Methodenartikel

Modellering van dysplastisch en functioneel longalveolair herstel na griepinfectie

898 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69062

⸱

19 september 2025

 ,  ,  , 
1Cancer and Developmental Biology Laboratory, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol geeft instructies voor intranasale toediening van IAV en downstream-analyse van longbeschadiging bij muizen en bijbehorende transcriptionele veranderingen in longceltypen.

Samenvatting

Virale infectie veroorzaakt zowel acute als langdurige schade aan de longblaasjes, de gespecialiseerde weefselstructuur die verantwoordelijk is voor de gasuitwisseling tussen het cardiovasculaire systeem en de externe omgeving. Influenza A-virus (IAV)-infectie bij muizen vertegenwoordigt een translationeel model voor de reactie van de menselijke long op virale infectie en induceert zowel voorbijgaande als aanhoudende veranderingen in de celtoestand in de longblaasjes. In sommige gevallen kunnen afwijkende celtoestanden veroorzaakt door viraal letsel die na verloop van tijd niet worden opgelost, de kritieke gasuitwisselingsfunctie van de long permanent aantasten. Dit artikel demonstreert methoden voor intranasale infectie van muizen met A/PR/8/34 IAV en karakterisering van voorbijgaande en langdurige veranderingen in de cellulaire samenstelling en weefselstructuur van beschadigde longen. Dit model maakt een gedetailleerd onderzoek mogelijk naar de moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan longherstel en chronische disfunctie. Deze benadering biedt ook een platform voor het evalueren van therapeutische interventies die gericht zijn op het bevorderen van effectieve longregeneratie en het herstellen van de ademhalingsfunctie na viraal letsel.

Inleiding

De longen spelen een cruciale rol bij de toevoer van zuurstof en voedingsstoffen naar lokale weefsels. Endotheelcellen (EC's) die kleine capillaire bloedvaten van de longen bevolken, zijn essentieel voor de goede werking van het longweefsel, het behoud van de vasculaire integriteit en efficiënte gasuitwisseling1. EC's vormen de vasculaire niche en wisselen elkaar samen met andere cellen zoals epitheelcellen, immuuncellen en mesenchymale cellen. Dit draagt bij aan de regulatie van de longontwikkeling en van weefselherstel als reactie op letsel of ziekte2.

H1N1 Influenza A-virusinfectie is een wereldwijd probleem3. Patiënten met een H1N1-infectie worden vaak gediagnosticeerd met exsudatieve diffuse alveolaire schade (DAD)4. Infectie met H1N1 kan leiden tot ernstige longschade en ernstige gevolgen, waaronder longontsteking, ernstig acuut longletsel (ALI) en acuut respiratoir distress syndroom (ARDS)5. De schade komt voornamelijk voort uit het virus dat longepitheelcellen infecteert, wat een overmatige immuunrespons veroorzaakt, wat resulteert in ontsteking, weefselbeschadiging en vochtophoping in de longen. De epitheelcellen langs de luchtwegen en longblaasjes, die verantwoordelijk zijn voor gasuitwisseling, worden dus direct beschadigd door het H1N1-virus, wat leidt tot verstoring van de normale structuur van de long 6,7. Het is duidelijk geworden dat andere celtypen, hoewel niet direct geïnfecteerd door IAV, beschadigd kunnen raken als reactie op infectie 8,9. Weefselbeschadiging na griepinfectie tast daarom alle cellulaire compartimenten van de long aan, en onlangs is aangetoond dat IAV-infectie zowel voorbijgaande als aanhoudende veranderingen in de celtoestand in meerdere cellulaire compartimenten veroorzaakt9. Deze celplasticiteit als reactie op ziekte kan nuttig of schadelijk zijn voor succesvol weefselherstel en rechtvaardigt verder onderzoek.

Het meest gebruikte experimentele model voor het bestuderen van influenza en de pathogenese ervan is intranasale infectie van muizen met influenzavirus A/PR/8/3410. Het is een belangrijke techniek die het mogelijk maakt om de ernst van de ziekte, mortaliteit en virale besmettelijkheid te bestuderen. Intranasale infectie van muizen bootst de natuurlijke infectieroute bij mensen na en maakt de studie van zowel adaptieve als aangeboren immuunresponsen tegen het virus mogelijk. In 1934 werd een specifieke stam van het Influenza A-virus "A/PR/8/34" geïsoleerd uit een patiënt in Puerto Rico11. Deze stam van het griepvirus is nu aangepast aan de muis en infecteert mensen niet langer productief. Vanwege de overeenkomsten in het immuunsysteem van muizen en mensen zijn muizen het meest populaire diermodel voor IAV-onderzoek12. Bij deze methode wordt de A/PR/8/34 H1N1-stam rechtstreeks via de neusgaten aan muizen toegediend, waardoor een natuurlijke infectie wordt nagebootst13. Het is een gemakkelijke, kosteneffectieve en handige methode om de effecten van virale infectie op het longweefsel van de gastheer te bestuderen in zowel wildtype (WT) als knock-out (KO) omstandigheden. Alternatieve technieken hebben voor- en nadelen ten opzichte van het intranasale model. Intratracheale (IT) inoculatie maakt nauwkeurige afgifte van het virus in de longen mogelijk, maar deze techniek bootst infectie door inademing niet volledig na en geeft geen informatie over toxiciteit in de bovenste luchtwegen. IT-inoculatie vereist ook grote vaardigheid om het risico op tracheale beschadiging te verminderen13,14. Inhalatie van aerosolinhalatie (AR) bootst de natuurlijke infectieroute na en creëert een meer uniforme longpathologie in vergelijking met intranasale infectie, maar het kan moeilijk zijn om een uniforme virusconcentratie in de aerosol te behouden en om een nauwkeurige afgifte van virale aerosol te bereiken. Veiligheid is ook een belangrijk aandachtspunt van de AR-inoculatiemethode10. Daarom is de intranasale inoculatietechniek van IAV-toediening een cruciale benadering van pulmonaal gericht onderzoek naar de stroomafwaartse effecten van virale infectie op weefselbeschadiging en -herstel. In tegenstelling tot chemische of mechanische modellen, biedt het een meer realistische en minder invasieve manier om door griep veroorzaakte longschade en interacties tussen gastheer en pathogeen te bestuderen.

Hier stellen we een reproduceerbare methode vast voor intranasale infectie van muizen met het Influenza A-virus (A/PR/8/34) en voor het karakteriseren van zowel de cellulaire en structurele veranderingen op korte als op lange termijn in de longblaasjes die het gevolg zijn van virale schade. Studies met behulp van deze methode kunnen helpen bij het ontdekken van mechanismen van longweefselbeschadiging en -herstel om nieuwe therapeutische doelen voor longziekten te identificeren.

Protocol

Het werken met het influenza A-virus in een diermodel wordt beschouwd als bioveiligheidsniveau 2 (BSL2) en dierbioveiligheidsniveau 2 (ABSL2). Alle dierprocedures die worden gebruikt om deze gegevens te genereren, zijn goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van het Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health (Protocol #24-452). Dit protocol is ook goedgekeurd door het Institutional Biosafety Committee van het Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health. Alvorens met dit protocol te beginnen, wordt aanbevolen dat gebruikers goedkeuring vragen aan hun institutionele commissie voor dierenverzorging en -gebruik en institutionele bioveiligheidscommissie.

1. Voorbereiding van de werkvoorraad

OPMERKING: Alle werkzaamheden met het griepvirus moeten op ijs in een bioveiligheidskast worden uitgevoerd. Werp tips en al het andere dat in contact komt met het virus uit in een container met 10% bleekmiddel. IJsemmers, pipetten en tipdozen moeten worden besproeid met 10% bleekoplossing in plaats van ondergedompeld. Incubeer minimaal 30 minuten bij kamertemperatuur. Gooi vast afval weg in een afvalcontainer voor biologisch gevaarlijk afval en gooi vloeibaar afval weg in de gootsteen, spoelend met water.

  1. Ontdooi bevroren bouillon (0,5 ml) virus op ijs in een bioveiligheidskast.
  2. Zet een afvalcontainer op met 10% bleekmiddel in kraanwater. Plaats twee plastic of kartonnen diepvriesdozen die tot 100 monsterbuisjes kunnen bevatten in een vriezer van -80 °C om voor te koelen.
  3. Etiketteer 160 tubes van 1,5 ml vooraf op virusaliquots. Buizen met schroefdop hebben de voorkeur boven buizen met flip-cap om te voorkomen dat er aerosolen ontstaan bij het openen van virale voorraadbuizen voor gebruik. Plaats de buisjes op ijs om voor te koelen voordat u aliquots van het virus maakt.
  4. Maak 3 μL aliquots virus met behulp van een gekalibreerde P20-pipet en tips, plaats het virus alleen in voorgekoelde buisjes en houd de aliquots te allen tijde op ijs.
  5. Bewaar ze na het maken van aliquots in een voorgekoelde diepvriesdoos met het label "A/PR/8/34 Influenza Virus (IAV)", het catalogusnummer, het lotnummer en de houdbaarheidsdatum.
    OPMERKING: Verschillende partijen virussen hebben een verschillende besmettelijkheid en mogen niet worden gemengd.
  6. Plaats de doos in een vriezer van -80 °C. Zorg ervoor dat alles zo koud mogelijk blijft, want de virale titer neemt af bij elke vries-/dooicyclus.

2. Verdunnen van aliquots van het virus voor gebruik in experimenten met intranasale infecties

  1. Ontdooi een aliquot van 3 μL virale voorraad op ijs in de bioveiligheidskast.
  2. Maak een verdunning van 1:100 (verdunning A) door 2 μl van het aliquoot van 3 μl over te brengen in een voorgekoelde buis van 1,5 ml die 198 μl koude D-PBS bevat.
  3. Ga door met het verdunnen van de virale voorraad totdat deze de juiste concentratie heeft bereikt voor 0,5-1 LD50 in de stamachtergrond van de gebruikte muizen. Houd alles op ijs en gebruik voorgekoelde buizen om oververhitting van het virus te voorkomen.
    OPMERKING: Bijvoorbeeld, voor VR-95PQ, partij 70063082, infecteer muizen met 12.600 tot 31.500 CEID50/μL virus (geschaald naar lichaamsgewicht) bij een verdunning van 1:500.000.
  4. Maak van verdunning A (1:100) een verdunning van 1:50.000 (verdunning B) door 10 μL verdunning A toe te voegen aan 4990 μL koude D-PBS in een voorgekoelde tube van 15 ml. Meng goed door op en neer te pipetteren met een serologische pipet van 5 ml.
  5. Maak van verdunning B een verdunning van 1:500.000 (verdunning C) door 200 μL verdunning B toe te voegen aan 1,8 ml D-PBS in een voorgekoelde tube van 5 ml. Meng goed door op en neer te pipetteren.
    OPMERKING: Om de ideale verdunning van het virus te bepalen die moet worden gebruikt bij het infecteren van de dieren bij de aankoop van een nieuwe partij, is het mogelijk om een schatting te maken aan de hand van de titer van het virus die op de productfiche staat vermeld en de verdunning aan te passen op basis van de titer van de vorige partij. De beste manier om de ideale verdunning te bepalen, is door de nieuwe partij virus empirisch te titeren met behulp van wildtype C57BL/6-muizen. Plan een reeks verdunningen variërend van 1:50.000 tot 1:500.000 en bestel 1-2 kooien C57BL/6 vrouwelijke muizen per verdunning om te testen. Infecteer muizen in verschillende concentraties en controleer hun gewichtsverlies. Om virale titers te testen, stelt de studie voor om alleen vrouwelijke muizen te gebruiken om de variabiliteit te verminderen die kan worden veroorzaakt door geslachts- of gewichtsverschillen tussen muizen. Vrouwelijke muizen worden vaak zieker dan mannelijke muizen, mogelijk vanwege hun kleinere formaat, of als gevolg van geslachtsspecifieke verschillen in reactie op griepinfectie, zoals voorkomt bij andere vormen van longbeschadiging bij muizen15. Hoewel dit niet in detail werd bestudeerd, werden vrouwelijke muizen gebruikt in de titerexperimenten, want als de titer werd bepaald met mannelijke muizen, zouden vrouwelijke muizen kunnen sterven bij de bepaalde dosis. Het bleek echter dat mannelijke muizen aanzienlijk ziek worden en merkbare longbeschadigingen hebben wanneer ze worden geïnfecteerd met een virale titer, die werd bepaald met behulp van alleen vrouwelijke muizen. Een ideale verdunning bij gebruik van muizen met een gemengde achtergrond of gekruiste muizen is "1 LD50", de verdunning waarbij 50% van de wildtype C57BL/6-muizen sterft. Gefokte muizen zijn beter bestand tegen infectie16 en zullen bij deze verdunning gewond raken en goed herstellen. Als de muizen voor het experiment een ingeteelde C57BL/6-achtergrond hebben, is de ideale dosis de helft van deze "0,5 LD50". Omdat het doel van deze experimenten is om letsel en herstel te bestuderen, is het ideaal om een dosis te bepalen waarbij muizen ziek worden en 20-25% van hun lichaamsgewicht verliezen, maar de meeste muizen uiteindelijk herstellen (Figuur 1). Als alle muizen in het onderzoek ongeveer hetzelfde gewicht hebben (~25 g), is het mogelijk om het influenzavirus in een dosis van 50 μl van de juiste verdunning aan elke muis toe te dienen. Muizen variëren echter in gewicht van 15-35 g. Dien daarom 2 μL virale verdunning per gram lichaamsgewicht toe (een muis van 15 g zou bijvoorbeeld 30 μL influenza krijgen, terwijl een muis van 35 g 70 μL zou krijgen). Dit resulteert in een consistenter niveau van infectie en weefselbeschadiging bij dieren van verschillende grootte. Deze informatie is nodig om het verdunningsvolume C te plannen.

3. Transport van virale aliquots naar dierenfaciliteiten

  1. Plaats de tube van 5 ml met de uiteindelijke virale verdunning in het ijs en label de container met een sticker voor biologisch gevaar. Bekleed een plastic monsterdragerdoos met papieren handdoeken om eventueel morsen op te vangen.
  2. Plaats materialen die nodig zijn voor intranasale infectie in de doos met het biohazard-label: een P200-pipet, een ongeopende doos met gefilterde P200-pipetpunten, een pen en een conische buis van 50 ml gevuld met vers 10% bleekmiddel voor viraal afval. Vul als infectiebestrijding een tube van 1,5 ml met dezelfde koude D-PBS die wordt gebruikt om de IAV te verdunnen.

4. Toediening van IAV aan muizen

OPMERKING: Voor het werken met het griepvirus in de dierenfaciliteit is een ABSL2-veiligheidsniveaufaciliteit vereist. Standaard PBM omvatten scrubs, een wegwerplaboratoriumjas, twee haarmutsen, dubbele nitrilhandschoenen, dubbele schoenovertrekken, veiligheidsbrillen (veiligheidsbrillen) en een masker. Het verdunde influenzavirus moet gedurende het hele toedieningsprotocol op ijs worden bewaard om verlies van besmettelijkheid te voorkomen.

  1. Al het werk met virussen moet plaatsvinden in een bioveiligheidskast. Hoewel het A/PR/8/34 influenzavirus een aan muizen aangepaste stam is, zijn influenzavirussen vatbaar voor mutatie en behandelen ze het virus daarom alsof het mogelijk besmettelijk is voor mensen.
  2. Dien isofluraan-anesthesie één voor één toe aan dieren met een debiet van 2,5-3% op de verdampermachine. Verplaats dieren van een anesthesiebox naar een neuskegel voordat ze griep toedienen.
  3. Wanneer een muis onder narcose is, controleer dan zijn ademhaling en knijp in de teen om te zien of hij reageert. Muizen zijn klaar voor een IAV-infectie wanneer ze reageren op een teenknijp met een kleine stuiptrekking of "sprong" - maar niet als ze wakker genoeg zijn om hun hoofd te bewegen.
  4. Gebruik een P200-pipet die is ingesteld op 50 μl (of 2 μl/g lichaamsgewicht; zie opmerking hieronder stap 2.5) om verdunde IAV (of PBS-controle) uit de injectieflacon op ijs op te zuigen en plaats de pipet op het tipdoosje of papieren handdoek waar de tip niet in contact komt met handschoenen of het oppervlak van de bioveiligheidskast.
  5. Pak de verdoofde muis op door te schrobben en houd de muis rechtop in een hoek van 45°. Nekvel de muis strak genoeg zodat de luchtpijp langwerpig is voor een betere inademing, maar niet zo strak dat de ademhaling wordt belemmerd. Zorg ervoor dat de adem van de muis oppervlakkig maar consistent is, zonder naar adem te happen.
  6. Piket de IAV-verdunning langzaam in de neusgaten van de muis. Dit kan met succes worden gedaan met behulp van een van de twee methoden zoals beschreven in de stappen 4.6.1 en 4.6.2.
    1. Laat de virale verdunning druppelsgewijs in de neusgaten vallen, afwisselend tussen de neusgaten zodat het virus beide zijden van de neus binnendringt.
    2. Creëer een "bubbel" van virus die beide neusgaten beslaat, in stand gehouden door consequent en langzaam te pipetteren terwijl de muis de vloeistof inademt.
      OPMERKING: In deze studie werd consequent de bubbelinstillatiemethode gebruikt, die meer gecontroleerd en reproduceerbaar was. Deze methode maakt het mogelijk om de virussuspensie onder narcose gemakkelijk in de neusgaten af te geven en vergemakkelijkt de natuurlijke ademhaling. De druppelsgewijze methode is even geldig, maar welke methode ook wordt gebruikt, consistentie in de methode moet worden toegepast op alle experimenten om minder variabiliteit in de resultaten te garanderen.
  7. Houd de pipetpunt dicht bij de neus, maar raak de neus niet aan. Als de muis wakker wordt, dient u de helft van de dosis toe en legt u de muis terug op de isofluraan-neuskegel voordat de tweede helft van de dosis wordt toegediend.
  8. Als de muis wakker genoeg is om zijn hoofd te schudden, te hoesten of het virus uit te spugen, is meer anesthesie nodig om te voorkomen dat het virus in de verneveling ontstaat en om een goede infectie te garanderen. Als de muis niet wakker is, dien dan de volledige dosis toe. Als de muis terug op de neuskegel is geplaatst, herhaalt u stap 4.6 om de resterende IAV toe te dienen.
  9. Werp de punt uit in een afvalcontainer met vers 10% bleekmiddel. Gebruik een nieuwe punt voor elke kooi muizen.
  10. Houd na elke IAV-toediening de muis 1-2 minuten rechtop om de luchtweg open te houden en zorg ervoor dat de griep voldoende in de longen is afgeleverd. Als het griepvirus met succes in de longen van de muis is afgeleverd, kan gekraak worden gevoeld door een vinger aan elke kant van de borst van de muis te plaatsen.
  11. Nadat de muis is begonnen te herstellen, plaatst u de muis terug in de kooi om volledig te herstellen. Muizen herstellen snel van isofluraan, maar moeten worden gecontroleerd totdat ze ambulant zijn.
  12. Noteer gebeurtenissen zoals gekraak in de borst en diepe ademhaling die erop wijzen dat IAV goed is ingeademd, of bubbels en neusspray die erop wijzen dat een deel ervan uit de neusgaten van de muis is verdreven. Houd deze informatie bij in een spreadsheet met letsellogboeken (aanvullend bestand 1) en een laboratoriumnotitieboekje.
  13. Herhaal stap 4.2-4.12 voor elke muis die moet worden geïnfecteerd.

5. Vervoer terug naar het lab

  1. Plaats 50 ml conisch bleekmiddel en tips terug in de plastic monsterdragerdoos, samen met de overgebleven IAV-verdunning (indien aanwezig) en de laboratoriumitems die worden gebruikt voor griepinfectie.
  2. Eenmaal terug in het laboratorium, incubeer je alles wat in contact is gekomen met het virus met 10% bleekmiddel. Spuit ijsemmers, pipetten en tipdozen in met 10% bleekoplossing in plaats van onder te dompelen. Incubeer minimaal 30 minuten bij kamertemperatuur. Gooi vast afval weg in de afvalcontainer voor biologisch gevaarlijk afval en gooi vloeibaar afval weg in de gootsteen en spoel door met water.

6. Monitoring van muizen en aanvullende experimentele procedures

  1. Controleer de lichaamsconditiescore (BCS)17 en het lichaamsgewicht van alle controle- (PBS) en IAV-geïnfecteerde muizen dagelijks na griepinfectie, beginnend de dag na infectie (dag 1) of 3 dagen na infectie (dag 4). Het is onwaarschijnlijk dat met IAV geïnfecteerde muizen substantieel gewicht verliezen tot dag 4 na infectie (Figuur 1).
    OPMERKING: Muizen die meer dan 30% van hun lichaamsgewicht verliezen of een lichaamsconditiescore van 1 bereiken, moeten worden geëuthanaseerd.
  2. Indien gewenst dient EdU toe aan muizen via intraperitoneale (i.p.) injectie of in het drinkwater om de celproliferatie na griepinfectie te controleren.
    OPMERKING: Veel celtypen in de muizenlong vermenigvuldigen zich na IAV-geïnduceerde schade9. Het is mogelijk om naar wens andere medicijnen, speciaal voer of speciaal water toe te dienen voor specifieke experimentele doeleinden. Houd er rekening mee dat muizen niet zoveel eten of drinken als normaal tijdens hun herstel van griep, dus een op injectie gebaseerde toedieningsmethode kan wenselijker zijn; aan de andere kant kan het moeilijk zijn om muizen met een BCS van 2-2,5 te injecteren.

7. Oogsten van longweefsel voor stroomafwaartse benaderingen

  1. Oogst longweefsel voor stroomafwaartse toepassingen, waaronder immunofluorescentieanalyse, flowcytometrie of eencellige RNA-sequencing in de muizenfaciliteit of in het laboratorium in een bioveiligheidskast.
  2. Euthanaseer muizen één voor één met behulp van CO2. Ontwricht niet cerviaal om te voorkomen dat de luchtpijp ontwricht raakt. Bilaterale thoracotomie is meestal een goedgekeurde secundaire euthanasiemethode.
    OPMERKING: Deze studie volgt de goedgekeurde richtlijnen voor dierenverzorging en het CO2 -euthanasieprotocol van de instelling en heeft deze methode consequent gebruikt in eerdere grieponderzoeken zonder significante variabiliteit in longbeschadiging of histopathologische uitkomsten te introduceren. Ketamine/xylazine kan ook worden gebruikt om muizen te euthanaseren om schade door CO2 -inademing te voorkomen. CO2 -inhalatie is echter een acceptabele methode als het verkrijgen van ketamine/xylazine te duur is of als het verkrijgen van een DEA-licentie te moeilijk is.
  3. Ontleed de borstholte en leg de ribbenkast en de luchtpijp bloot.
  4. Snijd het middenrif open en ontleed het voorzichtig weg van de ribbenkast om de longen niet te doorboren. Knip langs de zijkanten van de ribbenkast en verwijder de ribbenkast aan de bovenkant. Snijd de sleutelbeenderen door en ontleed het bot en het zachte weefsel weg van de voorkant van de luchtpijp.
  5. Ontleed de spier en het weefsel rond de luchtpijp totdat de kraakbeenringen zichtbaar zijn, maar prik de luchtpijp niet door. Duw met een gebogen tang de slokdarm achter de luchtpijp vandaan en ontleed deze weg van de luchtpijp.
  6. Rijg een stuk hechtdraad achter de luchtpijp en leg een losse hechtknoop (lus het ene uiteinde om de ene tang met de andere, pak het losse uiteinde van de hechtdraad vast en trek het losse uiteinde door de lussen).
  7. Doordrenk de bloedsomloop met D-PBS. Klem een groot bloedvat vast (onder de voorpoot of aan de onderkant van het middenrif) en doordrenk D-PBS door de rechterventrikel (onderkant van het hart, naar boven) door langzaam op het uiteinde van de spuit te duwen. Als de naald niet zichtbaar is door de hartwand, bevindt deze zich waarschijnlijk in de linker hartkamer. Hierdoor wordt bloed uit de longen verwijderd.
    OPMERKING: Duw geen luchtbellen. Als er luchtbellen in de leiding zitten, verwijder deze dan voordat u met de spuit op D-PBS drukt. Als endotheelceldood een probleem is, is het zachter om zwaartekrachtperfusie te gebruiken in plaats van PBS met de hand te duwen.
  8. Als u alleen weefsel verzamelt voor histologie of immunofluorescentie, gaat u verder met stap 7.9; als u alleen voor eencellige suspensie verzamelt, snijdt u alle longlobben af en plaatst u ze in PBS op ijs, en gaat u verder met stap 7.11.
  9. Longinflatie voor stroomafwaartse immunofluorescentie of histologie:
    1. Blaas de longen op met 2% paraformaldehyde (PFA) en dehydrateer met ethanol voor paraffine-inbedding of blaas op met 2% PFA en dehydrateer door sucrose voor cryosectie.
    2. Voor RNA-detectietechnieken zoals RNAscope of hybridisatiekettingreactie (HCR), fixeert u de longen in 4% PFA. Voor de beste fixatie blaast u de longen op in agarose met een ultralaag smeltend gehalte van 2% en snijdt u onmiddellijk op een vibrerende microtoom in 2% of 4% PFA in een weefselkweekplaat voor stroomafwaartse immunofluorescentie.
  10. Longinflatie met de hand:
    1. Blaas de longen met de hand op met een spuit en een naald van 21-23 G met of zonder slang of met behulp van de zwaartekracht door een tube PFA op een ringstandaard 30 cm boven het oppervlak van de bank te bevestigen.
    2. Nadat u de luchtpijp hebt geïsoleerd, steekt u de naald in de bovenkant van de luchtpijp, schuint u deze af, zonder de onderkant van de luchtpijp te doorboren, en spant u de hechtdraad rond de luchtpijp en de naald aan voordat u vloeistof inbrengt.
      OPMERKING: Het gebruik van een scherpe naald brengt een klein risico op tracheale punctie met zich mee in vergelijking met een naald met stompe punt, en de onderzoekers moeten tijdens de procedure zeer voorzichtig zijn om schade te voorkomen. Als een scherpe naald de luchtpijp doorboort, moet een naald met stompe punt worden gebruikt.
  11. Om een eencellige suspensie te maken voor stroomafwaartse flowcytometrie of single-cell sequencing-analyse, verwijdert u longweefsel uit D-PBS en hakt u longweefsel fijn met een schaar en hakt u vervolgens 2-3 minuten met een scheermesje om nog fijnere weefselstukjes te verkrijgen.
  12. Dissocieer in digestbuffer met 480 E/ml collagenase I, 100 μL/ml dispase en 2 μL/ml DNase in D-PBS, bij 37 °C gedurende 30-35 min. Filtreer door de filters van 100 μm en 40 μm, lyseer alle resterende rode bloedcellen met behulp van ammoniumchloride-kalium (ACK) lysisbuffer en suspendeer in 1% BSA in PBS voor downstreamverwerking en analyse.
    OPMERKING: Om virale infectie en klaring na infectie in de longen te detecteren, is het mogelijk om de virale belasting te evalueren met behulp van een qRT-PCR- of TCID50-test in longhomogenaten om virale replicatie te meten. Neuraminidase en capsidekleuring kunnen ook worden gebruikt om virale infecties op te sporen. De virale klaring zou moeten plaatsvinden op dag 8-9 na infectie18,19, terwijl het herstel en de regeneratie van longweefsel enkele weken aanhoudt 9.

Resultaten

In vergelijking met niet-geïnfecteerde, met PBS behandelde muizen zullen IAV-geïnfecteerde muizen heterogene weefselbeschadiging vertonen (Figuur 1A). Weefselschade kan worden gekwantificeerd met behulp van een k-means clustering-algoritme in MATLAB20 (Figuur 1B). IAV-geïnfecteerde muizen beginnen tussen 3-4 dagen na infectie af te vallen. Bij een ideale titer verliezen muizen tussen de 20-30% van hun oorspronkelijke lichaamsgewicht, waarbij het maximale gewichtsverlies 8-10 dagen na infectie (dpi) optreedt (Figuur 1C). Tegen 11-12 dpi zouden muizen moeten beginnen aan te komen en zouden ze tegen 14 dpi binnen 10-15% van hun oorspronkelijke lichaamsgewicht moeten zijn. Voor onderzoek naar regeneratie is het nuttig als de meeste muizen in het experiment afvallen en weefselbeschadiging ervaren, maar niet sterven. Vanwege de heterogeniteit in weefselbeschadiging (Figuur 1A,B) en de mogelijke variabiliteit in intranasale toediening, is het echter normaal dat meerdere muizen in een experiment niet afvallen of weefselbeschadiging ervaren en dat meerdere muizen >30% lichaamsgewicht verliezen, wat resulteert in euthanasie (Figuur 1D). Experimenten die proberen een verschil in overleving en gewichtsverlies te bepalen tussen bijvoorbeeld muizen met KO van een bepaald gen en hun WT-controles, moeten mogelijk de titer en dosering van IAV aanpassen en zullen een powerberekening moeten uitvoeren om de steekproefomvang te bepalen die nodig is om een dergelijk verschil in deze twee parameters te detecteren.

Naast veranderingen in de algehele weefselstructuur en de gezondheid van muizen, treden transcriptionele veranderingen in alle cellulaire compartimenten van de longen op in de loop van de reactie van het weefsel op schade. Dit omvat zowel voorbijgaande celtoestanden die uiteindelijk verdwijnen als het weefsel wordt gerepareerd, inclusief overgangs- of intermediaire epitheelceltoestanden en myeloïde immuunceltoestanden, als persistente celtoestanden die niet bijdragen aan functioneel herstel, waaronder Krt5+-epitheelcellen en TrkB+-endotheelcellen9. In het capillaire endotheel van de muizenlong ontstaat bijvoorbeeld een voorbijgaande interferon-gestimuleerde endotheelceltoestand bij 6 dpi, gekenmerkt door hoge expressie van interferon-gestimuleerde genen (Figuur 2A). Deze toestand wordt opgelost met 11-19 dpi (Figuur 2A). Een door letsel geïnduceerde capillaire endotheliale (iCAP) toestand ontstaat bij 11 dpi, gekenmerkt door hoge expressie van Ntrk2 (TRKB), Sparcl1 en Bnip3 (Figuur 2B). In tegenstelling tot de interferon-gestimuleerde endotheelceltoestand, blijft de iCAP-endotheelceltoestand dan bestaan in gebieden met ernstig beschadigd weefsel en is deze een jaar na infectie nog steeds aanwezig (Figuur 2C). Voorbijgaande alveolaire epitheelceltoestanden, waaronder alveolaire overgangscellen en onrijpe alveolaire type I epitheelceltoestanden (AT1), ontstaan ook na infectie (Figuur 2D). Ten slotte resulteert infectie in verlies van veel endogene alveolaire macrofagen (aMAC_a) en hun reconstitutie van zowel inflammatoire monocyten (iMON) als endogene aMAC's. Alveolaire macrofagen 1 jaar na infectie hebben verschillende transcriptietoestanden (aMAC_a en aMAC_b), afhankelijk van hun oorsprong (Figuur 2E)9. Voorbijgaande en aanhoudende celtoestanden die ontstaan na acuut longletsel rechtvaardigen verder onderzoek, aangezien hun abnormale gedrag binnen de niche productief of negatief kan bijdragen aan succesvol weefselherstel en de daaropvolgende weefselfunctie. Single-cell RNA-sequencinggegevens zijn eerder gepubliceerd9 en worden gedeponeerd in de Gene Expression Omnibus als GEO: GSE262927.

figure-results-1
Figuur 1: Monitoring van longbeschadiging en diergezondheid. (A) Hematoxyline- en eosine (HE)-kleuring van longweefselsecties van een nagebootste (PBS-behandelde) long aan de linkerkant en een IAV-geïnfecteerde long aan de rechterkant. Vergeleken met de niet-beschadigde long vertoont de IAV-geïnfecteerde long heterogene weefselschade. Schaalbalken, 1 mm. (B) Met behulp van een k-means clustering-algoritme in MATLAB20 kan weefselbeschadiging worden gekarakteriseerd als ernstig (rood), beschadigd (groen) of normaal (blauw). Het is belangrijk op te merken dat in de met PBS behandelde longkwab aan de linkerkant de luchtwegstructuren worden geclassificeerd als "ernstig" vanwege de dichtheid en kleuringsintensiteit van luchtwegepitheelcellen. Het is echter nog steeds mogelijk om gemakkelijk het verschil te onderscheiden tussen met PBS behandelde en met griep geïnfecteerde longen, gegeven deze basislijn. Schaalbalken, 1 mm. (C) Voorbeeld van een afslankcurve van een representatief IAV-infectie-experiment waarbij 13 dagen na infectie (dpi) muizenlongen werden verzameld. De curve bevat gegevens van zes wild-type muizen en punten geven het gemiddelde aan, terwijl foutbalken de standaardfout van het gemiddelde vertegenwoordigen. (D) Voorbeeld overlevingscurve van een representatief IAV-infectie-experiment waarbij muizenlongen werden verzameld 14 dagen na infectie (dpi). De curve bevat gegevens van zeven wildtype muizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Monitoring van veranderingen in de toestand van capillaire endotheelcellen na IAV-infectie. (A) Een interferon-gestimuleerde EC-toestand ontstaat bij 6 dpi die wordt opgelost tussen 11-19 dpi. Heranalyse van gepubliceerde eencellige RNA-sequencinggegevens van muizenlongen op verschillende tijdstippen na griepinfectie toont aan dat de interferonmodulescore in alle capillaire endotheelceltypen het hoogst is met 6 dpi. Gegevens werden opnieuw geanalyseerd met behulp van R en de interferonmodulescore is gebaseerd op de expressie van 87 interferon-gestimuleerde genen binnen elk celtype. CAP1, capillaire type 1 endotheelcel; iCAP, door letsel geïnduceerde endotheelcel; CAP2, capillaire type 2 endotheelcel; EC, endotheelcel. (B) Daarentegen ontstaat een door letsel geïnduceerde EC-toestand die wordt gekenmerkt door expressie van Ntrk2 (TRKB) bij 11 dpi en houdt aan tot een jaar na infectie. Schaalbalk, 500 μm. (C) Transcriptionele gegevens van eencellige RNA-sequencing van longcapillaire endotheelcellen na griepinfectie tonen de dynamische aard van de capillaire endotheelceltoestand tijdens weefselherstel aan. (D) Alveolaire epitheelcellen ervaren ook celplasticiteit na een griepinfectie. Een alveolair overgangsceltype ontstaat tussen 6-11 dpi en wordt opgelost door 19 dpi. Een onrijpe AT1-celtoestand (AT1_c) ontstaat bij 11 dpi en houdt aan tot 90 dpi. (E) Na infectie gaan veel bestaande alveolaire macrofagen (aMAC_a) verloren en wordt een instroom van inflammatoire monocyten (iMON) gezien bij 6 dpi. De alveolaire macrofaagpopulatie wordt gereconstitueerd door zowel bestaande aMAC's om de aMAC_a populatie te regenereren, als door inflammatoire monocyten, waardoor de aMAC_b populatie ontstaat. Hoewel beide een alveolaire macrofaagtoestand vertegenwoordigen, kunnen de resulterende aMAC's transcriptioneel worden onderscheiden. Grafieken in (C-E) geven het percentage cellen in elke populatie aan op elk tijdstip in de longitudinale influenza-infectiedataset en zijn gegenereerd met behulp van R. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: Voorbeeldlogboek voor verwondingen, gewichtslogboeken en logboeken voor de lichaamsconditiescore (BCS) voor het monitoren van dieren na een griepinfectie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Hier hebben we een handige methode gerapporteerd om het griepvirus in muizen over te brengen om snelle en effectieve schade aan de longen van muizen te initiëren en mechanismen van zowel succesvolle regeneratie als dysplastisch herstel te bestuderen. We tonen aan dat intranasale inoculatie van A/PR/8/34 IAV een stressvrije techniek kan zijn. Het duurt minder dan 2 minuten per muis om de inoculatie te voltooien na isofluraan-anesthesie. Het is een eenvoudige en niet-invasieve techniek van virale inoculatie die de natuurlijke infectieroute volgt en het mogelijk maakt om de reactie van zowel het weefsel als het immuunsysteem op een meer fysiologisch relevante manier te bestuderen. Virus dat via de neusgaten van de muis wordt geïnoculeerd, kan zowel mucosale als systemische immuniteit induceren21. Wat nog belangrijker is, de schade veroorzaakt door virale infectie is duidelijk zichtbaar in plakjes longweefsel die zijn gekleurd met hematoxyline en eosine (HE) kleuring22 (Figuur 1). Een volledige tijdlijn van verwachte transcriptionele veranderingen in longceltypen in elk compartiment van de long is eerder gepubliceerd9. Hier hebben we een subset van deze gegevens opnieuw geanalyseerd om aan te tonen dat in de capillaire endotheel-, alveolaire epitheel- en myeloïde immuuncompartimenten van de muizenlongen voorbijgaande en aanhoudende transcriptieveranderingen optreden in de loop van de respons op griepinfectie van niet-geïnfecteerde muizen tot een jaar na infectie (Figuur 2).

Er zijn verschillende kritieke stappen in dit protocol en de juiste probleemoplossing van deze stappen zal een succesvol experiment opleveren. A/PR/8/34 influenzavirus is een aan muizen aangepaste griepstam die mensen niet productief infecteert23, maar het is altijd belangrijk om tijdens het experiment alle aangegeven veiligheidsprocedures te volgen om elke mogelijkheid van infectie van laboratoriumpersoneel te voorkomen. Toediening van isofluraan-anesthesie is een cruciale stap om de succesvolle toediening van het virus te garanderen, aangezien muizen het virus niet goed zullen inademen als ze wakker zijn. Controleer de ademhaling en controleer de bewegingen van de muiskop tijdens de procedure om er zeker van te zijn dat het virus in beide neusgaten wordt ingeënt. Als muizen niet volledig verdoofd zijn, kunnen er belletjes ontstaan, die zowel de inademing van het virus beperken als aerosolen genereren. Beide uitkomsten moeten worden vermeden en muizen moeten terug op de isofluraan-neuskegel worden geplaatst als niezen of luchtbellen in de neusgaten worden waargenomen. Monitoring na infectie, zoals het meten van gewichtsverlies, lichaamsconditiescore en gezondheidstoestand, evenals het verstrekken van een herstelvoedingssupplement, is ook een belangrijk onderdeel van dit experiment. Als wordt waargenomen dat muizen niet voldoende gewicht verliezen of niet de verwachte hoeveelheid weefselbeschadiging hebben (Figuur 1), is het mogelijk dat de dosis te laag is; Aan de andere kant, als veel muizen het eindpunt van 30% gewichtsverlies bereiken, is het mogelijk dat de dosis te hoog is. In beide gevallen is het het beste om de juiste dosis te bepalen door middel van een empirische titer van de partij virus met behulp van een cohort C57BL/6-muizen zoals we hier beschrijven.

Aangezien griepinfectie wereldwijd nog steeds voorkomt, ernstige aandoeningen van de luchtwegen veroorzaakt en dodelijk kan zijn, is het van het grootste belang om het proces van virale infectiviteit en de cellulaire reactie op infectie en weefselbeschadiging in de longen te begrijpen. De intranasale infectiemethode die in deze studie wordt beschreven, kan daarom helpen bij de identificatie van belangrijke regulerende mechanismen en de ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen voor longziekten. Bovendien zouden toekomstige toepassingen van de techniek een andere stam van het aan de muis aangepaste influenzavirus, zoals X31, kunnen gebruiken om de effecten op de structuur en functie van het longweefsel te bepalen in het geval van herhaalde luchtweginfecties. Aangezien veel mensen tijdens hun leven te maken krijgen met meerdere luchtweginfecties, kan een dergelijke uitbreiding van dit model belangrijke implicaties hebben voor de studie van de regeneratie van longweefsel en dus voor de volksgezondheid.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd ondersteund door het Intramural Research Program van de Amerikaanse National Institutes of Health (NIH), National Cancer Institute, Center for Cancer Research.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL tube Fisher Scientific02-682-557
100 µm celstrainerFalcon352360
15 mL conische buisFalcon352196
1x PBSGibc010010-023
40 µm celstrainerFalcon352340
5 mL buisGlobe6101C
50 mL conische buisFalcon352098
A/PR/8/34 Influenza Virus stockATCC VR-95PQVerschillende partijen hebben een verschillend virustiter
ACK Lysis BufferQuality Biological118-156-101
Anti-TRKB AntilichaamR&D SystemsAF1494
BleekmiddelClorox10% Bleekmiddel
Bovine Serum AlbumineSigma AldrichA8022
CO2 Anesthesie Inductie KamerElkeN/A
Collagenase Type IGibco17100017
DAPIMilipore Sigma28718-90-3
DispaseCorningCB-40235
Dissectiegereedschap: schaar, gebogen pincet, recht pincetElkeN/A
DnaseSigma Aldrich4716728001
D-PBSCorning21-031-CM
EthanolPharmco111000200
Glazen flesjesDWK Life Sciences986562
IJsemmerElkeN/A
IsofluraanCovetrus29404
Naalden, 21–23 GElkeN/A
P20/P200 pipet PipetmanF144056M/F144058M,
P20/P200 pipettipsThomas Scientific1159M43/1159M40
Paraformaldehyd (PFA) Thermo ScientificJ19943-k22%PFA
PipetmanElkeN/A
Kunststof of kartonnen vriesdozenElkeN/A
VeiligheidsmesElkeN/A
Ring StandElkeN/A
Serologische pipetten, 5 mLFalcon357543
Slide Top Inductie Muis Isofluraan KamerSomni Scientific
HechtdraadFisher ScientificNC9422522
Spuitbuis en luer-locksElkeN/A
Spuit, 10 mLElkeN/A
Bureauanesthesie Machine IsofluraanOhmedaOhmeda Isotec- 4De stroomsnelheid moet 2.5–3% zijn
Ultra-lage smeltpunt agaroseSigma AldrichA5030-1G
WeegschaalOHAUSCS200

Referenties

  1. Mammoto, A., Mammoto, T. Vascular niche in lung alveolar development, homeostasis, and regeneration. Front Bioeng Biotechnol. 7, 318(2019).
  2. Tsikis, S. T., Hirsch, T. I., Fligor, S. C., Quigley, M., Puder, M. Targeting the lung endothelial niche to promote angiogenesis and regeneration: a review of applications. Front Mol Biosci. 9, 1093369(2022).
  3. Torrego, A., Pajares, V., Mola, A., Lerma, E., Franquet, T. Influenza A (H1N1) organising pneumonia: figure 1. BMJ Case Rep. 2010, bcr1220092531(2010).
  4. Murota, M., et al. Influenza H1N1 virus-associated pneumonia often resembles rapidly progressive interstitial lung disease seen in collagen vascular diseases and COVID-19 pneumonia; CT-pathologic correlation in 24 patients. Eur J Radiol Open. 7, 100297(2020).
  5. Niethamer, T. K., et al. Defining the role of pulmonary endothelial cell heterogeneity in the response to acute lung injury. eLife. 9, e53072(2020).
  6. Klomp, M., Ghosh, S., Mohammed, S., Khan, M. N. From virus to inflammation, how influenza promotes lung damage. J Leukoc Biol. 110 (1), 115-122 (2021).
  7. Newton, A. H., Cardani, A., Braciale, T. J. The host immune response in respiratory virus infection: balancing virus clearance and immunopathology. Semin Immunopathol. 38 (4), 471-482 (2016).
  8. Jones, D. L., et al. An injury-induced mesenchymal-epithelial cell niche coordinates regenerative responses in the lung. Science. 386 (6727), eado5561(2024).
  9. Niethamer, T. K., et al. Longitudinal single-cell profiles of lung regeneration after viral infection reveal persistent injury-associated cell states. Cell Stem Cell. 32 (2), 302-321.e6 (2025).
  10. Belser, J. A., Gustin, K. M., Katz, J. M., Maines, T. R., Tumpey, T. M. Comparison of traditional intranasal and aerosol inhalation inoculation of mice with influenza A viruses. Virology. 481, 107-112 (2015).
  11. Oltean, T., Maelfait, J., Saelens, X., Vandenabeele, P. Need for standardization of influenza A virus-induced cell death in vivo to improve consistency of inter-laboratory research findings. Cell Death Discov. 10 (1), 247(2024).
  12. Nguyen, T. -Q., Rollon, R., Choi, Y. -K. Animal models for influenza research: strengths and weaknesses. Viruses. 13 (6), 1011(2021).
  13. Jin, X. -Y., et al. Comparative pathogenicity of influenza virus-induced pneumonia mouse model following intranasal and aerosolized intratracheal inoculation. Virol J. 21 (1), 240(2024).
  14. Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 164(2012).
  15. Cantu, A., Gutierrez, M. C., Dong, X., Leek, C., Anguera, M., Lingappan, K. Modulation of recovery from neonatal hyperoxic lung injury by sex as a biological variable. Redox Biol. 68, 102933(2023).
  16. Sunagar, R., Kumar, S., Namjoshi, P., Rosa, S. J., Hazlett, K. R. O., Gosselin, E. J. Evaluation of an outbred mouse model for Francisella tularensis vaccine development and testing. PLoS One. 13 (12), e0207587(2018).
  17. Cowley, P. M., Roberts, C. R., Baker, A. J. Monitoring the health status of mice with bleomycin-induced lung injury by using body condition scoring. Comp Med. 69 (2), 95-102 (2019).
  18. Gonzalez, A. J., Ijezie, E. C., Balemba, O. B., Miura, T. A. Attenuation of influenza A virus disease severity by viral coinfection in a mouse model. J Virol. 92 (23), e00881-e00918 (2018).
  19. Lv, J., et al. Kinetics of pulmonary immune cells, antibody responses and their correlations with the viral clearance of influenza A fatal infection in mice. Virol J. 11, 57(2014).
  20. Liberti, D. C., et al. Alveolar epithelial cell fate is maintained in a spatially restricted manner to promote lung regeneration after acute injury. Cell Rep. 35 (6), 109092(2021).
  21. Cipolla, D., et al. Inhalable and nasal biologics: analytical, formulation, development, and regulatory considerations. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 2024, (2025).
  22. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (6), (2014).
  23. Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal models for influenza virus pathogenesis and transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Intranasale infectiealveolaire epitheelcellenendotheliale celtoestandensingle cell sequencingflowcytometriedigestie van longweefselimmunofluorescentiekleuringalveolaire macrofagen
Modellering van dysplastisch en functioneel longalveolair herstel na griepinfectie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.