Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

RNA-isolatie van oculair lensepitheel van muizen en bulkmassa's van vezelcellen

916 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69079

⸱

10 oktober 2025

 ,  , 
1School of Optometry and Vision Science Program, Indiana University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de scheiding van het epitheel van de ooglens van de muis en de bulkmassa van de vezelcel, gevolgd door RNA-isolatie en qPCR-analyse. Deze methode maakt het mogelijk om lenscelcompartimenten te scheiden voor een meer gedetailleerde analyse van het transcriptoom en biologische processen in epitheelcellen versus gedifferentieerde vezelcellen.

Samenvatting

De lens is een gespecialiseerd, transparant weefsel in de voorste oogkamer dat bestaat uit twee hoofdceltypen, epitheelcellen en vezelcellen. Een monolaag lensepitheelcellen bedekt de voorste hemisfeer van de lens, terwijl het grootste deel van de lens bestaat uit een massa lensvezelcellen. Een collageen basaalmembraan, bekend als de capsule, omringt en kapselt het hele weefsel in. Lensepitheelcellen hechten sterk aan de lenscapsule en kunnen gemakkelijk worden gescheiden van de bulkvezelmassa door de capsule van het weefsel af te pellen. Moeilijkheden bij het verkrijgen van voldoende RNA-concentratie uit het lage aantal epitheelcellen in de lensmonolaag hebben eerder de studie van epitheelcel versus vezelceltranscriptomen belemmerd. Dit protocol presenteert een methode om de epitheel- en vezelcelcompartimenten en RNA-concentratiestappen netjes te scheiden en te isoleren om daaropvolgende transcriptomische experimenten met epitheelcelmonsters van een enkel paar muislenzen mogelijk te maken. Het vermogen om de belangrijkste celtypen van de lens afzonderlijk te onderzoeken, helpt bij het onderzoeken van biologische mechanismen van lensonderhoud en ontregeling, waardoor de karakterisering van celtypespecifieke verstoringen die verantwoordelijk zijn voor leeftijdsgebonden lenspathologieën mogelijk wordt.

Inleiding

De oculaire lens is een transparant orgaan dat het licht fijn op het netvlies focust om een helder beeld te produceren. De lens bestaat uit twee hoofdceltypen: een monolaag van epitheelcellen die de voorste hemisfeer bedekken en vezelcellen die de bulkmassa van het weefsel vormen (Figuur 1). De lens wordt omhuld door een collageen basaalmembraan dat bekend staat als de lenscapsule, waaraan epitheelcellen stevig zijn gehecht. Naarmate de lens groeit, vermenigvuldigen epitheelcellen op de evenaar zich en differentiëren ze tot ontluikende schillen van vezelcellen die op een concentrische manier op de lens worden gelaagd 1,2,3. Levenslange lensgroei hangt af van de continue proliferatie van deze kleine populatie equatoriale epitheelcellen die deel uitmaken van de kiemzone4. Naarmate vezelcellen rijpen, worden alle cellulaire organellen afgebroken om lichtverstrooiende objecten te elimineren 5,6,7,8,9,10,11 en de weefseltransparantie te behouden, en de binnenste vezelcellen worden uiteindelijk verdicht, wat resulteert in een stijf lenscentrum 9,12. Vanwege de omringende lenscapsule is er geen celvernieuwing in de lens en blijven de zaadvezels gedurende het hele leven in het midden van de lens terwijl nieuwe vezels worden toegevoegd aan de weefselperiferie of cortex. De vezelcellen van de lens hebben verschillende optische eigenschappen, afhankelijk van hun leeftijd, en kunnen een tijdelijke momentopname geven van de verschillende biologische kenmerken in elk gegeven stadium13.

Ondanks de beschikbare chirurgische opties blijft staar, gedefinieerd als elke troebelheid in de normaal transparante lens, de belangrijkste oorzaak van blindheid in de wereld14. Staar kan zich manifesteren in het lensepitheel, de cortex of de kern met verschillende pathofysiologieën15. De cellulaire en moleculaire mechanismen van cataractvorming blijven echter onduidelijk 16,17. Om beter te begrijpen hoe deze verschillende soorten staar kunnen worden voorkomen en alternatieven voor chirurgie kunnen worden ontwikkeld, moeten we beter begrijpen hoe deze verschillende celtypen hun homeostase in de lens behouden.

De epitheel- en vezelcellen spelen verschillende fysiologische rollen in de lens. Celproliferatie is bijvoorbeeld beperkt tot het lensepitheel18. Ondertussen vormen de lensvezels de bulkmassa van de lens en geven ze structuur en brekingseigenschappen aan de lens9. Om een meer genuanceerd perspectief te krijgen op de biologische processen die betrokken zijn bij de verschillende compartimenten van de lens, moeten epitheel- en vezelcellen afzonderlijk worden onderzocht. Hier presenteren we een methode om het epitheel te isoleren uit de bulkmassa van de vezelcel, mRNA uit elke fractie te extraheren en deze transcripten te analyseren met behulp van reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR).

figure-introduction-1
Figuur 1: Diagram van de anatomie van de lens. De lens bestaat uit twee celtypen, een eenlaagse epitheelcellen (blauw en oranje) die de voorste hemisfeer bedekken en een bulkmassa lensvezels (wit). Het weefsel is omgeven door een dun collageen membraan, bekend als de lenscapsule (tan). Voorste epitheelcellen (blauw) zijn in rust, terwijl equatoriale epitheelcellen (oranje) zich vermenigvuldigen, differentiëren en verlengen om nieuwe lagen vezelcellen (wit) te worden aan de rand van de lens. Nieuwe generaties vezelcellen worden in concentrische omhulsels over eerdere generaties vezels gelegd. De oudste lensvezelcellen zijn samengeperst in het midden van het weefsel. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Cheng (2024)38. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" van het National Institutes of Health en een goedgekeurd protocol van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Indiana University.

1. Werkgebied, apparatuur en bereiding van reagentia

  1. Autoclaaf pipetpunten voor gebruik en wijs dozen met geautoclaveerde tips aan voor RNA-experimenten om RNase-besmetting te voorkomen.
  2. Behandel het werkoppervlak in de zuurkast en weefselhomogenisatiestampers met RNase-ontsmettingsoplossing, spoel grondig af met gedeïoniseerd water en droog af.
  3. Week dissectiegereedschap (gebogen tang, rechte tang en microdissectieschaar) gedurende 70 minuten in 5% ethanol en droog voor gebruik af met een delicate veeg.
  4. Gebruik gloednieuwe dissectietrays en petrischalen voor dissectie- en weefselisolatiestappen.
  5. Aliquot 400 μL koud TRIzolzuur-guanidinium-fenolreagens in DNAse- en RNAse-vrije microcentrifugebuisjes van 1,5 ml in de zuurkast.

2. Dissectie van de muislens

  1. Euthanaseer volwassen muizen met een overdosis CO2 gevolgd door cervicale dislocatie als secundaire maatregel.
  2. Isoleer de ogen met behulp van een gebogen tang.
    1. Druk het weefsel rond het oog voorzichtig in met de tang, waardoor het oog uit de oogkas steekt. Sluit de tang onder het oog en verwijder deze door gestaag omhoog te trekken.
    2. Breng de ogen over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml met 750-1000 μl 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
  3. Breng voor dissectie de ogen over naar putjes in een dissectiebak met verse 1x PBS.
  4. Gebruik onder een dissectiemicroscoop een rechte tang om de basis van de oogzenuw vast te houden en knip de zenuw zo dicht mogelijk bij het oog door met een scherpe microdissectieschaar.
  5. Steek voorzichtig een fijne rechte tang in de opening waar de oogzenuw was aangesloten en knijp samen om het weefsel op zijn plaats te houden.
  6. Steek de punt van de microdissectieschaar in dezelfde opening en knip voorzichtig vanaf de achterste pool van het oog in de richting van de overgang tussen hoornvlies en sclerus. Steek de instrumenten niet te diep in om beschadiging van de lens te voorkomen.
    OPMERKING: De knaagdierlens neemt een groot volume in beslag in het oog en daarom worden ondiepe sneden aanbevolen om te voorkomen dat de lens wordt doorboord.
  7. Knip langs de overgang tussen hoornvlies en scleratiek met behulp van de microdissectieschaar en scheid ten minste de helft van de omtrek van het oog.
  8. Gebruik de rechte tang om de oogweefsels voorzichtig om te keren terwijl u op het hoornvlies duwt, waarbij de lens door de incisie in het hoornvlies en de scleratiek wordt geëxtrudeerd.
  9. Verwijder voorzichtig alle grote, aangehechte tissues van de lens met behulp van een fijne rechte tang.
  10. Rol de lens indien nodig voorzichtig op een schone, delicate veeg met behulp van een gebogen tang om eventueel achtergebleven extralenticulair weefsel te verwijderen.
    OPMERKING: Rol het weefsel snel over het doekje en laat het weefsel niet overmatig uitdrogen. Er kunnen kleine opaciteiten op het lensoppervlak zijn als gevolg van droge plekken op het lenskapsel. Deze opaciteiten zijn over het algemeen omkeerbaar wanneer de lens terugplaatst in 1x PBS en hebben geen invloed op de volgende stappen.
  11. Breng de gereinigde lens over in een petrischaaltje van 6 cm met 1x PBS.
  12. Gebruik een fijne rechte tang om de lenscapsule ondiep in de buurt van de evenaar te doorboren en pel de lenscapsule voorzichtig weg van de vezelbulkmassa. De lensepitheelcellen blijven aan de capsule vastzitten. Verwijder voorzichtig alle grote stukjes vezels uit de capsule die mogelijk zijn losgekomen door decapsulering.
  13. Pak de capsule voorzichtig vast met een fijne rechte tang en draai de 1x PBS erin om eventuele resterende vezels te verwijderen. Alle losjes aangehechte vezelcellen zullen zich dissociëren van de capsule en de epitheelcellen.

3. RNA-isolatie

OPMERKING: Een samengevatte workflow voor RNA-isolatie wordt weergegeven in figuur 2.

  1. Breng 2 lenscapsules of 2 vezelbulkmassa's aan in de respectievelijke microcentrifugebuisjes van 1,5 ml die 400 μl koud TRIzol-reagens bevatten.
    OPMERKING: Vezelmassa's moeten met behulp van een gebogen tang van de schaal naar de buis worden verplaatst om het weefsel op te scheppen.
  2. Sluit de slangen goed af en verplaats ze naar een chemische zuurkast voor de volgende stappen.
  3. Homogeniseer de bulkmassa's van de lensvezel voorzichtig met behulp van een schone pelletstamper.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u de vezelmassa volledig opbreekt.
  4. Incubeer monsters (lenscapsules of gehomogeniseerde vezelbulkmassa's) in TRIzol gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in de zuurkast.
  5. Voeg in de zuurkast 200 μl chloroform per 400 μl TRIzol-reagens toe aan elke buis. Sluit de buisjes goed en schud krachtig met de hand gedurende 15 seconden, waarbij u de duim op de onderkant van de buis houdt en de wijsvinger op de dop.
    OPMERKING: De microcentrifugebuisjes van 1,5 ml die in de materialenlijst worden vermeld, worden gebruikt vanwege de goede afdichting. Als u microcentrifugebuisjes van andere merken gebruikt, test dan de sluiting en afdichting van de buis voordat u gaat schudden, aangezien TRIzol en chloroformoplossing onder de dop van buizen die geen goede afdichting hebben, kunnen lekken.
  6. Incubeer de monsters gedurende 10-15 minuten bij kamertemperatuur om fasescheiding mogelijk te maken.
    OPMERKING: Er moet een roze TRIzol-reagenslaag op de bodem van de buis zijn die lipiden en eiwitten bevat, een witte laag tussen de fasen die DNA bevat en een duidelijke waterige fase aan de bovenkant die RNA bevat. De witte DNA-laag kan moeilijker te zien zijn in de epitheelcelmonsters.
  7. Centrifugeer de monsters bij 14.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
    NOTITIE: Verplaats de buizen voorzichtig in en uit de centrifuge en zorg ervoor dat u de fasen tijdens de overdracht niet verstoort.
  8. Stel buisjes en reagentia samen uit een RNA Clean and Concentrator-kit. Spinkolombuizen worden uit de set in een opvangbuis gemonteerd.
  9. Breng in de zuurkast voorzichtig de heldere waterfase (de toplaag) over in een schone microcentrifugebuis van 1,5 ml, waarbij u het volume noteert.
    OPMERKING: Vermijd het verstoren, aanraken of optrekken van de witte DNA-laag onder de waterige fase. Kantel de buis bij het overbrengen van de waterfase om de witte laag niet te verstoren. Het verdient de voorkeur om een kleine hoeveelheid van de waterige fase in de buis te laten in plaats van het monster te verontreinigen. Doorgaans kan voor 200 μL toegevoegde chloroform 180-190 μL waterige fase worden teruggewonnen.
  10. Voeg 200-proof ethanol toe aan de waterige fase in een volumetrische verhouding van 1:1.
    OPMERKING: RNA-bindingsbuffer uit de concentratorkit kan in een volumetrische verhouding van 2:1 worden toegevoegd aan de waterfase voordat ethanol wordt toegevoegd. Deze stap wordt overgeslagen om de RNA-opbrengst te verhogen en omdat het RNA na isolatie voldoende zuiver is.
  11. Meng voorzichtig door de buis meerdere keren om te keren of door de oplossing op en neer te pipetteren. Breng de gemengde oplossing over naar een RNA-spinkolom met behulp van een pipettor.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u het filter niet aanraakt met de pipetpunt.
  12. Centrifugeer de centrifugekolommen bij 16.000 x g gedurende 30 s bij 4 °C.
    NOTITIE: Het wordt aanbevolen om het deksel van de kolom en de zijkant van de opvangbuis te labelen om de sets buizen georganiseerd te houden en voor het geval de dop afbreekt in de volgende centrifugatiestap.
  13. Gooi de doorstroom weg en voeg 400 μL RNA Prep Buffer toe aan de spinkolom.
  14. Centrifugeer de centrifugekolommen bij 16.000 x g gedurende 30 s bij 4 °C.
  15. Gooi de doorstroom weg en voeg 700 μL RNA-wasbuffer toe aan de centrifugekolom.
  16. Centrifugeer de centrifugekolommen bij 16.000 x g gedurende 30 s bij 4 °C.
  17. Gooi de doorstroom weg en voeg 400 μL RNA-wasbuffer toe aan de centrifugekolom.
  18. Centrifugeer de centrifugeren van de centrifugeren van de kolommen bij 16.000 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C.
  19. Gooi de doorstroming weg en centrifugeer nogmaals bij 16.000 x g gedurende 30 s bij 4°C om ervoor te zorgen dat de centrifugekolom droog is.
  20. Verplaats de centrifugekolom naar een nieuw gelabelde microcentrifugebuis van 1,5 ml.
  21. Voeg 15 μL RNasevrij water toe aan het membraanfilter. Incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u het filter niet aanraakt met de pipetpunt.
  22. Centrifugeer de centrifugeerkolom bij 16.000 x g gedurende 30 s bij 4 °C om het gezuiverde RNA te elueren.
    OPMERKING: De dop van de microcentrifugebuis van 1.5 ml blijft tijdens het centrifugeren open. Plaats de spinkolommen en microcentrifugebuisjes voorzichtig zo dat de open doppen tegen het rotordeksel rusten, zodat deze niet zwaait en breekt tijdens het centrifugeren. De deksels moeten de draairichting van de rotor volgen.
  23. Verwijder de spinkolommen en gooi ze weg. Het RNA zit in de vloeistof die wordt verzameld in de microcentrifugebuisjes van 1,5 ml.
  24. Sluit de microcentrifugebuisjes van 1,5 ml goed af en incubeer RNA-monsters gedurende 10 minuten bij 55-65 °C om de heroplosbaarheid te bevorderen.
  25. Plaats de monsters onmiddellijk na de verwarmingsstap op ijs.
  26. Bewaar monsters bij -80 °C of transcribeer ze in omgekeerde volgorde in cDNA voor langdurige opslag.
    OPMERKING: RNA-monsters werden maximaal 3 maanden bewaard zonder merkbaar concentratieverlies. Aliquot RNA-monsters tot kleinere volumes voor opslag om vries-dooicycli te minimaliseren en degradatie te voorkomen.

4. Meting van de RNA-concentratie met behulp van een UV-VIS-spectrofotometer

  1. Bewaar de RNA-monsters op ijs, schakel de NanoDrop (UV-VIS-spectrofotometer) in en laat het instrument initialiseren.
  2. Selecteer in het menu Nucleïnezuren de RNA-kwantificeringsmodule.
  3. Maak de UV-Vis-spectrofotometer leeg door 2,0 μl eluent van de RNA-concentratiestap op het voetstuk te pipetteren, in dit geval water van moleculaire kwaliteit. Laat de instrumentarm zakken en lees het lege monster af.
  4. Til de arm van het instrument op, reinig het voetstuk van de sensor met een schoon, droog delicaat doekje, en gevolgd door nog een doekje bevochtigd met gedeïoniseerd water, gevolgd door nogmaals een droog doekje.
  5. Voer desgewenst monsterdetails in de UV-Vis-spectrofotometerinterface in.
  6. Laad 2,0 μl van het RNA-monster op het voetstuk, laat de arm zakken en kwantificeer.
  7. Herhaal stap 4.4 tot en met 4.6 om het voetstuk tussen de monsters schoon te maken.
  8. Als u klaar bent, slaat u het experiment op en exporteert u het indien nodig voor verdere kwantificering.

5. Omgekeerde transcriptie

  1. Met behulp van een zeer processieve en thermostabiele reverse transcriptase wordt 2,0 μg lensvezel-RNA en al het geëxtraheerde epitheliale RNA omgekeerd getranscribeerd volgens het door de fabrikant aanbevolen protocol. Meng reagentia en RNA voor elk monster in een schoon PCR-buisje. Bewaar alle oplossingen en RNA-monsters op ijs.
    OPMERKING: Deze transcriptase kan tot 2,5 μg RNA per reactie omgekeerd transcriberen. Er wordt uitgegaan van een volledige conversie van RNA naar cDNA, dus de RNA-startconcentratie wordt gebruikt als de vermoedelijke cDNA-concentratie.
  2. Voer de reactie uit in de thermische cycler met behulp van de omstandigheden vermeld in tabel 1.
  3. Bewaar omgekeerd getranscribeerd cDNA bij -80 °C of ga verder met de qPCR-stap.
    OPMERKING: cDNA-monsters werden maximaal 4 maanden bewaard zonder merkbare degradatie, aangezien cDNA stabieler is dan RNA. Monsters kunnen waarschijnlijk langer worden bewaard, op voorwaarde dat de vries-dooicycli tot een minimum worden beperkt.
StapTemperatuur (°C)Tijd (min)Cycli
Annealing25101
Omgekeerde transcriptie50101
Inactivatie van enzymen8551
Houden4∞1

Tabel 1: Thermocycler-voorwaarden voor omgekeerde transcriptie. Deze aandoeningen zijn afgestemd op een specifieke, zeer processieve en thermostabiele reverse transcriptase. De omstandigheden kunnen variëren, afhankelijk van het enzym en de gebruikte kit.

6. Kwantitatieve PCR in real time

  1. Alvorens met reacties te beginnen, bereidt u cDNA-voorraadoplossingen voor tot de gewenste concentratie door te verdunnen met water van moleculaire kwaliteit. In deze experimenten zal 1 μL cDNA worden gebruikt bij 5 ng/μL voor reacties van 5 ng/put. Bewaar alle oplossingen en cDNA-monsters op ijs.
    OPMERKING: TaqMan-arrayplaten (formaat 0,1 ml) worden aanbevolen voor reacties van 5-50 ng cDNA per putje. Het maken van aliquots van cDNA is nuttig om vries-dooicycli te beperken. In deze studie werden de monsters beperkt tot maximaal 5 vries-dooicycli.
  2. Bereid een werkende mastermix voor die bestaat uit Advanced Master Mix en sondes voor commerciële aanbevelingen. Zie rubriek 7 voor een voorbeeld van een voorbereiding. Bewaar alle oplossingen en cDNA-monsters op ijs.
    OPMERKING: Een paar sondes met twee verschillende kleurstoffen wordt vaak per put gebruikt. In deze studie werd bijvoorbeeld Crygs-FAM-MGB gebruikt als de gen-interessesonde en Ppia-VIC-MGB als interne controle. Commerciële aanbevelingen voor de uiteindelijke sonde- en primerconcentraties zijn respectievelijk 250 nM en 900 nM. Als een doelwit zeer sterk tot expressie komt, kan een primer-beperkte sonde nodig zijn om uitputting van reactiereagentia te voorkomen.
  3. Laad de cDNA-voorraad (1 μl) in de daarvoor bestemde putjes op de qPCR-plaat, gevolgd door het werkende mastermengsel (9 μl). Meng de oplossingen door langzaam op en neer te pipetteren terwijl u de mastermix toevoegt. Zorg ervoor dat de druppel cDNA in de oplossing wordt gemengd en vermijd luchtbellen.
    OPMERKING: Afhankelijk van de gevoeligheid van het doelwit, moet de plaat mogelijk op ijs worden geladen.
  4. Sluit de qPCR-plaat af door voorzichtig een optisch zelfklevende hoes aan te brengen. Gebruik een zelfklevende filmapplicator om het deksel glad te strijken en zorg voor een goede afdichting rond elke put.
  5. Vortexplaten op 1000 RPM gedurende 10 s om te mengen.
  6. Centrifugeer de platen op 1000 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen op de bodem van de putjes zijn.
  7. Laad de plaat in een kwantitatieve PCR-thermische cycler en voer deze uit met behulp van de cycli vermeld in tabel 2.
    OPMERKING: Conventionele qPCR-protocollen zijn doorgaans beperkt tot 40 cycli. Het is onwaarschijnlijk dat het verhogen van het aantal cycli zinvolle resultaten zal opleveren, aangezien een enkele doelkopie na 40 cycli theoretisch ongeveer 1 biljoen amplicons kan opleveren19.
StapTemperatuur (°C)Tijd(en)Cycli
Inactivatie van uracil-N-glycosylase (UNG)501201
Denaturatie951201
Denaturatie95145
Annealing6020
Houden4∞1

Tabel 2: Thermocycler-voorwaarden voor kwantitatieve polymerasekettingreactie. Deze aandoeningen zijn afgestemd op een specifieke reeks commerciële genexpressietesten. Er worden standaardparameters gebruikt, met uitzondering van het verhogen van de versterkingscycli van 40 naar 45.

7. Voorbeeld volumeberekening voor qPCR

OPMERKING: Een R-broncode voor een volumecalculator voor de beschreven vergelijkingen hieronder is beschikbaar in aanvullend bestand 1. Deze calculator is voor de Taqman-sondes en mastermix die worden vermeld in de materiaaltabel.

  1. Bepaal het aantal te pipetteren putten en bereken een minimum van 12,5% overschrijding. Deze overtollige constante (kExcess) compenseert pipetteerfouten en zorgt ervoor dat er voldoende oplossing is. Voor dit voorbeeld zullen 96 putjes worden gebruikt als doel voor de monstervoorbereiding.
    Vergelijking:
    figure-protocol-1
    Voorbeeld:
    figure-protocol-2
    OPMERKING: Als 12,5% overschrijding geen geheel getal is, is een gemakkelijke manier om "mooie" getallen in de volgende stappen te garanderen, naar boven af te ronden naar de dichtstbijzijnde put en kOverschrijding dienovereenkomstig aan te passen.
  2. Bereken het volume van het werkende mastermengsel. In deze experimenten wordt 1 μL cDNA en 9 μL werkende mastermix per putje gebruikt. cDNA- en mastermixvolumes kunnen naar behoefte worden aangepast.
    Vergelijking:
    figure-protocol-3
    Voorbeeld:
    figure-protocol-4
  3. Bereken de concentratiemodificator (kConc). Deze modifier wordt gebruikt om een meer geconcentreerde werkende mastermix te creëren die tot 1x zal verdunnen wanneer gemengd met cDNA.
    Vergelijking:
    figure-protocol-5
    Voorbeeld:
    figure-protocol-6
  4. Bereken het volume van de sonde (20x).
    Vergelijking:
    figure-protocol-7
    Voorbeeld:
    figure-protocol-8
  5. Bereken het volume van de mastermix (2x).
    Vergelijking:
    figure-protocol-9
    Voorbeeld:
    figure-protocol-10
  6. Breng het werkende mastermengsel op het berekende volume met behulp van moleculairH2O.
    Vergelijking:
    figure-protocol-11
    figure-protocol-12
    figure-protocol-13
    figure-protocol-14
    figure-protocol-15
    Voorbeeld:
    figure-protocol-16
    figure-protocol-17
    figure-protocol-18
    figure-protocol-19
    figure-protocol-20

Aanvullend bestand 1: Een R-broncode voor een volumecalculator. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Lensepitheel en vezels werden geïsoleerd uit 6 tot 7 weken oude wildtype muizen. Voor deze experimenten werden drie muizen gebruikt en 2 lenscapsules of 2 vezelcelmassa's van elke muis werden samengevoegd voor één biologische replicaat. Zoals beschreven in het protocol, werd RNA geëxtraheerd met behulp van TRIzol-reagensfasescheiding. Gemiddeld leverde een paar lensepitheel en vezelbulkmassa's respectievelijk 0,8 μg (SD ± 0,2) en 9,7 μg (SD ± 2,3) RNA op. De gemiddelde concentratie in ee...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De hier gepresenteerde stappen tonen het vermogen aan om RNA te isoleren uit afzonderlijke lenscompartimenten die met succes kunnen worden getranscribeerd in cDNA voor moleculair-biologische methoden. Vanwege de gevoelige aard van analysemethoden is het essentieel dat de lens in de dissectiefase vrij is van aangehechte weefsels. Dit kan een paar iteraties van het rollen van de lens op een Kimwipe vereisen om voldoende reinheid te bereiken. Er moet voor worden gezorgd dat de lens niet te ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door subsidie R01 EY032056 (aan CC) van het National Eye Institute.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Centrifuge en RotorFisher Scientific14285554PM
Chloroform, HPLC-kwaliteitAlfa Aesar22920
Ethanol (190-proof)Decon Labs2801
Ethanol (200-proof)Fisher BioReagentsBP2818
Fisherbrand Pellet PestleFisher Scientific12-141-363
Forceps, Gebogen; Student Tweezers #7World Precision Instruments501981
Forceps, Recht; Dumont #5Fine Science Tools11252-40
Forceps, Recht; Student Tweezers #4World Precision Instruments501978
Kimwipes, kleinKimberly-Clark34155Gevoelige taakveger
MicroAmp Adhesive Film ApplicatorApplied Biosystems4333183
MicroAmp EnduraPlate Optical 96-Well Fast Clear Reactieplaat met BarcodeApplied Biosystems4483485
MicropipettenEppendorf 01-671-120
Microscoop, DissectieCarl ZeissSteREO Discovery.V8
MiniAmp Optical Adhesive CoverApplied Biosystems4360954
MiniAmp Thermal CyclerApplied BiosystemsA37834
MixMate Plate Vortex MixerEppendorf5353000529
Moleculair Gegradueerde WaterFisher ScientificBP28191
Nanodrop One Microvolume UV-Vis SpectrofotometerThermo ScientificND-ONE-W
Nunc MicroWell MiniTraysFisher Scientific12-565-154Dissectiebakje
PCR TubesVWR201007-012
Petrischaal, 60 mm x 15 mmFisher ScientificFB0875713A
Fosfaatbufferoplossing, 1x Dulbecco'sGibco14190-136
Pipetpunten, 10 µL GegradueerdUSA Scientific1161-3700
Pipetpunten, 1250 µL XL GegradueerdUSA Scientific1161-1720
Pipetpunten, 200 µL Profiel GegradueerdUSA Scientific1163-1700
QuantStudio 3 Real-Time PCR SysteemApplied BiosystemsA28567
Reverse Transcriptase, SuperScript IV VILO Invitrogen11756050Hoge processieve en thermostabiele reverse transcriptase
RNA Clean and Concentrator 5 KitZymoZR1013
RNase-Vrij WaterFisher BioReagentsBP2819
RNaseZapSigmaR2020RNase decontaminatieoplossing
SealRite Microcentrifuge 1,5 mL BuisjesUSA Scientific1615-5500
SuperFine Vannas 8 cmWorld Precision Instruments501778Schaar
TaqMan FAST Advanced Master Mix voor qPCRApplied Biosystems4444557
TaqMan Gene Expression Assay (FAM) Sonde (MTO)ThermoFisher Scientific4448892
TRIzolInvitrogen15596026Zuur-guanidinium-fenol oplossing
Vortex MixerThermo Scientific88880017

Referenties

  1. Lovicu, F. J., Robinson, M. L. Development of the Ocular Lens. , Cambridge University Press. (2004).
  2. Bassnett, S., Winzenburger, P. A. Morphometric analysis of fibre cell growth in the developing chicken lens. Exp Eye Res. 76 (3), 291-302 (2003).
  3. Kuszak, J. R. The ultrastructure of epithelial and fiber cells in the crystalline lens. Int Rev Cytol. 163, 305-350 (1995).
  4. Yamamoto, N., Majima, K., Marunouchi, T. A study of the proliferating activity in lens epithelium and the identification of tissue-type stem cells. Med Mol Morphol. 41 (2), 83-91 (2008).
  5. Bassnett, S. On the mechanism of organelle degradation in the vertebrate lens. Exp Eye Res. 88 (2), 133-139 (2009).
  6. Bassnett, S. The fate of the Golgi apparatus and the endoplasmic reticulum during lens fiber cell differentiation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (9), 1793-1803 (1995).
  7. Bassnett, S. Lens organelle degradation. Exp Eye Res. 74 (1), 1-6 (2002).
  8. Bassnett, S., Beebe, D. C. Coincident loss of mitochondria and nuclei during lens fiber cell differentiation. Dev Dyn. 194 (2), 85-93 (1992).
  9. Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: Structural determinants of eye lens transparency. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
  10. Vrensen, G. F., Graw, J., De Wolf, A. Nuclear breakdown during terminal differentiation of primary lens fibres in mice: A transmission electron microscopic study. Exp Eye Res. 52 (6), 647-659 (1991).
  11. Counis, M. F., et al. Analysis of nuclear degradation during lens cell differentiation. Cell Death Differ. 5 (4), 251-261 (1998).
  12. Piatigorsky, J. Lens differentiation in vertebrates. A review of cellular and molecular features. Differentiation. 19 (3), 134-153 (1981).
  13. Al-Khudari, S., Donohue, S. T., Al-Ghoul, W. M., Al-Ghoul, K. J. Age-related compaction of lens fibers affects the structure and optical properties of rabbit lenses. BMC Ophthalmol. 7, 19(2007).
  14. World Report on Vision. , World Health Organization. Geneva. (2019).
  15. Hashemi, H., et al. Global and regional prevalence of age-related cataract: A comprehensive systematic review and meta-analysis. Eye (Lond). 34 (8), 1357-1370 (2020).
  16. Cheng, C., Gong, X. Diverse roles of eph/ephrin signaling in the mouse lens. PLoS One. 6 (11), e28147(2011).
  17. Ibaraki, N. A brighter future for cataract surgery. Nat Med. 3 (9), 958-960 (1997).
  18. Scullica, L., Grimes, P., Mcelvain, N. Further autoradiographic studies of the lens epithelium. Normal and x-irradiated rat eyes. Arch Ophthalmol. 70, 659-665 (1963).
  19. Caraguel, C. G., Stryhn, H., Gagne, N., Dohoo, I. R., Hammell, K. L. Selection of a cutoff value for real-time polymerase chain reaction results to fit a diagnostic purpose: Analytical and epidemiologic approaches. J Vet Diagn Invest. 23 (1), 2-15 (2011).
  20. 60/280 and 260/230 ratios. , Thermo Scientific. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/Product-Bulletins/T123-NanoDrop-Lite-Interpretation-of-Nucleic-Acid-260-280-Ratios.pdf (2009).
  21. Beyer, E. C., Kistler, J., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Antisera directed against connexin43 peptides react with a 43-kd protein localized to gap junctions in myocardium and other tissues. J Cell Biol. 108 (2), 595-605 (1989).
  22. Gong, X., Cheng, C., Xia, C. H. Connexins in lens development and cataractogenesis. J Membr Biol. 218 (1-3), 9-12 (2007).
  23. Leonard, M., Zhang, L., Bleaken, B. M., Menko, A. S. Distinct roles for n-cadherin linked c-src and fyn kinases in lens development. Dev Dyn. 242 (5), 469-484 (2013).
  24. Leonard, M., et al. Modulation of n-cadherin junctions and their role as epicenters of differentiation-specific actin regulation in the developing lens. Dev Biol. 349 (2), 363-377 (2011).
  25. Logan, C. M., et al. N-cadherin regulates signaling mechanisms required for lens fiber cell elongation and lens morphogenesis. Dev Biol. 428 (1), 118-134 (2017).
  26. Maddala, R., Nagendran, T., Lang, R. A., Morozov, A., Rao, P. V. Rap1 gtpase is required for mouse lens epithelial maintenance and morphogenesis. Dev Biol. 406 (1), 74-91 (2015).
  27. Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Front Cell Dev Biol. 10, 983178(2022).
  28. Paul, D. L., Ebihara, L., Takemoto, L. J., Swenson, K. I., Goodenough, D. A. Connexin46, a novel lens gap junction protein, induces voltage-gated currents in nonjunctional plasma membrane of xenopus oocytes. J Cell Biol. 115 (4), 1077-1089 (1991).
  29. Rong, P., et al. Disruption of gja8 (alpha8 connexin) in mice leads to microphthalmia associated with retardation of lens growth and lens fiber maturation. Development. 129 (1), 167-174 (2002).
  30. Terrell, A. M., et al. Molecular characterization of mouse lens epithelial cell lines and their suitability to study RNA granules and cataract associated genes. Exp Eye Res. 131, 42-55 (2015).
  31. White, T. W., Bruzzone, R., Goodenough, D. A., Paul, D. L. Mouse cx50, a functional member of the connexin family of gap junction proteins, is the lens fiber protein mp70. Molecular Biology of the Cell. 3 (7), 711-720 (1992).
  32. Xia, C. H., et al. Altered cell clusters and upregulated Aqp1 in connexin 50 knockout lens epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (11), 27(2024).
  33. Beyer, E. C., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Connexin43: A protein from rat heart homologous to a gap junction protein from liver. J Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2621-2629 (1987).
  34. Gong, X., et al. Disruption of Alpha3 connexin gene leads to proteolysis and cataractogenesis in mice. Cell. 91 (6), 833-843 (1997).
  35. Xu, L., Overbeek, P. A., Reneker, L. W. Systematic analysis of E-, N- and P-cadherin expression in mouse eye development. Exp Eye Res. 74 (6), 753-760 (2002).
  36. Nishina, S., et al. Pax6 expression in the developing human eye. Br J Ophthalmol. 83 (6), 723-727 (1999).
  37. Wistow, G., et al. Gamman-crystallin and the evolution of the betagamma-crystallin superfamily in vertebrates. FEBS J. 272 (9), 2276-2291 (2005).
  38. Cheng, C. Tissue, cellular, and molecular level determinants for eye lens stiffness and elasticity. Front Ophthalmol (Lausanne). 4, 1456474(2024).
  39. Huynh, P. N., Cheng, C. Spatial-temporal comparison of eph/ephrin gene expression in ocular lenses from aging and knockout mice. Front Ophthalmol (Lausanne). 4, 1410860(2024).
  40. Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation. J Vis Exp. (31), e1519(2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Fibercelmassamuislenslensetheelcellenlensfibercellenmicrodissectiespinzuilzuiveringdifferenti le genexpressieconnexinexpressie
RNA-isolatie van oculair lensepitheel van muizen en bulkmassa's van vezelcellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.