Evaluatie van bladreacties op microbiële secundaire metabolieten met behulp van een high-throughput formaat

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een high-throughput benadering voor het evalueren van plantionenlekkage, peroxidaseactiviteit en calloseproductie in hetzelfde monster.

Samenvatting

Microben scheiden tijdens plantinfectie structureel diverse secundaire metabolieten af, waarvan sommige door plantcellen worden gedetecteerd, wat stressreacties veroorzaakt. Bij deze methode wordt de inductie van ionenlekkage, peroxidaseactiviteit en calloseproductie gemeten in hetzelfde bladschijfmonster. Ten eerste worden Arabidopsis- of gerstbladschijven vacuüm geïnfiltreerd in een 96-put plaat. Na 4-6 uur wordt geleidbaarheid gemeten, gevolgd door peroxidaseactiviteit en callose-depositie na 24 uur. Het flg22-peptide induceert alle drie de reacties en is een betaalbare positieve controle. Surfactine en gramilline cyclische lipopeptiden induceren respectievelijk peroxidaseactiviteit en ionenlekkage, terwijl het fytogiftige T-2 trichotheceen de peroxidaseactiviteit onderdrukt. Al met al maakt deze aanpak meerdere vergelijkingen mogelijk tussen plantengenotypen of metabolietbehandelingen. Deze benadering kan worden toegepast op chemische genetica of bioprotectie om stressmodulerende verbindingen te identificeren voor verder onderzoek. In de plantgenetica kan deze benadering worden gebruikt om reacties tussen plantenpopulaties te vergelijken voor genetische mapping en om ons begrip van interacties tussen plant en microben te verbeteren.

Inleiding

Planten reageren op diverse microbiële moleculen om cellulaire stressreacties te activeren, wat kan leiden tot ziekteresistentie. Microbe-geassocieerde moleculaire patronen (MAMP's), zoals het flg22-peptide uit bacteriële flagelline, worden door plantreceptoreiwitten gedetecteerd om een aantal cellulaire signaalresponsen te initiëren. Deze omvatten vroege responsen zoals kinasecascades, productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), calciumpieken, membraandepolarisatie en late reacties zoals callose-afzetting en peroxidaseactiviteitsinductie¹. Microbiële secundaire metabolieten (MSM's) zijn klein (50-1.500 Dalton), structureel diverse moleculen die overzichtelijk zijn voor groei en ontwikkeling, maar het overleven van de microbe bevorderen. Sommige MSM veroorzaken cellulaire stressreacties bij planten, hoewel de mechanismen die deze reacties initiëren nog onopgelost^{zijn 2,3}. Voorgestelde mechanismen voor plantherkenning van MSM zijn onder andere mechanosensing, door redox geïnduceerde eiwitmodificaties of lipide-gebaseerde signalering ^4,5. In sommige gevallen veroorzaakt MSM stressreacties of cellulaire schade, afhankelijk van de concentratie. Zo induceert het T-2-toxine callose en ROS-productie bij 1 μM en celdood bij 10 μM, en wordt het doorgaans beschreven als een fytotoxine⁴. MSM's beïnvloeden de pathogenese in sommige interacties tussen plant en microben en kunnen ofwel plantengevoeligheid of resistentie veroorzaken. Zo induceert het gramilline cyclisch lipopeptide ROS-productie, ionenlekkage en calloseproductie, terwijl het de gevoeligheid voor gerst voor Fusarium graminearum² verhoogt. De cyclische lipopeptiden syringomycine en syringopeptin induceren de productie van plant-ROS en bevorderen gastheerresistentie tegen de Pseudomonas fluorescens-bacterie ³. Andere MSM, zoals surfactine en iturine, worden geproduceerd door niet-pathogene microben en bevorderen resistentie tegen daaropvolgende infectie door plantenstressreacties^{op te} wekken ^6,7. Deze bioprotectieve MSM induceren cellulaire reacties, waaronder ionenfluxen, ROS-productie, transcriptionele veranderingen en calloseproductie⁸. Het begrijpen van interacties tussen MSM en planten kan helpen om de rol van MSM in ziekteresistentie te bepalen en gastheergenen te identificeren die kunnen worden ingezet om de gewasresistentie te verbeteren.

Huidige methoden om MSM-geïnduceerde stressresponsen van de installatie te evalueren, houden doorgaans in dat één stressrespons tegelijk wordt getest⁸. Aangezien secundaire MSM moeilijk te extraheren kan zijn en er een beperkte hoeveelheid metaboliet beschikbaar kan zijn, kan het testen op meerdere responsen binnen hetzelfde monster geruststelling bieden dat de MSM effect heeft op plantcellen. Een methode met hoge doorvoer om apoplastische ROS-uitbarstingen te evalueren is het detecteren van luminescentie die wordt opgewekt door geoxideerde luminol in aanwezigheid van mierikswortelperoxidase⁹. Helaas wordt de luminol-gebaseerde luminescentie gedempt door kationen en sommige oplosmiddelen, waardoor het gebruik van deze assay beperkt wordt voor extracten die zouten bevatten of voor niet-polaire moleculen die in DMSO moeten worden opgelost, waardoor een methode nodig is die met deze verontreinigingen^{werkt 9}. Om deze problemen aan te pakken, hebben we de huidige methoden uitgebreid om drie stressreacties (ionenlek, peroxidase-activiteit en eelt) van hetzelfde bladmonster te evalueren in een high-throughput assay (Figuur 1)10,11,12. Onze aanpak omvat het behandelen van bladschijven met MSM's met behulp van vacuüminfiltratie in een plaat met 96 putten. Vervolgens worden geleidbaarheidsmetingen uitgevoerd 4-6 uur na behandeling om ionenlekkage te evalueren, gevolgd door peroxidaseactiviteit en callose-depositiemetingen na 24 uur. Onze aanpak is geoptimaliseerd voor Arabidopsis en gerst, maar kan met experimentele validatie worden uitgebreid naar andere plantensoorten. Zo is geïnduceerde gerstperoxidase-activiteit met deze methode niet detecteerbaar, maar onderdrukking van activiteit door giftige verbindingen kan worden waargenomen. Daardoor variëren bladkenmerken of de amplitude van de geïnduceerde respons tussen soorten, wat de toepasbaarheid van deze benadering op sommige plantensoorten beperkt.

Experimenteel ontwerp met deze methode moet rekening houden met de controles, replicatie en concentratie van MSM die worden gebruikt om de beste resultaten te garanderen. Een negatieve controle is essentieel om MSM's te identificeren die statistisch verschillende niveaus van stressrespons induceren in vergelijking met de effecten van verwonding. Idealiter zou de negatieve controle hetzelfde oplosmiddel bevatten als de MSM, maar dan zonder MSM. Typische oplosmiddelen voor hydrofobe MSM zijn DMSO en methanol, die cellulaire reacties opwekken zoals ROS-productie bij hoge concentraties ^13,14. In deze assay zien we een effect op peroxidaseactiviteit, waarbij 10% of hoger DMSO en methanol de activiteit van de peroxidase-activiteit door flg22 blokkeren (Figuur 2). In het geval van complexe extracten kan het moeilijk zijn om een negatieve controle te ontwikkelen zonder MSM wanneer de metabolieten van belang onbekend zijn. In plaats daarvan zou het fractioneren van de extracten op basis van grootte, polariteit of lading relatieve vergelijkingen tussen fracties mogelijk maken om de meest spanningsveroorzakende fractie voor verdere analyse te identificeren. Daarnaast zorgt het opnemen van een positieve controle, zoals 1 μM flg22 of 10 μM T-2 toxine, ervoor dat de onderzoeker kan beoordelen of de assay werkt. We raden aan om vier technische replica's per behandeling te nemen en positieve en negatieve controles in elke plaat te verwerken wanneer meerdere platen binnen een experiment worden gemeten.

Al met al vangt deze aanpak drie door MSM veroorzaakte stressreacties van planten, waarmee een toegankelijke en kosteneffectieve methode wordt geboden om interacties tussen planten en MSM te onderzoeken. Het high-throughput formaat stelt onderzoekers in staat subtiele verschillen tussen plantengenotypen of microbiële extracten binnen dezelfde experimentele eenheid vast te leggen. Dit maakt systeemniveaubenaderingen mogelijk om plantengenenfamilies te begrijpen of plantenpopulaties te onderzoeken voor genetische mapping. Aan de microbekant kan deze benadering worden gebruikt om te screenen op potentiële bioprotectieve verbindingen of in chemische genomica om verbindingen te identificeren die specifieke stressreacties versterken of onderdrukken.

Protocol

1. Monstervoorbereiding en behandeling

OPMERKING: Alle juiste veiligheidsmaatregelen en verwijderingspraktijken moeten worden genomen om het risico voor de onderzoeker en het milieu te minimaliseren.

1. Plantenteelt
   1. Kweek Arabidopsis tot het 4-5 weken oude stadium op een Cornell-grondmengsel (300 veenmos: 630 vermiculiet: 1 langzaam vrijgevende meststof: 4,2 kalk) met twee planten per pot in 24 potten per tray. Geef de planten water naar behoefte van onderaf door water toe te voegen aan de bak. Stel de groeikameromstandigheden continu in op 21 ^°C met 16 uur licht en 8 uur donker, en houd ongeveer 30-50% luchtvochtigheid. Gebruik de 5-9e^volledig uitgezet bladeren voor experimenten en oogst 's ochtends.
   2. Kweek gerst totdat het eerste en tweede echte blad volledig zijn uitgezet in 75 potgrond: 24 zwarte aarde: 1 kalkgrondmengsel. Plant één zaadje per pot in 24 percelen per tray, en geef water wanneer nodig. Stel de groeikameromstandigheden in op 21 ^°C met 16 uur licht en 8 uur donker bij ongeveer 30-50% luchtvochtigheid. Proef de eerste en tweede volledig uitgestrekte bladeren en oogst 's ochtends.
2. Verzamel drie bladschijven per plant met een kurkboorder van 4 mm diameter, waarbij je de middenader vermijdt. Vermijd het macereren van het weefsel door een scherpe boorder met een draaiende beweging te gebruiken.
3. Plaats onmiddellijk en voorzichtig de bladschijven in een put van een 96-putplaat in 196 μL steriel Milli-Q H₂O. Blijf schijven verzamelen totdat het vereiste aantal monsters is verzameld.
4. Voeg secundaire metabolieten of oplosmiddelbehandelingen toe aan de gewenste concentratie aan een eindvolume van 200 μL in individuele putten.
5. Plaats de 96-well-plaat met het deksel eraf in een bell jar met een vacuümmond.
6. Bevestig de vacuümslang aan de nozzle van de bell jar en zet de vacuümdruk aan tot de vacuüm 9,8 pond per vierkante inch bereikt (meestal 10 seconden). Herhaal dit proces nog een keer zelf.
7. Plaats het deksel op de plaat en incubeer op een orbitale shaker (55 rpm) onder licht (13 W, 50 μmol∙^m-2∙^s-1) geplaatst 23 cm boven de shaker gedurende 4 uur.

2. Metingen van ionenlekken

1. Was de sonde met Milli-Q water en dep zachtjes op Kimwipe om te drogen. Let ter referentie op de geleidingskracht van het water.
2. Na 4-6 uur na behandeling wordt de geleidbaarheid van individuele putten bemonsterd en geregistreerd door de sonde onder te dompelen in de vloeistof rondom de bladschijf. Houd de plaat onder een hoek van 45° om ervoor te zorgen dat de sonde volledig is geemerd.
3. Spoel de sonde tussen de monsters door onder te dompelen in Milli-Q water en droog te deppen op een Kimwipe. Test af en toe de geleidbaarheid van het water om te zorgen dat de metingen van de sonde stabiel blijven.
4. Plaats een plastic afdichtingsfilm op de plaat en breng hem terug naar de orbitale shaker voor de incubatie gedurende de nacht.

3. Peroxidase-activiteitsmetingen

1. Bereid het peroxidasesubstraat dagelijks vers voor als een oplossing van 50 mL. Verhit 40 ml gedestilleerd steriel water tot 70 ^°C in een beker met een roerbeker en los 50 mg 5-aminosalicylzuur (1 mg/mL) op in het verwarmde water. Voeg water toe tot 50 mL en stel de pH bij op 6 met NaOH. De oplossing is lichtgevoelig, dus bedek het met aluminiumfolie of gebruik een amberkleurige buis.
2. In een 50 mL amberkleurige conische buis maak je een 1% H₂O_{2 oplossing} door 1,7 mL van 30% H₂O_{2 toe} te voegen aan 48,3 mL Milli-Q H₂O.
3. Voeg direct voor de assay 10 μL van de 1% H₂O_{2 oplossing} per milliliter 5-aminosalicyloplossing toe die nodig is voor de assay om het assaymedium te genereren.
4. Om de behandelde bladschijven te bemonsteren, neem je 50 μL uit elke put op het gewenste tijdstip. Breng over op een heldere, platbodemplaat met 96 putten en voeg 50 μL van het assaymedium toe, waarbij je 5x pipetteert door te mengen.
5. Incubeer de reactie op kamertemperatuur gedurende 3 minuten en stop de reactie door 20 μL 2 N NaOH toe te voegen, waarbij je zachtjes tikt om te mengen.
6. Meet de absorptie van de putten bij 595 nm in een plaatlezer.

4. Callose-beeldvorming en beeldanalyse

1. Na het bemonsteren van de putten voor de peroxidase-assay, verwijder je de resterende vloeistof uit de putten en voeg je 100 μL van een azijnzuur:ethanol (1:3)-oplossing toe voor fixatie en ontkleuring. Plaats een deksel op de plaat en incubeer de plaat op een shaker (60 rpm) in een dampkap gedurende 24 uur op kamertemperatuur.
2. Vervang de ontkleuringsoplossing door een verse oplossing en incubeer nog eens 24 uur op kamertemperatuur.
3. Pipette de ontkleuringsoplossing en voeg 100 μL 150 mM K₂HPO₄ toe aan elke put. Leg het bord op de shaker en laat het 30 minuten op kamertemperatuur incuberen.
4. Verwijder de K₂HPO₄ wash-oplossing en voeg 100 μL van 150 mM K₂HPO₄ toe met 0,1 mg/mL anilineblauw. Bedek de 96-put plaat met een deksel en aluminiumfolie en laat ze minstens 2 uur (Arabidopsis) of een nacht (gerst) op een shaker incuberen.
   OPMERKING: anilineblauw is lichtgevoelig en moet voor elke technische replica vers worden gemaakt.
5. Verwijder de anilineblauwe oplossing en vervang met 50% glycerol. Bedek de 96-wells platen met aluminiumfolie en bewaar ze bij 4 °C tot ze klaar zijn om te fotograferen.
6. Doe een druppel glyceroloplossing van 50% op een schoon glazen glaasje. Pak voorzichtig een bladschijf met een pincet en plaats deze met de abaxiale kant naar boven op de slide. Bedek met een deklaag van 1,5 om luchtbellen te minimaliseren, en voeg indien nodig extra 50% glycerol toe om onder de dekfolie te vullen.
7. Breng het bladmateriaal scherp in beeld met doorgegeven wit licht (helder veld) onder een 20x droge objectieflens.
8. Selecteer de excitatiegolflengte tot 370 nm en de emissiegolflengte tot 509 nm voor anilineblauwe beeldvorming en stel een belichtingstijd in. Optimaliseer de belichtingstijd om voldoende signaal te bieden, maar voorkom oververzadiging van pixels. Voor kwantitatieve vergelijking van beelden moet ervoor gezorgd worden dat de laserintensiteit en belichtingstijd consistent zijn voor alle biologische replicaten, behandelingen en technische replicata.
9. Selecteer voor elke bladschijf drie verschillende gezichtsvelden en neem afbeeldingen voor elk met behulp van de parameters die in stap 4.8 zijn ingesteld. Maak alle beelden met plantaardig materiaal dat het gezichtsveld volledig vult met minimale achtergrondgebieden (niet-plantmateriaal). Maak beelden op één z-vlak op het bladoppervlak.
   OPMERKING: Enige achtergrond kan onvermijdelijk zijn en kan in latere beeldkwantificatiestappen worden gecorrigeerd. In dit voorbeeld worden beelden gemaakt met een rechtopstaande epifluorescentiemicroscoop met een kwiklamp en de DAPI-filterkubus (excitatie 360/40 nm, emissie 460/50 nm). In gevallen waarin geen kwiklamp beschikbaar is, kan een LED-lichtbron met meerdere golflengtes worden gebruikt.
10. Om callose-vlekken uit afbeeldingen te kwantificeren, download en installeer je de gratis beschikbare FIJI-beeldverwerkingssoftware met behulp van de online instructies op https://imagej.net/Fiji/Downloads. Open FIJI en importeer de anilineblauwe afbeeldingen voor analyse. Voor deze analyse gebruik je .tiff bestanden met een resolutie van minstens 300 dpi. Exporteer afbeeldingsbestanden in .tiff formaat met de microscoopsoftware vóór analyse, of laat FIJI de bestanden openen.
    OPMERKING: Fiji kan de meeste propriëtaire bestandstypen openen (bijv. .czi, .nd2, .lif, .vsi).
11. Stel de schaal in op de afbeelding (klik op Analyseren | Stel Schaal in), met behulp van de afstandswaarden uit de microscoopopstelling.
12. Converteer de afbeelding naar een 32-bits grijswaarden afbeelding (klik op Afbeelding | Type | 32 bit).
13. Pas de drempel aan (klik op Afbeelding | Aanpassen | Drempel) om alleen het fluorescentiesignaal op te nemen dat anilineblauwe kleuring vertegenwoordigt door op Auto te klikken en vervolgens handmatig de minimum- en maximumwaarden op de drempelcurve aan te passen. Zodra de drempel is vastgesteld, klik je op Apply | Converteer naar Masker. Met spreadsheetsoftware schrijf je de geselecteerde drempelparameters voor elke afbeelding op.
    OPMERKING: Door de inherente autofluorescentie van plantmonsters en het verwijderen van het plantweefsel kan de drempel verschillen tussen de monsters. Voor reproduceerbaarheid is het essentieel om de drempel van elke afbeelding vast te leggen en consistent te zijn in het aanpassen van drempelwaarden tussen monsters.
14. Kwantificeer het aantal en de grootte van aniline blauwe puncta met behulp van Deeltjes analyseren (klik op Analyseren | Analyseer deeltjes) met de standaardinstellingen. Voor gemiddelde waarden van alle puncta in de afbeelding, selecteer Samenvatten in het pop-upvak en klik dan op OK.
15. Kopieer en plak deze resultaten uit het Samenvattingsvak in de spreadsheet met de drempelparameters voor verdere analyse. Waarden die in deze kwantificering zijn opgenomen zijn onder andere het aantal (aantal anilineblauwe puncta), het totale oppervlak (het totale oppervlak in eenheden² van anilineblauwe puncta), de gemiddelde grootte (gemiddelde grootte in eenheden² van anilineblauwe puncta), %Oppervlakte (percentage van de gemiddelde dekking in eenheden² van anilineblauwe fluorescentie ten opzichte van het totale oppervlak), Omtrek (gemiddelde omtrek van puncta) en IntDen (indicatie van fluorescentieintensiteit van anilineblauwe kleuring).
16. Herhaal stappen 4.11-4.15 voor alle beelden die tijdens het experiment zijn gemaakt. Wanneer je een drempelbeeld van FIJI sluit, selecteer dan Niet opslaan om te voorkomen dat je de ruwe dataafbeelding verandert naar het drempelmasker.
17. Als afbeeldingen een gebied met een niet-plantachtergrond bevatten, meet dan het oppervlak van het plantweefsel door handmatig het plantenweefselgebied te omlijnen met de Polygon- of Freehand-selectietools en het Gebied te meten (klik op Analyseren | Meet). Kopieer deze waarde in de spreadsheet voor elke afbeelding.
18. In een spreadsheet gemiddeld je de waarden van de drie gezichtsveldafbeeldingen van één biologische replicatie. Als sommige afbeeldingen uit het experiment geen plantoppervlak bevatten (zie stap 4.17), corrigeer dan alle waarden op basis van het oppervlak van plantweefsel in elke afbeelding. Deel bijvoorbeeld de Count-waarde door het oppervlak van plantweefsel voor elke afbeelding voordat je grafieken maakt en statistische vergelijkingen maakt.

5. Data-analyse

1. Evalueer de kwaliteit van het experiment door positieve controles te vergelijken met negatieve controles binnen dezelfde plaat met behulp van een t-test. Als de positieve controles geen significante veranderingen in stressreacties veroorzaakten, herevalueer dan experimentele omstandigheden zoals de gezondheid van de planten, het tijdstip van behandeling, de negatieve controle en de mogelijke achteruitgang van de MSM's.
2. Significantietesten
   1. Als alle technische replica's van een behandeling binnen dezelfde plaat worden geëvalueerd, analyseer dan de verschillen tussen individuele behandelingen en de negatieve controle met standaard statistische benaderingen zoals een eenrichtings-ANOVA met een Tukey-test.
   2. Als technische replica's van een behandeling over meerdere platen worden geëvalueerd, normaliseer dan elk monster ten opzichte van de negatieve controle om de invloed van plaat-op-plaat-fouten te minimaliseren. Deel elke waarde door het gemiddelde van de negatieve controlemonsters binnen dezelfde plaat. Onderwerp de genormaliseerde waarden aan standaard statistische methoden.

Resultaten

Met deze methode kan men bepalen of een MSM een subset van de cellulaire stressreacties van planten activeert. De resultaten van deze assay leveren kwantificatie van peroxidaseactiviteit, ionenlek en calloseproductie om te bepalen of een MSM verschillende responsen induceert in vergelijking met een negatieve controle. Een positief resultaat voor een verbinding zou worden aangegeven door een significant verschil met de negatieve controle, zoals getoond voor de gramilline-ionofoor, die ionenlekkage en calloseproductie induceert (Figuur 3)². Het opnemen van een positieve controle, zoals 1 μM flg22, die alle drie de responsen induceert, zorgt voor intacte plantprestaties en experimentele omstandigheden (Figuur 3)^11,15. Gramilline en flg22 zijn opgelost in water, terwijl het hydrofobe surfactine en T-2-toxine in DMSO zijn opgelost. Om hydrofobe moleculen te bereiden, bereiden we eerst een 10 mM voorraad in DMSO. Deze kolf wordt gebruikt om een uiteindelijke concentratie van 10 μM in Milli-Q water te creëren voor bladbehandeling, dat 0,1% DMSO bevat. Surfactine (10 μM) induceert peroxidaseactiviteit en callose, terwijl het T-2-toxine (10 μM) de peroxidase-activiteit onderdrukt en de productie van callose induceert, waarschijnlijk door celdood ^2,6,16. Het gebruik van water of 0,1% DMSO als negatieve controles is geschikt voor de aangegeven behandelingen, aangezien beide controles vergelijkbare resultaten geven (Figuur 2).

In onze voorlopige screenings van 100 commercieel verkrijgbare MSM zien we callose-inductie voor de meeste onderzochte verbindingen (>70%), terwijl ionenlekkage en peroxidase-activiteit door minder verbindingen worden veroorzaakt (30% en 35%). De meerderheid van deze verbindingen wordt geproduceerd door Fusarium-soorten , waaronder zeven verschillende trichothecenen zoals deoxynivalenol (DON) en T-2-toxine. Hoewel verdere replicatie gaande is om deze resultaten te bevestigen, wijzen ze op vergelijkbare trends als bij onze positieve controles (Figuur 3), waarbij callose werd geïnduceerd door alle behandelingen en ionenlekken of peroxidase door sommige, maar niet alle behandelingen, werd getriggerd.

Figuur 1: Overzicht van de procedure om MSM-geïnduceerde cellulaire responsen in bladeren te evalueren. Bladschijven worden geplaatst in een plaat met 96 putjes die de behandelingen van belang bevat, en de schijven worden vacuümgeïnfiltreerd. Elke plaat bevat vier replica's van een negatieve controle (water met oplosmiddel) en een positieve controle (flg22 of T-2 toxine). Na 4-6 uur wordt de geleidbaarheid van de vloeistof rondom de bladschijf gemeten als een kwantificering van ionenlekkage. Na 24 uur wordt de peroxidaseactiviteit gekwantificeerd met een colorimetrische test met de vloeistof rondom de bladschijf, en wordt de bladschijf ontkleurd en verwerkt voor callose-kwantificering. Afkorting: MSM = microbieel secundair metaboliet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Het effect van het oplosmiddel op door flg22 geïnduceerde ionenlekkage of peroxidaseactiviteit. Vier replicate Arabidopsis-monsters werden behandeld met 1 μM flg22 gecombineerd met DMSO of methanol (0, 0,01, 0,1, 1, 10%). Staafdiagrammen tonen de gemiddelde geleidbaarheid van het monster na 4 uur of de peroxidaseactiviteit (OD₆₀₀) na 24 uur na behandeling uit één enkel experiment (n = 4, SD). Het experiment werd twee keer herhaald met vergelijkbare resultaten. Significant verschil met de watercontrole werd bepaald met de t-test en aangegeven met een asterisk (p < 0,05). Afkortingen: DMSO = dimethylsulfoxide; MeOH = methanol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Inductie van ionenlekkage, peroxidaseactiviteit of callose-afzetting in Arabidopsis-bladschijven door microbiële moleculen. Behandelingen omvatten het immunogene, niet-toxische peptide flg22 (1 μM), de cyclische lipopeptiden gramilline en surfactine (10 μM), en het T-2-toxine (10 μM)^2,6. Alle gegevens werden genormaliseerd naar de watercontrole + 0,1% DMSO. Box-and-whisker plots tonen de geleidbaarheid van het monster na 4 uur, de peroxidaseactiviteit (OD₆₀₀) na 24 uur, of het aantal callose-afzettingen na 24 uur uit één enkel experiment (n = 4-16 planten). De boxplots geven een 'x' aan om de waarde van het gemiddelde aan te geven, en de vakjes geven het eerste kwartiel, mediaan en derde kwartiel van behandeling aan. De hoogste en laagste waarnemingen die geen uitschieters zijn, worden aangegeven door de snorharen (>1,5x interkwartielbereik, aangegeven door cirkels). Significant verschil met de waterregeling wordt aangegeven met een asterisk en werd bepaald door eenrichtings-ANOVA met een Tukey-test (p < 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Plantenkoloniserende microbiële gemeenschappen scheiden diverse MSM's af om de vorming van biofilms te bevorderen, concurrerende microben te onderdrukken en de planthost¹⁷ te beïnvloeden. Hoewel sommige MSM's geen invloed hebben op de plant, veroorzaken andere snelle celdood, onderdrukken ze celfunctie of veroorzaken ze plantenresistentie¹⁷. Sommige MSM's beïnvloeden plantresistentie tegen de MSM-producerende microbe, en resistente genotypen kunnen worden geselecteerd op basis van MSM-insensitiviteit ^2,3,18. Andere MSM's induceren systemische resistentie en bieden bescherming tegen microbiële pathogenen, wat in de landbouw is gebruikt om bioprotectieve producten te ontwikkelen die ziekten onderdrukken⁸. Om effectieve en duurzame strategieën voor gewasverbetering te ontwikkelen, is het identificeren van gunstige MSM's en de plantgenen die optimale MSM-responsiviteit mogelijk maken, essentieel.

Het vinden van nuttige MSM's wordt bemoeilijkt doordat deze verbindingen enzymatisch worden geproduceerd, waarbij meerdere enzymen nodig zijn voor het eindproduct². Dit maakt het moeilijk om te bepalen welk gen je moet targeten om de productie van MSM voor genetisch onderzoek af te schaffen. Enzymatische biosynthese resulteert in meerdere structurele variaties van dezelfde MSM met mogelijk verschillende bioactiviteiten¹⁹. Het scheiden en zuiveren van deze MSM's om de bioactieve moleculen te vinden kan tijdrovend of onmogelijk zijn. In sommige gevallen kunnen slechts lage concentraties van individuele MSM's worden gezuiverd, waarbij meerdere rondes zuivering^{vereist 2}. Zodra een bioactief bestanddeel of extract is verkregen, kunnen verschillende benaderingen worden gebruikt om te begrijpen hoe de microbe de plant kan beïnvloeden.

Eerdere inspanningen richtten zich op het monitoren van de impact van MSM op transcriptionele herprogrammering of bioprotectie in modelplanten²⁰. Om MSM-responsen buiten modelplanten te evalueren, zijn high-throughput assays die responsen op diverse MSM's vastleggen en minimale MSM's vereisen potentieel nuttig. Recent onderzoek wijst uit dat ROS-uitbarstingen een veelvoorkomende vroege reactie zijn op MSM's, waaronder gramilline, surfactine, syringomycine en syringopeptine ^2,3,7. Een luminol-gebaseerde assay detecteert de apoplastische ROS-uitbarsting die wordt gegenereerd door peroxidasen en NADPH-oxidasen en is geschikt voor high-throughput tests²¹. Helaas zijn intracellulaire ROS geïnduceerd door MSM's, zoals surfactine, niet detecteerbaar met deze methode⁷. Het kwantificeren van peroxidaseactiviteit biedt een gevoeliger alternatief dan de luminol-gebaseerde assay om de tijdelijke activatie van ROS-producerende enzymen tijdens stress¹¹ te detecteren. Onze observatie dat surfactine peroxidase-activiteit induceert, komt overeen met recent onderzoek waaruit blijkt dat peroxidase-activiteit wordt getriggerd door surfactine en beauvericine in Arabidopsis (Figuur 3)². Daarnaast toonden we aan dat flg22 en de ionofoorgramilline ionenlekkage induceerden, en alle geteste verbindingen, waaronder flg22, T-2-toxine, surfactine en gramilline, callose induceren zoals verwacht (Figuur 3)^2,4,7.

Door meerdere responsen binnen dezelfde steekproef te evalueren, minimaliseren we experimentele variatie in het afzonderlijk beoordelen van elk van deze eigenschappen en maken we correlatie mogelijk voor systeemniveaustudies over stressreacties van planten. Het evalueren van meerdere behandelingen of genotypen binnen dezelfde experimentele eenheid maakt ook populatieniveau fenotypering voor populatiegenetica mogelijk. Zo werd een vergelijkbare benadering gebruikt om een QTL te identificeren die onderliggend is aan de door flg22 geïnduceerde ROS-productie in gerst²². Deze assay kan ook worden gebruikt voor chemische genetische screenings om modulatoren van plantstressreacties te vinden of om potentiële bioprotectieve MSM's uit microbiële extracten te identificeren.

Om te waarborgen dat de experimentele methode werkt binnen het systeem van interesse, moeten onderzoekers de volgende factoren en beperkingen overwegen:

Kwaliteit van het bladweefsel
Zorg ervoor dat het bladweefsel van de plant niet wordt gestrest vóór het oogsten. Tekenen dat planten gestrest zijn verschillen per soort, maar zijn meestal verwelking, vergeling, roodheid, vlekken, overmatig krullen of rollen van bladeren. Het bemonsteren van bladweefsel veroorzaakt verwonding, dus het vermijden van overmatige maceratie van het weefsel vermindert achtergrondfouten door het hanteren.

Plantensoorten
Dit protocol is geoptimaliseerd voor gebruik met gerst en Arabidopsis-bladeren. Gerstbladeren hebben een langere kleuringstijd nodig voor callose dan Arabidopsis, waarschijnlijk vanwege de dikkere cuticulaire was in grassen, wat de hydrofobie verhoogt en de diffusie van behandelingen in het blad²³ beperkt. Dit kan ook deels het ontbreken van peroxidaseactiviteitsinductie met onze methode verklaren, hoewel we onderdrukking van peroxidaseactiviteit door giftige verbindingen konden zien, vergelijkbaar met wat we in Arabidopsis (Figuur 3) hebben gepresenteerd. We hebben geprobeerd het aantal bladschijven per monster te verhogen tot 5, de pH aan te passen naar 5, 6 of 7, het aantal vacuüminfiltraties te verhogen naar 10, en de substraatconcentratie aan te passen of het substraat te veranderen naar guaiacol²⁴. Hoewel we een verhoogde peroxidaseactiviteit zagen bij meer bladschijven en infiltratierondes, bleven de verschillen tussen de negatieve controle en flg22 klein (10% toename bij flg22) of niet significant tussen de experimenten. We weten dat gerst reageert op flg22 door ROS-productie, callose-productie en peroxidase-expressie^25,26 te induceren. In maïswortels vertoonden eiwitextracten MAMP-geïnduceerde peroxidaseactiviteit, wat suggereert dat eiwitextractie nodig kan zijn om de inductie te zien, in tegenstelling tot het detecteren van de eiwitactiviteit die uit bladschijven uitspoelt, zoals in onze assay²⁴ wordt gedaan. In onze analyse induceert verwonding duidelijk peroxidase-activiteit in het negatieve controlemonster, omdat deze activiteit verdwijnt wanneer de cellen sterven door toxine-blootstelling. Het is mogelijk dat de flg22-behandeling dezelfde peroxidasen kan opwekken als verwonding, zodat het lijkt alsof er geen inductie heeft plaatsgevonden. Alternatief kan onze assay niet gevoelig genoeg zijn om subtiele veranderingen te detecteren, of diffunderen de peroxidasen mogelijk niet goed in de oplossing.

Om dit protocol toe te passen op andere plantensoorten, zouden we voorstellen de beschreven methode te gebruiken en Arabidopsis daarnaast als controle op te nemen om te garanderen dat het protocol werkt. Als de peroxidase-activiteit laag lijkt, kan het verhogen van het aantal bladschijven per monster, het verhogen van het aantal vacuüminfiltraties tot 5 of 10, en het proberen van verschillende behandelingen, waaronder andere MAMPs, ionoforen of T-2-toxine, een positief resultaat opleveren.

Negatieve controlebehandelingen
Deze methode is afhankelijk van een effectieve en geschikte negatieve controle voor vergelijkingen. Idealiter bevat een negatieve controle hetzelfde achtergrondoplossing als de MSM-behandeling van interesse, maar zonder MSM. Het achtergrondoplosmiddel zou water zijn of dezelfde invloed hebben op de gemeten spanningen als water. Dit is een praktische aanpak in gevallen waarin de MSM al gezuiverd is en opgelost kan worden in een oplosmiddel naar keuze. Bij het vergelijken van microbiële extracten kan een negatieve controle het bijproduct zijn van gedeeltelijke zuivering van de MSM, die hetzelfde achtergrondmedium bevat maar met een verlaagde MSM-concentratie na fractionering. Of de onderzoeker kan het kweekmedium gebruiken dat wordt gebruikt om het MSM-houdende extract te genereren als negatieve controle. In deze complexere monsters kan de negatieve controle zouten bevatten die de geleidbaarheidsmeting opblazen, of oplosmiddelen kunnen de peroxidase-activiteit onderdrukken (Figuur 2). Om te bepalen of zouten de resultaten van ionenlekken beïnvloeden, kan de onderzoeker de geleidbaarheid van de negatieve controle en het monster testen in afwezigheid van een bladschijf om te bepalen of het monster of het blad veranderingen in geleidbaarheid veroorzaakt. Om te bepalen of oplosmiddelen de peroxidaseresponsen beïnvloeden, kan de onderzoeker flg22 toevoegen aan de negatieve controle en het resultaat vergelijken met flg22 opgelost in water om te bepalen of er een verschil is. Het is mogelijk dat oplosmiddelen, getinte verbindingen of te veel zouten in een negatieve controle de effecten van MSM op de beschreven plantstressreacties kunnen verhullen, en daarom zal deze aanpak niet in alle scenario's geschikt zijn.

Bemonsteringstijd
Het is belangrijk om 's ochtends met behandelingen te beginnen, omdat opwekbare verdedigingsreacties een circadiane cyclus volgen en de hoogste amplitude hebben vroeg in de ochtend^{27 uur}. Uit onze ervaring veroorzaakt Arabidopsis ionenlekkage als reactie op gramilline sneller (4 uur) dan gerst en maïs (^4-7 uur), en daarom kan een tijdsverloop nodig zijn om experimentele parameters ^2,28 vast te stellen. De celrespons neemt na verloop van tijd af, en we raden aan om stressresponsen niet te testen na 30+ uur na de behandeling.

Concentratie
MSM-concentratie kan een niet-lineaire invloed hebben op het opwekken van stressreacties van planten, wat een fenomeen is dat hormesis²⁰ wordt genoemd. Afhankelijk van de beschikbaarheid en oplosbaarheid van de MSM, zouden onderzoekers idealiter de stressresponsen van de plant testen over een reeks MSM-concentraties. Typische concentraties variëren tussen 100 nM en 1.000 μM als uitgangspunt ^2,11,20.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
5-aminosalicylic acid	Millipore Sigma	A79809
Barnart vacuum pump	Artisan Technology Group	400-3910
COND-905 micro conductivity probe	Lazar Research Laboratories Inc.
flg22 peptide	AnaSpec	AS-62633
Infinite 200PRO F	TeCan Group Ltd.	30190086
Surfactin	Sigma-Aldrich	S3523
T-2 toxin	Cayman Chemical Company Inc	20433