Methodenartikel

Meten van eencelveroudering met een beeldvormingsgebaseerde biomarker van chromatine en epigenetische veroudering

DOI:

10.3791/69057

⸱

30 januari 2026

 ,  ,  , 
1Harry Perkins Institute of Medical Research, QEII Medical Centre and Centre for Medical Research, The University of Western Australia, 2Scintillon Institute

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol presenteert de beeldvormings- en computationele workflow om beeldvormingsgebaseerde chromatine en epigenetische leeftijd (ImAge) te extraheren en te valideren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om gepersonaliseerde zorg te bevorderen en potentiële verjongingsstrategieën te beoordelen, zijn biomarkers die de biologische leeftijd weerspiegelen cruciaal. We hebben imaging-based chromatine en epigenetische leeftijd (ImAge) geïntroduceerd, een imaging-gebaseerde biomarker die is afgeleid van de ruimtelijke organisatie van chromatine en epigenetische markeringen binnen enkele kernen, waarmee intrinsieke leeftijdsgerelateerde veranderingen worden vastgelegd. ImAge vangt en kwantificeert effectief de effecten van interventies die de biologische leeftijd moduleren, met gevoeligheid door significante afnames na verjongingsstrategieën (zoals calorische restrictie en gedeeltelijke herprogrammering via tijdelijke Oct4, Sox2, Klf4 en Myc (OSKM) expressie) en toename na behandelingen zoals chemotherapie. Bovendien correleerde een lagere ImAge met een hogere locomotorische activiteit, wat suggereert dat het functionele verbeteringen vastlegt naast biologische leeftijdsomkering, en een veelbelovend hulpmiddel biedt voor eencelinterventies om levenslangdigheidsinterventies te evalueren. Omdat ImAge een integratieve methode is die goede kwaliteit beeldvorming en nauwgezette computationele analyse vereist, streven wij ernaar grondige begeleiding te bieden om deze te extraheren en te valideren. Dit uitgebreide protocol zal de workflow beschrijven voor zowel natte laboratoriumprocedures (monstervoorbereiding en beeldvorming) als het juiste gebruik van onze open-source computationele pijplijn (omgevingsopstelling en verwerking van de beeldgegevens) om ImAge te extraheren en te valideren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De toenemende gemiddelde levensduur en een vergrijzende wereldbevolking onderstrepen de cruciale noodzaak van effectieve biomarkers van functionele of biologische leeftijd 1,2,3. Deze biomarkers zijn essentieel om het ziekterisico en de levensduur nauwkeurig te voorspellen, wat de geriatrische zorg aanzienlijk kan verbeteren en de bijbehorende kosten kan verlagen. Hoewel DNA-methylatie (DNAm)-klokken aanzienlijke vooruitgang hebben geboekt in het kwantificeren van biologische veroudering 4,5,6, vertrouwen ze vaak op lineaire regressie en vereisen ze grote cohorten, waarbij mogelijk genuanceerde, contextafhankelijke biologische componenten die specifiek zijn voor individuenover het hoofd worden gezien. Bovendien vereisen deze sequencing-gebaseerde technieken cellyse, complexe monstervoorbereiding en dure reagentia per cel, waardoor ze duurder en uitdagender zijn voor hoge-doorvoer, grootschalige of longitudinale studies waarbij monstervernietiging een nadeel is9.

Om deze beperkingen te overwinnen, ontwikkelden we beeldvormingsgebaseerde chromatine en epigenetische leeftijd (ImAge), een nieuwe techniek die veroudering en verjonging bij enkelcelresolutie kwantificeert. Deze techniek werd toegepast en gevalideerd in muisperifere bloed en diverse vaste organen, zoals beschreven door Alvarez-Kuglen et al.1. Deze publicatie beschrijft de geoptimaliseerde protocollen in detail, zodat ze door andere onderzoekers kunnen worden aangepast en toegepast voor diverse toepassingen.

Deze benadering verschilt fundamenteel van traditionele DNAm-klokken doordat ze intrinsieke leeftijdsgebonden trajecten vastlegt op basis van de ruimtelijke organisatie van chromatine en epigenetische markeringen binnen enkele kernen1. Beeldvormingsgebaseerde methoden bieden duidelijke voordelen: ze zijn van nature niet-destructief, wat betekent dat cellen niet worden vernietigd tijdens de verwerking, in tegenstelling tot sequencing-gebaseerde methoden. Deze niet-destructieve aard maakt het cruciaal mogelijk om de ruimtelijke structuur van chromatine en epigenetische markeringen op enkelcelniveau te behouden, waardoor de ruimtelijke context van cellen binnen weefsels behouden blijft—een perspectief dat vaak verloren gaat in conventionele sequencingworkflows. Bovendien zijn beeldvormingstechnieken over het algemeen kosteneffectiever voor grootschalige of longitudinale studies, omdat ze geen dure reagentia of complexe bibliotheekvoorbereiding per cel vereisen, waardoor ze geschikt zijn voor herhaalde waarnemingen over tijd10,11.

Een belangrijk voordeel van ImAge is het vermogen om leeftijdsgerelateerde trajecten als intrinsieke hoofdkenmerken van de data zelf te onthullen, zonder dat er chronologische leeftijdsregressie nodig is. ImAge heeft een sterke correlatie aangetoond met chronologische leeftijd in muis perifere bloed mononucleaire cellen en diverse vaste organen1. Cruciaal is dat ImAge de verwachte verstoringen van biologische leeftijd effectief vastlegt, met een toename na chemotherapie en een afname van calorische restrictie en gedeeltelijke herprogrammering door tijdelijke OSKM-expressie in lever- en skeletspieren. Bovendien zijn ImAge-uitlezingen waargenomen die omgekeerd correleren met de bewegingsactiviteit bij chronologisch identieke muizen, wat hun nut aangeeft bij het meten van aspecten van biologische en functionele leeftijd.

Het implementeren van de ImAge-methodologie vereist expertise in zowel wet-lab experimentele procedures12 als computationele analyses1 (Figuur 1); Daarom biedt dit artikel uitgebreide, stapsgewijze protocollen voor beide aspecten. Dit geoptimaliseerde protocol is bedoeld om de brede adoptie van ImAge te faciliteren, waardoor onderzoekers leeftijdsgebonden veranderingen in chromatine en epigenetische organisatie kunnen onderzoeken bij enkelcelresolutie over verschillende celtypen en weefsels. In dit protocol werden H3K27ac en H3K27me3, twee markers die voldoende contrast en resolutie bieden voor het bepalen van ImAge, geselecteerd als representatieve markeringen. Onderzoekers kunnen dit protocol repliceren om biologische veroudering te kwantificeren, de impact van interventies voor de levensduur beoordelen en de inherente heterogeniteit binnen verouderings- en verjongingsprocessen op individueel organismenniveau onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven worden uitgevoerd volgens richtlijnen en protocollen die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van The Scripps Research Institute (Protocol 09-0004-6). De gegevens die in dit manuscript worden gepresenteerd, zijn verkregen met mannelijke i4F-muizen, die variëren in leeftijd van 2 tot 14 maanden. Organen van belang (lever- en skeletspieren) werden geoogst van 13,8 maanden oude i4F en nestgenoot controlemuizen die 1 week lang behandeld werden met een lage dosis doxycycline (0,2 mg/ml)14. Kernen werden geïsoleerd uit monsters van jonge (3,2 maanden), oudere (13,8 maanden) en oudere mensen behandeld met doxycycline om OSKM-factoren (verouderd-OSKM) te overexpressen.

1. Beeldvorming van monsters

  1. Monstervoorbereiding
    1. Verzamel organen van belang (lever- en skeletspieren) van vers gedissecte muizen (of andere interessante diersoorten) en vries ze snel in met vloeibare stikstof. Bewaar monsters op -80 °C totdat ze klaar zijn om te gebruiken.
    2. Breng organen en weefsels over in een voorgekoelde vijzel en leg ze over droogijs. Giet vloeibare stikstof over het bevroren weefsel en maal met een voorgekoelde stamper. Verpulver het monster met de voorgekoelde vijzel tot een gelijkmatig fijn poeder is verkregen.
    3. Aliquot maalt weefsel met een voorgekoelde metalen spatel in meerdere buizen en bewaart ongebruikte monsters bij -80 °C.
      OPMERKING: Gemalen weefselmonsters in de buisjes kunnen worden opgeslagen bij -80 °C of worden geïsoleerd door de kernen.
    4. Extraheer kernen uit bevroren aliquots met behulp van een commercieel verkrijgbare Nuclei Lysis Buffer kit volgens de instructies van de fabrikant.
    5. Tel kernen met Trypan Blue. Meng kernen en trypan blauw in een gelijke verhouding in een aparte buis. Breng 10 μl van de nuclei-Trypan Blue-oplossing over naar een hemocytometer of een geautomatiseerde celteller.
    6. Verdun monsters in PBS + 0,5% BSA zodat 10.000 kernen kunnen worden verplat in een volume van 20-30 μL/put.
  2. Platingvoorbereiding
    1. Voer alle relevante metadata voor de voorbereiding van het platen en computationele analyse in de Platemap (beschikbaar in Aanvullend Bestand 1). Noteer de voorbeeldidentificaties (bijv. nummers of tekens) in dezelfde indeling als de daadwerkelijke putplaat in het sampleID-tabblad. Noteer experimentele omstandigheden, inclusief de leeftijd van het monster, in dezelfde indeling als de daadwerkelijke putplaat in het conditie-tabblad.
      OPMERKING: De informatie in het conditietabblad wordt gebruikt om de leeftijdsgroep van elke steekproef te identificeren (d.w.z. jong of oud). Deze geïdentificeerde leeftijdsgroepen zullen vervolgens dienen als referenties voor het construeren van het verouderingsmodel (ImAge). Daarom moet het conditietabblad gegevens bevatten die aan leeftijd kunnen worden gekoppeld, samen met andere relevante experimentele omstandigheden indien nodig.
    2. Noteer de doelbiomarkers (bijv. H3K27me3) in dezelfde lay-out als de daadwerkelijke putplaat in het kanaal# (# wordt vervangen door een nummer) tab. Controleer dat alle metadatacombinaties overeenkomen en correct worden weergegeven in één opeenvolgend tabelformaat in het plaatmap-tabblad.
      OPMERKING: Elke kolom in de tabel moet overeenkomen met een aangewezen tabbladnaam (bijvoorbeeld "sampleID"). Er is een extra tabblad met de naam "metadata" beschikbaar om projectdoelstellingen en kleuringsdetails te documenteren; Deze informatie zal niet worden gebruikt in de data-analyse. Gebruik dit tabblad indien nodig.
    3. Exporteer de tab-plaatmap als csv-bestandsformaat met de korte, beschrijvende projectnaam (bijv. project.csv).
      OPMERKING: Het metadata-tabblad biedt een sjabloon om de projectdoelstellingen en immunokleuringsinformatie samen te vatten. Het gebruik van het metadata-tabblad in de Platemap-template is optioneel voor het platingproces zelf. Andere tabbladen, waaronder sampleID, kanaal# (# wordt vervangen door een nummer), zijn echter vereist voor computationele analyse.
  3. Plaat 10.000 kernen/put in een volume van 20 - 30 μL in een putplaat (bijv. platen met 384 putjes). Draaiplaat op 1.000 x g (acceleratie negen, vertraging 4) gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  4. Fixeer met 1:1 volume van 8% paraformaldehyde (PFA) in PBS gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.
    VOORZICHTIG: Voer PFA-stappen uit in een dampafzuigkap en voer afval af volgens de veiligheidsprocedures van de instelling.
  5. Verwijder de oplossing. Voeg 30 μL 0,1 M glycine toe in PBS gedurende 5 minuten op kamertemperatuur. Verwijder de oplossing. Was 2x met 100 μL PBS en voeg 30 μL PBS toe voor opslag.
    OPMERKING: Cellen kunnen worden opgeslagen bij 4 °C of direct worden geïnterpreteerd met immunolabeling.
  6. Immunolabeling
    1. Verwijder PBS. Voeg 30 μL blokkerende oplossing toe (2% BSA en 0,5% Triton X-100 in PBS) en incubeer 1 uur op kamertemperatuur. Verwijder de blokkeringsoplossing.
    2. Voeg 25 μL primaire antilichamen toe: Mouse anti-H3K27ac (1:250) en Rabbit anti-H3K27me3 (1:250) verdund in blokkerende buffer (0,4 - 2 μg/mL). Broed 's nachts uit bij 4 °C.
    3. Verwijder de primaire antistofoplossing. Was 3x met 100 μL PBS gedurende 3 minuten op kamertemperatuur.
    4. Voeg 25 μL secundaire antilichamen toe: Alexa 488 Donkey Anti-Mouse (1:250) en Alexa 555 Donkey Anti-Rabbit (1:250) verdund in blokkeringsbuffer (1 - 10 μg/mL). Incubeer 2 uur op 4 °C of 1 uur op kamertemperatuur.
    5. Was 3x met 100 μL PBS gedurende 3 minuten op kamertemperatuur. Kleur met DAPI/Hoechst in 30 μL concentratie 0,01 mg/mL. Was met 100 μL PBS.
      OPMERKING: Bewaar de plaat op 4 °C in folie of ga direct door met beeldvorming. DAPI/Hoechst is vereist voor de segmentatiestap van de kernen.
  7. Beeldvorming
    1. Beeldcellen op een high-content imager voor maximale resolutie (voor deze dataset werd 20x gebruikt, maar 63x wordt aanbevolen).
      OPMERKING: Hoewel imaging met elke high-content imager kan worden uitgevoerd, gaat dit protocol uit van een vlakke mapstructuur van verworven beelden en een generiek beeldformaat (bijv. .tiff) als de uitvoer van de verworven afbeelding (Figuur 2).
    2. Verzamel meerdere velden per put en meerdere z-stacks, idealiter van boven naar beneden van celkernen. Een dekking van 10 μm samen met de z-as (bijv. 20 z-sneden bij een z-stap van 0,5 μm) bedekt doorgaans de meeste muiscelkernen. De grootte en vereiste dekking hangen af van de soort en de celtypen die geïnteresseerd zijn. Representatieve beeldvorming is weergegeven in Figuur 3.
    3. Stuur de beeldgegevens over naar de computer waar computationele analyse zal worden uitgevoerd, volgens de mappenstructuur zoals weergegeven in Figuur 2.
    4. Voeg het vierkante haakjes-geannoteerde voorvoegsel van de projectnaam, gedefinieerd in stap 1.2.2 hierboven, toe aan de map met afbeeldingsgegevens (bijv. [project]original_folder_name)

2. Computationele analyse van beeldvormingsgegevens

  1. Voorbereiding van systeemsoftwarevereisten (Alleen vereist voor de initiële installatie)
    1. Installeer Windows Subsystem for Linux (WSL) als je op een Windows-machine werkt door de instructies op https://learn.microsoft.com/en-us/windows/wsl/install te volgen. Installeer Anaconda of Miniconda door de instructies op https://www.anaconda.com/docs/getting-started/anaconda/main te volgen
  2. Voorbereiding van computationele omgeving (vereist alleen voor de initiële opstelling)
    1. Download de workflow-scripts van de GitHub-repository https://github.com/terskikh-lab/ImAge_workflow. Pak het gedownloade bestand uit.
      OPMERKING: De gegevensopslaglocatie kan willekeurig worden aangewezen; het wordt echter aanbevolen een map te kiezen die losstaat van de opslaglocatie van het systeembestand (bijvoorbeeld de C-schijf op Windows).
    2. Organiseer de gekloonde ImAge-repository zodat deze overeenkomt met de veronderstelde mapstructuur voor een correcte scriptuitvoering (Figuur 2).
    3. Open de terminal-app als je op Linux of macOS werkt. Open de WSL-app als je op Windows werkt.
    4. Verander de map naar het gekloneerde repositorybestand. Voortaan duidt de term Command: op een instructie om de volgende code te kopiëren en plakken in de terminalapplicatie, gevolgd door het indrukken van de Enter-toets .
      Commando: cd /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY/ImAge-main
      OPMERKING: Vervang "/PATH_TO_CLONED_REPOSITORY" door de gebruikersspecifieke instelling. Bijvoorbeeld, wanneer de repository wordt uitgepakt in de "analysis"-map van de D-schijf en wordt benaderd vanuit WSL, dan wordt dit "/mnt/d/analysis" genoemd.
    5. Maak een nieuwe computationele omgeving aan met Python versie 3.10 met conda (commandoregelapplicatie geïnstalleerd met Anaconda/miniconda).
      Command: conda create -n ImAge_workflow python=3.10
    6. Activeer de nieuw aangemaakte omgeving.
      Commando: conda activeer ImAge_workflow
    7. Installeer poetry (een python-pakketbeheerder) met pip-installer (python-pakketinstaller geïnstalleerd bij het aanmaken van de ImAge_workflow-omgeving).
      Commando: pip install poetry
    8. Installeer vereiste python-pakketten met Poetry.
      Commando: poëzie installeren
      VOORZICHTIG: Zorg ervoor dat de huidige map de ImAge_workflow map is, wat geverifieerd kan worden door een commando: pwd uit te voeren.
    9. Configureer CUDA binnen de Conda-omgeving om grafische verwerkingsunit (GPU) functionaliteit in te schakelen in de segmentatiestap voor snellere berekening (alleen toepasbaar voor Linux of Windows PC met Nvidia GPU).
      Commando: mkdir -p $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d
      echo 'NVIDIA_PACKAGE_DIR=$(dirname $(python -c "import nvidia; print(nvidia.__file__)"))' >> $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d/env_vars.sh
      echo 'for dir in $NVIDIA_PACKAGE_DIR/*; doe if [ -d "$dir/lib" ]; exporteer dan LD_LIBRARY_PATH="$dir/lib:$LD_LIBRARY_PATH"; fi done' >> $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d/env_vars.sh
      OPMERKING: De scripts detecteren automatisch de beschikbaarheid van GPU's op de server. Als er geen GPU's beschikbaar zijn, draait het standaard op de CPU.
  3. Voer berekeningen uit zoals hieronder beschreven.
    OPMERKING: De computationele analyse bestaat uit vier stappen: kernsegmentatie, beeldfeature-extractie, verouderings- (ImAge)-asconstructie en voorspelling van ImAge. Elk proces wordt uitgevoerd met behulp van python-scripts; o1_illumination_correction, o2_segmentation, o3_extract_features en o4_ImAge_validation. Al deze stappen zijn opgenomen in één Python-script, main.py. De geëxtraheerde ImAge-uitlezingen kunnen worden gevisualiseerd met behulp van een doos- en vioolplot zoals gepresenteerd in Figuur 4. De ImAge-uitlezing kan ook worden geëxtraheerd in een eenvoudig tabelformaat (standaard .csv bestandsformaat), waarbij samples als rijen worden weergegeven en bijbehorende uitlezingen en metadata als kolommen. Gebruikers hebben de flexibiliteit om indien nodig aanvullende numerieke analyses uit te voeren op de ImAge-uitlezingen. Deze plots en het CSV-bestand kunnen worden verkregen met één Python-script, visualization.py. Het ImAge-voorspellingsproces maakt gebruik van bootstrapped signalen die worden verkregen van individuele cellen binnen hetzelfde weefsel. Deze bootstrapped signalen zijn gemiddelde signalen afgeleid van willekeurige steekproefneming en herhaalde iteraties. Deze aanpak is erop gericht te zorgen dat de analyse de meest betrouwbare en representatieve uitlezingen vastlegt, waarbij de onzekerheid van de analyse evenredig is aan de inherente heterogeniteit van het weefsel.
    1. Open de terminal-app als je op Linux of macOS werkt. Open de WSL-app als je op Windows werkt.
      Commando: cd /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY/ImAge-main
      VOORZICHTIG: Zorg ervoor dat de huidige map de ImAge_workflow map is, wat geverifieerd kan worden door een commando: pwd uit te voeren.
    2. Activeer de omgeving.
      Commando: conda activeer ImAge_workflow
    3. Configureer de analyseparameters op de workflow/main.py bestand in de code- of teksteditor (bijv. de Kladblok-app, Microsoft Visual Studio Code, enz.).
      1. Stel de projectnaam in de variabele p in op een korte, bestandssysteemveilige identifier die wordt gebruikt om uitvoer te organiseren (bijv. p = brain_3ages_k27me3).
      2. Stel de lijst van kanalen in voor feature-extractie in chs. Voeg het segmentatiekanaal toe als functies van dat kanaal nodig zijn voor de analyse (chs = ['DAPI', 'H3K27me3', 'H3K27ac']).
      3. Kaart afbeeldingskanaalidentificaties van bestandsnamen tot plaatkaartkolommen met imageIndex. Bepaal het kanaallabelformaat dat door het imagingsysteem wordt gebruikt om beeldgegevens te verzamelen en gebruik dat label als sleutel. Map elk label aan de exacte, hoofdlettergevoelige kolomkop in de platemap die in stap 1.2.2 is opgeslagen (bijv. imageIndex = {'1': 'Channel1', '2': 'Channel2', '3': 'Channel3'}).
        VOORZICHTIG: Kolomnamen zijn hoofdlettergevoelig en moeten overeenkomen met je kentekenkaartbestand.
      4. Stel datalocaties in: orgDataLoadPath naar de root-basis van de dataset, orgDataSubFolder naar de afbeeldingsubmap indien nodig, en resultsSavePath naar de output-root.
      5. Bevestig de bestandsnaamextensie in imageFileFormat en bewerk imageFileRegEx om Python-benoemde capture-groepen te gebruiken voor alle benodigde onderdelen: rij, col, veld, zposition en kanaal. Gebruik de volgende syntaxis: (? P\d+), waarbij GROUP wordt vervangen door rij, col, veld, zpositie of kanaal.
        OPMERKING: Werk de regex bij als de bestandsnamen verschillen; Alle genoemde groepen moeten correct parsen. Bijvoorbeeld, de bestandsnaam r01c11f01p01-ch1sk1fk1fl1.tiff moet worden omgezet naar het volgende: r(? P\d+)c(? P\d+)f(? P\d+)p(? P\d+)-ch(? P\d+)sk1fk1fl1\.tiff.
      6. Stel het segmentatiekanaal in segmentation_ch in op het nucleaire kanaal dat wordt gebruikt voor objectdetectie (bijv. segmentation_ch = 'DAPI').
      7. Bepaal of je verlichtingscorrectie wilt gebruiken door illumiCorrection in te stellen. Zet op True om BaSiC-modellen te berekenen en toe te passen; Stel in op False om rawe beelden te verwerken.
        OPMERKING: Voor platen met ≥ 25 putten wordt verlichtingscorrectie aanbevolen om systematische bias te verminderen.
      8. Stel de fysieke voxelgrootte in micrometers in voxel_dim in als [z, y, x]. Gebruik microscoopmetadata om de afstand te bepalen (bijv. voxel_dim = [1,0, 0,6, 0,6]). Sla het bestand op en sluit de editor na het verifiëren van elke parameter
    4. Voer scripts uit om ImAge-uitlezingen te verkrijgen en voer validatie uit. Sluit tijdens het uitvoeren van het script de terminal of de WSL-app niet.
      Commando: Python workflow/main.py
      OPMERKING: Het script (main.py) omvat alle stappen, waaronder segmentatie, feature-extractie, ImAge-asconstructie en standaard voorspelling. Het script genereert een geschatte voltooiingstijd voor elke stap (bijvoorbeeld kernsegmentatie). Elk proces (bijvoorbeeld o1_illumination_correction) genereert tussenbestanden in .pickle-formaat die resultaten van elk proces bevatten. Dit is echter uitsluitend bedoeld voor gegevensoverdracht tussen processen om gestandaardiseerde verwerking te waarborgen en is niet bedoeld voor gebruikersmanipulatie in dit artikel. Toch geldt, als gebruikers deze bestanden moeten manipuleren of adopteren, zie dan de documentatie die bij elke Python-functie is opgenomen voor de datavorm en types13.
    5. Visualiseer resultaten en exporteer ruwe ImAge-uitlezingen voor aanvullende analyse op externe software. Commando: Python workflow/visualization.py
      OPMERKING: Deze stap levert figuren en tabellen van ImAge-uitlezingen op, en de bestanden bevinden zich respectievelijk op fig_o4_ImAge_validation_VIOLIN en export_o4_ImAge_validation (Figuur 2).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Representatieve beelden moeten goed worden gevuld om losse cellen te verkrijgen, maar individuele kernen mogen elkaar niet raken, omdat dit de kwaliteit van de segmentatie van de celkernen zal verminderen. Figuur 3 toont de representatieve beeldvorming om robuuste computationele analyseresultaten te verkrijgen.

De resultaten die in dit methodemanuscript zijn beschreven, zijn aangepast van het ImAge-manuscript door Alvarez-Kuglen e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monstervoorbereiding
Voor de monstervoorbereiding oogst u direct interessante weefsels en vries deze onmiddellijk in vloeibare stikstof. Bij het malen van weefsel met een vijzel kan een siliconen deksel voor de vijzel worden gebruikt om monsterverlies te voorkomen. Voeg meer vloeibare stikstof toe als het weefsel moeilijk te vermalen is. Voor kwetsbaardere weefsels kunnen monsters ook vers (in plaats van ingevroren) worden verwerkt om mechanische verstoring of weefsel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs geven geen belangenconflicten aan.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken alle huidige en voormalige leden van het Terskikh-lab voor hun hulp bij het opzetten van de protocollen en het computationele kader. Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health-subsidies R21 AG068913, R21 AG075483, R21 AG083782 en het Future Health Research and Innovation Fund van het WA Department of Health, BU/PG: 01760/47004300 aan A.V.T.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bovine Serum AlbuminSigma-Aldrich A9647
Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa 488 InvitrogenA-21202
Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa 555InvitrogenA-31572
GlycineBio-Rad161-0718
Histone H3K27ac antibody (mAb) Active Motif39685
Histone H3K27me3 antibody (pAb) Active Motif39155
Hoechst 33342InvitrogenH3570
Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ PrepSigma-AldrichNUC101
Operetta CLS High Content ImagerRevvityhttps://www.revvity.com/au-en/product/operetta-cls-system-hh16000020
Paraformaldehyde 16% Aqueous Solution EM GradeElectron Microscopy Sciences15710-S
PBSThermo FisherAM9624
PhenoPlate 384-well MicroplateRevvity6057302
Triton-XSigmaT8787
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061 

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alvarez-Kuglen, M., et al. ImAge quantitates aging and rejuvenation. Nat Aging. 4, 1308-1327 (2024).
  2. Zampino, M., et al. Biomarkers of aging in real life: three questions on aging and the comprehensive geriatric assessment. GeroScience. 44 (6), 2611-2622 (2022).
  3. Moqri, M., et al. Biomarkers of aging for the identification and evaluation of longevity interventions. Cell. 186 (18), 3758-3775 (2023).
  4. Bell, C. G. DNA methylation aging clocks: challenges and recommendations. Genome Biol. 20 (1), 249(2019).
  5. Horvath, S., Raj, K. DNA methylation-based biomarkers and the epigenetic clock theory of ageing. Nat Rev Genet. 19 (6), 371-384 (2018).
  6. Field, A. E., et al. DNA methylation clocks in aging: Categories, causes, and consequences. Mol Cell. 71 (6), 882-895 (2018).
  7. Galow, A. M., Peleg, S. How to slow down the ticking clock: Age-associated epigenetic alterations and related interventions to extend life span. Cells. 11 (3), 468(2022).
  8. Westneat, D. F., Wright, J., Dingemanse, N. J. The biology hidden inside residual within-individual phenotypic variation. Biol Rev Camb Philos Soc. 90 (3), 729-743 (2015).
  9. Lähnemann, D., et al. Eleven grand challenges in single-cell data science. Genome Biol. 21 (1), 31(2020).
  10. Ninomiya, K. ImAge: quantifying epigenetic ageing with single-cell images. Nat Rev Cancer. 25, 755(2025).
  11. Stepanov, A. I. Genetically encoded epigenetic sensors for visualization of H3K9me3, H3K9ac and H3K4me1 histone modifications in living cells. Biochem Biophys Res Commun. 733, 150715(2024).
  12. Farhy, C., et al. Improving drug discovery using image-based multiparametric analysis of the epigenetic landscape. Elife. 8, e49683(2019).
  13. ImAge_workflow. , https://github.com/terskikh-lab/ImAge_workflow (2025).
  14. Chondronasiou, D., et al. Multi-omic rejuvenation of naturally aged tissues by a single cycle of transient reprogramming. Aging Cell. 21 (3), e13578(2022).
  15. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. J Cell Biol. 189 (5), 777-782 (2010).
  16. The Open Microscopy Environment. , bioformats. https://github.com/ome/bioformats (2025).
  17. González-Ramírez, M., et al. Differential contribution to gene expression prediction of histone modifications at enhancers or promoters. PLoS Comput Biol. 17 (9), e1009368(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Chromatinebiomarkerbepaling van biologische leeftijdisolatie van kernenimmunofluorescentiekleuringcomputationele beeldanalysehistonmodificatieverjongingsstrategie n

Gerelateerde artikelen