Deze studie presenteert een methode om de functie van PAK5 in ESCC te beoordelen, waarbij wordt aangetoond dat overexpressie een slechte prognose voorspelt en tumorprogressie via de PAK5-GAREM1 signaalas bevordert.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
Deze studie presenteert een methode om de functie van PAK5 in ESCC te beoordelen, waarbij wordt aangetoond dat overexpressie een slechte prognose voorspelt en tumorprogressie via de PAK5-GAREM1 signaalas bevordert.
Oesofageale plaveiselcelcarcinoom (ESCC) is wereldwijd een belangrijke oorzaak van kankergerelateerde sterfte, met name in Azië. Door het ontbreken van vroege symptomen worden de meeste patiënten in een gevorderd stadium gediagnosticeerd, wat de effectiviteit van de behandeling beperkt en de prognose verslechtert. Het begrijpen van de mechanismen achter ESCC en het identificeren van biomarkers of therapeutische doelen is cruciaal voor het verbeteren van patiëntuitkomsten. P21-geactiveerde protenekinase 5 (PAK5), een lid van de mitogeen-geactiveerde eiwitkinasefamilie, is in verband gebracht met verschillende maligniteiten door het reguleren van celcyclus, migratie en invasie. De rol ervan binnen ESCC blijft echter onduidelijk. Deze studie beoordeelde de PAK5-expressie in ESCC-weefsels en aangrenzende normale weefsels met behulp van immunohistochemie en voerde een Kaplan-Meier overlevingsanalyse uit om de associatie tussen PAK5 en prognose te evalueren. ESCC-celmodellen met PAK5-overexpressie en knockdown werden opgezet, en functionele assays, waaronder CCK-8, kolonievorming en Transwell-assays, werden uitgevoerd. Daarnaast werd mRNA-sequencing uitgevoerd om downstream doelen en signaalroutes te identificeren die door PAK5 worden gereguleerd. Deze resultaten toonden aan dat de expressie van PAK5 significant verhoogd was in ESCC-weefsels vergeleken met normale weefsels en geassocieerd was met een slechte prognose. Functionele assays toonden aan dat PAK5 de proliferatie, kolonievorming, migratie en invasie van ESCC-cellen bevorderde, terwijl transcriptomische analyse GAREM1 als een belangrijke downstream effector benadrukte. Deze bevindingen geven aan dat PAK5 bijdraagt aan de progressie van ESCC en mogelijk dient als een prognostische biomarker en therapeutisch doelwit.
Wereldwijd behoort slokdarmkanker tot de dodelijkste maligniteiten. In China vormt slokdarmplaveiselcelcarcinoom (ESCC) het overheersende histologische subtype. Hoewel er therapeutische vooruitgang is geboekt, blijft de prognose voor ESCC-patiënten somber, met een overlevingskansvan slechts 10% tot 25% over 5 jaar. Dit komt grotendeels door de uitdagingen van vroege detectie en de beperkte beschikbaarheid van effectieve moleculair gerichte therapieën2. In tegenstelling tot andere solide tumoren waarbij gerichte therapieën veelbelovend zijn, staan dergelijke benaderingen in ESCC nog in de kinderschoenen, gehinderd door een tekort aan bruikbare moleculaire doelen.
PAK5, een groep II PAK, integreert cytoskeletdynamiek en pro-survival signalering en is in verband gebracht met chemoresistentie bij verschillende maligniteiten 3,4,5,6,7,8,9,10,11. Gezien de prominente rol van MAPK-signalering in ESCC-biologie en therapierespons 1,2,12, werd verondersteld dat PAK5 wordt opgewaardeerd in ESCC en kwaadaardige fenotypen bevordert door modulatie van MAPK-signalering, waarbij GAREM1 mogelijk betrokken is als adaptor/regulator 13,14,15,16. Kwantitatieve IHC, functionele genetische verstoring en transcriptomische profilering werden gebruikt om deze hypothese te testen.
De behandeling van ESCC omvat doorgaans een combinatie van oesofagtomie, chemotherapie en radiotherapie. Hoewel een slokdarmoperatie genezend kan zijn, brengt het een hoog risico op morbiditeitmet zich mee 4,8. Bovendien slagen zowel chemotherapie als radiotherapie er vaak niet in alle kankercellen te elimineren, wat resulteert in resistentie, recidisie en uitzaaiingen 8,9. Immunotherapie is recentelijk een prominente focus in de oncologie geworden, met een effectieve behandeling van gevorderde kankers. Deze groeiende interesse benadrukt de dringende behoefte aan nieuwe biomarkers die kunnen helpen bij vroege diagnose en behandelplanning voor ESCC. Eerdere studies hebben aangetoond dat andere leden van de PAK-familie, zoals PAK1 en PAK4, proliferatie, invasie en therapieresistentie in ESCC bevorderen, wat het belang van deze kinasefamilie in de ESCC-biologie onderstreept. De rol van PAK5, een minder bestudeerde groep II PAK, blijft echter slecht gedefinieerd, wat de huidige studie17,18 motiveert.
P21-geactiveerde kinase 5 (PAK5), een lid van de PAK II-subfamilie, werd voor het eerst geïdentificeerd als een hersenspecifieke kinase in 2002. Gelegen op chromosoom 20p12, codeert PAK5 voor een eiwit van ongeveer 80 kDa en wordt voornamelijk gevonden in de mitochondriën en kern, waar het diverse rollen speelt in de celregulatie 10,11,13. De functies in de mitochondriën omvatten energiemetabolisme en regulatie, terwijl de nucleaire aanwezigheid verbonden is met gentranscriptie en celcycluscontrole. Hoewel PAK5 minder bestudeerd is dan zijn tegenhangers, wordt aangenomen dat het cruciaal is voor neuroontwikkeling, celoverleving en kankerprogressie10. Opmerkelijk is dat PAK5 betrokken is bij cytoskeletregulatie, anti-apoptotische mechanismen en cellulaire proliferatie12. De upregulatie ervan in neoplastische cellen is in verband gebracht met opkomende geneesmiddelresistentie, wat overeenkomt met bevindingen die PAK5-overexpressie associëren met verhoogde tumorcelresistentie tegen chemotherapie 10,11,13,14. Toch blijft de precieze functie van de PAK5 in de ESCC-progressie ongrijpbaar. Deze studie onderzoekt de invloed van PAK5 op het ESCC-transcriptomische milieu en de functionele gevolgen daarvan. Transcriptomische profilering werd uitgevoerd om genexpressieveranderingen te identificeren die geassocieerd zijn met PAK5-activiteit in ESCC-cellen. Daarnaast werd een ESCC-celmodel met gecontroleerde PAK5-modulatie ontwikkeld om de rol ervan in tumorgroei en metastatisch potentieel te verduidelijken. In tegenstelling tot conventionele biomarkerontdekkingsstrategieën in ESCC, die voornamelijk vertrouwen op Western blotting of single-modality transcriptmetingen, integreert de huidige workflow kwantitatieve immunohistochemie, transcriptomische profilering en functionele assays. Deze gecombineerde benadering maakt gelijktijdige moleculaire en fenotypische validatie mogelijk, wat mechanistisch inzicht biedt en de biologische relevantie verbetert. Daarnaast legt het protocol de nadruk op experimentele reproduceerbaarheid, waarbij gebruik wordt gemaakt van gepaarde tumor- en aangrenzende weefselmonsters, gestandaardiseerde immunokleuringsprocedures en hoogwaardige RNA-inputs (RNA-integriteitsnummer ≥ 7) voor sequencing. Deze kenmerken verbeteren de robuustheid en toepasbaarheid van de assay in laboratoria, met name voor studies die klinisch betekenisvolle kinase-gedreven reguleringsnetwerken in ESCC willen definiëren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Alle procedures werden goedgekeurd door de Ethische Commissie van het Tweede Geaffilieerde Ziekenhuis van de Hainan Medische Universiteit (Goedkeuringsnummer LW2022602), en geïnformeerde toestemming werd verkregen van elke deelnemer in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. De reagentia en de gebruikte apparatuur in deze studie zijn vermeld in de Materiaalkunde.
1. Afname van patiënten en weefselmonsters
In totaal werden 40 patiënten met pathologisch bevestigde ESCC opgenomen, allemaal met normale lever- en nierfunctie vóór de operatie. Tumormonsters (Groep T) en aangrenzende normale weefsels (Groep N; ≥2 cm vanaf de tumorrand) werden direct na de chirurgische resectie verzameld. Weefsels werden 7 dagen gefixeerd in 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS bij kamertemperatuur voordat paraffine werd ingebed.
2. Immunohistochemische kleuring
Paraffine-ingebedde blokken werden op 5 μm doorgesneden en 1 uur lang gebakken bij 60 °C. Secties werden gedeparaffiniseerd met xyleensubstitutie, gerehydrateerd met gegradueerd ethanol en onderworpen aan antigeenwinning in een 10 mM natriumcitraatbuffer (pH 6,0) bij 95-98 °C gedurende 20 minuten. De endogene peroxidaseactiviteit werd afgekoeld met 3% waterstofperoxide gedurende 10 minuten, gevolgd door blokkering met 5% normaal serum gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Secties werden 's nachts (12-16 uur) geïncubeerd bij 4 °C met anti-PAK5 primaire antistof (1:100 verdunning, zie Materiaaltabel). Na PBS-washes werden de preparaten 30 minuten geïncubeerd met mierikswortelperoxidase-geconjugeerd secundair antilichaam bij kamertemperatuur, ontwikkeld met DAB totdat er kleur verscheen (1-5 min, onder microscoop gemonitord om overkleuring te voorkomen), en 30-60 seconden geïntroduceerd met hematoxyline. Secties werden gedehydrateerd, gemonteerd en onder een brightfield-microscoop gefotografeerd. De kleurintensiteit en het aandeel positieve cellen werden gekwantificeerd met beeldanalysesoftware met minstens vijf willekeurige velden per sectie (200× vergroting). De kwantificatiemethode hanteerde de H-score berekening, met de formule: H-score = ∑ (kleuringsintensiteitsgraad × percentage positieve cellen) (intensiteit geclassificeerd als 0 = negatief, 1 = zwak, 2 = matig, 3 = sterk; percentage gecategoriseerd als 0-25%, 26-50%, 51-75%, 76-100%). Om betrouwbaarheid te waarborgen, voerden twee onafhankelijke pathologen blinde scoring uit, met een inter-waarnemer overeenkomst κ-waarde ≥ 0,75. Kwaliteitscontrolecriteria werden strikt geïmplementeerd: positieve controles (bekend PAK5-positief ESCC-weefsel) en negatieve controles (primaire antistof vervangen door PBS) moeten validatie doorstaan; de intensiteit van achtergrondkleuring moet onder een vooraf ingestelde drempel liggen (bijv. H-score < 50); De variatiecoëfficiënt (CV) van kleuringsresultaten over dubbele batches moet <20% zijn om experimentele variabiliteit uit te sluiten.
3. Cellijnen en cultuur
KYSE-150 (humaan ESCC) en HEK-293 (virale verpakking) cellen werden geauthenticeerd door short tandem repeat (STR) profilering en bevestigd als mycoplasma-vrij. KYSE-150-cellen werden gekweekt in RPMI-1640 medium, aangevuld met 10% foetaal rundereserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (100 U/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine). HEK-293-cellen werden in DMEM behouden, aangevuld met dezelfde toevoegingen. Cellen werden subgekweekt met 0,25% trypsine-EDTA wanneer ze 70%-80% samenvloeiing bereikten, en werden 24 uur voor elk experiment op de juiste dichtheden gezaaid.
4. Lentivirale vectorconstructie en infectie
Lentivirale vectoren waren ontworpen om ofwel PAK5 (pLV-EF1α-PAK5-PGK-Puro) te overexpressen of PAK5 (pLV-U6-shRNA-PAK5-PGK-Puro) te dempen. HEK-293-cellen werden gezaaid in schalen van 10 cm en getransfecteerd bij 70%-80% confluentie met het transferplasmide, verpakkingsplasmiden (gag/pol en rev) en envelope plasmide (VSV-G) in een verhouding van 4:3:1 met behulp van een lipide-gebaseerd transfectiereagens, met een totale DNA-hoeveelheid van ~20 μg per schaal van 10 cm. Het medium werd 6-8 uur na transfectie vervangen. Virale supernatanten werden verzameld bij 48 uur en 72 uur, gecentrifugeerd op 500 × g gedurende 10 minuten om puin te verwijderen, gefilterd door een 0,45 μm filter en ofwel geconcentreerd of opgeslagen bij −80 °C. Voor transductie werden KYSE-150-cellen één dag voor de infectie gezaaid en blootgesteld aan virale supernatant bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 5-10 in aanwezigheid van 8 μg/mL polybrene. MOI werd gedefinieerd als de verhouding tussen infectieuze eenheden en het aantal doelcellen. Er werd een pre-experiment uitgevoerd om MOI te schatten met GFP-telling of qPCR, en een MOI van 5-10 werd gekozen. Het medium werd na 12-16 uur vervangen en een puromycine-killcurve werd vastgesteld door niet-transduceerde cellen te behandelen met puromycineconcentraties variërend van 0-4 μg/mL gedurende 72-96 uur om de minimale dodelijke concentratie te bepalen. De geselecteerde concentratie voor selectie was 1-2 μg/mL, en de onderhoudsconcentratie was 0,5-1 μg/mL. Cellen werden geselecteerd met puromycine (1-2 μg/mL) vanaf 48 uur later. PAK5-overexpressie of stilte werd geverifieerd door RT-qPCR met specifieke primers voor PAK5 (forward 5′-CCAAAGCCTATGGTGGGACCC-3′, reverse 5′-AGGCCGTTGATGGAGGTTTC-3′) en GAPDH (forward 5′-GTGGACATCCGCAAAGAC-3′, reverse 5′-AAAGGGTGTAACGCAACTA-3′). De relatieve expressie van PAK5 werd berekend met de 2−ΔΔCt-methode . Alle experimenten werden uitgevoerd met ten minste drie biologische replicata.
5. CCK-8 cellevensvatbaarheidstest
De cellevensvatbaarheid werd beoordeeld met behulp van de Cell Counting Kit-8 (CCK-8), die gebaseerd is op de reductie van het WST-8-reagens door cellulaire dehydrogenasen. Logaritmisch groeiende KYSE-150-cellen werden gezaaid bij 2.000 cellen per put in 96-wellplaten in een volledig medium van 100 μL. Bij 0 uur, 24 uur, 48 uur, 72 uur en 96 uur werd 10 μL CCK-8 reagens (met WST-8) aan elke put toegevoegd. Na incubatie bij 37 °C gedurende 2 uur werd de absorptie bij 450 nm (A450) gemeten met een microplaatlezer. Blanke putten die alleen medium bevatten, werden toegevoegd. Elke experimentele groep bevatte ten minste drie biologische replicaten, en elke meting werd uitgevoerd met vijf technische replicaten.
6. Kolonievormingstest
Single-cel suspenties van KYSE-150 werden gezaaid met 1.000 cellen per put in 6-well platen en 14 dagen gekweekt, waarbij medium elke 2-3 dagen werd vervangen. Kolonies werden 15 minuten vastgezet met 4% PFA, 15 minuten gekleurd met 0,1% kristalviolet in 20% methanol, afgespoeld met water en aan de lucht gedroogd. Kolonies met meer dan 50 cellen werden geteld met behulp van beeldanalysesoftware en de kolonievormingssnelheid berekend.
7. Transwell-invasie-assay
Inserts met poriën van 8 μm werden vooraf gecoat met een basmentmembraanmatrix (50 μL per insert, 1:8 verdunning) en 1 uur geïncubeerd bij 37 °C; Kwaliteitscontrole werd uitgevoerd vóór het zaaien van cellen: blanco inserts (zonder cellen) en negatieve controleinserts (zonder chemoattractant) werden opgezet om de testvaliditeit te verifiëren, en de uniformiteit van de basale membraanmatrixlaag werd bevestigd door visuele inspectie (of gewichtsmeting voor strengere controle). Cellen werden serum-uitgeput in 1% FBS-medium gedurende 6-12 uur, en 2 × 10⁵ cellen/mL (200 μL per insert) werden in de bovenste kamer gezaaid. De onderste kamer bevatte 600 μL medium met 20% FBS als chemoattractant. Na 24 uur incubatie werden niet-geïnvaderde cellen aan het bovenoppervlak verwijderd, en de geïnvaderde cellen aan het onderoppervlak werden 10 minuten met methanol gefixeerd en 15 minuten gekleurd met 0,1% kristalviolet. Gekleurde cellen werden onder een brightfield-microscoop gefotografeerd en geteld in minstens vijf willekeurige microscopische velden per insert (200× vergroting); Tellen werd uitgevoerd met een blinde methode (telpersoneel was niet op de hoogte van groepstoewijzingen) om subjectieve vooringenomenheid te voorkomen.
8. Flowcytometrische detectie van apoptose
Cellen werden geoogst (inclusief drijvende cellen), twee keer gewassen met PBS en opnieuw opgehangen in een bindingsbuffer bij 1 × 106 cellen /mL. Annexine V-FITC (5 μL) en propidiumjodide (5 μL) werden toegevoegd aan 100 μL van de suspensie, gevolgd door incubatie bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten in het donker; na incubatie werd aan elk monster een bindingsbuffer van 400 μL toegevoegd. Voorafgaand aan de flowcytometrische analyse werd compensatiecorrectie uitgevoerd met enkelkleurige controles (Annexin V-FITC enkelkleurige cellen en PI enkelkleurige cellen) om fluorescentieoverloop te elimineren, en de FSC/SSC-poort werd ingesteld om enkele cellen te selecteren (exclusief celresten en aggregaten). Monsters werden binnen 1 uur geanalyseerd op een flowcytometer uitgerust met een 488 nm laser, waarbij per monster minstens 10.000 gebeurtenissen werden verkregen. Apoptotische indices werden gekwantificeerd met behulp van flow cytometrie-analysesoftware: een uniforme gatingdrempel werd toegepast op alle monsters om consistentie te waarborgen, en de verhoudingen van vroege apoptotische cellen (Annexine V⁺/PI⁻) en late apoptotische cellen (Annexin V⁺/PI⁺) werden afzonderlijk gerapporteerd om het apoptotische profiel van elke groep te karakteriseren.
9. RNA-sequencing en bio-informatica analyse
Totaal RNA werd geëxtraheerd en beoordeeld op zuiverheid (A260/280 tussen 1,8 en 2,1) en integriteit (RIN ≥7 als kwaliteitscontroledrempel). mRNA werd gezuiverd met behulp van oligo(dT)-kralen, gefragmenteerd bij 94 °C gedurende 5-7 minuten, en omgekeerd getranscribeerd in cDNA. Bibliotheken werden voorbereid door eindreparatie, adapterligatie en PCR-versterking (8-12 cycli), en gesequenced op een Illumina-platform om gepaarde eind 150 bp reads te genereren op een diepte van 30-50 miljoen leesparen per monster. Reads werden getrimd en uitgelijnd met het menselijke referentiegenoom met behulp van STAR of HISAT2. Gentellingen werden verkregen met featureCounts, en differentiële expressieanalyse werd uitgevoerd met DESeq2, waarbij drempels van FDR < 0,05 en |log2 keer verandering werden toegepast| ≥ 1. Functionele verrijkingsanalyse van differentieel tot expressie gedrukte genen werd uitgevoerd met clusterProfiler voor genontologie en KEGG-routes (met Benjamini-Hochberg (BH) gecorrigeerd FDR < 0,05), en eiwit-eiwit interactienetwerken werden geconstrueerd met behulp van de STRING-database.
10. Statistische analyse
Continue gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD uit ten minste drie onafhankelijke experimenten. Vergelijkingen tussen twee groepen werden uitgevoerd met tweezijdige, ongepaarde t-tests, en vergelijkingen tussen drie of meer groepen werden uitgevoerd met eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's post-hoc test. Niet-parametrische tests werden toegepast waar passend. Overlevingsverdelingen werden geschat door Kaplan-Meier-analyse met log-rang tests. Voor RNA-seq-gegevens werd meervoudige testcorrectie uitgevoerd met behulp van de Benjamini-Hochberg-methode. Exacte p-waarden worden weergegeven in figuurlegendes; Statistische significantie werd beschouwd bij p < 0,05, waarbij * p < 0,05 aangeeft en **p < 0,01.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
PAK5 komt sterk voor in ESCC en wordt geassocieerd met een slechte prognose
Figuur 1 illustreert de algehele workflow, van de klinische validatie van PAK5 tot functionele en transcriptomische analyse, waarin GAREM1 wordt geïdentificeerd als een downstream doel. Om de hypothese te testen dat PAK5 de progressie van ESCC bevordert door het MAPK-pad via GAREM1 te moduleren, werden de expressiepatronen van PAK5 in ESCC-weefsels en hu...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Deze studie biedt een diepgaand onderzoek naar de rol van PAK5 in de progressie van slokdarmplaveiselcelcarcinoom (ESCC) door klinische monsters, functionele assays en transcriptomische analyses te combineren. Deze bevindingen verbreden het begrip van de betrokkenheid van PAK5 bij ESCC en benadrukken het potentieel ervan als zowel prognostische marker als therapeutisch doelwit.
De duidelijke overexpressie van PAK5 in ESCC-weefsels en de associatie met een slec...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs geven aan dat zij geen concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die het werk in dit artikel zouden kunnen beïnvloeden.
Dit werk werd ondersteund door de Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (subsidienummer 822QN474).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Annexin V-FITC apoptosis detection kit | Beyotime Biotechnology | C1062S | Apoptosis detectie staining kit |
| Anti-PAK5 antibody | Abcam | ab110069 | Primaire antistof voor IHC, verdunning 1:100 |
| Automated electrophoresis system | Agilent | 2100 Bioanalyzer | RNA integriteitsbeoordeling |
| cDNA synthesis kit | Invitrogen | 1896649 | Reverse transcriptie kit |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | C3886 | Kleurstof voor kolonies en invasie |
| DMEM Medium | Gibco (Thermo Fisher) | 11965092 | Celcultuurmedium |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Thermo Fisher) | 16000044 | Celcultuursupplement |
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACSCanto II | Instrument voor celanalyse |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 8 | Statistische analyse- en grafieksoftware |
| H&E Staining Kit | Solarbio | G1120 | Hematoxyline en eosine kleuringsoplossing |
| HRP-conjugated Anti-Rat IgG | Abcam | ab150165 | Secundaire antistof voor IHC |
| Illumina NovaSeq sequencer | Illumina | NovaSeq 6000 | High-throughput sequencing platform |
| KYSE-150 cell line | RIKEN Cell Bank | RCB2057 | Menselijke slokdarm plaveiselcelcarcinoom cellijn |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | L3000008 | Transfectiereagens |
| Microplate reader | Bio-Tek Instruments | ELx808 | Absorbantie meetinstrument |
| DynabeadTM Oligo(dT)25s | Thermo Fisher Scientific | 61005 | Voor mRNA zuivering |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Thermo Fisher) | 15140122 | Antibiotica voor celcultuur |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4864 | DNA kleuringsstof |
| RPMI-1640 Medium | Gibco (Thermo Fisher) | 11875093 | Celcultuurmedium |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher | NanoDrop ND-1000 | RNA concentratie en zuiverheid meting |
| SPSS software | IBM | Version 23 | Statistische analyse software |
| Transwell inserts | Corning | 3422 | Celinvasie assay inserts |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.