Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie en zuivering van volwassen muiscardiomyocyten door Langendorff-perfusie en zwaartekrachtsedimentatie

285 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69102

⸱

31 maart 2026

 ,  , 
1Deqing People's Hospital, 2School of Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, 3Anesthesiology Department, Shanxi Provincial People's Hospital Affiliated Shanxi Medical University

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie heeft als doel de extractieprocedure voor volwassen muiscardiomyocyten te optimaliseren en te stroomlijnen, met als ultiem doel het verbeteren van onderzoeksmethodologieën bij hart- en vaatziekten. Dit protocol verkrijgt efficiënt cardiomyocyten met hoge levensvatbaarheid en zuiverheid binnen een verkorte verwerkingstijd, waardoor betrouwbaardere experimenten mogelijk worden en therapeutische vooruitgang wordt versneld.

Samenvatting

Hart- en vaatziekten blijven een grote wereldwijde gezondheidsuitdaging, wat een dringende behoefte creëert aan betrouwbare in vitro modellen. Deze studie presenteert een geoptimaliseerd protocol voor de isolatie en kweek van volwassen muiscardiomyocyten om beperkingen van lage levensvatbaarheid en niet-cardiomyocytenbesmetting in bestaande methoden aan te pakken. Het protocol is gebaseerd op retrograde Langendorff-perfusie, waarbij heparinenatrium wordt gebruikt voor antistolling en collagenase type II (1,2 mg/mL) alleen wordt gebruikt voor de vertering. Cardiomyocyten werden gezuiverd door zwaartekrachtsedimentatie en gekweekt op laminine-gecoate oppervlakken. Deze methode leverde consequent 8,75 ± 0,36 ×10.5 cardiomyocyten per hart op met een hoog aandeel staafvormige cellen (91,2% ± 2,11%) en een hoge zuiverheid (het percentage cTNT⁺DAPI⁺-cellen ten opzichte van DAPI⁺-cellen was ongeveer 97,47% ± 1,365%), wat duidelijke sarcomerische structuren vertoonde. Door een gestandaardiseerde en reproduceerbare methode te bieden voor het verkrijgen van hoogwaardige volwassen cardiomyocyten, overbrugt dit protocol effectief de kloof tussen in vitro-studies en pathofysiologische relevantie, en ondersteunt zo geavanceerd cardiovasculair onderzoek.

Inleiding

Hart- en vaatziekten blijven wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak1. Cardiomyocyten, als centraal aandachtspunt in hartonderzoek, zijn al lange tijd essentiële instrumenten voor het onderzoeken van hartfysiologie enpathologie. Hoewel commercieel verkrijgbare cardiomyocytencellijnen en de recent populair gemaakte menselijke pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hPSC-CM's) grotere voordelen bieden qua toegankelijkheid en eenvoudige manipulatie 3,4,5, tonen primaire cardiomyocyten die ex vivo geïsoleerd zijn superieure structurele en functionele correlatie met cardiale fysiologische en pathologische mechanismen. Daarom is het beheersen van technieken voor in vitro cardiomyocytenisolatie van het grootste belang.

Cardiomyocyten vertonen gedurende de ontwikkeling duidelijke morfologische en functionele transformaties. Opmerkelijk is dat deze cellen het proliferatieve potentieel behouden tijdens de embryonale ontwikkeling en de neonatale periode (binnen 7 dagen na de geboorte), maar deze regeneratieve capaciteit gaat daarna permanent verloren6. Door postnatale rijping ondergaan cardiomyocyten een ingrijpende morfologische remodel, en krijgen uiteindelijk hun karakteristieke volwassen fenotype tegen 2 maanden oud - met staafvormige morfologie en een sterk georganiseerde sarcomerische structuur 7,8. Deze ontwikkelingsfase-afhankelijke kenmerken onderstrepen het cruciale belang van het gebruik van volwassen muiscardiomyocyten voor mechanistische studies van de hartpathofysiologie.

Cruciaal voor de vooruitgang in dit vakgebied is de betrouwbare aanschaf van high-fidelity cardiomyocyten, met name volwassen cellen die de menselijke cardiale fysiologie nauwkeurig nabootsen. De huidige isolatieprotocollen voor volwassen muis-cardiomyocyten staan voor verschillende aanhoudende uitdagingen: (i) verminderde cellulaire levensvatbaarheid, (ii) heterogene populatiekenmerken en (iii) technisch veeleisende procedures – die allemaal samen de voortgang van onderzoek belemmeren 9,10. Dit onderstreept de dringende noodzaak om isolatiemethodologieën te optimaliseren om zowel een verhoogd rendement als zuiverheid te bereiken, waardoor fysiologisch relevantere cellulaire platforms voor het onderzoek naar cardiovaatziekten worden geboden.

Door systematische optimalisatie van perfusieparameters, enzymatische digestieprotocollen en reagentiaformuleringen heeft deze studie met succes een verbeterde methodologie vastgesteld voor het isoleren en kweken van volwassen muiscardiomyocyten. Het geoptimaliseerde protocol levert cardiomyocyten op met goed bewaarde morfologische integriteit, gekenmerkt door hoge staafvormige verhoudingen en duidelijk zichtbare sarcomerische structuren. Deze ontwikkelingen bieden een robuust experimenteel platform voor diepgaand onderzoek naar cardiomyocytenpathofysiologie, wat onderzoek naar cardiovasculaire ziekten gericht op myocardcellulaire mechanismen aanzienlijk bevordert.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierprocedures in deze studie werden strikt uitgevoerd volgens de richtlijnen van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), goedgekeurd door de Ethische Commissie van Deqing People's Hospital. De studie gebruikte mannelijke C57BL/6 muizen van 8-12 weken oud, gekocht bij GemPharmatech Co., Ltd. Alle dieren werden gehuisvest in SPF-klasse barrièrefaciliteiten met milieuparameters die voldoen aan nationale normen (kamertemperatuur 22 ± 2 °C, relatieve luchtvochtigheid 50 ± 10%, 12/12 uur licht/donker cyclus). Gedurende de experimenten hield deze studie zich strikt aan de "3R"-principes (Vervanging, Reductie, Verfijning) en voerde standaardprocedures uit, waaronder anesthesie en analgesie om het lijden van dieren te minimaliseren.

OPMERKING: Kort gezegd wordt het intacte hart snel uit de muisthoracale holte verwijderd en onderworpen aan retrograde perfusie met collagenase type II-oplossing via het Langendorff-apparaat om de extracellulaire matrix enzymatisch te vertederen. Na volledige weefselvertering wordt het verzachte myocardas zorgvuldig gedissocieerd tot een single-cell suspensie. De resulterende celsuspensie wordt sequentieel gefilterd om onverteerde weefselfragmenten te verwijderen, gevolgd door zwaartekrachtsedimentatie om levensvatbare cardiomyocyten te verrijken. De gezuiverde cardiomyocyten kunnen vervolgens worden gebruikt voor latere experimentele toepassingen.

1. Langendorff perfusieapparaat voorbereiding

OPMERKING: Het Langendorff-systeem heeft een totaal buisvolume van 15,5 mL. De perfusiestroom is 3,5 mL/min voor cardiale perfusie en 10-15 mL/min voor systeemspoeling.

  1. Spoel het Langendorff-perfusiesysteem met 50 mL 75% ethanol.
    OPMERKING: Voer maandelijks glasbuisreiniging uit met 1 M HCl om de steriliteit te waarborgen.
  2. Spoel met 250 mL steriele ddH2O om ethanolresten te verwijderen en luchtbellen te elimineren.
  3. Stel de waterbadtemperatuur in op 42 °C. Zet de pomp aan om circulerende verwarming te starten en vul de buitenruimte van de Serpentine-buis met warm water.
    OPMERKING: Dit zorgt ervoor dat het perfusat het hart bereikt bij 37 °C.

2. Buffervoorbereiding

  1. Bereid Krebs-Bicarbonaat-oplossingsbuffer (KB), perfusiebuffer (PB), verteringsbuffer (DB), myocytplatingmedium (MPM) en myocytkweekmedium (MCM) voor volgens de formuleringen vermeld in Tabel 1.
    OPMERKING: Bereid het op de dag van gebruik vers voor.
  2. Prekoel 10 mL KB-buffer op ijs.
  3. Vul de lumen met PB. Stel de debiet in op 3,5 mL/min en meet de effluenttemperatuur (37 °C is optimaal).
  4. Spoel 7 ml DB door de pijpleiding en sluit vervolgens de perfusielijn.
  5. Bereid een heparinenatriumoplossing voor (0,5%, 62,5 KU) en vul 300 μL in een insulinespuit.
  6. Aliquot 10 mL PB en 10 mL KB in twee aparte petrischalen en koel ze vooraf op ijs.
  7. Plaats een 100 μm celfilter op het deksel van een 50 mL centrifugebuis, maak deze vooraf nat met 1 mL KB en bevestig hem op een 50 mL centrifugebuis.

3. Hartextractie en canule

OPMERKING: In dit protocol werden steriele handschoenen, instrumenten, gaas en wattenstaafjes gebruikt gedurende de procedure om externe besmetting te minimaliseren. Hoewel de volledige aseptische techniek essentieel is voor primaire celkweek, diende het hier ter ondersteuning van dierenwelzijn en weefselintegriteit voor latere histologische en moleculaire analyses, in plaats van om de steriliteit voor celisolatie te behouden.

  1. Verdoof de muis via intraperitoneale injectie van 80 mg/kg pentobarbital natrium (farmaceutische kwaliteit) gecombineerd met 5 IU/g heparinenatrium met lichaamsgewicht. Houd het nauwlettend in de gaten totdat diepe verdoving is bereikt. Knijp in de tenen van de muis en observeer het verdwijnen van de teenknijpreflex om het succes van de anesthesie te bevestigen.
  2. Verwijder borsthaar met onthaaringscrème.
  3. Bevestig de muis op een schuimplaat en desinfecteer de borsthuid met 75% alcohol.
  4. Til de thoracale huid op met een tang en maak een incisie bij het uitsteeksel van het xiphoïd.
  5. Hef de xiphoïde en snijd de ribben aan beide zijden richting de okselgebieden, en doorsnijd vervolgens het middenrif volledig.
    OPMERKING: Voorkom schade aan het hart.
  6. Immobiliseer het borstbeen en de ribben met hemostatische pincet om het hart volledig bloot te leggen.
  7. Neem bloed op en verplaats de lever voorzichtig naar de achterpoten met weefsel. Gebruik wattenstaafjes voorzichtig om het hart te manipuleren zodat de onderste vena cava zichtbaar wordt.
  8. Injecteer 300 μL heparinenatriumoplossing (vanaf stap 2.5) in de inferieure vena cava met behulp van de voorbereide insulinespuit.
    OPMERKING: Let erop dat er geen luchtbellen ontstaan.
  9. Verwijder het thymische weefsel en snijd vervolgens de omliggende aderen en slagaders door. Breng het hart direct over naar de voorgekoelde PB-buffer (van stap 2.6).
    OPMERKING: Het verwijderen van de thymus verbetert de zichtbaarheid van de aorta. Behoud een aortasegment tijdens de excisie. Myocardcontractie werd vertraagd door voorgekoelde PB-oplossing. Cardiale excisie onder narcose leidt tot humane euthanasie.
  10. Met behulp van micropincet grijpt u de aorta vast en monteert deze op de canule van het Langendorff-perfusiesysteem. Bevestig met 5-0 zijden hechting.
    OPMERKING: Voer deze stap snel uit. Zorg ervoor dat het perfusiesysteem is uitgeschakeld tijdens het opstellen van het hart.

4. Cardiale perfusie

  1. Zet het perfusiesysteem aan en start de timing voor 2 minuten en 30 seconden. Tijdens deze periode bestaat het afvalwater uit PB-buffer en hoeft het niet te worden verzameld.
  2. Na afloop van het interval van 2 minuten en 30 seconden, begin je met het verzamelen en hercirculeren van de DB-buffer terwijl je 15 minuten timet.
    OPMERKING: Controleer de myocardstatus - optimale spijsvertering wordt aangeduid door verminderde weefselelasticiteit en verhoogde doorschijnendheid. Als de spijsvertering onvolledig lijkt, kan de duur matig verlengd zijn, maar mag niet langer zijn dan 20 minuten om cardiomyocytschade te voorkomen.
  3. Na de getimede periode wissel je van DB naar PB-buffer en blijf je perfusie nog 4 minuten en 30 seconden uitvoeren. Het afvalwater bevat in deze fase een DB-buffer; Verzamel het.
  4. Beëindig de perfusie door het systeem uit te schakelen na het laatste tijdinterval.

5. Celdissociatie en zuivering

  1. Haal het hart uit de canule en plaats het in de voorgekoelde KB-buffer (bereid in stap 2.6).
    OPMERKING: De enzymatische vertering werd beëindigd door onmiddellijke overdracht van het hart in de KB-buffer. Dit verdunt het restenzym snel, voorkomt overdigestie en zorgt voor een hoge levensvatbaarheid van de cel.
  2. Verwijder met fijne schaar zorgvuldig het atrium- en aortaweefsel, waarbij alleen het myocarde behouden blijft.
  3. Het myocardweefsel wordt mechanisch gedissocieerd in kleine fragmenten (<1 mm3) met behulp van micropincetten.
  4. Blaas voorzichtig de weefselfragmenten af met een 2 mL druppelaar om een single-cell suspension te bereiken.
    OPMERKING: Wees uiterst voorzichtig tijdens het blazen om de staafvormige cardiomyocytenmorfologie te behouden. Vermijd het gebruik van standaard pipettoppen, omdat hun smalle boring de celintegriteit mechanisch kan verstoren.
  5. Filter de resulterende celsuspensie door de voorbevochtigde 100 μm celzeef (gemonteerd in stap 2.7) in een 50 mL buis.
  6. Breng de gefilterde suspensie over in een buis van 15 mL en laat cardiomyocyten door zwaartekrachtsedimentatie neerzinken (15 min, 4 °C).
    OPMERKING: Het verminderde basale oppervlak van 15 mL buizen verbetert de efficiëntie van celherstel aanzienlijk vergeleken met 50 mL buizen.
  7. Aspireer voorzichtig het supernatant, suspendeer de gepelleteerde cardiomyocyten opnieuw in 10 mL ijskoude KB-buffer met een 2 mL transferpipet, en herhaal de sedimentatie (15 min, 4 °C).
  8. Herhaal stappen 5.4-5.7 om een gezuiverde voorbereiding te verkrijgen van intacte, staafvormige cardiomyocyten die geschikt zijn voor toepassingen.

6. Celcultuur

  1. Bedek de kweekschalen met 10 μg/mL laminine en incubeer bij 37 °C gedurende 2 uur.
    OPMERKING: Om mechanische schade aan staafvormige cardiomyocyten te minimaliseren en de verlengde verwerkingstijd van differentiële plating te verkorten, gebruikte deze studie laminincoating in plaats van differentiële plating, een strategie die niet alleen de efficiëntie van cellulaire hechting verbetert, maar ook de natuurlijke fysiologische kenmerken van cardiomyocyten behoudt.
  2. Sussen de cardiomyocyten opnieuw in 4 mL voorverwarmde (37 °C) MPM. Na het verwijderen van de laminineoplossing zaad je de cardiomyocyten in de gecoate schalen. Incubeer bij 37 °C met 2%CO2 gedurende 1 uur. Observeer de celmorfologie, grootte en dichtheid onder een microscoop.
  3. Na de incubatie giet je de MPM zorgvuldig over en vervang je deze door voorverwarmde (37 °C) MCM. Houd de incubatie 24 uur aan op 37 °C met 2%CO2 .
  4. Na 24 uur wordt de cardiomyocyten onderzocht op structurele integriteit en morfologie.
    OPMERKING: Houd een strikte aseptische techniek aan gedurende de hele procedure.
    WAARSCHUWING: Collagenase type II kan ademhalingsallergieën, huid- en oogirritatie veroorzaken. Zorg ervoor dat je in een goed geventileerde ruimte werkt en vermijd het inademen van stof of contact met huid en slijmvliezen. Alle weggegooide muishartweefsels, bloedmonsters en alle wegwerpbenodigdheden die ermee in aanraking zijn gekomen, moeten als biologisch gevaarlijk afval worden verzameld in aparte, lekvrije containers met het biohazard-symbool. Deze materialen worden vervolgens onderworpen aan gecentraliseerde decontaminatie- en verwijderingsprocedures.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De isolatie- en kweekprocedure van volwassen muiscardiomyocyten wordt in het protocol gedemonstreerd, met de vereiste instrumentatie en buisopstelling zoals geïllustreerd in Figuur 1. Morfologisch onderzoek toonde aan dat vers geïsoleerde cardiomyocyten, evenals die gekweekt voor 1 uur en 24 uur, allemaal karakteristieke staafvormige of fusvormige morfologie vertoonden met duidelijk zichtbare striaties (Figuren 2A-C)...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze studie vormt een belangrijke methodologische doorbraak in cardiovasculair onderzoek door een geoptimaliseerd protocol op te stellen voor isolatie en kweek van volwassen muiscardiomyocyten. Door systematische verfijning van de buffersamenstelling en enzymatische verteringsparameters verbetert deze aanpak aanzienlijk de betrouwbaarheid van het kweeksysteem, terwijl zowel de zuiverheid als de levensvatbaarheid van cardiomyocyten worden verbeterd. Deze technische ontwikkelingen bieden e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten om te melden.

Dankbetuigingen

Wij erkennen dankbaar de financiële steun die is verleend door de National Natural Science Foundation of China (nr. 82400312).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BDMAladdin Scientific Corporation, Shanghai, ChinaD111028
BSAAladdin Scientific Corporation, Shanghai, ChinaB265994
C57BL/6 muizen GemPharmatech Co., Ltd8–12-week-oude mannelijke 
CaCl2Aladdin Scientific Corporation, Shanghai, ChinaC431202
Collageenase type IIWorthington Biochemical Corporation (USA)LS004176LOT#:43D23502   Enzymactiviteitseenheden: 270u/mg dw
FBSBeyotime Biotechnology, ChinaC0226
GlucoseAladdin Scientific Corporation, Shanghai, ChinaD639737
HEPESSigma-AldrichH7006
KClAladdin Scientific Corporation, Shanghai, ChinaP112134
KH2PO4Aladdin Scientific Corporation, Shanghai, ChinaP104075
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030081
MEMThermo Fisher Scientific11095080
MgSO4Aladdin Scientific Corporation, Shanghai, ChinaM116444
Na2HPO4Aladdin Scientific Corporation, Shanghai, ChinaS274390
NaClAladdin Scientific Corporation, Shanghai, ChinaC111547
NaH2PO4Aladdin Scientific Corporation, Shanghai, ChinaS108339
NaHCO3Aladdin Scientific Corporation, Shanghai, ChinaS112338
Penicilline-streptomycine (100x)Beyotime Biotechnology, ChinaC0222
Primovert Inverted Cell Culture Microscope Carl Zeiss
TaurineAladdin Scientific Corporation, Shanghai, ChinaT103829

Referenties

  1. Crea, F. The burden of cardiovascular risk factors: a global perspective. Eur Heart J. 43 (30), 2817-2820 (2022).
  2. Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circ Res. 119 (8), 909-920 (2016).
  3. Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study. Dev Biol. 80 (2), 466-482 (1980).
  4. Karakikes, I., Ameen, M., Termglinchan, V., Wu, J. C. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: insights into molecular, cellular, and functional phenotypes. Circ Res. 117 (1), 80-88 (2015).
  5. Protze, S. I., Lee, J. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: From developmental biology to therapeutic applications. Cell Stem Cell. 25 (3), 311-327 (2019).
  6. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
  7. Mohamed, T. M. A., et al. Regulation of cell cycle to stimulate adult cardiomyocyte proliferation and cardiac regeneration. Cell. 173 (1), 104-116.e12 (2018).
  8. Wang, W. E., et al. Dedifferentiation, proliferation, and redifferentiation of adult mammalian cardiomyocytes after ischemic injury. Circulation. 136 (9), 834-848 (2017).
  9. Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochem Biophys. 61 (1), 93-101 (2011).
  10. Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. J Vis Exp. (87), e51357(2014).
  11. Alam, P., Maliken, B. D., Ivey, M. J., Jones, S. M., Kanisicak, O. Isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes. J Vis Exp. (164), e61073(2020).
  12. Kruppenbacher, J. P., May, T., Eggers, H. J., Piper, H. M. Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture. Naturwissenschaften. 80 (3), 132-134 (1993).
  13. Dambrot, C., et al. Serum supplemented culture medium masks hypertrophic phenotypes in human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. J Cell Mol Med. 18 (8), 1509-1518 (2014).
  14. Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: comparison with serum-supplemented medium. Biochem Biophys Res Commun. 128 (1), 376-382 (1985).
  15. Zheng, X., et al. Proteomic analysis for the assessment of different lots of fetal bovine serum as a raw material for cell culture. Part IV. Application of proteomics to the manufacture of biological drugs. Biotechnol Prog. 22 (5), 1294-1300 (2006).
  16. O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods Mol Biol. 357, 271-296 (2007).
  17. Gong, Y., et al. Mitochondrial tumor suppressor 1A attenuates myocardial infarction injury by maintaining the coupling between mitochondria and endoplasmic reticulum. Circulation. 152 (3), 183-201 (2025).
  18. Xiao, C., et al. FMO2 prevents pathological cardiac hypertrophy by maintaining the ER-mitochondria association through interaction with IP3R2-Grp75-VDAC1. Circulation. 151 (23), 1667-1685 (2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Isolatie van cardiomyocytenvolwassen muizenhartzuivering van cardiomyocytencollagenase-digestielaminine-coatingcelviabiliteitsarcomere structuurcardiovasculair onderzoek
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.