Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Geautomatiseerde analyse van C. elegans fluorescentiebeelden met behulp van SegElegans

1.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69094

⸱

10 oktober 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology-Hellas, 3Instituto de Automática e Informática Industrial, Universitat Politècnica de València

In dit artikel

Samenvatting

Hier geven we instructies voor het effectief gebruik van SegElegans, een deep learning-systeem dat we hebben ontwikkeld voor de geautomatiseerde segmentatie van individuele wormen in breedveldmicroscopiebeelden, voor later gebruik in beeldanalysesoftware zoals ImageJ. We bieden manieren om het systeem zowel online als offline te gebruiken.

Samenvatting

Microscopie, met name van de fluorescerende soort, is een veelgebruikt hulpmiddel in het onderzoek van C. elegans . De analyse van gegevens van microscopie-experimenten kan echter behoorlijk vervelend en tijdrovend zijn. Automatisering is dus wenselijk. We hebben SegElegans ontwikkeld, een tweekoppig U-net-gebaseerd convolutioneel neuraal netwerksysteem dat speciaal is ontworpen voor de geautomatiseerde segmentatie van wormen, zelfs in afbeeldingen met grote aantallen aanrakende of overlappende individuen. Het eerste deel van SegElegans bestaat uit één encoder en twee decoders. De encoder, gebaseerd op het SmaAt AT-model, past dubbele convolutielagen toe, gevolgd door een Convolutional Block Attention Module (CBAM). Beide decoders maken gebruik van convolutionele LSTM's: de ene voert semantische segmentatie uit van wormafbeeldingen (lichaam, rand, achtergrond of overlap), terwijl de andere een lineair skelet langs elke worm extraheert. Het tweede deel is een nabewerkingsalgoritme dat de uitgangen van de twee decoders combineert en deze gebruikt om nauwkeurige instantiesegmentaties te genereren. Deze segmentaties kunnen vervolgens worden ingevoerd in ImageJ of andere geschikte beeldanalysetools. Hier presenteren we instructies over hoe u toegang krijgt tot dit systeem en het uitvoert. We bieden een online, op cloud computing gebaseerde implementatie en twee methoden om de SegElegans-modellen offline te gebruiken, op een lokale machine, mocht de vereiste hardware beschikbaar zijn.

Inleiding

Caenorhabditis elegans is een eukaryoot modelorganisme dat veel wordt gebruikt op het gebied van cellulaire en moleculaire biologie 1,2,3. Het is een kleine (~1 mm voor wildtype volwassenen) bodemlevende nematodenworm met een snelle levenscyclus (~drie weken) en een groot aantal nakomelingen (meestal genetisch identiek aan de zelfbevruchtende hermafrodiete ouder). Ondanks zijn relatieve eenvoud is het dier nog steeds een complex meercellig organisme met gedefinieerde en verschillende weefsels en organen, die dankzij zijn kleine omvang en transparantie in vivo kunnen worden bestudeerd zonder dat fixatie of andere invasieve behandelingen nodig zijn4. Het vermogen van de worm om in vivo onderzoek te doen door middel van microscopie kan verder worden versterkt door het gebruik van fluorescerende reporters, die het mogelijk maken om gemakkelijk individuele cellen te onderscheiden of zelfs om subcellulaire organellen/componenten zoals mitochondriën, lipidedruppels of eiwitaggregaten direct te visualiseren, en van processen zoals signaaltransductie, genexpressie, blaasjesfusie; autofagie, neuronale en spieractiepotentialen, enz.5,6,7,8,9,10,11. Daarnaast is de nematode ook zeer vatbaar voor genetische manipulatie door middel van mutagenese12, transgenese via micro-injectie of microdeeltjesbombardement13, CRISPR-bewerking14 en, belangrijker nog, als het gaat om eenvoudige en kosteneffectieve genetische screening, RNAi15. Deze manipulatie maakt de uitgebreide studie van genen en hun rol in de nematode zelf mogelijk, terwijl tegelijkertijd, dankzij de significante genetische homologie die C. elegans vertoont met andere modelorganismen, fundamentele ontdekkingen worden gedaan die relevant zijn voor de mens16,17. Ten slotte maakt deze homologie/conservering de worm ook tot een ideale eerste proeftuin voor geneesmiddelen en chemische middelen, waardoor de mechanismen van geneesmiddelactiviteit kunnen worden opgehelderd, potentiële activiteitsmodificerende genetische variaties kunnen worden geïdentificeerd en mogelijke ongewenste interacties en off-target effecten kunnen worden ontdekt 18,19,20.

Alle bovengenoemde voordelen hebben C. elegans tot een aantrekkelijk model gemaakt voor cellulaire en moleculaire biologiestudies, met name voor wetenschappers die geïnteresseerd zijn in de in vivo en vaak real-time monitoring van processen via microscopie. Dergelijke onderzoeken omvatten doorgaans een aanzienlijke hoeveelheid beeldanalyse via speciale software, waarbij de meest gebruikte optie ImageJ 21,22,23 is. Een gemeenschappelijk kenmerk van de analyse via dergelijke software is de noodzaak voor de gebruiker/onderzoeker om interessegebieden (ROI's) voor analyse te specificeren door middel van selectietools. Heel vaak wordt elke individuele worm in een afbeelding geselecteerd als zijn eigen ROI, met als doel informatie per worm te verkrijgen over eenvoudige morfologische kenmerken (zoals lichaamsafmetingen) of meer "geavanceerde" experimentele uitlezingen zoals de expressieniveaus van een gen (gemeten met een fluorescerende reporter), de uitlezing van een ratiometrische reporter, het aantal en de grootte van lipidedruppels, de vorming van eiwitaggregaten, de morfologie van individuele organellen en hun netwerken enz.5,8,10,24,25,26,27. Deze selecties per worm worden meestal handmatig gemaakt, omdat automatische selectiemethoden die zijn gebaseerd op standaard beeldverwerkingsalgoritmen meestal niet in staat zijn om de vormen en kenmerken van de worm te onderscheiden, vooral in donkerveldbeelden waar de contouren van de wormen niet duidelijk zichtbaar zijn of in helderveldbeelden met aanzienlijke aantallen dieren die elkaar raken en overlappen. Het handmatige proces is echter traag (20 s tot 1 min per worm, afhankelijk van de benodigde precisie en de ervaring van de gebruiker), arbeidsintensief en onderhevig aan vooringenomenheid en fouten van de gebruiker.

Een alternatieve en veel krachtigere aanpak voor het genereren van individuele C. elegans ROI's (een taak die doorgaans segmentatie wordt genoemd op het gebied van computervisie) is om deze te automatiseren met behulp van deep learning/neurale netwerktechnieken. Convolutionele neurale netwerken, voornamelijk gebaseerd op het masker R-CNN28 en de U-net-architecturen29, hebben behoorlijke resultaten opgeleverd bij segmentatietaken op verschillende biologische modelsystemen 30,31,32, waaronder in C. elegans 33,34,35,36,37,38,39 , maar geen enkele heeft een bevredigende oplossing geboden voor het probleem van het genereren van segmentaties van het hele lichaam die individuele dieren correct onderscheiden (bijvoorbeeld segmentatie) in afbeeldingen met een hoge resolutie met grote aantallen aanrakende of ronduit overlappende wormen. Om aan deze behoefte te voldoen, hebben we SegElegans ontwikkeld, een deep learning-model dat speciaal is ontworpen en geoptimaliseerd voor deze taak40.

SegElegans bestaat uit twee grote delen (Figuur 1). Het eerste deel is een tweekoppig U-net variant convolutioneel neuraal netwerk. Het bestaat uit een encoderblok en twee decoderblokken. Het encoderblok is gebaseerd op het SmaAt AT-model41 en maakt gebruik van dubbele convolutieblokken voor elke laag die wordt ingevoerd in een Convolutional Block Attention Module (CBAM)42. De twee decoderblokken zijn gebaseerd op het convolutionele long short-term memory (LSTM) netwerk43. Eén decoder is verantwoordelijk voor het categoriseren van elke pixel van de afbeeldingen als een deel van het hoofdgedeelte van een worm, een deel van de rand van een worm, een deel van de achtergrond of een deel van een gebied waar wormen elkaar overlappen (dit wordt meestal semantische segmentatie genoemd). De andere decoder is verantwoordelijk voor het tekenen van een lineair "skelet" over de lengte van elke worm. Het tweede deel is een nabewerkingsalgoritme dat de uitgangen van de twee decoders combineert en deze gebruikt om nauwkeurige instantiesegmentaties te genereren. Het identificeert in eerste instantie de segmenten van echte overlappingen door de semantische segmentatie-output te vergelijken met die van het skelet. Vervolgens voert het de instantiesegmentatie rechtstreeks uit voor wormen zonder overlappingen of door deze samen te stellen uit segmenten voor overlappende segmenten40. Deze segmentaties worden opgeslagen als binaire maskers en ImageJ-compatibele ROI's.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De volgende paragrafen bevatten gedetailleerde instructies over hoe effectief gebruik te maken van SegElegans (Figuur 2). Ze bevatten instructies over het voorbereiden van beeldacquisitie (sectie 1), hoe het model online (sectie 2) of offline (sectie 3-5) moet worden uitgevoerd en het importeren van ROI's naar ImageJ of andere tools (sectie 6). Aangezien voor de evaluatie van afbeeldingen via het model een pc is vereist met een CUDA-compatibele Graphics Processing Unit (GPU) die ten minste 6 GB (idealiter meer) VRAM (Video Random Access Memory) heeft, wordt de meeste gebruikers (op voorwaarde dat ze toegang hebben tot de services van Google) geadviseerd om de online versie van het model te gebruiken die voldoet aan deze hardwarevereisten en deze overtreft via cloud computing (Sectie 1 > Sectie 2 > Sectie 6). Als alternatief kunnen gebruikers die toegang hebben tot de juiste krachtige hardware en een basiskennis hebben van het gebruik van de opdrachtregel/terminal (of gebruikers die geen toegang hebben tot de bovengenoemde cloud computing-opties) het handiger vinden om het model lokaal uit te voeren (sectie 1 > sectie 3 > sectie 4 of 5 > sectie 6).

1. Acquisitie van voorbeeld- en geleidingsbeelden

  1. Gebruik SegElegans om segmentaties van volwassen wormen van elke wormstam te verkrijgen, ongeacht welke fluorescerende reporters ze al dan niet tot expressie brengen. Als het (de) fenotype(n)/gegevens van belang worden gemeten in helderveldbeelden, verkrijg deze dan normaal met behulp van een breedveldmicroscoop en compatibele software, met behulp van een 4x of vergelijkbare objectieflens.
    OPMERKING: SegElegans kan afbeeldingen analyseren met een breed scala aan helderheid en contrast, hoewel het de voorkeur verdient dat er geen verzadigde heldere of donkere pixels zijn. Met betrekking tot afmetingen is het systeem getraind met afbeeldingen van 1328 x 1048, maar het zou moeten werken met elke afbeelding die ten minste 512x512 groot is.
  2. Als het (de) fenotype(n)/gegevens van belang worden gemeten in donkerveldbeelden (typisch bij gebruik van een of meer transgene fluorescerende reporters of kleurstoffen), verkrijg dan helderveldbeelden naast de gegevens die als richtbeelden moeten worden gebruikt (zoals uitgelegd in stap 1.1). Zorg ervoor dat de geleidebeelden ruimtelijk en zo dicht mogelijk in de tijd perfect overeenkomen met de donkerveldbeelden van het fluorescentiekanaal(en), idealiter door gebruik te maken van de meerkanaals acquisitie-opties die worden geboden door de besturingssoftware van de microscoop. Sla de gidsafbeeldingen op in een aparte map van de bijbehorende donkerveldgegevensafbeeldingen, waarbij u voor beide afbeeldingen dezelfde naam gebruikt.

2. De online versie van SegElegans uitvoeren

  1. Log in op een Google-account in een webbrowser. Het wordt aanbevolen om hiervoor een nieuw speciaal laboratoriumaccount aan te maken.
  2. Voer Google Drive in (https://drive.google.com) en upload de map met de brightfield-afbeeldingen (gegevens of gids). Zoals eerder vermeld, als gidsafbeeldingen worden gebruikt om ROI's te genereren voor donkerveldafbeeldingen, neem deze donkerveldgegevensafbeeldingen dan niet op in deze map.
  3. Ga naar https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOnline/tree/v1.0 en klik op het SegElegans Body Prediction Interface.ipynb-bestand . Klik op de knop Openen in Colab bovenaan het bestand dat wordt geopend. De Jupyter notebook/interface voor SegElegans wordt geopend op Google Colab.
  4. Voer codeblok 1 uit door op de afspeelknop (figure-protocol-1) onder de titel te drukken. Geef de runtime toestemming om de code uit te voeren en de uitvoer te observeren nadat de uitvoering is voltooid (er verschijnt een groen vinkje naast de afspeelknop). Colab moet automatisch de juiste, CUDA-compatibele runtime uitvoeren en een NVIDIA-SMI-uitvoertabel weergeven. Anders forceert u het gebruik van een T4 GPU-runtime via het menu Runtime-> Runtime-type wijzigen .
  5. Voer codeblok 2 uit om de inhoud van Google Drive in de runtime te laden. Accepteer alle bevestigingsdialogen en verleen alle gevraagde toestemmingen.
  6. Voer codeblokken 3 en vervolgens 4 uit. Blok 3 duurt een paar minuten om te voltooien, dus zorg ervoor dat het groene vinkje is verschenen voordat je doorgaat naar 4.
  7. Open het pictogram met het maptabblad links van de Colab-interface. Hiermee worden de bestanden die in de runtime zijn geladen, inclusief de geïmporteerde inhoud van Drive, weergegeven als /content/drive/MyDrive. Klik met de rechtermuisknop op de map met de afbeeldingen, kopieer het pad en plak het in de test_images invoervorm van codeblok 5. Zorg ervoor dat het er als volgt uitziet: /content/drive/MyDrive/Imagefolder. Geef op dezelfde manier een pad op voor de analyse-uitvoer (bijvoorbeeld /content/drive/MyDrive/Imagefolder/Output). Houd er rekening mee dat paden in deze omgeving een schuine streep gebruiken om mappen (/) te scheiden.
  8. Voer codeblok 5 uit.
  9. Specificeer de exacte extensie van de afbeeldingen die door het model moeten worden geanalyseerd in de meegeleverde vorm van codeblok 6. Voor het doel van deze invoer ".tif", ". TIF" en ".tiff" worden behandeld als verschillende extensies.
  10. Pas de batch_crop_img-invoer in codeblok 6 niet aan als het systeem draait in de standaard T4 GPU-runtime (die gratis wordt aangeboden aan alle gebruikers voor een beperkt aantal uren per dag, afhankelijk van het gebruiksniveau). Verminder het als de runtime problemen met de beschikbaarheid van geheugen veroorzaakt.
  11. Voer codeblok 6 uit. Dit zal enige tijd duren, dus zorg ervoor dat het groene vinkje is verschenen voordat u verder gaat.
  12. Voer codeblok 7 uit. Pas de invoer niet aan voor de standaard T4-runtime, maar verminder het aantal subprocessen of schakel parallelle verwerking volledig uit als er problemen optreden met de beschikbaarheid van geheugen. Dit zal ook veel tijd in beslag nemen.
  13. Open Google Drive in een ander browservenster of tabblad en navigeer naar de uitvoermap die is aangewezen in 2.7.
    OPMERKING: Op dit punt heeft SegElegans de eerste evaluatie en nabewerking van segmentaties afgerond en verschillende submappen met uitvoer gemaakt. 0_summary resultaten bevatten grafieken die de output voor elke afbeelding samenvatten, waarbij aan elke worm een indexnummer wordt toegekend. 1_complete_mask bevat de gecureerde binaire maskers voor alle segmentaties waarvan het algoritme heeft besloten dat ze goed zijn voor analyse. 1_edge_small_mask bevat binaire maskers voor alle segmentaties die het algoritme heeft besloten te verwerpen omdat de dieren te klein zijn of gedeeltelijk verduisterd aan de rand van het beeld. 1_overlap_mask bevat binaire maskers voor alle segmentaties van wormen die echte overlappingen vertoonden en die standaard niet worden toegevoegd aan de gecureerde uitvoer. 1_all_rois_results bevat de segmentaties van ALLE 3 de typen, ongeacht de curatie, in het ImageJ-formaat (zip-bestanden met ROI's).
  14. Kies nu een van de drie opties:
    1. Gebruik de ROI's die zijn opgegeven in 1_all_rois_results in ImageJ en weiger ongewenste ROI's na de import daar (zie protocolsectie 6).
    2. Accepteer de samengestelde goede maskers zonder enige handmatige correctie (en zonder overlappende wormen) (ga naar 2.16).
    3. Pas de curatie handmatig aan door de wormen (inclusief de overlappende) te selecteren die in de uitvoer moeten worden opgenomen (ga verder naar 2.15).
  15. Om de curatie handmatig aan te passen, gebruik je codeblok 8. Bekijk de resultaten van de eerste curatie aan de hand van de overzichtsgrafieken in de map met 0_summary resultaten . Voor elke afbeelding die moet worden gecorrigeerd, voert u de volledige naam (met extensie) van de oorspronkelijke invoerafbeelding in de vorm "name_image_change" in en de nummers van de maskers die moeten worden behouden (uit de samenvattende grafiek), gescheiden door komma's in de vorm "index_images". Voer codeblok 8 uit. Herhaal deze stap voor elke andere afbeelding die moet worden gecorrigeerd.
  16. Na correctie of als gebruikers ervoor kiezen om de initiële curatie zonder correcties (en zonder de overlappende wormen) te accepteren, voert u codeblok 9 uit. Er wordt een nieuwe submap gemaakt in de uitvoermap in Google Drive met de naam 2_curated_rois_results. Het bevat alle uiteindelijke gecureerde segmentaties in het ImageJ-formaat (zip-bestanden met ROI's).
  17. Om het proces opnieuw uit te voeren voor een andere map met afbeeldingen, stelt u de runtime opnieuw in via het menu Runtime > Sessie opnieuw opstarten en begint u vanaf het begin.

3. De offline versie van SegElegans voorbereiden voor het eerste gebruik

  1. Als alternatief voor het online uitvoeren van SegElegans op Colab, is er een offline versie van SegElegans beschikbaar voor gebruikers die de cloud computing-services van Google niet kunnen of willen gebruiken. Dit vereist een pc (Windows of Linux) met een CUDA-compatibele GPU (https://developer.nvidia.com/cuda-gpus) met ten minste 6 GB VRAM (hoewel 16 wordt aanbevolen indien beschikbaar en betaalbaar).
    OPMERKING: De volgende instructies in secties 3-5 zijn gericht op Windows, maar de software kan ook worden uitgevoerd op Linux-gebaseerde systemen met enkele kleine wijzigingen in de gebruikte commando's.
  2. Download het CUDA-toolkit-installatieprogramma van https://developer.nvidia.com/cuda-downloads de instructies te volgen om de versie te krijgen die geschikt is voor het gebruikte apparaat.
    OPMERKING: SegElegans is getest met versies 12.9 en 13.0 van de toolkit en CUDA versie 11 in Windows, maar toekomstige versies zullen naar verwachting achterwaartse compatibiliteit behouden.
    1. Installeer de toolkit volgens de instructies van de installateur zelf. Visual Studio is niet nodig.
  3. Download de juiste versie van het Python-installatieprogramma voor het apparaat van https://www.python.org/downloads/. Installeer Python, volg de instructies van het installatieprogramma zelf en zorg ervoor dat python.exe aan PATH wordt toegevoegd.
    OPMERKING: SegElegans is gebouwd en getest op Python 3.13, maar toekomstige versies zullen naar verwachting achterwaartse compatibiliteit behouden.
  4. Ga naar https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOffline/releases/tag/v1 . Klik op de link Bron code (zip) om het pakket te downloaden met de benodigde bestanden om SegElegans lokaal in te stellen en uit te voeren.
  5. Pak het zip-bestand uit. Plaats het in een map op het hoogste of zelfs hoogste niveau, zoals C:\SegElegans. De inhoud van het zip-bestand bevindt zich al in een submap SegElegansOffline-1.
  6. Open de Windows-opdrachtprompt (cmd.exe). Typ het commando python -m venv "fullsegeleganspath" waarbij "fullsegeleganspath" het volledige pad is, tussen aanhalingstekens, in de submap SegElegansOffline-1 .
    OPMERKING: Als het zip-bestand bijvoorbeeld is uitgepakt in C:\SegElegans, is het volledige pad C:\SegElegans\SegElegansOffline-1 en is het commando python -m venv "C:\SegElegans\SegElegansOffline-1" . Houd er rekening mee dat paden in deze omgeving een backslash gebruiken om mappen te scheiden ('\').
  7. Gebruik in de opdrachtprompt de standaardbesturingselementen om in de map SegElegansOffline-1 te navigeren en voer de opdracht Scripts\activate uit. Een (SegElegansOffline-1) label zou moeten verschijnen vóór de volgende promptcursor, wat aangeeft dat de Python-omgeving nu actief is.
  8. Voer in de actieve omgeving (SegElegansOffline-1) de opdracht pip install -r requirements.txt uit. Het proces zal enige tijd in beslag nemen.
  9. Voer het commando python in en voer het uit assemblenetworks.py .
    OPMERKING: SegElegans is nu klaar om te draaien. Er zijn twee manieren om dit te bereiken: een snel script dat automatisch alle segmentaties als ImageJ ROI's levert zonder de optie om de curatie handmatig te corrigeren (sectie 4), en een lokaal Jupyter-notebook dat de optie biedt om de curatie te overzien en te corrigeren (sectie 5). De laatste aanpak wordt voor de meeste gebruikers aanbevolen.

4. De offline versie van SegElegans uitvoeren met een snel script

  1. Open de Windows-opdrachtprompt (cmd.exe). Zoals beschreven in stap 3.7, navigeert u naar de SegElegans-omgevingsmap en activeert u deze.
  2. Om het snelle script te gebruiken, voert u in de opdrachtprompt met de actieve (SegElegansOffline-1) omgeving de opdracht python in en voert u deze uit SegElegansBodyQuickEval.py -i "pathtoinputfolder" -x waarbij "pathtoinputfolder" het volledige pad is, tussen aanhalingstekens, naar de map met de brightfield-afbeeldingen (bijv. "D:\Data\Experiment12365\Condition 1") en de exacte bestandsextensie is van de afbeeldingen die gebruikers willen analyseren (Voorbeeld ". TIF"). Typ de opdracht python SegElegansBodyQuickEval.py -h voor instructies over aanvullende parameters die kunnen worden gewijzigd om de verwerking door het script te versnellen als het apparaat dit aankan.
    OPMERKING: De uitvoermap wordt in dit geval gemaakt in de invoermap (dus voor het bovenstaande voorbeeld: "D:\Data\Experiment12365\Condition 1\Output"). Binnenin bevindt zich een reeks submappen. 0_summary resultaten bevatten grafieken die de output voor elke afbeelding samenvatten, waarbij aan elke worm een indexnummer wordt toegekend. 1_complete_mask bevat de samengestelde binaire maskers voor alle niet-overlappende segmentaties waarvan het algoritme heeft besloten dat ze goed zijn voor analyse. 1_edge_small_mask bevat binaire maskers voor alle segmentaties die het algoritme heeft besloten te verwerpen omdat de dieren te klein zijn of gedeeltelijk verduisterd aan de rand van het beeld. 1_overlap_mask bevat binaire maskers voor alle segmentaties van wormen die echte overlappingen vertoonden. 1_all_rois_results bevat de segmentaties van ALLE 3 de typen, ongeacht de curatie, in het ImageJ-formaat (zip-bestanden met ROI's). Aangezien er hier geen manier is om curatie handmatig te corrigeren, bevat 2_curated_rois_results standaard alle segmentaties die door het algoritme als goed worden beschouwd EN alle overlappende segmentaties in het ImageJ-formaat (zip-bestanden met ROI's).

5. De offline versie van SegElegans uitvoeren met een Jupyter-notebook

  1. Open de Windows-opdrachtprompt (cmd.exe). Zoals beschreven in stap 3.7, navigeert u naar de SegElegans-omgevingsmap en activeert u deze.
  2. Om de Jupyter-interface te gebruiken, voert u in de opdrachtprompt met de actieve (SegElegansOffline-1) omgeving de opdracht jupyter-notebook in en voert u deze uit. Dit opent een webbrowservenster/tabblad met een lokaal gehoste site. Selecteer in het beginscherm het bestand SegElegansOfflineJupyterInterface.ipynb.
  3. Voer de code uit in codeblok 1 door deze te selecteren (klik links buiten de eigenlijke code) en op de afspeelknop (figure-protocol-2) op de werkbalk hierboven te drukken. Er verschijnt een bevestigingsbericht onder het codeblok wanneer de uitvoering is voltooid.
  4. Voer codeblok 2 uit. Dit genereert enkele invoerformulieren in de uitlezing onder het codeblok. Vul de gegenereerde formulieren in met het pad naar de invoermap met de helderveldafbeeldingen (Voorbeeld: "D:\Data\Experiment12365\Conditie 1"), het gewenste pad voor de analyse-uitvoer (Voorbeeld: "D:\Data\Experiment12365\Condition 1\Output") en de exacte bestandsextensie van de te analyseren afbeeldingen (Voorbeeld ". TIF"). Pas de extra meegeleverde instellingen aan (verhoog het aantal subcrops per batch naar 9 of 16 en voer meerdere parallelle nabewerkingsprocessen uit) als het apparaat voldoende geschikt is.
  5. Voer codeblok 3 uit.
  6. Voer codeblok 4 uit. Dit zal enige tijd duren, dus zorg ervoor dat het volledig is voordat u verder gaat.
  7. Voer codeblok 5 uit. Nogmaals, dit zal enige tijd duren. Navigeer hierna naar de hierboven aangegeven uitvoermap.
    OPMERKING: Op dit punt heeft SegElegans de eerste evaluatie en nabewerking van segmentaties afgerond en verschillende submappen met uitvoer gemaakt. 0_summary resultaten bevatten grafieken die de output voor elke afbeelding samenvatten, waarbij aan elke worm een indexnummer wordt toegekend. 1_complete_mask bevat de gecureerde binaire maskers voor alle segmentaties waarvan het algoritme heeft besloten dat ze goed zijn voor analyse. 1_edge_small_mask bevat binaire maskers voor alle segmentaties die het algoritme heeft besloten te verwerpen omdat de dieren te klein zijn of gedeeltelijk verduisterd aan de rand van het beeld. 1_overlap_mask bevat binaire maskers voor alle segmentaties van wormen die echte overlappingen vertoonden en die standaard niet worden toegevoegd aan de gecureerde uitvoer. 1_all_rois_results bevat de segmentaties van ALLE 3 de typen, ongeacht de curatie, in het ImageJ-formaat (zip-bestanden met ROI's).
  8. Gebruik net als bij de online versie van SegElegans een van de drie onderstaande opties:
    1. Gebruik de ROI's die zijn opgegeven in 1_all_rois_results in ImageJ en weiger ongewenste ROI's na de import daar (zie protocolsectie 6).
    2. Accepteer de automatisch samengestelde goede maskers zonder enige handmatige correctie (en zonder overlappende wormen) (ga naar stap 5.11).
    3. Pas de curatie handmatig aan door de wormen (inclusief de overlappende) te selecteren die in de uitvoer moeten worden opgenomen (ga verder naar stap 5.9).
  9. Om de curatie handmatig aan te passen, gebruik je codeblokken 6 en 7. Voer eerst 6 uit. Dit maakt invoerformulieren in de uitlezing onder de code.
  10. Bekijk de resultaten van de eerste curatie in de overzichtsgrafieken in de submap 0_summary resultaten . Voor elke afbeelding die moet worden gecorrigeerd, voert u de volledige naam in van de INPUT-afbeelding (met extensie) in de vorm Afbeelding die moet worden gecorrigeerd: en de nummers van de maskers die moeten worden behouden (uit de overzichtsgrafiek), gescheiden door komma's in de vorm Maskers die moeten worden behouden. Voer codeblok 7 uit en zorg ervoor dat de uitvoering is voltooid. Herhaal deze stap voor elke andere afbeelding die moet worden gecorrigeerd.
  11. Nadat de curatiecorrectie is uitgevoerd of als gebruikers ervoor kiezen om de initiële curatie zonder correcties (en zonder de overlappende wormen) te accepteren, voert u codeblok 8 uit. Er wordt een nieuwe submap gemaakt in de aangewezen uitvoermap met de naam 2_curated_rois_results. Het bevat alle uiteindelijke gecureerde segmentaties in het ImageJ-formaat (zip-bestanden met ROI's).
  12. Om het proces opnieuw uit te voeren voor een andere map met afbeeldingen, reset u de runtime via het menu Kernel > Kernel opnieuw opstarten en Uitvoer van alle cellen wissen en begint u bij het begin.

6. Importeren van de segmentaties naar ImageJ (of alternatieven)

  1. Open een van de daadwerkelijke gegevensafbeeldingen op ImageJ.
  2. Open het bijbehorende zip-bestand met de ROI's van die afbeelding. Hierdoor worden de selecties in de ImageJ ROI-manager geladen. Als het ROI's zijn van de 2_curated_rois_results output, zijn ze klaar voor analyse met de gewenste methoden die normaal worden gebruikt (bij voorkeur met behulp van macro's om het proces verder te automatiseren en te versnellen).
  3. Als het ROI's zijn van de 1_all_rois_results output, verwijdert u ongewenste segmentaties uit de ROI-manager. Selecteer ze en druk op de knop Verwijderen in het beheerdersvenster zelf. Druk niet op de Delete-toets op het toetsenbord, omdat dan de inhoud van de selectie in de afbeelding wordt verwijderd.
  4. Als er andere software dan ImageJ nodig is voor de analyse, zal het ROI-formaat hoogstwaarschijnlijk niet compatibel zijn. In dat geval importeer segmentaties in de universeel gebruikte vorm van binaire maskers, die worden geleverd in de mappen 1_complete_mask en 1_overlap_mask . Raadpleeg de instructies van de ontvangende software over hoe u die import moet uitvoeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Door dit protocol te volgen, zouden onderzoekers in staat moeten zijn om wormsegmentaties van hoge kwaliteit te extraheren, zelfs voor de analyse van fluorescentiebeelden zonder zichtbare wormranden. Zoals besproken in sectie 6 van het protocol, kunnen deze segmentaties rechtstreeks naar ImageJ worden geïmporteerd en worden gebruikt voor het snel meten van relevante eigenschappen zoals de intensiteit van fluorescerende reporters (vaak gebruikt voor het kwantificeren van expressie) of het...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De hier gepresenteerde methodologie zou gebruikers in staat moeten stellen om C. elegans-microscopie-experimenten in een aanzienlijk sneller tijdsbestek te analyseren zonder enig verlies van nauwkeurigheid. Omdat het segmentaties extraheert uit helderveldgidsbeelden, onafhankelijk van de werkelijke fluorescentie (zoals besproken in protocolsectie 1), kan het worden gebruikt met elke stam en voor elke toepassing die het meten van fenotypes per worm vereist. Dit kunnen toepassinge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

Het werk in het laboratorium van de auteurs wordt gefinancierd door het secretariaat-generaal voor
Onderzoek en innovatie van het Griekse Ministerie van Ontwikkeling, de
Europese Unie - NextGenerationEU (projectcode: TAEDR-0535850, Acroniem:
BrainPrecision) in het kader van de actie "Flagship Actions in
Interdisciplinaire wetenschapsgebieden met speciale interesse in verbinding
naar het productieve weefsel", onder de National Recovery and Resilience
Plan "Griekenland 2.0", het Uitvoerend Agentschap Onderzoek van de Europese Commissie
Excellence Hub "CHAngeing" (GA-101087071) en de Hellenic Foundation
voor Onderzoek en Innovatie (H.F.R.I.) in het kader van de "1ste Oproep voor H.F.R.I.
Onderzoeksprojecten ter ondersteuning van faculteitsleden en onderzoekers en de
aanschaf van dure onderzoeksapparatuur" (Projectnummer:
HFRI-FM17C3- 0869, NeuroMitopagie).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Computer met internettoegang (voorbeeld: Dell Vostro Desktop)Verschillende (Dell bijvoorbeeld) -Dit maakt het mogelijk om SegElegans online via cloud computing uit te voeren zoals aanbevolen en om beeldanalysesoftware zoals ImageJ te gebruiken.
CUDA-compatibele graphicsverwerkingseenheid met minimaal 6 GB VRAM (voorbeeld: MSI Geforce RTX  RTX3050 Ventus 2X 6GB) (Optioneel)NVIDIA + verschillende fabrikanten (Micro Star International bijvoorbeeld)https://developer.nvidia.com/cuda-gpusDit maakt het mogelijk om SegElegans offline op een lokale machine uit te voeren.
CUDA-compatibele GPU-chipsets zijn hier te vinden:
https://developer.nvidia.com/cuda-gpus
De VRAM is afhankelijk van de werkelijke implementatie van de chipset in een GPU door de fabrikant.
WAARSCHUWING: U heeft een dure en krachtige CUDA-kaart nodig die ver boven de minimale vereisten (16+ GB VRAM) ligt om de prestaties van de cloud computing-versie te evenaren.
Epifluorescentiemicroscoop (Invitrogen EVOS FL Auto 2)ThermoFisher Scientific AMAFD2000 bijvoorbeeldWe raden aan een systeem te gebruiken dat automatisch beelden van zowel brightfield als een of meer fluorescentiekanalen bijna gelijktijdig kan vastleggen.
ImageJ (Optioneel)NIHhttps://imagej.net/software/fiji/downloadsWe raden de Fiji-distributie aan, beschikbaar hier:
https://imagej.net/software/fiji/downloads
PC met NVIDIA GPU-compatibiliteit (voorbeeld: Dell Vostro Desktop) (Optioneel) Verschillende (Dell bijvoorbeeld) -Dit is nodig in combinatie met de GPU om SegElegans offline op een lokale machine uit te voeren.
Een GPU vereist Windows-compatibele hardware met de juiste PCI-slots op de moederbord, ruimte om de kaart te plaatsen en een voldoende krachtige voeding.
SegElegans-https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOnline/tree/v1.0 Zie manuscript voor volledige instructies. 

Referenties

  1. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nat Rev Drug Discov. 5 (5), 387-398 (2006).
  2. Markaki, M., Tavernarakis, N. Caenorhabditis elegans as a model system for human diseases. Curr Opin Biotechnol. 63, 118-125 (2020).
  3. Zuryn, S. C. elegans as a model for health and disease. Semin Cell Dev Biol. 154 (Pt A), 1-3 (2024).
  4. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
  5. Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. , 1-13 (2006).
  6. Feinberg, E. H., et al. GFP reconstitution across synaptic partners (GRASP) defines cell contacts and synapses in living nervous systems. Neuron. 57 (3), 353-363 (2008).
  7. Hammarlund, M., Jin, Y. Axon regeneration in C. elegans. Curr Opin Neurobiol. 27, 199-207 (2014).
  8. Daniele, J. R., et al. UPR(ER) promotes lipophagy independent of chaperones to extend life span. Sci Adv. 6 (1), eaaz1441(2020).
  9. Yemini, E., et al. NeuroPAL: A multicolor atlas for whole-brain neuronal identification in C. elegans. Cell. 184 (1), 272-288.e11 (2021).
  10. Sinnige, T., et al. Kinetic analysis reveals that independent nucleation events determine the progression of polyglutamine aggregation in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (11), e2021888118(2021).
  11. Gkikas, I., Daskalaki, I., Kounakis, K., Tavernarakis, N., Lionaki, E. MitoSNARE assembly and disassembly factors regulate basal autophagy and aging in C. elegans. Int J Mol Sci. 24 (4), 4230(2023).
  12. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
  13. Praitis, V., Maduro, M. F. Transgenesis in C. elegans. Methods Cell Biol. 106, 161-185 (2011).
  14. Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-guided genome engineering in Caenorhabditis elegans. Curr Protoc Mol Biol. 129 (1), e106(2019).
  15. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  16. Lai, C. H., Chou, C. Y., Ch'ang, L. Y., Liu, C. S., Lin, W. Identification of novel human genes evolutionarily conserved in Caenorhabditis elegans by comparative proteomics. Genome Res. 10 (5), 703-713 (2000).
  17. Kuwabara, P. E., O'Neil, N. The use of functional genomics in C. elegans for studying human development and disease. J Inherit Metab Dis. 24 (2), 127-138 (2001).
  18. Ranganathan, R., Sawin, E. R., Trent, C., Horvitz, H. R. Mutations in the Caenorhabditis elegans serotonin reuptake transporter MOD-5 reveal serotonin-dependent and -independent activities of fluoxetine. J Neurosci. 21 (16), 5871-5884 (2001).
  19. Lackner, M. R., et al. Chemical genetics identifies Rab geranylgeranyl transferase as an apoptotic target of farnesyl transferase inhibitors. Cancer Cell. 7 (4), 325-336 (2005).
  20. Yoon, S., et al. Microfluidics in high-throughput drug screening: Organ-on-a-chip and C. elegans-based innovations. Biosensors (Basel). 14 (1), 55(2024).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  23. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  24. Valente, A. J., Maddalena, L. A., Robb, E. L., Moradi, F., Stuart, J. A. A simple ImageJ macro tool for analyzing mitochondrial network morphology in mammalian cell culture. Acta Histochem. 119 (3), 315-326 (2017).
  25. Ramki, K., Thiruppathi, G., Ramasamy, S. K., Sundararaj, P., Sakthivel, P. An aggregation-induced emission-based ratiometric fluorescent chemosensor for Hg(II) and its application in Caenorhabditis elegans imaging. Methods. 221, 1-11 (2024).
  26. Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. Reporter gene fusions. WormBook. , 1-23 (2006).
  27. Braeckman, B. P., Smolders, A., Back, P., De Henau, S. In vivo detection of reactive oxygen species and redox status in Caenorhabditis elegans. Antioxid Redox Signal. 25 (10), 577-592 (2016).
  28. He, K., Gkioxari, G., Dollár, P., Girshick, R. Mask R-CNN. arXiv. , (2017).
  29. Ronneberger, O., Fischer, P., Brox, T. U-Net: Convolutional networks for biomedical image segmentation. arXiv. , (2015).
  30. Exploring deep learning architectures in NAECON 2018. Proc IEEE NAECON. Alom, M. Z., Yakopcic, C., Taha, T. M., Asari, V. K. IEEE National Aerospace and Electronics Conference, , 228-233 (2018).
  31. Micallef, N., Seychell, D., Bajada, C. J. Exploring the U-Net++ model for automatic brain tumor segmentation. IEEE Access. 9, 125523-125539 (2021).
  32. Plebani, E., et al. High-throughput segmentation of unmyelinated axons by deep learning. Sci Rep. 12 (1), 1198(2022).
  33. Fudickar, S., Nustede, E. J., Dreyer, E., Bornhorst, J. Mask R-CNN based C. elegans detection with a DIY microscope. Biosensors (Basel). 11 (8), 257(2021).
  34. Lalit, M., Tomancak, P., Jug, F. EmbedSeg: Embedding-based instance segmentation for biomedical microscopy data. Med Image Anal. 81, 102523(2022).
  35. Layana Castro, P. E., Garvi, A. G., Sanchez-Salmeron, A. J. Automatic segmentation of Caenorhabditis elegans skeletons in worm aggregations using improved U-Net in low-resolution image sequences. Heliyon. 9 (4), e14715(2023).
  36. A convolutional neural network model for worm imaging in 2020. Proc IEEE ISBI. Chen, L., et al. IEEE 17th International Symposium on Biomedical Imaging (ISBI), , 508-512 (2020).
  37. Guan, G., et al. Cell lineage-resolved embryonic morphological map reveals signaling associated with cell fate and size asymmetry. Nat Commun. 16 (1), 3700(2025).
  38. Cao, J., et al. Establishment of a morphological atlas of the Caenorhabditis elegans embryo using deep-learning-based 4D segmentation. Nat Commun. 11 (1), 6254(2020).
  39. Zhao, C., et al. EmbSAM: Cell boundary localization and Segment Anything Model for fast images of developing embryos. bioRxiv. , (2024).
  40. Castro, P. E. L., et al. SegElegans: Instance segmentation using dual convolutional recurrent neural network decoder in Caenorhabditis elegans microscopic images. Comput Biol Med. 190, 110012(2025).
  41. Trebing, K., Stańczyk, T., Mehrkanoon, S. SmaAt-UNet: Precipitation nowcasting using a small attention-UNet architecture. Pattern Recognit Lett. 145, 178-186 (2021).
  42. Woo, S., Park, J., Lee, J. Y., Kweon, I. S. CBAM: Convolutional block attention module. arXiv. , (2018).
  43. Shi, X., et al. Convolutional LSTM network: A machine learning approach for precipitation nowcasting. arXiv. , (2015).
  44. Stuhr, N. L., et al. Rapid lipid quantification in Caenorhabditis elegans by Oil Red O and Nile Red staining. Bio Protoc. 12 (5), e4340(2022).
  45. Kuzmic, M., et al. In situ visualization of carbonylation and its co-localization with proteins, lipids, DNA and RNA in Caenorhabditis elegans. Free Radic Biol Med. 101, 465-474 (2016).
  46. Fang, E. F., et al. In vitro and in vivo detection of mitophagy in human cells, C. elegans, and mice. J Vis Exp. (129), e56301(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

C elegans beeldvormingfluorescentiemicroscopiegeautomatiseerde segmentatiedeep learning segmentatieworm instantiesegmentatieU Net neuraal netwerkImageJ analyseconvolutionele LSTMoverlappende wormencloud beeldanalyse
Geautomatiseerde analyse van C. elegans fluorescentiebeelden met behulp van SegElegans
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.