Dit protocol beschrijft de scheiding van het epitheel van de ooglens van de muis en de bulkmassa van de vezelcel, gevolgd door RNA-isolatie en qPCR-analyse. Deze methode maakt het mogelijk om lenscelcompartimenten te scheiden voor een meer gedetailleerde analyse van het transcriptoom en biologische processen in epitheelcellen versus gedifferentieerde vezelcellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
RNA-isolatie van oculair lensepitheel van muizen en bulkmassa's van vezelcellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De lens is een gespecialiseerd, transparant weefsel in de voorste oogkamer dat bestaat uit twee hoofdceltypen, epitheelcellen en vezelcellen. Een monolaag lensepitheelcellen bedekt de voorste hemisfeer van de lens, terwijl het grootste deel van de lens bestaat uit een massa lensvezelcellen. Een collageen basaalmembraan, bekend als de capsule, omringt en kapselt het hele weefsel in. Lensepitheelcellen hechten sterk aan de lenscapsule en kunnen gemakkelijk worden gescheiden van de bulkvezelmassa door de capsule van het weefsel af te pellen. Moeilijkheden bij het verkrijgen van voldoende RNA-concentratie uit het lage aantal epitheelcellen in de lensmonolaag hebben eerder de studie van epitheelcel versus vezelceltranscriptomen belemmerd. Dit protocol presenteert een methode om de epitheel- en vezelcelcompartimenten en RNA-concentratiestappen netjes te scheiden en te isoleren om daaropvolgende transcriptomische experimenten met epitheelcelmonsters van een enkel paar muislenzen mogelijk te maken. Het vermogen om de belangrijkste celtypen van de lens afzonderlijk te onderzoeken, helpt bij het onderzoeken van biologische mechanismen van lensonderhoud en ontregeling, waardoor de karakterisering van celtypespecifieke verstoringen die verantwoordelijk zijn voor leeftijdsgebonden lenspathologieën mogelijk wordt.
Inleiding
De oculaire lens is een transparant orgaan dat het licht fijn op het netvlies focust om een helder beeld te produceren. De lens bestaat uit twee hoofdceltypen: een monolaag van epitheelcellen die de voorste hemisfeer bedekken en vezelcellen die de bulkmassa van het weefsel vormen (Figuur 1). De lens wordt omhuld door een collageen basaalmembraan dat bekend staat als de lenscapsule, waaraan epitheelcellen stevig zijn gehecht. Naarmate de lens groeit, vermenigvuldigen epitheelcellen op de evenaar zich en differentiëren ze tot ontluikende schillen van vezelcellen die op een concentrische manier op de lens wo....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" van het National Institutes of Health en een goedgekeurd protocol van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Indiana University.
1. Werkgebied, apparatuur en bereiding van reagentia
- Autoclaaf pipetpunten voor gebruik en wijs dozen met geautoclaveerde tips aan voor RNA-experimenten om RNase-besmetting te voorkomen.
- Behandel het werkoppervlak in de zuurkast en weefselhomogenisatiestampers met RNase-ontsmettingsoplossing, spoel grondig af....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Lensepitheel en vezels werden geïsoleerd uit 6 tot 7 weken oude wildtype muizen. Voor deze experimenten werden drie muizen gebruikt en 2 lenscapsules of 2 vezelcelmassa's van elke muis werden samengevoegd voor één biologische replicaat. Zoals beschreven in het protocol, werd RNA geëxtraheerd met behulp van TRIzol-reagensfasescheiding. Gemiddeld leverde een paar lensepitheel en vezelbulkmassa's respectievelijk 0,8 μg (SD ± 0,2) en 9,7 μg (SD ± 2,3) RNA op. De gemiddelde concentratie in ee.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De hier gepresenteerde stappen tonen het vermogen aan om RNA te isoleren uit afzonderlijke lenscompartimenten die met succes kunnen worden getranscribeerd in cDNA voor moleculair-biologische methoden. Vanwege de gevoelige aard van analysemethoden is het essentieel dat de lens in de dissectiefase vrij is van aangehechte weefsels. Dit kan een paar iteraties van het rollen van de lens op een Kimwipe vereisen om voldoende reinheid te bereiken. Er moet voor worden gezorgd dat de lens niet te .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door subsidie R01 EY032056 (aan CC) van het National Eye Institute.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Centrifuge en Rotor | Fisher Scientific | 14285554PM | |
| Chloroform, HPLC-kwaliteit | Alfa Aesar | 22920 | |
| Ethanol (190-proof) | Decon Labs | 2801 | |
| Ethanol (200-proof) | Fisher BioReagents | BP2818 | |
| Fisherbrand Pellet Pestle | Fisher Scientific | 12-141-363 | |
| Forceps, Gebogen; Student Tweezers #7 | World Precision Instruments | 501981 | |
| Forceps, Recht; Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-40 | |
| Forceps, Recht; Student Tweezers #4 | World Precision Instruments | 501978 | |
| Kimwipes, klein | Kimberly-Clark | 34155 | Gevoelige taakveger |
| MicroAmp Adhesive Film Applicator | Applied Biosystems | 4333183 | |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96-Well Fast Clear Reactieplaat met Barcode | Applied Biosystems | 4483485 | |
| Micropipetten | Eppendorf | 01-671-120 | |
| Microscoop, Dissectie | Carl Zeiss | SteREO Discovery.V8 | |
| MiniAmp Optical Adhesive Cover | Applied Biosystems | 4360954 | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | |
| MixMate Plate Vortex Mixer | Eppendorf | 5353000529 | |
| Moleculair Gegradueerde Water | Fisher Scientific | BP28191 | |
| Nanodrop One Microvolume UV-Vis Spectrofotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W | |
| Nunc MicroWell MiniTrays | Fisher Scientific | 12-565-154 | Dissectiebakje |
| PCR Tubes | VWR | 201007-012 | |
| Petrischaal, 60 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Fosfaatbufferoplossing, 1x Dulbecco's | Gibco | 14190-136 | |
| Pipetpunten, 10 µL Gegradueerd | USA Scientific | 1161-3700 | |
| Pipetpunten, 1250 µL XL Gegradueerd | USA Scientific | 1161-1720 | |
| Pipetpunten, 200 µL Profiel Gegradueerd | USA Scientific | 1163-1700 | |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR Systeem | Applied Biosystems | A28567 | |
| Reverse Transcriptase, SuperScript IV VILO | Invitrogen | 11756050 | Hoge processieve en thermostabiele reverse transcriptase |
| RNA Clean and Concentrator 5 Kit | Zymo | ZR1013 | |
| RNase-Vrij Water | Fisher BioReagents | BP2819 | |
| RNaseZap | Sigma | R2020 | RNase decontaminatieoplossing |
| SealRite Microcentrifuge 1,5 mL Buisjes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| SuperFine Vannas 8 cm | World Precision Instruments | 501778 | Schaar |
| TaqMan FAST Advanced Master Mix voor qPCR | Applied Biosystems | 4444557 | |
| TaqMan Gene Expression Assay (FAM) Sonde (MTO) | ThermoFisher Scientific | 4448892 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | Zuur-guanidinium-fenol oplossing |
| Vortex Mixer | Thermo Scientific | 88880017 |
Referenties
- Lovicu, F. J., Robinson, M. L. Development of the Ocular Lens. , Cambridge University Press. (2004).
- Bassnett, S., Winzenburger, P. A. Morphometric analysis of fibre cell growth in the developing chicken lens. Exp Eye Res. 76 (3), 291-302 (2003).
- Kuszak, J. R.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
