Onderzoeksartikel
CD44 vergemakkelijkt de pathogenese van de ziekte door inflammatoire cascades en osteoclastische differentiatie te orkestreren via activering van de PI3K/Akt-route. Glyciteïne oefent therapeutische effecten uit op manifestaties van comorbide osteoporose (OP) + parodontitis (PD) door gerichte verzwakking van CD44-gemedieerde signalering.
Dit onderzoek verduidelijkt de kritische moleculaire determinanten die geassocieerd zijn met de comorbiditeit van osteoporose (OP) en parodontitis (PD) door middel van proteomische profilering, terwijl de regulerende functie van CD44 bij experimentele parodontitis in een OP-muizenmodel wordt afgebakend. Fase I omvatte het verzamelen van serummonsters van patiënten met OP+PD (n = 3) en gezonde controles (n = 6) die routinematige gezondheidsevaluaties ondergingen in onze instelling voor vergelijkende proteomische analyse. Daaropvolgende translationele validatie van differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's) en bijbehorende signaalcascades werd uitgevoerd in klinische monsters en OP+PD-muismodellen. Om de rol van CD44 in PD-progressie onder osteoporotische omstandigheden mechanistisch te karakteriseren, werd een OP-muizenmodel gegenereerd via bilaterale ovariëctomie, gevolgd door experimentele PD-inductie via ligatuurplaatsing. Uitgebreide beoordelingen omvatten histomorfometrische veranderingen via hematoxyline-eosinekleuring, microarchitecturale botanalyse in het maxillaire eerste molaire gebied met behulp van micro-CT, en immunoblotting-evaluatie van fosfoinositide-3-kinase (PI3K)/Akt-routecomponenten. Parallelle farmacologische screening van het netwerk in combinatie met moleculaire docking-simulaties werd uitgevoerd om bioactieve bestanddelen van Angelica sinensis met therapeutisch potentieel te identificeren. Proteomische ondervraging identificeerde CST3, A2M, CD44, CDH13, CETP en VWF als kandidaat-pathogene mediatoren in de pathogenese van OP+PD. In onze handen toonde gensetverrijkingsanalyse aan dat PI3K/Akt-signalering functioneert als een belangrijke bemiddelaar van de progressie van de OP+PD-ziekte. Kwantitatieve reverse-transcriptie PCR-gebaseerde validatie bevestigde significante CD44-opregulatie in zowel klinische als experimentele OP+PD-cohorten. In vivo modulatie via CD44-onderdrukking herstelde de integriteit van parodontaal weefsel aanzienlijk, verminderde infiltratie van inflammatoire cellen en versterkte de microarchitectuur van alveolaire botten bij OP-muizen, gelijktijdig met remming van de PI3K/Akt-route. Netwerkfarmacologie onthulde glyciteïne als de primaire bioactieve fytochemische stof in Angelica sinensis, met CD44 geïdentificeerd als het centrale moleculaire doelwit. Glyciteïne verbeterde de alveolaire botstructuur in OP+PD-muizen, waardoor de botvolumefractie (BV/TV), de trabeculaire dikte (Tb.Th), de botmineraaldichtheid (BMD) toenam en het trabeculair aantal (Tb.N) en de verhouding tussen botoppervlak en botvolume (BS/BV) werd verminderd, wat wijst op een gezondere botkwaliteit, mechanistisch toegeschreven aan CD44-signaalasverzwakking.
Parodontitis (PD) is een complexe, gemengde microbiële ziekte die wordt veroorzaakt door de afzetting van pathologische biofilms in de gingivale sulcus1. Het wordt gekenmerkt door een onbalans in de micro-ecologische omgeving die een pathologische ontstekingscascade binnen de gastheer veroorzaakt, wat uiteindelijk leidt tot onomkeerbare progressieve schade aan het cementum, het parodontale ligament en het alveolaire bot, die componenten zijn van het parodontale hechtingssysteem. Dit kan leiden tot het losraken of zelfs verliezen van de tand2. De hoeveelheid werd gestandaardiseerd voor vergelijkbaarheid, en de meest recente epidemiologische gegevens3 geven aan dat meer dan 1,066 miljard mensen wereldwijd lijden aan ernstige parodontitis, met een leeftijdsgestandaardiseerde prevalentie van ongeveer 12,5%, wat wijst op aanzienlijke variatie tussen internationale populaties.
Osteoporose (OP), een systemische botziekte, wordt gekenmerkt door een substantiële afbraak van de botmicrostructuur en een systematisch verlies van botmassa 4,5. Het risico op fracturen wordt sterk verhoogd door deze structurele zwakte, vooral bij oudere mensen. Met name personen van 65 jaar en ouder in Japan hadden een hogere prevalentie van parodontitis dan volwassenen tussen de 30 en 64 jaar. Postmenopauzale vrouwen hebben een hogere incidentie van parodontitis en ervaren vaak andere gezondheidsproblemen 6,7. De studie voorspelt dat de ziektelast van 2005 tot 2025 met meer dan 50% zal toenemen, waarbij de economische kosten naar verwachting zullen stijgen van $ 17 miljard tot $ 25 miljard. De studie voorspelt dat de ziektelast van 2005 tot 2025 met meer dan 50% zal toenemen, waarbij de economische kosten naar verwachting zullen stijgen van $ 17 miljard tot $ 25 miljard. Deze trend benadrukt de aanzienlijke sociaaleconomische impact van deze parodontitis. Bovendien is er bij vrouwelijke patiënten met parodontitis en gingivitis een duidelijke positieve correlatie tussen de duur van de ziekte en de chroniciteit ervan en de verhoogde gezondheidsrisico's8.
Eerdere studies gaven aan dat OP de ontwikkeling van PD zou kunnen bevorderen en vice versa vanwege gemeenschappelijke risicofactoren voor beide ziekten, zoals veroudering, roken en onvoldoende calcium- en vitamine D-inname. In de postmenopauzale vrouwelijke populatie kan ernstige OP gepaard gaan met een verlaagd mineraalgehalte in de onderkaak, wat in verband kan worden gebracht met deficiënte niveaus van parodontale aanhechting9. Het is aangetoond dat OP-geassocieerde verminderde botdichtheid PD-geïnduceerde alveolaire botresorptie kan versnellen, waardoor de invasie van parodontale pathogenen wordt bevorderd10. Onder een reeks gezondheidsuitdagingen die verband houden met leeftijds- en fysiologische verandering, zijn PD en OP bijzonder prominent met de versnelling van de vergrijzing van de wereldbevolking en de aanzienlijke toename van het aantal vrouwen in de menopauze. Daarom is het verduidelijken van de relevante indicatoren en hun associaties van cruciaal belang voor ziektepreventie, behandeling en prognostische beoordeling. Gemotiveerd door deze aspecten gebruikte deze studie proteomics om sleuteleiwitten te screenen, met de nadruk op CD44-gemedieerde PI3K/Akt-signalering, bij de ontwikkeling van OP+PD, waarbij de regulerende rollen en mogelijke mechanismen van sleuteleiwitten werden onderzocht met behulp van een experimenteel PD-model in OP-muizen. Verdere screening van gerichte therapeutische middelen die aanwezig zijn in Angelica sinensis - een traditioneel Chinees geneeskrachtig kruid dat veel wordt gebruikt in de klinische praktijk vanwege zijn ontstekingsremmende en botbeschermende eigenschappen, en waarvan eerder is gemeld dat het botverlies verlicht en ontstekingsreacties moduleert bij osteoporose en parodontitis. Geleid door netwerkfarmacologie en moleculaire docking, werd glyciteïne geïdentificeerd als de primaire bioactieve fytochemische stof en een rationele kandidaat voor OP+PD-interventie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Alle dierproeven zijn uitgevoerd volgens de richtlijnen van de instelling voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Het onderzoeksprotocol werd beoordeeld en goedgekeurd door de Ethische Commissie Dieren. Alles werd in het werk gesteld om dierenleed tot een minimum te beperken.
Deze studie heeft tot doel de rol van CD44-gemedieerde regulatie van de PI3K/Akt-route in osteoclastische differentiatie en ontstekingsprogressie tijdens comorbide osteoporose en parodontitis (OP+PD) te evalueren en te bepalen of glyciteïne, een bioactieve stof van Angelica sinensis, deze effecten therapeutisch kan moduleren. De grondgedachte komt voort uit opkomend bewijs dat CD44-overexpressie koppelt aan pathologische botresorptie en immuunontregeling bij OP+PD 11,12,13. Door proteomics, in vivo modellering en netwerkfarmacologie te integreren, onderzoekt het protocol systematisch moleculaire mechanismen en therapeutische interventies om ziekteprogressie te verminderen14.
De steekproefomvang voor in vivo experimenten was gebaseerd op eerdere studies en poweranalyse, wat resulteerde in n = 6 per groep, wat zorgt voor voldoende statistisch vermogen om significante verschillen (P < 0,05) tussen behandelingsomstandigheden te detecteren. Glyciteïne werd toegediend in doseringen van 50 mg/kg en 100 mg/kg, gesuspendeerd in 5% DMSO in olijfolie en toegediend via dagelijkse orale sonde. Muizen werden gedurende 8 weken na de inductie van PD gecontroleerd. Ligatuurplaatsing om parodontale ontsteking te induceren maakte gebruik van 5-0 zijdedraad, en bilaterale ovariëctomie werd uitgevoerd onder 0,3% pentobarbitale natriumanesthesie (0,5 ml/100 g)15. Bovendien werden moleculaire testen, waaronder RT-qPCR, western blotting en ELISA, uitgevoerd met behulp van gevalideerde protocollen16, en histologische evaluaties, zoals hematoxyline-eosine (H&E) en methyleenblauwkleuring, volgden vastgestelde tijdlijnen en kleuringsduur.
Alle experimentele procedures met chemische reagentia, kleurstoffen en biologische monsters werden uitgevoerd volgens standaard bioveiligheidsprotocollen om gezondheidsrisico's te minimaliseren. Gevaarlijke materialen zoals formaline, EDTA, methyleenblauw en zuur fuchsine werden behandeld met persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), waaronder handschoenen, maskers en veiligheidsbrillen. Alle afvalstoffen, inclusief gebruikte reagentia en verontreinigde wegwerpartikelen, werden ingezameld in aangewezen containers voor biologisch gevaarlijk en verwijderd via gecertificeerde verwijderingsdiensten voor gevaarlijk afval volgens institutionele en milieuveiligheidsrichtlijnen. Figuur 1 toont de algemene experimentele workflow.
Verzameling van klinische gegevens
In onze studie hebben we systematisch klinische basisgegevens en gedetailleerde medische geschiedenissen van drie OP+PD-patiënten en zes controlepersonen verzameld en uitgebreid geanalyseerd, inclusief demografische en leefstijlfactoren, evenals anatomische en gemetastaseerde profielen. Bovendien werd het testresultaat voor HPV-infectie (positief of negatief) rigoureus bevestigd. Het progressiestadium of recidiefpatroon van gemetastaseerde laesies werd in detail vastgelegd. Tijdens de eerste 7 dagen van immunotherapie werden de bloedmonsters van de patiënten systematisch verzameld en gestandaardiseerd, inclusief biochemische indicatoren zoals routinetests in het bloed. Routinematige bloedtesten werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de standaardprocedures om belangrijke parameters zoals bloedplaatjes, lymfocyten en neutrofielen nauwkeurig te evalueren. Serumalbumine werd parallel gemeten en de leverfunctie werd beoordeeld door kwantitatieve analyse van de globulineconcentratie-index.
Patiënten
Beoordeling van de botmineraaldichtheid en stratificatie van deelnemers
We hebben een systematische vergelijking gemaakt van botdichtheidsmetingen in het lumbale gebied en de femurhals. Alle onderzoeken werden uitgevoerd door ervaren radiologen op onze afdeling, met behulp van precisieapparatuur om de botdichtheidswaarden nauwkeurig te kwantificeren. Om een gestandaardiseerde monsterafname te garanderen, moesten de deelnemers ten minste 8 uur nuchter voor de bemonstering. Door botdichtheidsgegevens te integreren met uitgebreide parodontale beoordelingsgegevens, hebben we de proefpersonen strikt gecategoriseerd in de osteoporose met parodontitis (OP+PD)-groep of de gezonde controlegroep (HC), om ervoor te zorgen dat de geslachtsverhouding perfect overeenkwam tussen de twee groepen. De geslachtsmatching verwijst naar de gelijke verdeling van vrouwen tussen de OP+PD en gezonde controlegroepen. Er werden echter alleen vrouwelijke deelnemers in deze studie opgenomen om zich te concentreren op postmenopauzale osteoporose; Er waren geen mannelijke proefpersonen in beide groepen. De studie hield zich aan de ethische richtlijnen van de Verklaring van Helsinki, waarbij alle deelnemers formele formulieren voor geïnformeerde toestemming ondertekenden en hun rechten volledig beschermden.
Diagnostische parameters
Osteoporose werd gedefinieerd volgens de Chinese richtlijnen voor diagnose en behandeling van primaire osteoporose (2022)17, met diagnostische drempels vastgesteld op T-score ≤ -2,5 standaarddeviaties (SD) voor lumbale (L1-L4) of heup-BMD. De stadiëring van parodontitis volgde de 2018 World Workshop Classification of Parodontitis18, met inclusie beperkt tot gevallen van graad A, stadium II-III. Inclusiecriteria: Postmenopauzale vrouwen van 50-65 jaar, dubbele diagnose van OP en PD die aan de bovenstaande criteria voldoen, afwezigheid van auto-immuunziekten, geen voorgeschiedenis van kwaadaardige gezwellen, normale cardiopulmonale, lever- en nierfunctie. Uitsluitingscriteria: Geweigerde deelname door patiënt of familie, recente (≤6 maanden) farmacotherapie voor OP of PD.
Proteomische profilering van serummonsters
Serummonsters van drie OP+PD-patiënten en zes controlepersonen werden verzameld voor proteomische analyse. Relatieve eiwitkwantificering werd bereikt door middel van standaardprocedures en differentieel tot expressie gebrachte eiwitten werden gedefinieerd als eiwitten met een P < 0,05 en een vouwverandering >1,5 19.
Analyse van genensetverrijking (GSEA)
GSEA werd gebruikt om belangrijke signaalroutes te identificeren die ontregeld zijn tussen de controle- en OP+PD-cohorten. Ruwe transcriptomische gegevens werden eerst getransformeerd met behulp van log2-conversie en genormaliseerd via kwantielnormalisatie om batcheffecten te verwijderen. Genensets met meerdere biologische functies werden gescreend uit de Molecular Signatures Database (MSigDB) en statistische significantie werd beoordeeld met behulp van de niet-parametrische Wilcoxon-rangschikkingsomtest. Verrijkingsresultaten werden gerapporteerd met behulp van genormaliseerde verrijkingsscores en valse ontdekkingspercentages (FDR < 0,25).
Gewogen analyse van genco-expressienetwerken (WGCNA)
WGCNA werd gebruikt om genmodules te identificeren die significant geassocieerd zijn met OP+PD-fenotypes. Een zachte drempelmacht van 12 werd geselecteerd om een schaalvrije netwerktopologie te bereiken (R2 > 0,85), en Pearson-correlatieanalyse werd gebruikt om relaties tussen module-eigengenen en klinische eigenschappen te beoordelen. Functionele verrijkingsanalyses werden uitgevoerd om relevante biologische routes in sterk gecorreleerde modules bloot te leggen.
Opstelling van ovariëctomie-geïnduceerde osteoporotische muizenmodellen
Bij deze studie waren 116 vrouwelijke muizen van SPF-kwaliteit betrokken. Vóór de experimenten werden de dieren gehuisvest onder gecontroleerde temperatuur- en vochtigheidsomstandigheden gedurende een aanpassingsfase van 7 dagen, waarin ze gestandaardiseerd knaagdiervoer en gedestilleerd water kregen. Alle procedures voor het omgaan met dieren volgden strikt de ethische protocollen die zijn goedgekeurd door de ethische commissie van het Xi'an Jiaotong University Health Science Center, onder goedkeuring ID 0609. Het onderzoek is geregistreerd onder projectnummer [2024-054].
Chirurgisch protocol bilaterale ovariëctomie (OVX):
Muizen werden verdoofd via intraperitoneale injectie van 0,3% pentobarbitalnatrium (0,5 ml/100 g lichaamsgewicht). De dorsale vacht werd operatief onthaard en de dieren werden in dorsale lighouding op een verwarmd, steriel chirurgisch platform geplaatst. Na aseptische bereiding met 75% ethanol werden bilaterale paravertebrale incisies (1 cm lateraal van de wervelkolom) gemaakt ter hoogte van de niervetkussentjes. De eierstokslijmbeurs werd naar buiten gebracht en de eileider werd proximaal van de eierstok afgebonden met behulp van 5-0 zijden hechtingen, gevolgd door excisie van bilaterale eierstokken, geassocieerd vetweefsel en gedeeltelijke oviductale structuren. Musculofasciale en cutane lagen werden achtereenvolgens gesloten met 4-0 resorbeerbare hechtingen. Postoperatieve antisepsis werd uitgevoerd met 75% ethanol.
Controles voor schijnoperaties:
Schijngeopereerde muizen ondergingen identieke procedurele stappen, waaronder blootstelling aan de eierstokken en resectie van periovariumvetweefsel, zonder uitroeiing van de eierstokken.
Postoperatieve behandeling:
Postanesthetisch herstel werd vergemakkelijkt met behulp van circulerende waterverwarmingskussens tot volledige ambulatie. Analgesie werd gehandhaafd via subcutane carprofentoediening (5 mg/kg per dag) gedurende 72 uur na de operatie, aangevuld met profylactisch penicilline G (50.000 IE/kg) gedurende 48 uur om postoperatieve wondinfecties te voorkomen. De lichaamsmassa werd wekelijks gecontroleerd tijdens de 6 weken durende osteoporotische modelleringsfase, waarbij uitsluitingscriteria werden toegepast op dieren die >20% gewichtsverlies of klinische nood vertoonden.
Bouw van experimenteel OP+PD diermodel
Het experimentele PD-model is ontwikkeld op basis van het eerder vastgestelde OP-diermodel. Om draadbreuk te voorkomen en een vlotte inbreng tussen de kiezen te garanderen, werd 5-0 zijdehechtdraad gebruikt voor ligatie. Tijdens de procedure werd de mondhoek van de muis voorzichtig ingetrokken en werd de draad met een tang vastgepakt en voorzichtig in het cervicale gebied tussen de eerste en tweede kies geplaatst. De draad en de punt van de tang werden waterpas gehouden om trauma aan het mondslijmvlies te minimaliseren, waardoor het risico op bloedingen of sterfte werd verminderd. De andere hand trok voorzichtig aan het andere uiteinde van de draad en leidde deze geleidelijk naar de interproximale ruimte tussen de kiezen. Nadat de draad goed was gepositioneerd, werd een gedeelte nabij de buccale zijde met een tang vastgeklemd en voorzichtig tussen de tweede en derde kiezen geleid met behulp van dezelfde techniek. Zachte neerwaartse tractie zorgde voor een soepele doorgang van de zijde. Ten slotte werd de draad stevig om de tweede kies in het midden van de cervicale regio gebonden. De muizen kregen vervolgens de kans om te herstellen.
Kwantitatieve reverse transcriptie-polymerasekettingreactie (RT-qPCR)
De materiaaltabel geeft een overzicht van specifieke voorwaartse en achterwaartse primersequenties voor RT-qPCR gericht op genen die verband houden met ontsteking, stolling en celadhesie, waaronder CD44, CDH13, VWF en GAPDH. De primersequenties die worden gebruikt voor RT-qPCR-analyse zijn samengevat in Tabel 1.
Analyse van de westerse vlek
De expressiekarakteristieken van de belangrijkste eiwitten van de signaalroute in parodontale weefsels werden systematisch bestudeerd met behulp van western blotting. De parodontale weefsels werden onderworpen aan vries-dooi-homogenisatie met behulp van RIPA-buffer, die protease- en fosfataseremmers bevat, om het totale eiwit efficiënt te extraheren. Na centrifugatie met hoge snelheid (12.000 × g, 4 °C, 10 min) om het lysaat te scheiden, werd het supernatans gebruikt om de eiwitconcentratie nauwkeurig te meten met een BCA-kit, wat betrouwbare gegevens opleverde voor latere experimenten.
Voor elke experimentele groep werd 30 μg totaal eiwit geladen en gescheiden via een 10% SDS-PAGE-systeem. De opgeloste eiwitten werden vervolgens overgebracht naar PVDF-membranen met behulp van een semi-droge blotting-methode. Om achtergrondinterferentie te minimaliseren, werden de membranen geblokkeerd met 5% magere droge melk gedurende h bij omgevingstemperatuur. Vervolgens werden de membranen in een stabiele omgeving op 4 °C gehouden voor verdere verwerking.
De membranen werden vervolgens geïncubeerd met specifieke primaire antilichamen (zie Tabel met materialen) gedurende 2 uur bij °C. De volgende dag werd de TBST-buffer gebruikt voor grondig wassen en werden de membranen vervolgens behandeld met HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen in een verdunning van 1:10.000 gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur. Alle immunodetectiestappen werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met gestandaardiseerde protocollen om de consistentie en validiteit van de analyse van de signaalroute te garanderen20.
Door gebruik te maken van verbeterde chemiluminescentie (ECL) substraten om signalen vast te leggen en beeldvormingsapparatuur met hoge resolutie om eiwitbanden nauwkeurig te lokaliseren, werden de optische dichtheidswaarden van de banden kwantitatief geanalyseerd met behulp van ImageJ-software. Door de relatieve expressieniveaus van doeleiwitten/β-actine in elke groep systematisch te vergelijken met de controlegroep, werden uiteindelijk de activeringsgraad en dynamische veranderingen van de PI3K/Akt-route onder verschillende interventies nauwkeurig beoordeeld.
Enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA)
Met behulp van ELISA-kits (zie materiaaltabel) bereikte deze studie een nauwkeurige kwantificering van verschillende inflammatoire cytokines, waaronder TNF-α, IL-6, IL-1β en IL-4, in serummonsters. Het evalueerde ook de concentraties van TRAP5b, ALP en TGF-β als markers van osteoclastactiviteit. Een plaat met 96 putjes die was voorgecoat met capture-antilichamen werd geïncubeerd bij 25 °C met serummonsters die gedurende 2 uur 1:10 in PBS waren verdund, waardoor antigenen specifiek konden binden aan de geïmmobiliseerde capture-antilichamen. Na incubatie werden ongebonden stoffen via drie wasbeurten verwijderd met PBS-T (fosfaatgebufferde zoutoplossing met Tween-20). Vervolgens werden biotine-gelabelde detectie-antilichamen toegevoegd en gedurende 1 uur bij dezelfde temperatuur geïncubeerd. Vervolgens werd streptavidine-HRP geïntroduceerd om de gebiotinyleerde antilichamen te binden, en het mengsel werd nog eens 20 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd onder tegen licht beschermde omstandigheden. De enzymatische reactie werd vervolgens beëindigd met behulp van de stopoplossing en de absorptie werd gemeten bij 450 nm met behulp van een microplaatlezer om de cytokineconcentraties te bepalen.
Hematoxyline & Eosine (H&E) kleuring
Standaardmethoden werden gebruikt om H&E-kleuring uit te voeren op in paraffine ingebedde delen van parodontaal weefsel om microstructurele veranderingen te analyseren. Het monsterbereidingsproces omvatte de eerste fixatie in een 4% paraformaldehyde-oplossing gedurende 24 uur, gevolgd door graduele ethanoldehydratie (70%, 80%, 95% en 100%) en klaring in xyleen, en ten slotte inbedding in paraffine om 4 μm dikke secties21 te produceren. Na het ontwaxen in xyleen werden de monsters gerehydrateerd door middel van dalende ethanolconcentraties (100% tot 70%). Het kleuringsproces begon met een onderdompeling van 5 minuten in hematoxyline (Meisner's), gevolgd door spoelen onder stromend water, differentiatie in 1% zure alcohol in ethanol en nog een spoeling. Secties werden vervolgens gedurende 10 s gekleurd met 0,5% eosine om het protocol te voltooien.
Na het kleuren werden de objectglaasjes opnieuw gedehydrateerd in een gegradueerde ethanolreeks, geklaard in xyleen en verzegeld met montagemedium. De waarnemingen werden gedaan onder een microscoop die was uitgerust met 10x- en 40x-objectieven voor beeldacquisitie met hoge resolutie. Histologische analyse beoordeelde de structurele integriteit van parodontaal bindweefsel, infiltratie van inflammatoire cellen en morfologie van alveolaire botresorptie. Het ontstekingsniveau werd gescoord met behulp van een verbeterde Loe-Silness-index, waarbij twee pathologen die blind waren voor de identiteit van de steekproef de monsters onafhankelijk evalueerden via een semi-kwantitatieve schaal om objectiviteit en reproduceerbaarheid te garanderen22.
Methyleenblauwe kleuring
Deze studie maakte gebruik van de methyleenblauwkleuringsmethode op gestandaardiseerde, bewerkte maxillaire alveolaire botsecties om de mate van botresorptie te kwantificeren. De experimentele procedure begon met weefselfixatie: parodontale weefsels werden gedurende 24 uur gefixeerd in 10% neutrale formalineoplossing, gevolgd door een ontkalkingsbehandeling van 21 dagen in 10% EDTA (pH 7,4) oplossing. Na ontkalking werden de monsters in paraffine ingebed en bereid tot 4 μm dikke weefselsecties, die vervolgens op gesilaniseerde objectglaasjes werden gemonteerd. Het voorbehandelingsproces van de sectie omvatte het ontwassen van xyleen, hydratatie van gradiënt-ethanol en incubatie in een waterbad van 60 °C. De objectglaasjes werden vervolgens gedurende 15 minuten gekleurd met 0,1% methyleenblauwoplossing.
Na het kleuren werden de secties gedurende 1 minuut gewassen met gedestilleerd water dat was voorverwarmd tot 60 °C, zodat overtollige kleurstof effectief kon worden verwijderd zonder de weefselstructuur te beschadigen. Vervolgens werden ze gedurende 5 minuten tegengekleurd met 0,1% zuur fuchsine om het contrast tussen weefselstructuren te verbeteren. Dit kleuringsprotocol bood een consistente en betrouwbare visualisatie voor kwantitatieve analyse van alveolaire botresorptie23. Ten slotte werden de dia's gedehydrateerd met behulp van gesorteerde ethanol, geklaard in xyleen en gemonteerd. Het gekleurde botweefsel werd geanalyseerd onder een lichtveldmicroscoop en er werden beelden met een hoge resolutie verkregen om de resorptie van de alveolaire botrand nauwkeurig te beoordelen voor daaropvolgende morfologische evaluatie.
Micro-computertomografie (Micro-CT) analyse
Micro-CT-scanning werd uitgevoerd om 3D-microstructurele veranderingen in het alveolaire bot van OP+PD-modelmuizen te beoordelen, specifiek gericht op het maxillaire gebied van de eerste molaar. Na 8 weken postoperatieve monitoring werden de muizen op humane wijze geëuthanaseerd via CO2 -inhalatie, een methode die geschikt is voor het behoud van maxillofaciale structuren. Maxillaire monsters werden vervolgens geoogst en gefixeerd in 4% paraformaldehyde bij 4 °C gedurende 48 uur24.
Micro-CT-analyse werd uitgevoerd met de gereconstrueerde DICOM-beelden van het maxillaire gebied die in de software werden geïmporteerd door de dataset te selecteren die overeenkomt met de gescande monsters. Een standaard interessegebied (ROI) werd handmatig gedefinieerd als het mesiale buccale eenderde deel van de wortel van de maxillaire eerste kies door de alveolaire botstructuur te schetsen op sagittale en coronale weergaven, en ongeveer 50 opeenvolgende plakjes werden doorgaans opgenomen om de regio volledig te bedekken.
Om het trabeculair bot te scheiden van het omringende zachte weefsel en de achtergrond, werd een dichtheidsdrempel van 180-220 mgHA/cm3 toegepast. Segmentatie werd vervolgens uitgevoerd om een binaire structuur te genereren die alleen het trabeculaire bot vertegenwoordigt. Morfometrische analyse werd uitgevoerd met behulp van de Bone Morphometry Module in de software. Parameters werden automatisch berekend, waaronder botvolumefractie (BV/TV), trabeculaire dikte (Tb.Th), trabeculair aantal (Tb.N), botoppervlak-botvolumeverhouding (BS/BV) en botmineraaldichtheid (BMD). Na de analyse werden de numerieke resultaten geëxporteerd als spreadsheets.
Deze metingen werden gebruikt om de omvang van microstructurele schade in het alveolaire bot geassocieerd met de pathologische aandoening OP+PD te evalueren en om de therapeutische werkzaamheid van glyciteïne bij het herstellen van de botkwaliteit te beoordelen. Deze benadering maakte een reproduceerbare en kwantitatieve evaluatie met hoge resolutie mogelijk van de structurele integriteit in de parodontale botomgeving, wat belangrijke morfologische inzichten bood in de behandelingsresultaten.
Netwerk farmacologische profilering
Om systematisch de bioactieve componenten van de traditionele Chinese geneeskunde (TCM) te onderzoeken die belangrijke biologische routes kunnen moduleren die relevant zijn voor comorbide osteoporose en parodontitis (OP+PD), gebruikte deze studie een netwerkfarmacologische benadering om Angelica sinensis te analyseren. Deze plant werd geselecteerd op basis van het historische gebruik in TCM voor de behandeling van botgerelateerde aandoeningen en ontstekingen, waaronder symptomen die verband houden met zowel osteoporose als chronische tandvleesaandoeningen. In de screeningsfase van de samenstelling werden actieve ingrediënten van Angelica sinensis opgehaald met behulp van TCMSP- en TCMID-databases [databasedetails verplaatst naar ToM] en gefilterd met behulp van orale biologische beschikbaarheid (OB) ≥ 30% en geneesmiddelgelijkenis (DL) ≥0,18 criteria. Compound-target interacties werden voorspeld met behulp van STITCH, met validatie van de doellocatie via DisGeNET en OMIM. Routeverrijkingsanalyse werd uitgevoerd met behulp van het DAVID 2021-platform om KEGG-signaleringsroutes te identificeren die mogelijk worden gemoduleerd door de geselecteerde verbindingen. Om moleculaire interacties te visualiseren, werd een "compound-target-pathway"-netwerk geconstrueerd op basis van topologische indices (graad centraliteit, betweenness centraliteit). De analyse identificeerde glyciteïne, een natuurlijke flavonoïde, als een verbinding met gunstige farmacokinetische eigenschappen en sterke connectiviteit met CD44, wat wijst op potentiële therapeutische relevantie bij OP+PD. Glyciteïne is echter niet klinisch goedgekeurd voor de behandeling van osteoporose of parodontitis; Deze bevindingen zijn gebaseerd op in silico-voorspellingen en bieden een theoretisch kader voor daaropvolgende in vivo validatie-experimenten 25.
Moleculaire docking validatie
Eiwitstructuren van CD44 (PDB ID: 1UUH) en PI3K (PDB ID: 4L23) werden opgehaald uit de RCSB Protein Data Bank (https://www.rcsb.org). Ligandstructuren (glyciteïne, ligustilide) werden geoptimaliseerd door energieminimalisatie met behulp van een moleculair krachtveld. Docking-simulaties werden uitgevoerd met een genetisch algoritme onder de volgende parameters: 100 runs, populatiegrootte 150 en 25×106 energie-evaluaties. Bindingspockets werden gedefinieerd op basis van kristallografische ligandcoördinaten (CD44: 20×20×20 Å3; PI3K: 25×25×25 Å3). De resulterende docking-houdingen werden gerangschikt op bindingsenergie (ΔG, kcal/mol) en de reproduceerbaarheid werd gevalideerd met behulp van een wortel-gemiddelde-kwadraatafwijking (RMSD) drempel van <2,0 Å.
Therapeutische evaluatie van gyciteïne in OP+PD muizenmodellen
Glyciteïne (zuiverheid ≥ 98%) werd verkregen van een gecertificeerde biochemische leverancier in analytische kwaliteit voor in vivo experimenten, een natuurlijk isoflavon waarvan bekend is dat het aanwezig is in Angelica sinensis, met gerapporteerde ontstekingsremmende en osteoprotectieve eigenschappen26. Osteoporotische parodontitis werd geïnduceerd bij 11 weken oude vrouwelijke C57BL/6-muizen door middel van bilaterale ovariëctomie (OVX) en ligatuur-geïnduceerde parodontale ontsteking. Muizen werden gerandomiseerd in vier cohorten (n = 6 per groep):
Schijnvertoning: Schijnoperatie + vehiculum (5% dimethylsulfoxide [DMSO] in olijfolie, dagelijkse orale maagsonde)
OP+PD: Ziektemodel + vehikel
OP+PD + Lage dosis glyciteine (50 mg/kg): Ziektemodel + glycietesuspensie in vehiculum
OP+PD + Hoge dosis glyciteïne (100 mg/kg): Ziektemodel + glycietesuspensie in vehiculum
Statistische analyse
Er werden inferentiële statistische tests uitgevoerd en visuele gegevensrepresentaties gemaakt voor het genereren van grafieken en gegevensvisualisatie. Numerieke gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Groepsvergelijkingen werden beoordeeld door middel van tweezijdige ongepaarde t-tests, waarbij waarden met &l 0,05 als statistisch significant werden beschouwd. Deze methoden zorgden voor robuustheid van de gegevens en verbeterden de betrouwbaarheid van de daaropvolgende analytische resultaten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Proteomische profilering van OP+PD-cohorten
Kwantitatieve proteomische analyse van serum van OP+PD-patiënten (n=3) en gezonde controles (n=6) identificeerde ontregelde eiwitten die betrokken zijn bij de pathogenese van de ziekte. Vergelijkende analyse onthulde negen gedownreguleerde eiwitten (APOL1, CST3, IGLV3-27, IGHV3-33, PF4, CLEC3B, SRGN, C6, SELL) en zes opgereguleerde eiwitten (IGLV9-49, A2M, VWF, CETP, CD44, CDH13) in OP+PD-sera versus controles (
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Deze studie stelt een translationeel onderzoekskader voor dat proteomische profilering, validatie van genexpressie, in vivo diermodellering en netwerkfarmacologie combineert om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan de comorbiditeit van osteoporose en parodontitis (OP+PD). De centrale hypothese is dat CD44 de PI3K/Akt-signaleringsas moduleert, waardoor inflammatoir botverlies bij OP+PD-aandoeningen verergert, en dat glyciteïne, een flavonoïde van ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Deze studie werd ondersteund door de Science and Technology Foundation for the Health Care Industry van de provincie Gansu, China (subsidienr. GSWSKY2020-77), de Gansu Provincial Natural Science Foundation (subsidie nrs. 25JRRA314 en 21JR7RA620), het Gansu Provincial Talent Program en het Youth Incubation Research Program van het Gansu Provincial Hospital (subsidie nr. 23GSSYF-35).
Bijdragen van de auteur:
Jing Qi voerde het grootste deel van het experimentele werk en de data-analyse uit. Yunqing Pang heeft bijgedragen aan het verzamelen van monsters, het cureren van gegevens en statistische analyse. Yu Wang assisteerde bij het experimenteel ontwerp en bood technische ondersteuning. Dawei Hou en Jing Wang hielden samen toezicht op het project, herzagen het manuscript kritisch op belangrijke intellectuele inhoud en keurden de definitieve versie goed. Alle auteurs lazen en keurden het definitieve manuscript goed.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| ELISA kits | Shanghai Enzyme Link Biotechnology | Kwantificering van inflammatoire cytokinen (TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-4, ALP, TRAP5b, TGF-β, VWF, CD44) | |
| RNA extractie kit | Shanghai Yesheng Biotechnology | Serum RNA extractie | |
| cDNA synthese kit | Shanghai Yesheng Biotechnology | Hoge activiteit reverse transcriptie | |
| qPCR kit | Shanghai Yesheng Biotechnology | Kwantitatieve PCR-amplificatie | |
| Antilichamen (primair/secundair) | Cell Signaling Technology / Abcam / Hangzhou Xianli Biotechnology / Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology | Specifieke primaire antilichamen; β-actine interne controle; geiten-anti-konijn IgG secundair antilichaam | |
| Histologie reagentia | Beyotime Biotechnology / Shanghai Shangshang | Hematoxyline–eosine en methyleenblauw kleuring | |
| Chemiluminescerend substraat | Yakken Biotechnology | Western blot detectie | |
| Micro-CT systeem | Scanco Medical AG (Viva CT40) | Hoge resolutie microstructuur analyse | |
| LC-MS/MS systeem | Thermo Scientific Q Exactive HF-X | Hoge resolutie proteomische analyse | |
| Software: MaxQuant (v2.1.0), Andromeda | Broad Institute | Proteomics gegevens voorverwerking | |
| Software: GSEA (v4.3.2) | Broad Institute | Pathway verrijkingsanalyse | |
| Software: R (v4.0.3), WGCNA (v1.73), pheatmap (v1.0.12) | R Foundation | Statistische computing, netwerk analyse, clustering, heatmaps | |
| Software: AutoDock 4.2, AutoDockTools 1.5.7 | The Scripps Research Institute | Moleculair docking en raster definitie | |
| Software: Open Babel 3.1.1 | Open Babel project | Ligand structuur optimalisatie | |
| Software: PyMOL 2.5.2 | Schrödinger, LLC | Moleculair docking visualisatie |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen