DNA-modificaties te verminderen.

  1. Inoculeer de E. coli BL21 (DE3)-stam die is getransformeerd met pET28a_NgTET door materiaal uit een glycerolvoorraad over te brengen in 10 ml LB-medium aangevuld met 30 μg/ml kanamycine. Incubeer een nacht bij 37 °C met schudden bij 160 rpm.
  2. Gebruik de volgende dag de nachtcultuur om een hoofdcultuur te inoculeren tot een initiële OD600 van 0,1 in 50 ml LB-medium dat 30 μg/ml kanamycine bevat. Induceer de cultuur met 50 μM IPTG wanneer een OD600 van 0,4 wordt bereikt.
  3. Kweek de cultuur bij 37 °C met schudden bij 160 tpm tot een OD600 van 0,8.
  4. Infecteer de cultuur met de faag van belang bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 0,1 en incubeer gedurende 4 uur bij kamertemperatuur met schudden bij 120 tpm.
  5. Oogst de cellen door centrifugeren bij 4000 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
  6. Laat het bovenstaande door een filter van 0,45 μm lopen om met NgTET behandelde fagen met gehypomodeerd DNA te verkrijgen. Bewaar de gefiltreerde fagen bij 4 °C voor toekomstig gebruik.
    OPMERKING: (PAUZEPUNT) Gefiltreerde fagen zijn enkele maanden stabiel bij 4 °C, bewaard in LB-medium in een glazen fles.

2. Validatie

OPMERKING: Het doel van deze stap is om de verminderde overvloed aan DNA-modificaties van fagen experimenteel te verifiëren.

  1. Validatie van de behandeling via LC-MS (~ 2 dagen)
    1. Faagzuivering via sucrosegradiënt
      1. Om het resterende nucleïnezuur uit het lysaat te verwijderen, behandelt u 500 μL van de faagsuspensie (>1010 PFU/ml) met 20 E DNase I en 2 μL RNase A/T1 Mix (4 μg RNase A, 10 E RNase T1).
      2. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij 37 °C.
      3. Bereid een sucrosegradiënt van 0-45% voor in TM-buffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, pH 7,5). Bereid het verloop voor met een verloopmixer of handmatig.
        OPMERKING: Voor handmatige bereiding begint u met het pipetteren van 5 ml TM-buffer in een gradiëntbuis. Pinetteer vervolgens met behulp van een canule met stomp uiteinde langzaam 5 ml van de 45% sucrose-oplossing vanaf de bodem van de buis, zodat de 0%-oplossing geleidelijk kan rijzen.
      4. Laad 500 μL van de behandelde faagoplossing bovenop de gradiënt.
      5. Centrifugeer bij 70.000 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
      6. Steek de centrifugatiebuis vanaf de onderkant aan. Dit maakt de visualisatie van de faag mogelijk, die als een troebele band in het verloop verschijnt. Verwijder de faaghoudende fractie voorzichtig met behulp van een stompe canule.
      7. Breng de geëxtraheerde faagfractie over in een nieuwe ultracentrifugatiebuis.
      8. Voeg 30 ml ijskoude TM-buffer toe en centrifugeer 1 uur bij 100.000 × g bij 4 °C.
      9. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de pellet in 500 μL TM-buffer.
      10. Bewaar de geresuspendeerde fagen een nacht in een glazen injectieflacon bij 4 °C.
    2. Isolatie van faag-DNA
      1. Voeg 1 μg proteïnase K toe aan de geresuspendeerde fagen.
      2. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
      3. Voeg 1 volume mengsel van fenol/chloroform/isoamylalcohol (P/C/I) toe. Meng door inversie. Scheid de fasen door centrifugatie bij 15.000 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C. Breng de waterige fase over in een nieuwe reactiebuis. Herhaal de extractie drie keer.
        LET OP: Fenol/chloroform/isoamylalcohol (P/C/I) is zeer giftig, bijtend en vluchtig. Hanteer het altijd in een zuurkast terwijl u de juiste beschermende uitrusting draagt, waaronder een laboratoriumjas, veiligheidsbril en dubbele nitrilhandschoenen. Vermijd huid- en oogcontact en bewaar in een goed afgesloten container in een daarvoor bestemde chemicaliënkast. Gooi afval weg via goedgekeurde kanalen voor gevaarlijk afval. In geval van contact, onmiddellijk spoelen met water en medische hulp inroepen.
      4. Om achtergebleven fenol te verwijderen, voert u driemaal chloroform-terugextracties uit met 1 volume chloroform.
      5. Sla DNA 's nachts neer met 0,1 volume 3 M NaOAc (pH 5,5) en 2,5 volume ethanol bij -20 °C.
      6. Pellet het DNA de volgende dag door centrifugatie bij 15.000 g × g gedurende 1 uur bij 4 °C.
      7. Was de DNA-pellet twee keer met 200 μL 70% ethanol, schud voorzichtig, centrifugeer gedurende 15 minuten bij 15.000 × g bij 4 °C en verwijder voorzichtig het supernatant.
      8. Resuspendeer het gezuiverde DNA in ultrapuur water.
      9. Bewaar het DNA bij -20 °C tot verder gebruik.
        OPMERKING: (PAUZEPUNT) Geprecipiteerd DNA kan enkele maanden bij -20 °C worden bewaard.
    3. Bereiding van faag-DNA voor LC-MS-analyse
      1. Verwerk het gezuiverde DNA tot enkele nucleosiden met behulp van een nucleoside digestiemix.
      2. Analyse van de DNA-samenstelling via LC-MS.
        OPMERKING: Met deze stap kan de effectiviteit van de NgTET-behandeling worden gevalideerd. Het protocol is aangepast aan de specifieke apparatuur en kolom die in het lab beschikbaar zijn, maar kan worden aangepast op basis van beschikbare middelen en omstandigheden.
      3. Gebruik verteerd DNA geïsoleerd uit gezuiverde faag (stap 2.1.10).
      4. Neem de volgende in de handel verkrijgbare normen op voor de metingen: dA, dT, dG, dC, 5hmdC, 5fdC, 5cadC. Vermeld, indien beschikbaar, de standaard van de cytosinehypermodificatie die aanwezig is op het faag-DNA.
      5. Gebruik een HPLC-systeem dat is uitgerust met een C18-kolom (150 × 2,1 mm, 100 Å, 3 μm) en een 20 × 2,1 mm beschermzuil.
      6. Stel de kolomtemperatuur in op 40 °C en het eluentdebiet op 0,2 ml/min.
      7. Bereid de verdunningsmiddelen als volgt aan:
        Eluent A: 10 mM Ammoniumacetaat in water (pH 4,5).
        Eluent B: 0,1% mierenzuur in methanol.
        LET OP: 0,1% mierenzuur in methanol is ontvlambaar en kan de huid, ogen en luchtwegen irriteren. Gebruik altijd in een goed geventileerde ruimte of zuurkast. Draag geschikte beschermingsmiddelen, waaronder een laboratoriumjas, een veiligheidsbril en nitrilhandschoenen. Blijf uit de buurt van hitte, vonken en open vuur. Bewaar in een brandbare opbergkast. Afvoer via goedgekeurde protocollen voor gevaarlijk afval.
      8. Pas het volgende mobiele faseprofiel toe: 0-1 min: Constant op 5% B; 1-5 min: Gradiënt van 5% naar 90% B; 5-7 min: Constant op 90% B; 7-7,1 min: Gradiënt van 90% naar 5% B; 7,1-12 min: Constant op 5% B.
      9. Gebruik een massaspectrometer in negatieve en positieve ionisatiemodi (afzonderlijke injecties) met een elektrospray-ionisatiebron (H-ESI) bij hoge temperatuur onder de volgende omstandigheden:
        H-ESI spuitspanning: 3400 V (+), 2400 V (-), Mantelgas: 35 willekeurige eenheden, Hulpgas: 7 willekeurige eenheden, Veeggas: 0 willekeurige eenheden, Temperatuur ionenoverdrachtsbuis: 300 °C, Temperatuur verdamper: 275 °C, Detectiemodus: Volledige scan met behulp van de Orbitrap-massaanalysator, Massaresolutie: 120.000, Massabereik: 200-450 (m/z).
      10. Extractie ionchromatogrammen van de [M-H]- (dA, dT, dC, 5hmdC, 5fdC, 5cadC) en [M+H]+ (5ghmdC) vormen met behulp van Tracefinder-software.
      11. Bereken de relatieve abundantie van elke wijziging door het piekoppervlak van elk signaal te normaliseren naar het dG-piekgebied binnen de steekproef, met behulp van dG als een steekproefspecifieke interne standaard.
  2. Validatie met CRISPR-Cas splitsingstest (~2,5 dagen)
    OPMERKING: Deze stap maakt de fenotypische beoordeling mogelijk van het succes van de NgTET-behandeling en de impact ervan op de CRISPR-Cas-splitsing. Als NgTET actief is, mogen er geen plaques ontstaan uit het behandelde faag-DNA of moet de faagtiter worden verlaagd, omdat het verwijderen van beschermende DNA-modificaties het genoom vatbaar maakt voor CRISPR-Cas12- of 9-splitsing. Als het faag-DNA daarentegen onbehandeld is, zal het aantal gevormde plaques overeenkomen met de titer van de fagen, wat aangeeft dat het hypergemodificeerde T4-faaggenoom resistent is tegen CRISPR-Cas12- of 9-splitsing.
    1. Inoculeer E. coli BL21 (DE3) uit een nachtelijke cultuur, getransformeerd met zowel het pET28a_NgTET plasmide als een Cas12- of Cas9-expressieplasmide (bijv. DS-spCas of pCpf1 zonder afstandhouder). Alle plasmiden met aanvullende informatie zijn te vinden in Tabel 1.
      1. Kweek de cellen in LB-medium aangevuld met de juiste antibiotica bij 3 °C met schudden, beginnend bij een OD600 van 0,1. Zodra de cultuur een OD600 van ongeveer 0,4 bereikt, induceert u NgTET-expressie door 0,05 mM IPTG toe te voegen en incubeert u nog 2 uur bij 3 °C.
      2. Vergelijk als controle E. coli BL21 (DE3)-stammen met en zonder NgTET-overexpressie. Bij afwezigheid van NgTET-activiteit wordt een hoger aantal plaquevormende eenheden verwacht, wat wijst op een verminderde CRISPR-Cas-efficiëntie als gevolg van de aanwezigheid van geglycosyleerd 5ghmdC in het faag-DNA.
    2. Breng 300 μL van de E. coli-culturen over in een steriel buisje.
    3. Infecteer de cultuur met T4 WT of NgTET-behandelde faag met MOI 0.01. Pas voor dit experiment een laag traagheidsmoment toe om ervoor te zorgen dat bacteriën slechts door één faag tegelijk worden geïnfecteerd. Dit maximaliseert de efficiëntie van de CRISPR-Cas-splitsingsscreening en vereenvoudigt de interpretatie van de resultaten. Meng voorzichtig om een gelijkmatige verdeling van de fagen te garanderen.
    4. Incubeer de bacterie-faagsuspensie gedurende 7 minuten bij 37 °C.
    5. Voeg het bacterie-faagmengsel toe aan 4 ml LB zachte agar (0,75%) aangevuld met antibiotica. Meng grondig maar voorzichtig om te voorkomen dat er luchtbellen ontstaan.
    6. Giet het zachte agarmengsel op een voorverwarmde LB-agarplaat.
    7. Laat de platen bij kamertemperatuur kort stollen. Incubeer de platen een nacht bij 37 °C.
    8. Tel de volgende dag de resulterende plaques om plaquevormende eenheden (PFU) te bepalen.

3. CRISPR-Cas-mutagenese (~ 1 week)

OPMERKING: CRISPR-Cas-mutagenese is gebaseerd op het principe dat een specifieke plaats in het faaggenoom het doelwit is van een Cas-nuclease tijdens faaginfectie, wat resulteert in een dubbelstrengsbreuk. Deze breuk wordt hersteld door homologe recombinatie met behulp van donor-DNA, dat wordt toegediend op een tweede plasmide dat tijdens mutagenese aanwezig is in de geïnfecteerde gastheerstam. Het plasmide dat het donor-DNA bevat, codeert ook voor NgTET, wat essentieel is om de toegankelijkheid van het faag-DNA voor het Cas-nuclease te behouden door de overvloed aan gemodificeerde cytosines te verminderen, zoals eerder beschreven. In deze stap worden doelmutaties geïntroduceerd in het genoom van met NgTET behandelde T4-fagen bij infectie van E. coli15. Om consistent lage niveaus van DNA-modificaties in het T4-genoom te garanderen, wordt NgTET-dioxygenase tot expressie gebracht door de toevoeging van 50 μM IPTG (analoog aan stap 1.2) gedurende het mutageneseproces.

  1. Generatie van pET28a_NgTET_donor DNA-plasmiden via Golden Gate-klonen15
    1. Voor het genereren van het donor-DNA bestel je de gewenste sequentie als een heel gen of amplificeer je uit een genoom, bijvoorbeeld uit het faaggenoom, en introduceer je de gewenste mutatie.
      OPMERKING: Voor het ontwerp van donor-DNA moeten homologe gebieden worden opgenomen die de doellocatie flankeren (≈200 bp aan elke kant voor puntmutaties; langere gebieden voor grotere inserts). Het lineaire donorfragment moet BsaI-herkenningsplaatsen dragen die bij splitsing compatibele overhangen met het plasmide genereren. In silico klonen wordt aanbevolen om het constructontwerp te verifiëren. In de representatieve resultaten worden alle kritische componenten voor het donor-DNA geïllustreerd in een voorbeeld.
    2. Introduceer het donor-DNA-fragment stroomafwaarts van de NgTET-coderende sequentie en terminator in de pET28a_NgTET-ruggengraat met behulp van Golden Gate-assemblage.
      1. Bereid de assemblagereacties voor door 70 fmol pET28a_NgTET plasmide, 140 fmol donor-DNA-insert, 1 μL BsaI (20 E/μL), 5 U T4 DNA-ligase en 2 μL 10× ligasebuffer te combineren, met nucleasevrij water toegevoegd aan een eindvolume van 20 μL.
      2. Voer reacties uit in 25 cycli in een PCR-cycler met de volgende instellingen: 1) Beperking, 37 °C gedurende 1,5 min, 2) Afbinding, 16 °C gedurende 3 min, 3) Eindbeperking, 37 °C gedurende 5 min, en 4) Denaturatie, 60 °C gedurende 10 min.
    3. Voeg 6 μl van het reactiemengsel (uit stap 3.1.2) toe aan 100 μl chemisch competente E. coli DH5α, incubeer gedurende 10 minuten op ijs en schok gedurende 45 s bij 42 °C. Plaats de cellen onmiddellijk 1 minuut op ijs en voeg vervolgens 750 μL LB medium toe. Herstel bij 37 °C met schudden (500 tpm) gedurende 1 uur. Plaat op LB-agar met kanamycine (30 μg/ml) en een nacht incuberen bij 37 °C.
    4. Kies een enkele kolonie en inoculeer 20 ml LB-medium aangevuld met kanamycine (30 μg/ml). Incubeer een nacht bij 37 °C met schudden bij 160 rpm.
    5. Pellet vanaf 5 ml van de nachtcultuur de cellen en isoleer het plasmide-DNA met behulp van een standaard plasmide-extractiemethode. Elueer het plasmide in 40 μL nucleasevrij water.
    6. Bevestig de correcte klonen door de insertieplaats van het plasmide te sequencen met behulp van Sanger-sequencing.
  2. Constructie van spacer-bevattende CRISPR-Cas-plasmiden (pCpf1-sp als model)15
    OPMERKING: Het plasmide dat in dit hoofdstuk wordt beschreven, maakt de eerste stap van mutagenese mogelijk door een plaatsspecifieke dubbelstrengsbreuk in het faaggenoom te introduceren. Hoewel de procedure hier wordt gedemonstreerd met het CRISPR-Cas12-systeem (pCpfl-sp-plasmide), kunnen ook alternatieve nucleasen zoals CRISPR-Cas9 (DS-spCas-plasmide) worden gebruikt15 .
    1. Ontwerp een 20-nt spacer gericht op de mutageneseplaats (PAM: TTTV). Identificeer en ontwerp geschikte protospacers en bijbehorende spacers met behulp van bio-informaticatools.
    2. Synthese van twee 5′-gefosforyleerde oligonucleotiden. Zorg ervoor dat elk 10 nt van de gewenste spacer-sequentie draagt (samen vormen ze de volledige 20 nt spacer) en een extra 10 nt-gebied dat complementair is aan de insertieplaats in het pCpf1-sp-plasmide.
    3. Breng de ontworpen CRISPR-Cas-afstandhouder in het pCpf1-sp-plasmide door middel van PCR-amplificatie met behulp van de primers uit stap 2. Stel de reactie als volgt in (eindvolume 50 μL): 5 μL 10× GC-buffer, 1 μL 10 mM dNTP's, 1 μL voorwaartse primer (10 μM), 1 μL reverse primer (10 μM), 2,5 μL DMSO, plasmidesjabloon overeenkomend met 2 fmol, 1 μL Phusion DNA-polymerase (2 U/μL) en nucleasevrij water tot 50 μL.
    4. Plaats de reactiebuizen in een thermocycler en voer het volgende programma uit: eerste denaturatie bij 98 °C gedurende 30 s; 25 cycli van 98 °C gedurende 10 s, gloeien bij de juiste temperatuur (X °C) gedurende 30 s en verlenging bij 72 °C gedurende 6 min; gevolgd door een laatste verlenging bij 72 °C gedurende 10 minuten. Houd de monsters bij 4 °C tot verdere verwerking.
    5. Meng 5 μL van de PCR-reactie met DNA-laadbuffer (10×) en laad op een 1% agarosegel. Laat de gel 20 minuten op 130 V draaien en visualiseer de DNA-banden met behulp van UV-transverlichting. Als de amplificatie is gelukt, zuiver het PCR-product dan met behulp van een geschikte opruimset en elueer in 20 μL nucleasevrij water.
    6. Circulariseer het plasmide door ligatie met behulp van 100 ng van het geamplificeerde product gemengd met 1× T4 DNA-ligasebuffer en 60 U T4 DNA-ligase in een totaal reactievolume van 15 μL. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Transformeer 100 μl chemisch competente E. coli met het ligatieproduct zoals beschreven in stap 3.1.3. Leg de cellen op een plaat op LB-agar met 50 μg/ml streptomycine en incubeer een nacht bij 37 °C.
    7. Pluk een enkele kolonie van de plaat en inoculeer deze in 20 ml LB-medium aangevuld met 50 μg/ml streptomycine. Incubeer een nacht bij 37 °C met schudden bij 160 rpm. Oogst vanaf 5 ml van de nachtcultuur de cellen door centrifugatie en isoleer plasmide-DNA met behulp van een plasmide-extractiemethode naar keuze. Elueer het plasmide in 40 μL nucleasevrij water.
    8. Bevestig een succesvolle klonen door het plasmide op de inbrengplaats te sequencen met behulp van Sanger-sequencing.
  3. Mutagenese van fagen
    1. Transformeer E. coli BL21 (DE3)-cellen met twee plasmiden: pET28a_NgTET_donor-DNA en pCpf1-sp (Cas12)/DS-SPcas (Cas9) spacer (gegenereerd in stap 3.1 en 3.2). Meng 1 μL van elk plasmide met 100 μL chemisch competente E. coli BL21 (DE3). Volg het protocol beschreven in stap 3.1.3. Leg de getransformeerde cellen op een plaat op agar die 50 μg/ml streptomycine en 30 μg/ml kanamycine bevat en incubeer een nacht bij 37 °C.
    2. Inoculeer de getransformeerde E. coli-stam (E. coli BL21 (DE3) pET28a_NgTET_donor-DNA en pCpf1-sp (Cas12)/DS-SPcas(Cas9)_spacer) in 10 ml LB-medium aangevuld met 30 μg/ml kanamycine en 50 μg/ml streptomycine. Incubeer een nacht bij 37 °C met schudden bij 160 rpm.
    3. Verdun de volgende dag de nachtcultuur tot een initiële OD600 van 0,1 in 50 ml LB-medium dat 30 μg/ml kanamycine en 50 μg/ml streptomycine bevat.
    4. Kweek de teelt bij 37 °C met schudden bij 160 tpm tot een OD600 van 0,8 is bereikt. Verlaag de temperatuur tot kamertemperatuur (RT) en verlaag de roersnelheid tot 130 tpm.
      1. Om de adsorptie van fagen en DNA-injectie te verbeteren, voegt u MgCl2 en CaCl2 toe aan eindconcentraties van elk 1 mM, aangezien deze tweewaardige kationen efficiënte interacties tussen fagen en gastheer mogelijk maken.
      2. Infecteer de cultuur met NgTET-voorbehandelde T4-fagen, en als negatieve controle, met NgTET-onbehandelde T4-fagen bij een MOI van 0,1. Ga door met incuberen bij RT gedurende 4 uur.
    5. Breng de culturen na de incubatie over in een conische buis van 50 ml en centrifugeer ze gedurende 20 minuten bij 4000 × g bij 4 °C om de cellen te pelleteren. Filtreer de bovenstaande stoffen door een filter van 0,45 μm om eventuele resterende bacteriecellen te verwijderen. Gebruik de gefilterde supernatanten voor plaque-assays (beschreven in stap 2.2) om de faagconcentratie te bepalen of tegenselectie uit te voeren.

4. Identificatie van mutanten

OPMERKING: Het doel van tegenselectie is om het aandeel wildtype fagen dat na mutagenese in de populatie achterblijft, te verminderen. Hiervoor worden fagen verkregen uit de mutagenesestap (stap 3.3) gebruikt om E. coli te infecteren met hetzelfde CRISPR-Cas13-systeem, dat wordt gecodeerd door een ander plasmide pBA560 (aanvullende informatie in tabel 1) en dezelfde spacersequentie die tijdens de mutagenese wordt toegepast. In deze opstelling herkennen en splitsen Cas-nucleasen selectief wildtype faag-DNA, terwijl fagen met de gewenste mutaties onaangetast blijven. Deze selectiedruk onderdrukt wild-type replicatie en verrijkt de populatie voor mutante fagen14.

  1. Tegenselectie met Cas13
    1. Infecteer E. coli Cas13a_spacer (plasmide pBA560) met de fagen voor tegenselectie. Deze stap vergemakkelijkt tegenselectie door faag-RNA af te breken dat de beoogde mutatie niet heeft ondergaan.
    2. Voer de tegenselectie uit onder dezelfde omstandigheden als tijdens de mutagenese (zie stappen 3.3.1-3.3.5). Gebruik E. coli die een niet-gerichte Cas13a-afstandhouder tot expressie brengt als negatieve controle om te bevestigen dat de plaquereductie spacer-specifiek is.
    3. Filtreer na de incubatie het bovenstaande met tegengeselecteerde fagen door een filter van 0,45 μm om bacterieel resten te verwijderen.
      OPMERKING: (PAUZEPUNT) Gefiltreerde fagen zijn enkele maanden stabiel bij 4 °C, bewaard in LB-medium in een glazen fles.
    4. Gebruik de gecontraselecteerde en gefilterde fagen voor een plaque-assay op een E. coli B-stam om individuele plaques te isoleren voor stroomafwaartse validatie.
  2. Sequencing van de volgende generatie (~ 1 week)
    OPMERKING: De methode voor de sterk gemultiplexte sequencing-benadering omvat een PCR-proces in twee stappen om gemultiplext amplicon-DNA te genereren dat geschikt is voor long-read sequencing van de volgende generatie16.
    1. Scheid de fagen van de mutagenese door ze uit te plateren zoals beschreven in stap 2.2. Zorg voor de juiste controles door gebruik te maken van fagen die zijn verkregen uit mutagenese die zowel in aanwezigheid als in afwezigheid van NgTET-expressie wordt uitgevoerd. Als controle zou CRISPR-Cas9- en Cas12-targeting zonder NgTET niet moeten leiden tot de introductie van puntmutaties. Daarentegen wordt verwacht dat co-expressie van NgTET succesvolle bewerking mogelijk maakt, wat leidt tot een hogere mutagenese-efficiëntie.
    2. Om de afzonderlijke fagen te isoleren, pakt u individuele plaques van de plaat en brengt u ze over in een buisje met 100 μL Pi-Mg-buffer (26 mM Na2PHO4, 68 mM NaCl, 22 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, pH 7,5) en 1 μL CHCl3.
      LET OP: Chloroform is giftig, vluchtig en vermoedelijk kankerverwekkend, zelfs in kleine hoeveelheden. Hanteer alleen in een zuurkast en draag volledige beschermingsmiddelen, waaronder een laboratoriumjas, veiligheidsbril en nitrilhandschoenen. Vermijd inademing en huidcontact. Bewaar in een goed afgesloten container in een geventileerde, ontvlambare chemicaliënkast. Gooi chloroformafval weg via inzameling van gevaarlijk afval.
    3. Gebruik 1 μL geïsoleerde faag T4 in Pi-Mg-buffer als sjabloon voor de screening.
    4. Bereid het reactiemengsel voor met 0,125 μM van elke primer (rond de insteekpositie) en 1x zeer nauwkeurig polymerasemastermengsel, waarbij u het totale volume van de amplificatiereactie instelt op 10 μL. Voer een PCR-reactie uit met 30 amplificatiecycli.
    5. Voer een tweede PCR uit om de barcodes aan te brengen. Gebruik daarom 1 μL van een 1:10 verdunning van het product uit de eerste PCR als sjabloon.
    6. Bereid het reactiemengsel voor met 0,3 μM barcodeprimers en een high-fidelity hot-start polymerasemengsel in een totaal volume van 7 μL. Voer PCR uit met 20 amplificatiecycli.
      OPMERKING: (PAUZEPUNT) PCR-Producten kunnen enkele weken worden bewaard bij -20 °C.
    7. Verzamel alle PCR-producten met barcode en zuiver ze met behulp van magnetische opruiming op basis van kralen volgens standaardprotocollen voor de voorbereiding van de volgende generatie sequencingbibliotheek.
    8. Vang DNA met behulp van magnetische kralen, spoel twee keer met 80% ethanol en elueer in 100 μL elutiebuffer (5 mM Tris-HCl, pH 8,5).
    9. Meet de DNA-concentratie met behulp van spectrofotometrische en fluorometrische methoden, waarbij zo nodig een brede of zeer gevoelige test wordt toegepast.
      OPMERKING: (PAUZEPUNT) DNA kan enkele weken worden bewaard bij -20 °C.
    10. Genereer sequencingbibliotheken met behulp van een op ligatie gebaseerd protocol volgens de instructies van de fabrikant, te beginnen met 1 μg invoer-DNA.

5. Mutante propagatie, herstel van DNA-modificaties en bewijs

OPMERKING: Zodra de gewenste faagmutant is geïdentificeerd, wordt deze vermeerderd in wildtype E. coli om DNA-modificatieniveaus te herstellen die vergelijkbaar zijn met die van de WT-faag. Dit zorgt ervoor dat de gemuteerde faag zonder enig compromis kan worden gebruikt in volgende biologische experimenten, afgezien van de geïntroduceerde mutatie.

  1. Bereid een cultuur van 10 ml van de stam E. coli B in LB-medium voor en incubeer deze een nacht bij 37 °C met schudden bij 160 tpm.
  2. Inoculeer de volgende dag een vers 50 ml LB-medium met de nachtcultuur om een initiële OD600 van 0,1 te verkrijgen.
  3. Laat de cultuur groeien bij 37 °C met schudden bij 160 tpm tot een OD600 van 0,8 bereikt.
  4. Voeg 50 μl van de mutante faagvoorraad (4.2.2) toe aan de cultuur. Verwijder de fase voorzichtig om te voorkomen dat CHCl3 wordt overgedragen.
  5. Incubeer de geïnfecteerde cultuur een nacht bij kamertemperatuur en schud zachtjes bij 120 tpm.
  6. Na incubatie centrifugeer je de cultuur bij 4000 × g om bacteriële cellen te verwijderen. Filtreer het bovenstaande door een filter van 0,45 μm om de faag op te vangen.
  7. Breng de gefiltreerde mutante faag over in een glazen recipiënt en bewaar deze bij 4 °C tot verder gebruik.
    OPMERKING: (PAUZEPUNT) Gefiltreerde fagen zijn enkele maanden stabiel bij 4 °C, bewaard in LB-medium in een glazen fles.
  8. Als optionele validatie van de regeneratie van DNA-modificaties, met name geglycosyleerde cytosines, voert u een LC-MS-analyse uit zoals beschreven in stap 2.1.
    1. Zuiver hiervoor het teruggevonden faag-DNA van het faagnageslacht zoals beschreven in stap 2.1.1, isoleer zoals beschreven in stap 2.1.2 en bereid vervolgens voor op LC-MS-analyse zoals beschreven in stap 2.1.3.
    2. Analyseer ionchromatogrammen en bereken de relatieve abundantie van elke wijziging door het piekoppervlak van elk signaal te normaliseren naar het dG-piekgebied binnen het monster, met behulp van dG als een steekproefspecifieke interne standaard zoals beschreven in stap 2.1.3.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om T4 wild-type faag, T4-faag behandeld met NgTET en T4-faag behandeld met de inactieve NgTET D234A-variant als controles op te nemen, om de overvloed aan 5ghmdC10 direct te valideren en te vergelijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Identificatie van de faagband in de gradiënt.
De zichtbaarheid van de faagband in de gradiënt hangt af van de faagconcentratie in het eerste monster dat op de gradiënt is geladen. Wanneer de faag voldoende geconcentreerd is (~>1 × 1011 PFU/ml), is de band duidelijk te zien door de gradiënt vanaf de bodem te verlichten met een lichtbron (zie figuur 3).

Bij lage faagconcentraties is de band echter moge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze studie presenteert een robuuste en aanpasbare strategie voor het introduceren van precieze puntmutaties in bacteriofaaggenomen, inclusief veranderingen in één nucleotide. Een centraal element van de workflow is de integratie van strikte validatiestappen in elke fase, wat essentieel is om zowel de nauwkeurigheid als de efficiëntie van genoombewerking te waarborgen. Dit is met name van cruciaal belang gezien het meerstapskarakter van de workflow en de dynamische interacties tussen fag...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

KH en NP hebben een Europese octrooiaanvraag ingediend voor "Engineering of Fagen", Europese octrooiaanvraag nr. 23 175 257.7. De andere auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

Dit project heeft financiering ontvangen van de Duitse Onderzoeksraad (DFG; SPP 2330 projectnummer 464500427, RTG 2355 project 11 en RTG 2937 (projectnummer 505997786) van de Max Planck Society (Max Planck Research Group Leader financiering aan K.H.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL reactiebuizenSarstedt72.690.001
15 mL Canocial TubesSarstedt62.554.502
15 mL Open-Top Thinwall Polypropylene TubesBeckman Coulter Life Sciences36170616 mm x 95 mm (voor ultracentrifugatie)
50 mL canonische buizenSarstedt62.547.254
5x GC bufferThermo Fisher Scientific F519L
6x TriTrack DNA Loading Dye Thermo Fisher Scientific R1161
AgaroseMeridian BIOSCIENCEBIO-41025Molecular Grade
Avanti J-30I CentrifugeBeckman Coulter Life Sciencesgeen catalogus  nummerSerie-Nr. JKY14M01, https://www.beckman.de/centrifuges/ultracentrifuges/optima-xe
Boorzuur Merck10043-35-3
BsaI-HF v2NEBR3733S
Calciumchloride hexahydraatACROS ORGANICS7774-34-797 %, extra puur 
CeldichtheidmeterHarvard Biochrom 80211630
ChemiDoc MP Biorad12003154
ChloroformVWR650498
CuvettesSarstedt67.742
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma AldrichD4540
Di-natriumwaterstoffosfaatneoFroxx GmbH7558-79-4farma kwaliteit
Verwijderbare glazen Pasteur PipettesVWR612-1702230 mm
DNase I Roche471672800110 U/µL
dNTP-mix (10 mM elk dNTP) Sigma-Aldrich72004
DS_SPcas_ModAIntern product.https://github.com/MaikTungsten/CRISPRT4/tree/main/Plasmid_mapsPlasmidiscconstruct dat CRISPR-Cas12/ModA sgRNA bevat
DS-spCas (CRISPR-Cas9 systeem)Addgene 48645 (addgene accessoirenummer)Plasmidisc voor de constructie van spacerbevattende CRISPR-Cas plasmidiscs (CRISPR-Cas9 systeem) voor faamutagenese (stap 3.2)
E. coli B Strain Stam werd gebruikt voor T4 infectieDSMZgeen catalogus  nummerEscherichia coli (Migula 1895) Castellani en Chalmers 1919 (DSM 613, ATCC 11303)
E. coli BL21 (DE3) Expressiestam, competente celInvitrogenC600003Expressiestam, competente cellen.
E. coli DH5α Cloning stam, competente cellenInvitrogen18265017Cloning stam, competente cellen. 
EDTARoth8043.2
Ethanol (absoluut) VWR200-578-6
Flongle Flow CellOxford Nanopore Technologiesgeen catalogus  nummerR10.4.1. chemie, https://nanoporetech.com/document/flongle
Gene JET Plasmid Miniprep Kit Thermo Fisher Scientific 10242490
GeneRuler 1 kb Plus DNA ladderThermo Fisher Scientific SM1331
GeneRuler ULR DNA ladder Thermo Fisher Scientific SM1213
Gradient Master 108BIOCOMPgeen catalogus  nummerhttps://biocompinstruments.com/our-approach/gradient-forming
Heraeus Pico 17 CentrifugeThermo Scientific75002410
Infors HT Incubator MinitronInfors AGgeen catalogus  nummerhttps://infors-ht.com/de/produkte/inkubationsschuettler/minitron#productspecs
Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)Sigma-Aldrich367-93-1
KanamycineCarl RothT832.1
LB-AgarCarl-RothX969.1
LB-medium (Luria/Miller) Carl-RothX968.1
Magnesiumchloride hexahydraat Sigma-Aldrich7791-18-6
Magnesiumsulfaat Sigma-Aldrich7487-88-9
MinION apparaat Oxfrod Nanopore Technologiesgeen catalogus  nummerhttps://store.nanoporetech.com/eu/minion.html
ModA E165A_fwIDTGAATTAGTTTCAGATGA
ACAAGCGGTAATGATAC
CAGCT		Voorwaartse primer voor het introduceren van puntmutatie voor ModA E165A en om sticky ends te introduceren voor Golden Gate Cloning (Stap 3.1)
ModA E165A_revIDTCATATTACGATAACGA
TGACTATCCGGAAAC		Omgekeerde primer voor het introduceren van puntmutatie voor ModA E165A en om sticky ends te introduceren voor Golden Gate Cloning (Stap 3.1)
ModA_sgRNA_Cas12_fwIDTTCTTGTTCATCTACAAC
AGTAGAAATTAATTTAAA
GTTCTTAGACCCG		Voorwaartse primer voor het genereren van spacer voor CRISPR-Cas12/ CRISPR-Cas9/ CRISPR-Cas13 systemen voor faamutagenese en tegenselectie (stap 3.2 en stap 4.1)
ModA_sgRNA_Cas12_revIDTAGTAATGATAAAGAACT
TTAAATAATTTCTACTGT
TGTAGATGCTAC		Omgekeerde primer voor het genereren van spacer voor CRISPR-Cas12/ CRISPR-Cas9/ CRISPR-Cas13 systemen voor faamutagenese en tegenselectie (stap 3.2 en stap 4.1)
NanoDrop ND-1000 Spectrofotometer Thermo Fisher ScientificAZY2019944
NucleoMag Kit Machery NagelREF 744970.50
Nucleoside digestie mix New England BiolabsM06

Referenties

  1. Pozhydaieva, N., et al. Temporal epigenome modulation enables efficient bacteriophage engineering and functional analysis of phage DNA modifications. PLoS Genet. 20 (9), e1011384(2024).
  2. Schroven, K., Aertsen, A., Lavigne, R. Bacteriophages as drivers of bacterial virulence and their potential for biotechnological exploitation. FEMS Microbiol Rev. 45 (1), fuaa041(2021).
  3. Moye, Z. D., Woolston, J., Sulakvelidze, A. Bacteriophage applications for food production and processing. Viruses. 10 (4), 205(2018).
  4. Wolfram-Schauerte, M., Pozhydaieva, N., Viering, M., Glatter, T., Hofer, K. Integrated omics reveal time-resolved insights into T4 phage infection of E. coli on proteome and transcriptome levels. Viruses. 14 (11), 2502(2022).
  5. Usman, S. S., Uba, A. I., Christina, E. Bacteriophage genome engineering for phage therapy to combat bacterial antimicrobial resistance as an alternative to antibiotics. Mol Biol Rep. 50 (8), 7055-7067 (2023).
  6. Vlot, M., et al. Bacteriophage DNA glucosylation impairs target DNA binding by type I and II but not by type V CRISPR-Cas effector complexes. Nucleic Acids Res. 46 (2), 873-885 (2018).
  7. Tao, P., Wu, X., Tang, W. C., Zhu, J., Rao, V. Engineering of bacteriophage T4 genome using CRISPR-Cas9. ACS Synth Biol. 6 (10), 1952-1961 (2017).
  8. Mohanraju, P., et al. Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems. Science. 353 (6299), aad5147(2016).
  9. Zemach, A., McDaniel, I. E., Silva, P., Zilberman, D. Genome-wide evolutionary analysis of eukaryotic DNA methylation. Science. 328 (5980), 916-919 (2010).
  10. Hashimoto, H., et al. Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA. Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).
  11. Shitrit, D., et al. Genetic engineering of marine cyanophages reveals integration but not lysogeny in T7-like cyanophages. ISME J. 16 (2), 488-499 (2022).
  12. Dedrick, R. M., et al. Engineered bacteriophages for treatment of a patient with a disseminated drug-resistant Mycobacterium abscessus. Nat Med. 25 (5), 730-733 (2019).
  13. Marinelli, L. J., et al. BRED: a simple and powerful tool for constructing mutant and recombinant bacteriophage genomes. PLoS One. 3 (12), e3957(2008).
  14. Adler, B. A., et al. Broad-spectrum CRISPR-Cas13a enables efficient phage genome editing. Nat Microbiol. 7 (12), 1967-1979 (2022).
  15. Pozhydaieva, N., Höfer, K. Utilizing Golden Gate assembly to streamline CRISPR-Cas/NgTET-based phage mutagenesis. Methods Mol Biol. 2850, 329-343 (2025).
  16. Ramírez Rojas, A. A., et al. DuBA.Flow─a low-cost, long-read amplicon sequencing workflow for the validation of synthetic DNA constructs. ACS Synth Biol. 13 (2), 457-465 (2024).
  17. Lagerbäck, P., et al. Bacteriophage T4 endonuclease II, a promiscuous GIY-YIG nuclease, binds as a tetramer to two DNA substrates. Nucleic Acids Res. 37 (18), 6174-6183 (2009).
  18. Lagerbäck, P., Carlson, K. Amino acid residues in the GIY-YIG endonuclease II of phage T4 affecting sequence recognition and binding as well as catalysis. J Bacteriol. 190 (16), 5533-5544 (2008).
  19. Shembrey, C., et al. Principles of CRISPR-Cas13 mismatch intolerance enable selective silencing of point-mutated oncogenic RNA with single-base precision. Sci Adv. 10 (51), eadl0731(2024).
  20. Molina Vargas, A. M., et al. New design strategies for ultra-specific CRISPR-Cas13a-based RNA detection with single-nucleotide mismatch sensitivity. Nucleic Acids Res. 52 (2), 921-939 (2024).
  21. Shi, P., Wu, X. Programmable RNA targeting with CRISPR-Cas13. RNA Biol. 21 (1), 1-9 (2024).
  22. Levin, B. R., et al. The population and evolutionary dynamics of phage and bacteria with CRISPR-mediated immunity. PLoS Genet. 9 (3), e1003312(2013).
  23. Hershey, A. D., Chase, M. Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage. J Gen Physiol. 36, 39-56 (1952).
  24. Bair, C. L., Rifat, D., Black, L. W. Exclusion of glucosyl-hydroxymethylcytosine DNA containing bacteriophages is overcome by the injected protein inhibitor IPI. J Mol Biol. 366 (3), 779-789 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

NgTET dioxygenasegenoomredigering van fagenDNA modificatiessite specifieke mutagenesebacteriofaag engineeringGolden Gate cloneringplaque assayE coli T4 faag

Gerelateerde artikelen