Methodenartikel

Generatie van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide vlakke haardragende huidorganoïden met behulp van een lucht-vloeistof-interfacecultuursysteem

3.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69088

⸱

17 oktober 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Embryology, Leiden University Medical Center, 2The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Leiden University Medical Center, 3CEA, Inserm, IRIG, UA13 BGE, Biomics, University of Grenoble Alpes

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol schetst een methode voor het produceren van huidorganoïden die haarzakjes bevatten van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een vlak, fysiologisch relevant lucht-vloeistof-interfacecultuursysteem om de huidarchitectuur en -functie na te bootsen.

Samenvatting

Humaan geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC)-afgeleide huidorganoïden (SO's) die haarzakjes bevatten, bieden een geavanceerd in vitro model voor het onderzoeken van intercellulaire interacties binnen de micro-omgeving van de huid. Aanvankelijk ontwikkeld in een omgekeerde cystische configuratie, waarbij de dermis wordt blootgesteld aan de omgeving en de epidermis naar binnen gericht in de richting van het organoïdecentrum, kunnen SO's vervolgens worden overgebracht naar een vlakke configuratie in een lucht-vloeistofinterface (ALI) kweeksysteem, dat meer lijkt op de fysiologie van de menselijke huid. Dit manuscript presenteert een uitgebreid protocol voor het genereren en selecteren van cystische SO's die kunnen worden ontleed tot vlakke SO's en verder kunnen worden ontwikkeld in een ALI-kweeksysteem. Het protocol bevat gedefinieerde controlepunten voor macroscopische kwalitatieve beoordeling in kritieke stadia van de ontwikkeling van organoïden, beschrijft de technische stappen die nodig zijn voor het afvlakken van cystische SO's in een vlakke huid, specificeert optimale omstandigheden voor ALI-cultuur en demonstreert de resultaten door middel van moleculaire analyse. Op dag 27 onthulde immunofluorescentiekleuring met afstammingsspecifieke markers een gepluristratificeerd gepigmenteerd epitheel met huidaanhangsels, waaronder haarzakjes en talgklierachtige structuren. Dit protocol biedt een robuuste methode voor het genereren van vlakke SO's met aanhangsels en biedt een fysiologisch relevant in-vitromodel. Dit systeem ondersteunt diverse toepassingen in huidonderzoek en is al met succes gebruikt om pathogene infecties, door ultraviolette straling geïnduceerde weefselbeschadiging en geneesmiddelreacties te modelleren.

Inleiding

De huid vormt een cruciale beschermende barrière tussen organismen en hun omgeving, terwijl het ook de lichaamstemperatuur, de waterbalans en de sensorische input reguleert. Het is samengesteld uit drie hoofdlagen: de epidermis, een gelaagd keratinocytepitheel met een verhoornd oppervlak; de dermis, een bindweefsel dat rijk is aan extracellulaire matrix, fibroblasten, zenuwen, bloedvaten en immuuncellen; en de hypodermis, die voornamelijk bestaat uit onderhuidse vetcellen. De functie van de menselijke huid hangt ook af van gespecialiseerde aanhangsels zoals haarzakjes (HF's), talgklieren en zweetklieren1.

Huidaandoeningen behoren wereldwijd tot de meest voorkomende medische aandoeningen 2,3. Historisch gezien zijn de meeste huidgerichte onderzoeken uitgevoerd met behulp van diermodellen4, die de fysiologische complexiteit van het orgaan repliceren binnen een systemische context. Aanzienlijke verschillen tussen soorten4, samen met groeiende ethische zorgen, hebben echter geleid tot de ontwikkeling van fysiologisch relevante menselijke huidmodellen.

Conventionele modellen van de menselijke huid vallen in twee categorieën: gereconstrueerde menselijke epidermis, die bestaat uit gestratificeerde keratinocyten, en gereconstrueerde menselijke huid, die bovendien een onderliggend huidcompartiment bevat dat bestaat uit fibroblasten ingebed in een collageenmatrix5. Hoewel beide modeltypen ons begrip van huidfysiologie aanzienlijk hebben verbeterd, missen ze de volledige architecturale getrouwheid en cellulaire diversiteit van de inheemse menselijke huid. Een belangrijke beperking van deze modellen is de afwezigheid van huidaanhangsels zoals HF's, waardoor ze ongeschikt zijn voor onderzoek en het testen van geneesmiddelen met betrekking tot huidaandoeningen waarbij haargroei en regeneratie betrokken zijn6. Hoewel er meer geavanceerde systemen met HF's zijn gemeld, slagen ze er ofwel niet in om de complexiteit van de HF-structuur en micro-omgeving volledig samen te vatten of vertrouwen ze op complexe technologieën zoals bioprinten of micromolding 7,8,9,10.

Een nieuw huidmodel dat een aantal van deze uitdagingen aanpakt, is de huidorganoïde (SO), gegenereerd uit door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's)11. Door de embryonale ontwikkeling na te bootsen, kunnen hiPSC's worden gericht op ectoderm- en craniale neurale kamlijnen van het schedeloppervlak, waarbij ze zichzelf organiseren in cystische structuren die sterk lijken op de menselijke huid. Deze SO's bevatten bijna alle niet-immuun huidceltypen, georganiseerd in een gestratificeerde epidermis en een extracellulaire matrixrijke dermis. Belangrijk is dat SO's de ontwikkeling van huidaanhangsels ondersteunen: HF's en talgklieren. Gezien de vrijwel onbeperkte schaalbaarheid van hiPSC's, maken SO's geavanceerde genetische manipulatie en de ontwikkeling van nieuwe functionele tools mogelijk. Als zodanig vertegenwoordigen SO's een grote vooruitgang in het veld en zijn ze veelbelovend voor toepassingen in ontwikkelingsbiologie, ziektemodellering, het testen van geneesmiddelen en regeneratieve geneeskunde.

Er blijft echter een aanzienlijke beperking: SO's vormen omgekeerde cystische structuren waarbij de epidermis zich in de dermale cyste bevindt, beschut tegen mechanische krachten en ondergedompeld in waterig medium. Deze configuratie is niet alleen fysiologisch onnauwkeurig, maar sluit ook de totstandbrenging van een lucht-vloeistofinterface (ALI) uit. Als gevolg hiervan hebben cystische SO's een beperkte toepassing voor onderzoeken waarbij de epidermale barrière, mechanische krachten of directe apicale behandelingen betrokken zijn. Om dit probleem aan te pakken, wordt hieronder een reproduceerbare methode gepresenteerd om cystische SO's mechanisch af te vlakken en ze vervolgens als vlakke huid te kweken onder een ALI-conditie. Deze benadering, oorspronkelijk gerapporteerd door Jung et al., reorganiseert de weefselarchitectuur zodat de apicale epidermis wordt blootgesteld aan de lucht, waardoor verdere stratificatie en barrièrefunctie worden bevorderd12. De resulterende vlakke, haardragende organoïden behouden de complexe architectuur van de menselijke huid en weerspiegelen tegelijkertijd een fysiologisch nauwkeurige weefseloriëntatie, waardoor experimentele toegang tot het apicale oppervlak mogelijk is. Hoewel de procedure lang is (~100 dagen) en een aantal technisch uitdagende stappen omvat, vooral bij het ontleden van cystische SO's in vlakke SO's, kan het van bijzonder belang zijn voor onderzoekers die al werken met SO's of andere equivalenten van de menselijke huid die de fysiologische relevantie van hun modelsystemen willen vergroten.

Protocol

Figuur 1 toont de workflow voor het genereren van vlakke SO's met behulp van een ALI-cultuursysteem. Het eerste deel schetst het genereren van cystische SO's uit hiPSC's op basis van de methodologie die is ontwikkeld door Karl R. Koehler11, met kleine wijzigingen (Figuur 2). Het tweede deel beschrijft de procedure voor het verder ontwikkelen van cystische SO's tot vlakke SO's met behulp van een ALI-kweeksysteem zoals eerder beschreven12, met aanpassingen (Figuur 3). Alle chemicaliën en materialen staan vermeld in de materialentabel. Drie eerder beschreven hiPSC-lijnen (LUMCi001-A, LUMCi004-A en WT2) werden gebruikt om SO's (https://hpscreg.eu/)13 te genereren.

1. Generatie van cystische SO's

Figuur 2 toont verwachte en afwijkende morfologieën bij belangrijke stappen.

  1. Celaggregatie (dag -2)
    1. Kweek hiPSC's in een standaard plaat met 6 putjes totdat ze 70-80% samenvloeiing bereiken.
    2. Was de cellen met 1 ml Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS). Voeg 1 ml celdissociatiereagens (CDR) toe en incubeer bij 37 °C met 5% CO2 gedurende ~6 minuten om de hiPSC's los te maken zonder ze los te maken van de matrix (vermijd overspijsvertering).
    3. Zuig de CDR op en voeg 1 ml hiPSC-onderhoudsmedium (hiMM) toe dat 10 μM ROCK-remmer bevat. Maak de cellen voorzichtig los door op en neer te pipetteren met een P1000-pipet en bereid een celsuspensie voor van 3,5 × 103 cellen/ml.
    4. Doseer 100 μL van de celsuspensie in elk putje van een 96-well U-bodem, ultra-low-attachment plaat met behulp van een meerkanaals pipet. Centrifugeer de plaat gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur bij 110 × g en incubeer bij 37 °C met 5 % CO2.
  2. Verdunning van ROCK-remmer (dag -1)
    1. Bereid hiMM met 100 μg/ml antibioticum-antimycotisch supplement (AAS).
    2. Doseer 100 μL per putje en incubeer bij 37 °C met 5% CO2.
  3. Inductie van ectoderm aan het oppervlak (dag 0)
    1. Ontdooi het juiste volume van de basaalmembraanmatrix op ijs voordat u doorgaat naar de volgende stap. Bereid hiPSC minimal medium (hiMinM) aangevuld met basaalmembraanmatrix (2%), BMP4 (2,5 ng/ml), SB431542 (10 μM) en bFGF (4 ng/ml) (aangeduid als hiMinM+SFB) op ijs.
      OPMERKING: De BMP4-concentratie moet mogelijk worden aangepast, afhankelijk van de gebruikte cellijn (zie discussie).
    2. Verzamel celaggregaten in een buis van 2 ml met ronde bodem met behulp van een P200-pipetpunt met brede opening.
      OPMERKING: Gebruik in de handel verkrijgbare tips met brede openingen. Kies een opening met een binnendiameter van minimaal 2 mm om schade aan aggregaten tot een minimum te beperken. U kunt ook een scalpel verwarmen met een infraroodlussterilisator en deze gebruiken om een brede opening te maken van een conventionele pipetpunt.
    3. Laat aggregaten zich op de bodem van de buis nestelen. Zuig het medium voorzichtig op en voeg 2 ml hiMinM toe om de aggregaten te wassen. Herhaal de wasbeurt in totaal 3x.
    4. Breng de celaggregaten in koud hiMinM+SFB over naar een putje van een voorgekoelde plaat met 6 putjes met behulp van een P1000-pipetpunt met brede opening. Breng vervolgens elk aggregaat in 100 μl hiMinM+SFB over naar een 96-well U-bodem ultra-low-attachment plaat met behulp van een P200-pipetpunt met brede opening. Plaats de plaat terug in de broedmachine bij 37 °C met 5% CO2.
      OPMERKING: Gebruik voor deze stap een stereomicroscoop die onder een kap met laminaire luchtstroom (LAF) is geplaatst.
  4. Inductie van niet-epitheelcelpopulaties (dag 3)
    1. Bereid hiMinM met LDN193189 (1 μM), bFGF (250 ng/ml) en AAS (100 μg/ml). Doseer 25 μL in elk putje met behulp van een meerkanaals pipet.
    2. Schud de plaat voorzichtig om een gelijkmatige verdeling van het medium te garanderen. Plaats de plaat terug in de broedmachine bij 37 °C met 5% CO2.
  5. Voeding leveren (dag 6)
    1. Bereid hiMinM met AAS (100 μg/ml). Doseer 75 μL in elk putje met behulp van een meerkanaals pipet.
    2. Schud de plaat voorzichtig om een gelijkmatige verdeling van het medium te garanderen. Plaats de plaat terug in de broedmachine bij 37 °C met 5% CO2.
  6. Gemiddelde verfrissing (dag 8 en dag 10)
    1. Bereid hiMinM met AAS (100 μg/ml). Verwijder voorzichtig 100 μL medium uit elk putje met behulp van een meerkanaals pipet. Doseer 100 μL vers medium in elk putje met behulp van een meerkanaals pipet.
    2. Schud de plaat voorzichtig om een gelijkmatige verdeling van het medium te garanderen. Plaats de plaat terug in de broedmachine bij 37 °C met 5% CO2.
  7. Overgang naar platen met 24 putjes met een lage bevestiging (dag 12)
    1. Ontdooi het juiste volume van de basaalmembraanmatrix op ijs voordat u doorgaat naar de volgende stap. Bereid organoïde rijpingsmedium (OMM) met behulp van geavanceerd medium (49% v/v), neuraal basaal medium (49% v/v), glutaminesupplement (1x), B-27-supplement minus vitamine A (0,5x), N2-supplement (0,5x), 2-mercaptoethanol (0,1 mM) en AAS (100 μg/ml). Bereid het juiste volume koude OMM voor met 1% basaalmembraanmatrix (OMM1%M) en bewaar op ijs.
      OPMERKING: Gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen en werk in een goed geventileerde ruimte bij het manipuleren van 2-mercaptoethanol.
    2. Verzamel celaggregaten in een buis van 2 ml met ronde bodem met behulp van een P1000-pipetpunt met brede opening.
    3. Laat aggregaten zich op de bodem van de buis nestelen. Zuig het medium voorzichtig op. Voeg 1,5 ml Advanced medium toe om de aggregaten te wassen. Herhaal de wasbeurt in totaal 3x.
    4. Breng de celaggregaten in koude OMM1%M over naar een putje van een voorgekoelde plaat met 6 putjes met behulp van een P1000-pipetpunt met brede opening. Breng vervolgens elk aggregaat in 500 μl OMM1%M over naar een plaat met 24 putjes met lage bevestiging met behulp van een P1000-pipetpunt met brede opening. Plaats de plaat terug in de broedmachine bij 37 °C met 5% CO2.
      OPMERKING: Gebruik voor deze stap een stereomicroscoop die onder een LAF-kap is geplaatst.
  8. Gemiddelde verfrissing (dag 15)
    1. Ontdooi het juiste volume van de basaalmembraanmatrix op ijs voordat u doorgaat naar de volgende stap. Bereid de juiste hoeveelheid koude OMM1%M voor. Bewaar op ijs.
    2. Verwijder met behulp van P1000-tips voorzichtig 250 μL medium uit elk putje. Voeg vervolgens 250 μL OMM1%M toe aan elk putje. Plaats de plaat terug in de broedmachine bij 37 °C met 5% CO2 op een orbitale schudder die is ingesteld op 65 tpm.
  9. Voer tussen dag 18 en dag 45 op maandag, woensdag en vrijdag een halve gemiddelde verandering (250 μl) uit met OMM.
  10. Voer tussen dag 45 en dag 90 een halve mediumverandering (250 μl) uit met OMM op maandag en woensdag en een volledige mediumverandering op vrijdag.

2. Overgang van cystische SO's naar vlakke SO's

OPMERKING: Cystische SO's vertonen een omgekeerde morfologie, waarbij de epidermis naar binnen gericht is naar het midden van de organoïde en de dermis in contact staat met de externe omgeving. Tussen dag 70 en dag 90 is, afhankelijk van de cellijn en de differentiatie-efficiëntie, de vroege suprabasale differentiatie van de epidermis ver gevorderd en worden haarpinnen ontwikkeld. Dit is het stadium waarin de cystische SO's worden overgezet naar een ALI-kweeksysteem om weefsel te verkrijgen dat meer lijkt op de inheemse menselijke huid.

  1. Selectie van cystische SO's tussen dag 70 en dag 90 voor overgang naar vlakke SO's
    1. Selecteer cystische SO's met een diameter van ten minste 5 mm en een minimaal gehalte aan bijproducten (mesenchymale cellen die zich ophopen aan één pool van de cyste en ook kraakbeen kunnen bevatten). Gebruik de aanwezigheid van haarplacodes/pegs als kwaliteitsindicator van de ontwikkeling van de huidorganoïden (Figuur 1A en Figuur 2B).
      OPMERKING: Maak 2-4 vlakke SO's van elke cystische SO plat, afhankelijk van hun grootte.
  2. Voorbereiding van met collageen gecoate insert (12-wells formaat)
    1. Bereid een NaOH-oplossing (1 M) door de juiste hoeveelheid NaOH-pellets op te lossen in gedestilleerd water. Filter en steriliseer de NaOH-oplossing met behulp van een membraanfilter met een poriegrootte van 0,2 μm.
      OPMERKING: Gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen en werk in een goed geventileerde ruimte bij het manipuleren van NaOH-oplossing (1 M).
    2. Verdun op ijs de collageen type I-oplossing tot een eindconcentratie van 2 mg/ml met behulp van 10x PBS (tot een uiteindelijke 1x concentratie), NaOH (5 mM) en gedestilleerd water om het uiteindelijke volume aan te passen. Verdeel 150 μL van de collageenoplossing over elk inzetstuk dat in een standaard plaat met 12 putjes wordt geplaatst. Incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 °C om de collageengel te laten polymeriseren.
  3. Afvlakking van cystisch SO (Figuur 3)
    OPMERKING: Gebruik voor deze stap een stereomicroscoop die onder een LAF-kap is geplaatst.
    1. Plaats de geselecteerde cystische SO met een kleine hoeveelheid medium op het deksel van een petrischaaltje van 10 cm met behulp van een P1000-pipet met brede opening. Snijd de bijproducten van de SO zorgvuldig weg met behulp van een steriel scalpel. Gebruik een steriele tang aan de andere kant om de organoïde te stabiliseren tijdens de excisie (Figuur 3A).
      OPMERKING: In dit stadium lijkt de cystische SO op een leeggelopen ballon met twee huidlagen op elkaar.
    2. Snijd ongeveer 1 mm van de uiteinden van de organoïde naast de eerste incisie weg met behulp van een scalpel (Figuur 3B,F). Vouw de bovenste huidlaag voorzichtig open met een steriele tang (Figuur 3C,G).
    3. Snijd het stuk tissue in 2-4 stukken, afhankelijk van de grootte. Breng elk stukje weefsel voorzichtig over en plaats het met behulp van een steriele tang op een met collageen bedekt inzetstuk met de epidermis naar boven (Figuur 3D,H).
      OPMERKING: Beoordeel de pinnen onder een stereomicroscoop om er zeker van te zijn dat de epidermis correct is georiënteerd.
    4. Breng het inzetstuk terug naar een standaard plaat met 12 putjes die 600 μL OMM bevat. Plaats de plaat terug in de broedmachine bij 37 °C met 5% CO2 (Figuur 3E).
  4. Langdurig onderhoud van de lucht-vloeistofinterfacecultuur
    1. Voer tussen dag 1 en dag 21 na het afvlakken een volledige mediumverandering (600 μL) uit met OMM op maandag, woensdag en vrijdag. Plaats de plaat terug in de broedmachine bij 37 °C met 5% CO2 en 95% relatieve vochtigheid.
    2. Plaats de plaat tussen dag 21 en dag 27 na het afvlakken in een broedmachine bij 37 °C met 5% CO2 zonder vocht om de huidbarrière te versterken. Voer dagelijks een volledige mediumwissel (800 μl) uit met OMM.

Resultaten

De optimalisatie en checkpoints voor het genereren van cystische SO's zijn uitgebreid beschreven14. De hier gepresenteerde methode richt zich daarom op de belangrijkste controlepunten die moeten worden beoordeeld tijdens de ontwikkeling van cystische organoïden (Figuur 2A), de selectie van degenen die geschikt zijn voor de overgang naar vlakke SO's (Figuur 2B) en de criteria die worden gebruikt om de kwaliteit van de resulterende vlakke SO's te evalueren (Figuur 1B-D en Figuur 4).

De eerste belangrijke stap in de ontwikkeling van cystische SO's is de vorming van een enkel, dicht cellulair aggregaat dat de meerderheid van de cellen bevat die op dag 0 in de put aanwezig zijn (Figuur 2A). Dit wordt bereikt door een zorgvuldige en snelle behandeling van hiPSC's, gecombineerd met efficiënte centrifugatie, wat resulteert in een homogene verdeling van cellen in het midden van de put (Figuur 2A, Dag -2). Een goede inductie van het ectoderm aan het oppervlak leidt tot de vorming van een dun, helder epitheel op de buitenste laag van het aggregaat op dag 3 (Figuur 2A), dat zich vervolgens, na inductie van mesenchymale cellen, ontwikkelt tot transparante cystische aggregaten die een donkere kern van mesenchymale cellen bevatten op dag 8. Tussen dag 12 en 20 wordt de epitheliale cyste bedekt met een dunne laag mesenchymale cellen die zich ophopen aan één pool van de cyste (Figuur 2A, dag 12). Succesvolle co-inductie van epitheel- en mesenchymale cellen resulteert uiteindelijk in een gestratificeerd epitheel, waardoor de vorming van haarplacodes en pegs mogelijk wordt, die zichtbaar worden tussen dag 50 en 80 (Figuur 2A,B). Door de juiste SO's te selecteren op basis van deze ontwikkelingscontrolepunten, kunnen morfologische en groottevariabiliteit worden geminimaliseerd op het moment van overgang naar vlakke SO's.

De aanwezigheid van haarplacodes of pegs is het primaire inclusiecriterium voor het selecteren van cystische SO's voor verdere ontwikkeling tot vlakke SO's. De afwezigheid van zichtbare placodes is meestal het gevolg van een defect in de epidermale stratificatie, die dan extreem dun lijkt (Figuur 2B, Dag 50, middelste paneel). Voor het afvlakken worden alleen grote cysten (met een diameter van ten minste 5 mm) met bijproducten geconcentreerd aan één pool en over het algemeen minimale bijproducten gebruikt, terwijl die met niet-gepolariseerde bijproducten zijn uitgesloten (Figuur 2B).

Eenmaal in hun vlakke configuratie is de primaire kwaliteitscontrole van SO's gebaseerd op de macroscopische monitoring van HF-groei onder een stereomicroscoop. HF's worden geleidelijk langer gedurende de 27 dagen van ALI-cultuur, waarbij de talgklieren rond dag 14 zichtbaar worden en de pigmentatie in de loop van de tijd geleidelijk toeneemt (Figuur 1B,C). Vanwege de ruimtelijke beperkingen die worden opgelegd door het insertmembraan dat net onder de dunne collageengel ligt, kunnen alleen HF's die zich aan de periferie van de vlakke SO bevinden, volledig groeien, en ze doen dit in een oriëntatie parallel aan de insert (Figuur 1C). Met name steekt de haarschacht zelden buiten het huidoppervlak uit. Om de kwaliteit van de ontwikkelde vlakke SO's verder te beoordelen, kunnen ze worden ingebed in paraffine of OCT, doorgesneden en gekleurd om hun samenstelling en morfologie te onderzoeken. H&E-kleuring laat zien dat hun structuur sterk lijkt op die van de menselijke huid (Figuur 4A), met een volledig gelaagd epitheel en een dermis gescheiden door een basaalmembraan. Immunofluorescentiekleuring met behulp van specifieke markers voor de verschillende epidermale lagen, talgklieren en melanocyten bevestigt verder de menselijke huidachtige weefselarchitectuur van de vlakke SO's (Figuur 1D en Figuur 4B).

figure-results-1
Figuur 1: Workflow voor het genereren van vlakke SO's met HF's uit hiPSC's met behulp van een ALI-cultuursysteem. Schematische weergave en representatieve afbeeldingen van de belangrijkste stappen worden getoond. (A) Generatie van cystische SO's, in wezen zoals eerder beschreven10, totdat zichtbare haarplacodes/pegs zich vormen rond dag 80. (B) Cystische SO's worden ingesneden en afgeplat, met de epidermiszijde naar boven gericht, op een type I collageen gecoate celkweekinsert. ALI-culturen worden 21 dagen bewaard onder bevochtigde omstandigheden, gevolgd door 6 dagen in droge omstandigheden. (C) Sterk vergrote weergave van een gebied weergegeven in (B), ter illustratie van de groei van haarfollikels, ontwikkeling van talgklierachtige structuren (pijlpunten) en progressieve pigmentatie in de loop van de tijd. (D) Confocale beelden van vlakke SO-secties op dag 27 na het afvlakken, gelabeld met anti-type IV collageenantilichaam samen met ofwel Nijlrood, dat talgklierachtige structuren markeert, of anti-PMEL-antilichaam, dat melanocyten kleurt. Kernen worden tegengekleurd met DAPI. Schaal staven: 200 μm (A); 500 μm (B,C); 50 μm (D). Afkortingen: SOs = huidorganoïden; HFs = haarzakjes; hiPSC's = door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen; ALI = lucht-vloeistof interface; Col IV = collageen type IV; PMEL = premelanasoom-eiwit; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Representatieve beelden van de morfologie van celaggregaten bij belangrijke stappen tijdens de productie van SO. (A) Representatieve beelden van cystische SO's met geschikte (linkerpanelen) en ontoereikende (middelste en rechterpanelen) morfologieën in verschillende stadia. Op dag -2 moeten celaggregaten een uniforme verdeling vertonen (linkerpaneel), terwijl onjuiste plaatbehandeling na centrifugatie de celdistributie kan verstoren (rechterpaneel). Op dag 0 verschijnen goed gevormde aggregaten als compacte, dichte cellulaire clusters (linkerpaneel), terwijl een lage cellevensvatbaarheid resulteert in wijdverspreide celdood en verlies van de compacte 3D-structuren (rechterpaneel). Op dag 3 wordt een duidelijke buitenste epitheellaag zichtbaar (linkerpaneel), de afwezigheid ervan kan erop wijzen dat de BMP4-concentratie moet worden geoptimaliseerd (rechterpaneel). Op dag 12 hopen mesenchymale cellen zich op aan één pool en migreren ze om de epitheliale cyste (linkerpaneel) te omhullen, terwijl overmatige epitheliale (middelste paneel) of mesenchymale (rechterpaneel) differentiatie een goede epitheliale stratificatie belemmert. Op dag 50 vertonen SO's een bipolaire morfologie, met aan de ene kant een cystische huid en aan de andere kant bijproducten, voornamelijk kraakbeen , (linkerpaneel). Overmatige differentiatie van het epitheel (middelste paneel) of mesenchymale (rechterpaneel) belemmert een goede ontwikkeling van de huid. (B) Representatieve beelden van cystische SO's met zichtbare haarpinnen rond dag 80. Let op het variabele aandeel bijproducten (links naar de stippellijn) ten opzichte van de huid. De drie meest linkse panelen maken het mogelijk om 2-4 vlakke SO's te genereren, terwijl het meest rechtse paneel een SO van onvoldoende kwaliteit vertoont om af te vlakken. Schaalbalken: 500 μm voor dag -2, dag 50 en dag 80; 200 μm voor dag 0, dag 3 en dag 12. Afkorting: SO = skin organoid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Schematische weergave van de technische stappen voor het produceren van vlakke SO's. Voer het afvlakken van cystische SO's uit onder een stereomicroscoop in een LAF-kap. (A) Snijd de pool die bijproducten van de cystische SO ophoopt weg met behulp van een steriel scalpel. (B) Snijd de bovenste en onderste ledematen van de SO af om het ontvouwen van het weefsel te vergemakkelijken. (C) Snijd het vlakke weefsel in 2-4 stukken. Breng elk stuk over en druk het plat, met de epidermale kant naar boven, op een met collageen bedekt inzetstuk met behulp van een steriele tang. (D) Plaats de kweekbijsluiter met het afgeplatte weefsel in een standaard plaat met 12 putjes die 600 μl medium bevat. (E) Incubeer de plaat bij 37 °C met 5 % CO2. (F) Schematische dwarsweergave van de huidorganoïde afgebeeld in (B). (G) Schematische transversale weergave van de huidorganoïde afgebeeld in (C). (H) Afbeelding van een vlakke SO geplaatst op een type I collageengel gegoten op een celkweekinzetstuk geplaatst in een plaat met 12 putjes die 600 μL medium bevat. Afkortingen: SO = skin organoid; LAF = laminaire luchtstroom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Karakterisering van hiPSC-afgeleide vlakke SO's. (A) Representatieve helderveldbeelden van H&E-gekleurd planair SO op dag 1 en 27 na het afvlakken. Op dag 27 vertonen de vlakke SO's huidrijping met een pluristratified epidermis en HF's met talgklierachtige structuren (pijlpunten). (B) Confocale beelden van vlakke SO-secties gekleurd met anti-β4-integrine en anti-keratine 10- of anti-loricrine-antilichamen tonen vroege suprabasale differentiatie (KRT10+ -cellen) op dag 1 en late differentiatie (LOR+- laag) op dag 27. Kernen worden tegengekleurd met DAPI. Schaal staven: 50 μm (A); 100 μm (B). Afkortingen: SO = skin organoid; hiPSC = door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel; H&E = hematoxyline en eosine; β4 = b4 integrine; KRT10 = keratine 10; LOR = loricrin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Het hier beschreven protocol overwint een belangrijke beperking van het cystische SO-systeem door de oriëntatie en omgeving van het natuurlijke weefsel te herstellen door weefselafvlakking en blootstelling van de apicale epidermis aan lucht. Deze methode behoudt de intrinsieke cellulaire en structurele complexiteit van de organoïde, bevordert fysiologisch relevante organisatie en biedt directe toegang tot het gepluristratiseerde epidermale oppervlak voor experimentele manipulatie.

Verschillende stappen in het protocol zijn van cruciaal belang voor het bereiken van vlakke SO's van hoge kwaliteit, te beginnen met het genereren van cystische SO's van hoge kwaliteit. De belangrijkste kwaliteitscontroles en mogelijke punten voor protocolwijziging zijn al eerder uitgebreid beschreven12. Kort gezegd zou het uitgangspunt goed onderhouden, ongedifferentieerde hiPSC-culturen moeten zijn met een confluentie van 70-80%, met dicht opeengepakte cellen met een hoge nucleair-cytoplasmatische verhouding. Het genereren van cystische SO's vereist nauwkeurige modulatie van BMP4-signalering tijdens inductie van ectoderm aan het oppervlak12. Aangezien de gevoeligheid van BMP4 kan variëren tussen hiPSC-lijnen, kan titratie nodig zijn voor optimale resultaten. Het testen van BMP4-concentraties tussen 2,5 en 15 ng/ml wordt aanbevolen, aangezien er geen succesvolle gevallen buiten dit bereik zijn gemeld. Consistentie in de bron van reagentia is ook belangrijk; Daarom moeten bulkvoorraden van één enkele leverancier worden bereid en opgeslagen onder de aanbevolen omstandigheden en vóór hun houdbaarheidsdatum worden gebruikt om volledige biologische activiteit te garanderen en variabiliteit te minimaliseren.

Het selecteren van cystische SO's met de juiste morfologie en grootte is cruciaal voor een succesvolle SO-afvlakking. De rijping van cystische SO's en bijgevolg de vorming van pinnen en haarplacodes kan variëren tussen hiPSC-lijnen, daarom kan de timing van afvlakking variëren van dag 70 tot dag 90. De toevoeging van CHIR99021, een GSK3-remmer en WNT-signaleringsagonist, op dag 3 van cystische SO-vorming kan worden overwogen, aangezien is aangetoond dat het de organoïdegrootte vergroot en de vorming van kraakbeen vermindert door proliferatie te bevorderen en de migratie van de neurale lijst te remmen12. Hoewel veelbelovend, hebben we geen consistente resultaten waargenomen met deze wijziging in onze culturen.

Het afvlakken vereist handvaardigheid en vertrouwdheid met het weefsel. Met name tijdens de overdracht van het huidfragment op het gecoate inzetstuk moet ervoor worden gezorgd dat de juiste weefseloriëntatie wordt gegarandeerd. Het wordt aanbevolen om de oriëntatie te verifiëren met een fijne tang onder een stereomicroscoop en het weefsel voorzichtig aan te passen totdat de apicale kant naar boven wijst. Als ze op de juiste manier zijn geplaatst, moeten de haringen/haarcodes naar beneden wijzen. Na de overdracht van vlakke SO's naar ALI-cultuur, beginnen de HF's doorgaans binnen enkele dagen merkbare groei en pigmentatie van de haarschacht te vertonen.

De belangrijkste beperkingen van het beschreven model zijn de tijd en het hoge onderhoudsniveau dat nodig is, en de onvolwassenheid van het model. De ontwikkeling van cystische SO's begiftigd met haarpinnen duurt tussen de 70 en 90 dagen en wordt gevolgd door 4 weken ALI-cultuur. Deze langere tijdlijn, gecombineerd met een moeizame afvlakkingsprocedure, maakt het systeem minder geschikt voor toepassingen met een hoge doorvoer, vooral in vergelijking met in de handel verkrijgbare equivalenten van menselijke huid. Hoewel kleine optimalisaties de teelttijd enigszins kunnen verkorten, is een substantiële vermindering onwaarschijnlijk. De hoge cellulaire en structurele diversiteit van de huid hangt af van een complexe opeenvolging van epitheel-mesenchymale interacties en mechanische signalen, die waarschijnlijk niet kunnen worden versneld door de toevoeging van exogene factoren in vitro 15,16,17,18. De vorming van cystische SO's en hun progressie naar de vlakke vorm vereisen een hoog niveau van onderhoud. Een van de meest behandelingsintensieve perioden - afgezien van de eerste 18 dagen van cystische cultuur - doet zich voor wanneer vlakke SO's worden gehandhaafd in een atmosfeer met een lage luchtvochtigheid en dagelijks gemiddeld moeten worden aangevuld. Net als bij andere hiPSC-afgeleide modellen, behouden SO's in vitro een foetaal fenotype. Bovendien zijn zweetklieren en arrector pili-spieren grotendeels afwezig in SO's14, waarschijnlijk als gevolg van het gebrek aan vascularisatie, immuuncellen en mechanische krachten zoals schuifspanning, rekken en wrijving - die allemaal essentieel zijn voor een goede rijping 15,16,17,18,19 . Sommige van deze beperkingen kunnen worden aangepakt door de complexiteit van het model te vergroten. Co-cultuur met autologe hiPSC-afgeleide macrofagen17, integratie van een perfusiesysteem9 of toepassing van mechanische rekking17 kan de modelrijpheid helpen bevorderen20,21.

Opgemerkt moet worden dat het transwell-insert-formaat de neerwaartse groei van HF's in de vlakke SO's enigszins beperkt. Als gevolg hiervan hebben HF's de neiging zich lateraal te verspreiden en kunnen ze worden blootgesteld aan de lucht. Aangezien HF's normaal gesproken in vivo in de huid worden beschermd, moet hiermee rekening worden gehouden bij het ontwerpen van experimenten. Het aanpassen van de coating van het inzetstuk door een dikkere hydrogellaag aan te brengen, kan dit probleem helpen verminderen. Bovendien steken de haarschachten in dit model zelden buiten het huidoppervlak uit. Onze waarnemingen geven aan dat HF's in vlakke SO's in anageen, de actieve groeifase, blijven tot dag 27 van de ALI-cultuur. Gezien de verlengde duur van anagene straling in menselijke HF's is dit niet geheel onverwacht. Hoewel een langetermijncultuur uiteindelijk faseovergang kan ondersteunen, is dit onwaarschijnlijk bij gebrek aan systemische signalen. Het identificeren en aanvullen van de moleculaire signalen die nodig zijn voor folliculaire cycli kan kunstmatige inductie van de catagene en telogene fasen mogelijk maken.

Samenvattend maakt het protocol voor het genereren van vlakke SO's een breed scala aan experimentele benaderingen mogelijk die niet haalbaar of relevant zijn bij cystische SO. Planaire SO's zijn al met succes gebruikt om bacteriële11 en virale infecties22, door ultraviolette straling geïnduceerde weefselbeschadiging22 en bijbehorende geneesmiddelreacties te modelleren 12,22,23. De mogelijkheid om toegang te krijgen tot het apicale oppervlak van een fysiologisch relevant, complex huidequivalent is een substantiële vooruitgang voor het vakgebied en opent de deur naar een verscheidenheid aan nieuwe toepassingen in huidonderzoek.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

Wij danken onze collega's van het hiPSC Hotel, Leids Universitair Medisch Centrum, voor het beschikbaar stellen van hiPSC-lijnen. Dit werk werd ondersteund door het Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine, ondersteund door de Novo Nordisk Foundation, Denemarken (subsidienummer NNF21CC0073729) aan K.R. K.R. is Chargé de Recherche bij het Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Advanced DMEM/F12Thermo Fisher Scientific#12634010genoemd als Advanced medium in de tekst.
ALK5, inhib.TGFb type 1, SB431542Tocris Bioscience#1614In delen verdelen, bewaren bij -20 °C en bewaren bij 4 °C voor maximaal 7 dagen
Anti-CD104 rat monoclonal clone 439-9B antibodyBD Biosciences#555719NA
anti-collagen type IV polyclonaal antilichaamMerckMillipore#Ab769NA
Anti-cytokeratin 10 konijn polyclonaal antilichaamBiolegend#905401NA
Anti-loricrin konijn polyclonaal antilichaamBiolegend#905101NA
anti-PMEL muis monoklonaal antilichaamNovus Biologicals#NBP2-29407NA
B-27 Supplement, Minus Vitamin AThermo Fisher Scientific#12587010In delen verdelen, bewaren bij -20 °C
Cell culture insertsGreiner Bio-one#66564112-well, poriegrootte 0,4 µm; transparant (48 inserts/doos); https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/3d-cell-culture/thincert/3d-thincert-cell-culture-inserts/665641.html
Collagen Type ICorning#354249Stockoplossing bewaren bij 4 °C
Disposable scalpel steriele 0507 No. 21Swann Morton#0507NA
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)Thermo Fisher Scientific#14190094NA
Essential 6 (E6) mediumThermo Fisher Scientific#A1516401genoemd als hiPSC minimal medium (hiMinM) in de tekst.
FasudilLC Labs#F-4660In delen verdelen een 1000x stockoplossing en bewaren bij -20 °C. Na ontdooien bewaren bij 4 °C voor maximaal 14 dagen
Gentle Cell Dissociation ReagentStemcell Technologies#100-0485NA
GlutaMAX SupplementThermo Fisher Scientific#35050038NA
Human FGF-2 basic prenium gradeMiltenyi Biotec#130-093-842In delen verdelen, bewaren bij -80 °C en bewaren bij 4 °C voor maximaal 7 dagen
LDN 193189 dihydrochlorideTocris#6053In delen verdelen, lichtgevoelig, bewaren bij -20 °C
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane MatrixCorning#354230In delen verdelen, bewaren bij -20 °C en bewaren bij 4 °C voor maximaal 7 dagen
2-MercaptoethanolThermo Fisher Scientific#21985023Gevaarlijke stof, toxisch, corrosief, irriterend, gezondheids- en milieugevaar.
NaOHMerck#567530-250MGGevaarlijke stof, corrosief en irriterend. Bereid op het moment een oplossing.
Neurobasal MediumThermo Fisher Scientific#21103049genoemd als Neural Basal medium in de tekst.
Normocin 50 mg/mlInvivogen#ant-nr-1genoemd als antibiëtische-antimyotische aanvulling, in het test. In delen verdelen, bewaren bij -20 °C en bewaren bij 4 °C voor maximaal 14 dagen
Nunclon Sphera 96-WellU-Bottom MicroplateThermo Fisher Scientific#174929NA
Nunclon Sphera 174930 24-well multidishThermo Fisher Scientific#174930NA
N2 SupplementThermo Fisher Scientific#17502048In delen verdelen, bewaren bij -20 °C
Orbital shakerThermo Fisher Scientific#88881102NA
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific#15070063NA
Recombinant human BMP4 proteinR&D Systems#314-BP-010In delen verdelen, bewaren bij -80 °C en bewaren bij 4 °C voor maximaal 7 dagen
StemFlex (SF) mediumThermo Fisher Scientific#A3349401genoemd als hiPSC maintenance medium (hiMM) in de tekst.
SteriMax smart - Infrared Loop SterilizerWLD-TEC#4.002.000Optioneel
PincetMerck#T4537-1EAStijl 5; fijne naald-scherp, anti-magnetisch roestvrij staal
VitronectinStemcell Technologies#07180NA

Referenties

  1. Kolarsick, P. A. J., Kolarsick, M. A., Goodwin, C. Anatomy and physiology of the skin. J Dermatol Nurses Assoc. 3 (4), 203-213 (2011).
  2. Karimkhani, C., et al. Global skin disease morbidity and mortality: An update from the Global Burden of Disease Study 2013. JAMA Dermatol. 153 (5), 406(2017).
  3. Seth, D., et al. Global burden of skin disease: Inequities and innovations. Curr Dermatol Rep. 6 (3), 204-210 (2017).
  4. Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research techniques made simple: Animal models of wound healing. J Invest Dermatol. 138 (10), 2095-2105.e1 (2018).
  5. Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. J Dermatol Sci. 90 (1), 3-12 (2018).
  6. Vig, K., et al. Advances in skin regeneration using tissue engineering. Int J Mol Sci. 18 (4), 789(2017).
  7. Chu, X., et al. Functional regeneration strategies of hair follicles: Advances and challenges. Stem Cell Res Ther. 16 (1), 77(2025).
  8. Motter Catarino, C., Cigaran Schuck, D., Dechiario, L., Karande, P. Incorporation of hair follicles in 3D bioprinted models of human skin. Sci Adv. 9 (41), eadg0297(2023).
  9. Kageyama, T., Miyata, H., Seo, J., Nanmo, A., Fukuda, J. In vitro hair follicle growth model for drug testing. Sci Rep. 13 (1), 4847(2023).
  10. Abaci, H. E., et al. Tissue engineering of human hair follicles using a biomimetic developmental approach. Nat Commun. 9 (1), 5301(2018).
  11. Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
  12. Jung, S., et al. Wnt-activating human skin organoid model of atopic dermatitis induced by Staphylococcus aureus and its protective effects by Cutibacterium acnes. iScience. 25 (10), 105150(2022).
  13. Zhang, M., et al. Recessive cardiac phenotypes in induced pluripotent stem cell models of Jervell and Lange-Nielsen syndrome: Disease mechanisms and pharmacological rescue. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (5), E5383-E5392 (2014).
  14. Lee, J., et al. Generation and characterization of hair-bearing skin organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 17 (5), 1266-1305 (2022).
  15. Hu, M. S., et al. Embryonic skin development and repair. Organogenesis. 14 (1), 46-63 (2018).
  16. Li, K. N., Tumbar, T. Hair follicle stem cells as a skin-organizing signaling center during adult homeostasis. EMBO J. 40 (11), e107135(2021).
  17. Biggs, L. C., Kim, C. S., Miroshnikova, Y. A., Wickström, S. A. Mechanical forces in the skin: Roles in tissue architecture, stability, and function. J Invest Dermatol. 140 (2), 284-290 (2020).
  18. Gopee, N. H., et al. A prenatal skin atlas reveals immune regulation of human skin morphogenesis. Nature. 635 (8039), 679-689 (2024).
  19. Tokuyama, E., Nagai, Y., Takahashi, K., Kimata, Y., Naruse, K. Mechanical stretch on human skin equivalents increases the epidermal thickness and develops the basement membrane. PLoS One. 10 (11), e0141989(2015).
  20. Bai, X., et al. Organoid research: Theory, technology, and therapeutics. Organoid Res. 1 (1), 025040007(2025).
  21. Wang, Y., et al. Organoid research breakthroughs in 2024: A review. Organoid Res. 1 (2), 025040005(2025).
  22. Li, P., et al. Mpox virus infection and drug treatment modelled in human skin organoids. Nat Microbiol. 8 (11), 2067-2079 (2023).
  23. Kim, M. J., Ahn, H. J., Kong, D., Lee, S., Kim, D. H., Kang, K. S. Modeling of solar UV-induced photodamage on the hair follicles in human skin organoids. J Tissue Eng. 15, 20417314241248753(2024).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Ge nduceerde pluripotente stamcellenHaarfollikelvormingPlanaire huidorgano denImmunofluorescentiekleuringEpidermale differentiatieMesenchymale inductieTalgklierenIn vitro huidmodel
Generatie van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide vlakke haardragende huidorganoïden met behulp van een lucht-vloeistof-interfacecultuursysteem
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.