Celsubtype-specifieke analyse van neuronaal membraanproteasoom in somatosensorische neuronen

Summary

Het neuronale membraanproteasoom (NMP) werd onlangs geïdentificeerd in een subset van somatosensorische neuronen als een belangrijke regulator van perceptie van aanraking, pijn en jeuk. Dit artikel presenteert een robuuste workflow voor het analyseren van celtype-specifieke NMP-expressie en -functie met behulp van celsortering, transcriptoomprofilering en op cultuur gebaseerde immunofluorescentieanalyses.

Abstract

Sensorische neuronsignalering is afhankelijk van functionele proteasomen en hun subcellulaire lokalisatie beïnvloedt de functie. Een gespecialiseerd proteasoomcomplex, het neuronale membraanproteasoom (NMP), werd onlangs geïdentificeerd in een subpopulatie van perifere somatosensorische neuronen. De NMP lokaliseert uitsluitend in het plasmamembraan van de soma en zowel proximale als distale axonen. Single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) toonde aan dat de NMP onder normale omstandigheden voornamelijk tot expressie komt in MrgprA3⁺- en Cysltr2⁺-neuronen, die mechanische, jeuk- en pijnsensatie mediëren. Acute, selectieve NMP-remming in de poothuid van muizen verminderde de mechanische en pijngevoeligheid zonder de thermische sensatie te beïnvloeden. Met name in tegenstelling tot globale proteasoomremming, veroorzaakt selectieve NMP-remming geen neuropathie. In vitro studies suggereren dat de NMP de communicatie tussen neuronen vergemakkelijkt, mogelijk door de afgifte van signaalpeptiden, en essentieel is voor normale neuronale reacties op stimulatie. Deze bevindingen identificeren de NMP als een belangrijke regulator van sensorische neuronoverspraak die nodig is voor normale aanraking, pijn en jeuk. De NMP is dus een potentieel doelwit voor pijnbestrijding. Dit artikel presenteert methoden voor het isoleren van zowel NMP-expressie als niet-NMP-expressie neuronale populaties met behulp van antilichaamvoeding en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Deze populaties zijn geschikt voor celtype-specifieke expressieprofilering via scRNA-seq of op cultuur gebaseerde analyses van NMP-expressiedynamiek. Samen bieden deze methoden een robuuste workflow voor het onderzoeken van de dynamiek van NMP-expressie en de bijdrage ervan aan pijnrelevante ziekteaandoeningen.

Introduction

De proteasoomfunctie is essentieel voor een optimale ontwikkeling en onderhoud van het perifere zenuwstelsel (PNS)1,2,3,4,5,6. Zowel in vitro als in vivo studies met proteasoomremmers tonen aan dat proteasomale activiteit cruciaal is voor neurologische ontwikkeling, myelinisatie, prikkelbaarheid en gliacelfunctie 7,8,9,10. Bovendien induceert chemotherapie op basis van proteasoomremmers pijnlijke neuropathieën bij 30-60% van de patiënten, vaak gekenmerkt door chronische pijn en veranderd gevoel in de ledematen 8,9,11,12,13. Interessant is dat een lage dosis toediening van dezelfde remmers de gevoeligheid voor pijnlijke stimuli vermindert, wat wijst op een complexe rol voor het proteasoom bij sensorische verwerking ^6,14,15. Ondanks deze uitgebreide studies is de specifieke functie van proteasomen in het PZS echter nog steeds slecht begrepen.

Proteasomen zijn de primaire eiwitafbraakmachines in alle domeinen van het leven en zijn essentieel voor het behoud van eiwithomeostase¹⁶. Het 20S-kernproteasoom is samengesteld uit vier heptameerringen van α-, β-, β-, α-subeenheden en bemiddelt ubiquitine-onafhankelijke eiwitafbraak^17,18. Associatie met regulerende deeltjes vormt het 26S en 30S afgetopte proteasoom, dat ubiquitine-afhankelijke eiwitafbraak bemiddelt ^4,17. In neuronen zijn proteasomen geïdentificeerd in alle cellulaire compartimenten, en het is bekend dat hun subcellulaire lokalisatie functie¹⁹ beïnvloedt. Veel veelgebruikte proteasoomremmers missen echter specificiteit om zich selectief te richten op differentieel gelokaliseerde proteasoompopulaties.

Inderdaad, met behulp van membraanondoordringbare proteasoomremmers en antilichaamlabeling in niet-permeabiliseerde cellen, werd een neuronspecifiek proteasoomcomplex gevonden dat zich lokaliseerde naar het plasmamembraan in een subset van somatosensorische neuronen²⁰. scRNA-seq-analyse van neuronen in het primaire dorsale wortelganglion (DRG), gescheiden in NMP⁺- en NMPS-populaties via antilichaamvoeding tegen een proteasoomsubeenheid en ^{FACS-sortering}, resulteerde in 20 transcriptioneel verschillende celclusters²⁰. Verdere analyse toonde aan dat de NMP⁺-cellen geclusterd waren tot slechts 3 van de 20 clusters. Met behulp van genmarkersets voor specifieke neuronale subtypes werden 13 verschillende somatosensorische neuronsubtypes geïdentificeerd²⁰. De meerderheid van de NMP⁺-neuronen is geclusterd met MrgprA3⁺ en Cysltr2⁺ sensorische neuronen²⁰. Een minimaal aantal van de NMP⁺-cellen clusterde in een derde cluster, waarin geen specifieke genensets werden geïdentificeerd, en dit cluster werd daarom niet toegewezen²⁰. MrgprA3⁺ en Cysltr2⁺ neuronen zijn C-type nociceptoren, gevoelig voor hitte, mechanische en pruritogene stimuli, overeenkomend met respectievelijk CGRP-θ en SST neuronale subtypes^21,22. Van de 20 geïdentificeerde celclusters brachten 7 ^NMP-clusters genmarkers tot expressie die consistent waren met niet-neuronale cellen, waaronder Schwann-cellen, satellietglia en immuuncellen, en werden er ook²⁰ niet toegewezen. Deze celpopulaties werden verwacht, omdat het niet mogelijk is om niet-neuronale van neuronale cellen te scheiden tijdens het kweken van DRG-neuronen²⁰.

Bij het onderzoeken van de functie ervan veranderde in vitro remming van de NMP de neuronale exciteerbaarheid voor stimulatie van KCl, histamine en αβ-methyleenadenosine 5'-trifosfaat²⁰. In vivo verminderde NMP-remming de gevoeligheid voor mechanische en pijnprikkels zonder effecten op de thermische sensatie²⁰. Deze bevindingen tonen aan dat de NMP een belangrijke regulator is van mechanische, pijn- en jeukgevoelens, en een potentieel therapeutisch doelwit voor pijnbestrijding²⁰. De specifieke mechanismen die NMP-activiteit koppelen aan pijnontwikkeling in verschillende ziektecontexten blijven echter slecht begrepen. Daarom is verder onderzoek naar de dynamiek en functie van NMP-expressie bij pijn- en neuropathie-geassocieerde aandoeningen gerechtvaardigd.

Hier beschrijft dit artikel een robuuste workflow (Figuur 1) voor het identificeren en isoleren van NMP⁺ DRG-neuronale populaties. Deze benadering maakt celtypespecifiek onderzoek van de dynamiek van NMP-expressie mogelijk met behulp van FACS-sortering, scRNA-seq en immunokleuring. Deze benaderingen maken een analyse met hoge resolutie van NMP-expressie op een celtype-specifieke manier mogelijk, die kan worden gebruikt om de rol van de NMP in normale en verschillende pijngerelateerde aandoeningen te onderzoeken.

Protocol

Alle methoden die met proefdieren zijn beschreven, zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Loyola University of Chicago Stritch School of Medicine.

1. Bereiding van digestieoplossingen, DRG-media en FACS-media

1. Bereid een volledige zoutoplossing (CSS) met 137 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 1 mM MgCl_2,6 H₂O, 25 mM sorbitol, 10 mM HEPES en 3 mM CaCl_2,2 H₂O. Stel de pH in op 7,2 met NaOH en steriliseer met een filter.
2. Bereid de werkoplossing van het enzymmengsel voor weefseldissociatie (matige trituratie) door 190 μl van de bouillon (5 mg/ml in H₂O), 84 μl 50 mM EDTA en 6,5 ml CSS te combineren. Vers bereiden en filteren - steriliseren voor gebruik.
3. Bereid weefseldissociatie enzymmengsel (lage trituratie)-papaïneoplossing met 190 μl enzymmengselvoorraadoplossing, 150 μl papaïne, 84 μl 50 mM EDTA en 6,5 ml CSS. Vers bereiden en filteren - steriliseren voor gebruik.
4. Bereid BSA/TI/DMEM-oplossing door 7,5 mg trypsineremmer en 7,5 mg BSA te combineren in 5 ml DMEM/F12-medium. Vers bereiden en filteren-steriliseren.
5. Bereid DRG-neuronmedia voor door 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline/streptomycine, 1% glutamine en 2% 50x B27-supplement te combineren in 430 ml DMEM/F12.
6. Bereid FACS-buffer voor door 1% FBS, 1x PBS, 25 mM HEPES en 1% penicilline/streptomycine te combineren in geautoclaveerd water. Vers bereiden en filteren-steriliseren.
7. Smeer vierentwintig uur voor het begin van het protocol twee buisjes van 5 ml polystyreen met ronde bodem in door ze te vullen met FACS-buffer en ze bij 4 °C te plaatsen.

2. Bereiding van eencellige DRG-neuronsuspensuspensie

1. Oogst alle DRG's van 4-6 P20-P23-muizen volgens de eerder beschreven methoden^20,23.
2. Breng de DRG's over in een conische buis van 15 ml en voeg 7 ml weefseldissociatie-enzymmengsel (matige trituratie) werkoplossing toe. Incubeer met zacht roeren (door te roteren) bij 37 °C gedurende 20 minuten.
3. Draai de ganglia gedurende 2 minuten op 120 × g naar beneden. Verwijder voorzichtig het bovenstaande zonder de pellet te verstoren en resuspenseer de ganglia in 7 ml weefseldissociatie-enzymmengsel (lage trituratie)-papaïne-werkoplossing. Incubeer met zacht roeren (door roteren) gedurende 15 minuten bij 37 °C.
4. Centrifugeer op 120 × g gedurende 2 min. Verwijder het bovenstaande en suspendeer de ganglia opnieuw in 500 μl BSA/TI/DMEM-oplossing.
5. Tritureer de ganglia 12-16x met een 1 ml verstopte, vuurgepolijste glazen pasteurpipet.
6. Filter cellulair afval eruit door cellen door een celzeef van 40 μm te leiden. Was de zeef met 1 ml BSA/TI/DMEM-oplossing om ervoor te zorgen dat alle DRG-neuronen worden verzameld. Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml.
7. Centrifugeer op 120 × g gedurende 2 min. Verwijder het bovenstaande middel en suspendeer de pellet voorzichtig opnieuw in 1 ml DRG-media.
   OPMERKING: Dit is de eencellige DRG-neurensuspensie.

3. Voeding van antilichamen om NMP-positieve neuronen te labelen

1. Verdeel de DRG-neuronsuspensie in twee buisjes van 1,5 ml, elk met 500 μl, en label de twee buisjes: "primair" en "niet primair".
2. Voeg 20 μL geitenanti-proteasoom 20S subeenheid alpha 2 (PSMA2) antilichaam toe aan de "primaire" gelabelde buis (verdunning 1:25).
   1. Optioneel: Om de membraanintegriteit en specificiteit van het PSMA2-antilichaam te testen, neemt u een extra monster op van primaire DRG's die zijn geïncubeerd met kip anti-neurofilament zware keten (NF-H) (1:1.000) gevolgd door anti-kip (bijv. 488-geconjugeerd) secundair (1:250) (stap 3.10).
      OPMERKING: De anti-NF-H-labelcontrole mag niet resulteren in cellulaire labeling als het neuronale membraan intact is.
3. Incubeer de cellen onder zacht roeren gedurende 30 minuten bij 37 °C.
4. Warm gefilterde, gesteriliseerde 1x PBS tijdens incubatie van primaire antilichamen.
5. Centrifugeer de buisjes 2 minuten bij 200 × g en verwijder 90% van het bovenstaande (gooi ze weg).
6. Resuspendeer de neuronen in 500 μL warme 1x PBS. Incubeer de buisjes gedurende 3 minuten bij 37 °C onder zacht roeren.
7. Herhaal stap 3.5-3.6 voor in totaal drie wasbeurten.
8. Terwijl de wasstappen aan de gang zijn, bereidt u secundair antilichaam door 4 μL anti-geiten IgG (555 nm fluorofoor) te verdunnen in 1.000 μL warme DRG-media (verdunning 1:250).
9. suspendeer na de derde wasbeurt zowel de "primaire" als de "geen primaire" buisjes in 500 μl van de secundaire antilichaamoplossing.
   NOTITIE: Bescherm de buizen vanaf dit punt tegen licht door ze in aluminiumfolie te wikkelen.
10. Incubeer de buisjes onder zacht roeren gedurende 40 minuten bij 37 °C.
11. Was de cellen door stap 3.5-3.6 te herhalen voor een totaal van drie wasbeurten.
12. Resuspendeer na de derde wasbeurt neuronen in 300 μL FACS-buffer. Breng de geresuspendeerde cellen over in afzonderlijke buizen van 5 ml polystyreen met ronde bodem en plaats ze op ijs in een ijsemmer met deksel ter bescherming tegen licht.
13. Plaats de voorbehandelde buisjes met ronde bodem met FACS-buffer van de vorige dag in de ijsemmer met de buisjes met de cellen en ga verder met de FACS-sorteerstap.

4. Scheiding van NMP-positieve (NMP⁺ ) en NMP-negatieve (NMP-) neuronen via ^{FACS-sortering}

1. Onmiddellijk na het voeden van antilichamen en het labelen van DRG-neuronen, brengt u de cellen en gecoate buizen naar een FACS-sorteerder.
2. Voeg 7-aminoactinomycine D (7-AAD) (1:1.000) toe aan zowel de "primaire" als de "geen primaire" buisjes. Incubeer gedurende 10-30 minuten op ijs.
   OPMERKING: 7-AAD wordt gebruikt om dode cellen uit te sluiten van het sorteerproces.
3. Verwijder de FACS-buffer van de buizen die 's nachts zijn gecoat en vervang deze door 1 ml verse FACS-buffer. Deze buisjes dienen als verzamelbuisjes voor de gesorteerde neuronen.
4. Gebruik de "geen primaire" gelabelde buis om parameters en gating in te stellen voor niet-gelabelde neuronen.
5. Pas forward scatter (FSC) gating toe om cellen te isoleren die consistent zijn met de grootte van sensorische neuronen. De diameters van sensorische neuronen variëren van 10 tot 50 μm.
6. Pas side scatter (SSC) gating toe om dode cellen en puin uit te sluiten (lower side scatter) en om gebeurtenissen te isoleren die consistent zijn met de granulariteit van DRG-neuronen (grotere side scatter).
7. Laad de "primaire" buis en stel poortparameters in zoals vastgesteld met het "geen primaire" monster om niet-gelabelde (NMP^-) en 555-positieve (NMP⁺) neuronale populaties te detecteren.
8. Gebruik een mondstuk van 100 μm en een sorteerdruk van 15-20 psi om de neuronen te sorteren in 555⁺ en 555^-.
9. Ga verder met stroomafwaartse analyse van gesorteerde neuronen.

5. Eencellige RNA-sequencing van NMP⁺ en ^NMP-neuronen

1. Breng de gesorteerde cellen over in buisjes van 1,5 ml en leg ze op ijs. Transport de cellen naar een single-cell sequencing kern.
2. Voer eencellige RNA-sequencing uit op de NMP⁺ en ^{NMP-gesorteerde} neuronen op een diepte van 30.000 tot 100.000 lezingen per cel.
3. Analyseer de scRNA-seq-gegevens met behulp van verschillende gratis beschikbare softwareprogramma's om celclusters te genereren op basis van specifieke genexpressieprofielen. Voor meer informatie over de analysestappen en programma's die eerder werden gebruikt, zie Villalón Landeros et ^al.20.
4. Stel een lijst op van specifieke genmarkers om individuele neuronale populaties te identificeren met behulp van beschikbare databases zoals https://painseq.shinyapps.io/harmonized_painseq_v2/ of https://kleintools.hms.harvard.edu/tools/springViewer_1_6_dev.html?datasets/Sharma2019/all
5. Gebruik de lijst met specifieke genmarkers om de resulterende celclusters te identificeren.
   OPMERKING: De eerder uitgevoerde scRNA-seq-analyse is uitgevoerd door een onafhankelijk adviesbureau (www.cmcherryconsulting.com).

6. Primaire culturen van verrijkte NMP⁺ en ^NMP-neuronen

1. Plaats de dag voor het experiment 12 mm ronde dekglaasjes in een kweekplaat met 24 putjes (1 dekglaasje/putje) en was gedurende 15 minuten met 70% ethanol. Spoel vervolgens 3x af met steriel water en laat aan de lucht drogen in een steriele weefselkweekkap.
2. Zodra de dekglaasjes droog zijn, smeer ze in met 0,1 mg/ml poly-L-lysinehydrobromide (PLL) en zet ze een nacht bij 4 °C.
3. Verwijder op de dag van het experiment de PLL, spoel de dekglaasjes 3x af met steriel water en laat ze drogen in een weefselkweekkap.
   OPMERKING: De PLL kan worden opgeslagen en opnieuw worden gebruikt.
4. Verdun 10 μL 1 mg/ml laminine in 125 μL DRG-media en spot 20-30 μL op het midden van elk dekglaasje.
5. Smeer de dekglaasjes voor gebruik minimaal 40 minuten in met laminin.
6. Breng de FACS-gesorteerde cellen over in een buis van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 × g om cellen te verzamelen. Verwijder het bovenstaande en suspendeer neuronen opnieuw in 50 μL warme DRG-media.
7. Zuig laminine van het dekglaasje op en laat het dekglaasje drogen.
8. Zaad 15-20 μL geresuspendeerde neuronen op elk dekglaasje. Verplaats de plaat met de dekglaasjes zonder zaadjes voorzichtig naar een weefselkweekincubator en incubeer deze gedurende ten minste 30 minuten (niet langer dan 1 uur) om de cellen te laten hechten.
9. Verplaats de plaat terug naar een weefselkweekkap en voeg 1 ml steriele warme DRG-media toe aan elk putje met cellen op dekglaasjes.
   OPMERKING: Laat de pipetpunt naar de benedenhoek van het putje zakken en doseer langzaam om te voorkomen dat u het dekglaasje aanraakt en de cellen verstoort. Als u media te snel toevoegt, kan er turbulentie ontstaan en cellen losraken.
10. Houd de culturen op 37 °C met 5% CO₂/95% luchtvochtigheid met 75% mediawissels om de 2-3 dagen.

7. Analyse van celtypespecifieke NMP-expressie

1. Bereid een kweekplaat van 140 mm of een immunofluorescentiekleuringsbak voor door deze te bekleden met een groot stuk parafilm.
2. Breng met een steriele 5/45 tang de dekglaasjes van de weefselkweekschaal over naar de parafilm op de kleuringsbak en zorg ervoor dat de kant met de DRG-neuronen naar boven wijst.
3. Voeg 100 μL DRG-media toe aan elk dekglaasje op de parafilm om te voorkomen dat de cellen uitdrogen.
   OPMERKING: Voeg vloeistoffen toe door langzaam net over de rand van het dekglaasje te pipetteren.
4. Verdun het primaire anti-PSMA2-antilichaam van de geit in warme DRG-media in een verdunning van 1:20.
5. Gebruik een afzuiger die is uitgerust met een ongefilterde P10-punt om het medium langzaam van het dekglaasje te verwijderen door vanaf de rand aan te zuigen. Voeg 100 μL geitenanti-PSMA2-antilichaamoplossing toe aan de dekglaasjes en incubeer gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur.
6. Zuig voorzichtig de primaire antilichaamoplossing van de dekglaasjes op. Voeg 100 μL PBS (op kamertemperatuur) toe en incubeer gedurende 3 minuten op kamertemperatuur om te wassen.
7. Zuig PBS van het dekglaasje en herhaal de toevoeging en aspiratie van PBS voor in totaal drie wasbeurten.
8. Bereid anti-geiten (bijv. 555-geconjugeerd) secundair antilichaam in warme DRG-media in een verdunning van 1:250.
9. Voeg na de derde wasbeurt 100 μl van het verdunde secundaire antilichaam toe aan het dekglaasje en incubeer gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur.
   OPMERKING: Bescherm de cellen vanaf deze stap tegen licht.
10. Zuig de secundaire antilichaamoplossing van het dekglaasje op en was 3x zoals beschreven in de stappen 7.6-7.7.
11. Verwijder de laatste PBS-wasbeurt en fixeer de cellen door 100 μL fixeeroplossing toe te voegen die 4% paraformaldehyde (PFA), 4% sucrose in 1x PBS bevat. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
12. Zuig fixeermiddel aan en was 3x door de stappen 7.6-7.7 te herhalen.
13. Permeabiliseer de cellen door 100 μL 0,1% niet-ionisch wasmiddel (bijv. Triton X-100) in 1x PBS toe te voegen en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
14. Zuig de permeabiliserende oplossing aan en was 3x door de stappen 7.6-7.7 te herhalen.
15. Voeg 100 μL blokkeeroplossing bestaande uit 5% FBS, 5% ezelinnenserum in 1x PBS toe en incubeer 40 minuten bij kamertemperatuur.
16. Bereid een DRG-neuronceltypespecifieke primaire antilichaammix volgens de volgende verdunningen in blokkeeroplossing: konijn anti-calcitonine-gen-gerelateerd peptide (CGRP) (1:500); isolectine B4, biotineconjugaat (IB4) (1:50); kip anti-NF-H (1:1000).
    OPMERKING: Deze antilichamen interfereren niet met elkaar en kunnen in dezelfde oplossing aan elkaar worden toegevoegd.
17. Verwijder de blokkeeroplossing en voeg het primaire antilichaammengsel toe aan het dekglaasje. Incubeer 45 minuten bij kamertemperatuur.
18. Verwijder de antilichaamoplossing en was 3x door de stappen 7.6-7.7 te herhalen.
19. Bereid een secundaire antilichaammixoplossing door streptavidine (bijv. 647-geconjugeerd), ezel-anti-konijn (bijv. 488-geconjugeerd) en ezel-anti-kip (bijv. 405-geconjugeerd) te verdunnen tot elk 1:500.
20. Verwijder de laatste PBS-wasbeurt en voeg 100 μL secundaire antilichaamoplossing toe aan de dekglaasjes. Incubeer 45 minuten bij kamertemperatuur.
21. Was 3x door stap 7.6-7.7 te herhalen.
22. Optioneel: Bereid de nucleaire vlek voor op 1-10 μg/ml. Voeg 100 μL nucleaire kleurstofoplossing toe, incubeer gedurende 30 s bij kamertemperatuur en was 2x met gedeïoniseerd water (diH₂O) door de stappen 7.6-7.7 te herhalen.
23. Zuig de laatste spoeling van het dekglaasje op en til het dekglaasje met een tang met fijne punt van de parafilm. Dep overtollig vocht af door de rand van het dekglaasje voorzichtig aan te raken met een pluisvrije tissue.
24. Plaats een druppel van 7 μL montagemedium op een microscoopglaasje. Plaats het dekglaasje voorzichtig over de druppel van het montagemedium en zorg ervoor dat de cellen naar beneden wijzen en in contact komen met het medium.
25. Plaats de microscoopglaasjes met dekglaasjes minimaal 1 uur in een donkere, droge lade of doos om te drogen en sluit de rand van het dekglaasje af. Werk af met het verzegelen van de rand van de dekglaasjes met sneldrogende nagellak en wacht 10-15 minuten voordat u het afdrukt.
26. Afbeelding dia's met behulp van een confocale microscoop met fluorescentie- of draaischijf die is uitgerust met de juiste lichtfilters om blauwe, groene, rode en verrode fluorescentie te visualiseren.

Results

Het vermogen om onderscheid te maken tussen de NMP en intracellulaire proteasomen is afhankelijk van membraanondoorlatende labelbenaderingen. Het voeden van antilichamen maakt het gebruik van proteasoomsubeenheid-specifieke antilichamen op levende neuronen mogelijk om proteasomen te labelen die alleen van de buitenkant van de cel toegankelijk zijn. Vanwege hun grootte en hydrofiliciteit zijn antilichamen niet in staat om intacte celmembranen te passeren

Discussion

Proteasomen zijn essentieel in alle cellen en zijn te vinden in alle compartimenten in cel¹⁹. De recente ontdekking van een gespecialiseerd proteasoomcomplex, de NMP, in neuronen van het centrale 25,26,27 en perifere²⁰ zenuwstelsel heeft ons huidige begrip van de functie van proteasomen veranderd. Eerder werk heeft aangetoond dat de NMP functioneer...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES buffer solution, pH 7.3	Quality Biological	118-089-721	FACS buffer
10x PBS	Thermo Fisher Scientific	70011-044	FACS buffer
16% Paraformaldehyde (PFA) stock solution; EM grade	EMS	15710	fixative solution
1x Phosphate-buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	10-010-023	FACS washes
5 mL polystyrene round-bottom tube	Fisher Scientific	14-959-6	FACS tubes
7-Aminoactinomycin D (7-AAD)	Invitrogen	A1310	Labels dead cells
B27 supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	culture medium
Bovine serum albumin	MilliporeSigma	A9647; CAS: 9048-46-8	BSA/TI/DMEM
Calcium chloride dihydrate (CaCl?-2H?O)	MilliporeSigma	C7902	complete saline solution
Chicken anti-neurofilament heavy chain (NF-H)	MilliporeSigma	AB5539	antibody
DMEM/F12 1:1	Thermo Fisher Scientific	11320033	culture medium; BSA/TI/DMEM
Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor Plus 555	Thermo Fisher Scientific	A32816	antibody
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor Plus 488	Thermo Fisher Scientific	A32790	antibody
DyLight 405 donkey anti-chicken	Jackson ImmunoResearch	703-475-155	antibody
EDTA	MilliporeSigma	E5134; CAS: 6381-92-6	Liberase TM/Liberase TL-papain working solutions
Fetal Bovine Serum (FBS)	MilliporeSigma	A9647	culture medium/FACS buffer/blocking solution
Glass pasteur pipette, 9 inch	Fisher Scientific	1367820D	titruration
Goat anti-PSMA2	made in house	NA	antibody
HEPES powder	MilliporeSigma	H4034	complete saline solution
Hoechst	Thermo Fisher Scientific	H21492	nuclear stain
Horse serum	Thermo Fisher Scientific	26050070	blocking solution
IB4, biotin conjugate	MilliporeSigma	L2140	antibody
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020-1MG	culture dish
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081	culture medium
Liberase trituration low (TL)	MilliporeSigma	54010200001	Liberase TL stock solution
Liberase trituration moderate (TM)	MilliporeSigma	5401119001	Liberase TM stock solution
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl?-6H?O)	MilliporeSigma	M2393	complete saline solution
Mounting media	SouthernBiotech	0100-01	Fluoromount-G
Papain	Worthington	Cat#: 9001-73-4	Liberase TL-papain working solution
Penicillin/streptomycin	MilliporeSigma	15140122	culture medium/FACS buffer
Poly-L-lysine hydrobromide (PLL)	MilliporeSigma	P4707	culture dish
Potassium chloride (KCl)	MilliporeSigma	P5405	complete saline solution
Rabbit anti-CGRP	Immunostar	24112	antibody
sodium chloride (NaCl)	MilliporeSigma	S9888; CAS: 7647-14-5	complete saline solution
Sorbitol	MilliporeSigma	56755-M	complete saline solution
Streptavidin Alexa Fluor 647 conjugate	Thermo Fisher Scientific	S21374	antibody
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389-500G	fixative solution
Trypsin inhibitor	MilliporeSigma	T9253; CAS: 9035-91-8	BSA/TI/DMEM