Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Radiochemische beoordeling van de enzymactiviteit van glycogeensynthase in dierlijk weefsel

437 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69103

⸱

24 oktober 2025

 , 
1Indiana University School of Medicine-Muncie and Ball State University

In dit artikel

Samenvatting

De test op dierlijk weefsel maakt gebruik van nucleaire scintillatiedetectie om de enzymatische activiteit van glycogeensynthase te bepalen door de opname van radioactief gelabelde glucose in glycogeen te meten.

Samenvatting

Glycogeen is een belangrijke metaboliet voor veel eukaryote cellen, een integraal onderdeel van energieopslag en snelle energieafgifte. De opbouw van het molecuul is afhankelijk van glycogeensynthase, een sterk gereguleerd enzym met als primaire functie het vergemakkelijken van de sequentiële hechting van glucose-eenheden in een groeiend glycogeenpolymeer. Dit enzym wordt allosterisch geactiveerd door glucose-6-fosfaat en op meerdere plaatsen geremd door fosforylering. Kennis van enzymatische activiteit van glycogeensynthase is een belangrijk onderdeel van het begrijpen van het glycogeenmetabolisme, spierenergieniveaus en stofwisselingsstoornissen zoals diabetes en glycogeenopslagziekten. Hier wordt een zeer gevoelige en effectieve methode beschreven voor het bepalen van de activiteit van glycogeensynthase in dierlijk spierweefsel door de hoeveelheid geïntegreerde glucose te meten, van radioactief gelabelde [14C]-UDP-glucose, in glycogeenmoleculen. Deze procedure maakt gebruik van radioactief 14C en vereist de juiste autorisatie en laboratoriumruimte voor gebruik en verwijdering. Deze procedure vereist ook toegang tot een vloeistofscintillatieteller.

Inleiding

Glycogeen, een sterk vertakt polysacharide dat bestaat uit glucose-eenheden, dient als een belangrijke energiereserve in verschillende weefsels, waaronder spieren, lever en hersenen1. De synthese en afbraak ervan worden georkestreerd door een complex systeem van gespecialiseerde enzymen en regulerende eiwitten. Essentieel voor de biosynthese is het enzym glycogeensynthase (GYS), waarvan er twee isovormen zijn (GYS1 en GYS2). GYS1 is een regulerend enzym dat direct verantwoordelijk is voor de aanmaak van glycogeen uit glucose in niet-levercellen, terwijl GYS2 in de lever functioneert. Dit proces, bekend als glycogenese, is de opeenvolgende toevoeging van een individuele eenheid glucose aan een groeiende glycogeenketen. GYS katalyseert de overdracht van glucose van de intermediaire uridinedifosfaatglucose (UDP-glucose) naar het einde van een glycogeenketen, waardoor een alfa-1,4-glycosidische binding 2ontstaat. In coördinatie met het glycogeenvertakkende enzym breidt deze reactie de glycogeenmoleculen uit, wat zorgt voor zowel een efficiënte opslag als afgifte van energie.

Er bestaan analysetechnieken om de activiteit van het enzym te meten, waarbij een van de meest gebruikelijke groepen methoden bestaat uit die van de spectrofotometrische variëteit 3,4. Deze tests zijn doorgaans gebaseerd op een systeem van indirecte gekoppelde reacties en meten de absorptie van het stroomafwaartse product, NADH, bij 340 nm. Eén eenheid NADH wordt geconsumeerd voor elke eenheid UDP die door glycogeensynthase wordt bevrijd van UDP-glucose, waardoor een meetbare excitatie ontstaat die direct correleert met de glycogeensynthase-activiteit 5,6. Hoewel spectrofotometrie-assays relatief goedkoop en toegankelijk zijn, hebben ze het kleine nadeel dat ze vertrouwen op een indirecte reactie en grote nadelen van interferentie door troebelheid van monsters en lagere gevoeligheid, vooral een probleem voor kleinere monsters of monsters met weinig/sterk gefosforyleerd glycogeensynthase. Fluorometrische testen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de hierboven beschreven gekoppelde reacties, zijn ontwikkeld om de gevoeligheid in spierweefsel van mens7 en muis8 te verbeteren. Er bestaan andere technieken voor het kwantificeren van glycogeensynthase, zoals immunoblotting9 en immunohistochemie10; Deze technieken zijn echter alleen in staat om de fysieke hoeveelheid enzym te kwantificeren en kunnen in het beste geval activiteit afleiden uit fosforylering, maar niet direct enzymactiviteit kwantificeren11.

Van deze enzymtesttechnieken blijven radiochemische methoden het meest gebruikt voor het bepalen van de glycogeensynthase-activiteit in zoogdierweefsel vanwege hun gebrek aan interferentie door troebelheid van het monster en hun hoge gevoeligheid 8,9. Deze testen bevatten radioactief gelabelde glucose van UDP-glucose gelabeld met 14C12 of 3H13 in glycogeen, waardoor directe meting van enzymactiviteit gedurende een bepaalde tijd mogelijk is. In de volgende procedure wordt een weefselmonster dat glycogeensynthase bevat, blootgesteld aan UDP-glucose en glycogeenprimer. Glycogeensynthase katalyseert de reactie die in de onderstaande vergelijking wordt weergegeven:

UDP-[14C]glucose + (glycogeen)n → (glycogeen)n+1[14C] + UDP

Na een bepaalde tijd wordt de reactie beëindigd en wordt het glycogeen met radioactief gelabelde glucose ofwel neergeslagen op filterpapier12 (zoals hieronder beschreven) of onderworpen aan gelfiltratie zoals beschreven door Niederwanger et al.14 en gemeten met behulp van een scintillatiedetector. Deze methode omvat ook een afzonderlijke identieke reactie die glucose-6-fosfaat (G6P) omvat, een allosterische activator van glycogeensynthase. Onder omstandigheden met voldoende G6P-niveaus wordt de glycogeensynthase-activiteit maximaal geactiveerd, wat het absolute potentieel voor glycogeensynthase-activiteit van een bepaald monster aantoont. De hier beschreven methode is aangepast van Suzuki en collega's15 naar een formaat met 96 putjes en is geoptimaliseerd voor gebruik in spierweefsel van muizen; Het protocol kan echter worden gewijzigd voor andere weefsels en diersoorten.

Ondanks de inherente kosten en veiligheidsoverwegingen die gepaard gaan met radioactieve materialen, bieden radiochemische tests aanzienlijke voordelen ten opzichte van niet-radioactieve alternatieven, op voorwaarde dat er instrumenten beschikbaar zijn. De volgende procedure beschrijft een zeer gevoelige en robuuste manier om de activiteit van glycogeensynthase, een sleutelenzym in het glycogeenmetabolisme, in dierlijk spierweefsel te bepalen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures werden goedgekeurd door de Ball State University Animal Care and Use Committee. Mannelijke en vrouwelijke cohorten van B6; 129-Gaatm1Rabn/J wildtype muizen, 3 maanden oud, worden als representatief voorbeeld in dit manuscript gebruikt. De gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Voorbereiding voorafgaand aan de test

  1. Oogst weefsel door cervicale dislocatie16 en vries het onmiddellijk in vloeibare N2 in om de glycogeenvoorraden te behouden en bewaar in vloeibare N2 of ultralage vriezer tot het begin van de test.
  2. Bereid de stockoplossingen voor voordat met de glycogeensynthasetest wordt begonnen (tabel 1).
  3. Bepaal het aantal gerepliceerde muismonsters en controles dat gewenst is voor de test. Elk muismonster vereist in totaal vier replicaten, twee voor elke reactie (aan- of afwezigheid van G6P) (zie Figuur 1 en Tabel 2).
  4. Knip chromatografiepapier in stroken van 4 cm. Glycogeen hecht zich aan dit papier en blijft gebonden tijdens het wasproces. Gebruik de breedte (6 mm) van een papierversnipperaar om chromatografiepapier in dunne afzonderlijke segmenten te versnipperen.
  5. Label met een potlood aangewezen papierstroken met muisidentificatie, blanco's en totalen. Vermijd het gebruik van inkt.
  6. Plaats chromatografiepapier in het houten bloksjabloon. Elke sjabloon kan maximaal 12 papieren bevatten, wat overeenkomt met één rij van een plaat met 96 putjes.
  7. Zorg voor chromatografiepapierklemmen (klembordtops).
  8. Bereid één klem voor elke reactierij voor door de randen van chromatografiepapier vast te klemmen, zodat het grootste deel van het papieroppervlak bloot blijft. Zorg ervoor dat de gelabelde randen zichtbaar zijn.
  9. Label 1,7 ml microfuge tubes met monsteridentificatie. Twee buisjes per monster; één voor homogenaat en één voor supernatant.
  10. Bereid vóór het begin van de test zowel het + als het - G6P-reactiemengsel, zie tabel 3 voor meer informatie. Bereid 2.400 μL aliquots van elk reactiemengsel.

2. Radiochemische glycogeensynthase-activiteitsreactie

LET OP: Deze stap omvat het gebruik van [14C]-UDP-glucose, een radioactief materiaal. Hanteren, opslaan en afvoeren op een manier die is goedgekeurd door de Nuclear Regulatory Commission (NRC).

  1. Voeg 30 μL [14C]-UDP-glucose (0,1 μCi/μL) toe aan 2.400 μL aliquots van beide (+/- G6P) reactiemengsels voor een uiteindelijke concentratie van 0,0012 μCi/μL. Dit recept is geschikt voor 18 monsters.
    OPMERKING: Het volume van [14C]-UDP-glucose kan worden gewijzigd om het gebruik te sparen en voldoende gevoeligheid te garanderen. Gebruik bijvoorbeeld 50 μL voor hersenweefsel van muizen en 25 μL voor muizenhart.
  2. Vortexreactiemengsels en aliquoot 50 μL naar elk putje van een plaat met 96 putjes die monsters, blanco's en totalen bevat (Tabel 2). Dek daarna af met plaatfolie en plaats op 4 C.
  3. Laat de proteaseremmers bij kamertemperatuur ontdooien. Deze remmers zijn gespecificeerd in Tabel 4 met aanvullende informatie.
  4. Massa 30-50 mg bevroren weefsel uit. ~30 mg is optimaal voor skeletspier- en hartmonsters; ~50 mg voor de hersenen. Bewaar tissue en microfuge-buisjes in vloeibare N2 en weeg snel tissue om ervoor te zorgen dat het weefsel bevroren blijft. Gebruik een afgekoelde stamper om het weefsel verder te malen.
  5. Bereid de homogenisatiebuffer met proteaseremmers op ijs.
  6. Verplaats de buis met weefsel één monster per keer van vloeistof N2 naar ijs met een koude dop gedurende 1 minuut. Voeg een koude dop (buisdop met drie kleine gaatjes gekoeld in vloeistof N2) toe aan de monsterbuis terwijl deze zich nog in vloeibare N2 bevindt. Dit voorkomt weefselverlies omdat resterende vloeistof N2 in de buis verdampt. Eenmaal uit vloeibare N2 moeten de monsters in ijs blijven.
  7. Eenmaal op ijs, voegt u een volume (10-30 μL/mg weefsel) homogenisatiebuffer toe aan het monster en homogeniseert u het monster met Tissue-Tearor. Na voltooiing van deze twee stappen gaat u verder met het volgende voorbeeld.
    OPMERKING: Het volume van de buffer die aan monsters wordt toegevoegd, kan worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de weefselbron. Bijvoorbeeld: 30 μL /mg voor skeletspieren, 15 μL /mg voor het hart en 10 μL /mg voor de hersenen.
  8. Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 3.600 g en breng het bovenstaande over in een schone microfugebuis. Pas op dat u de pellet niet aanraakt. Vortex en voeg ~150 μL toe aan de overeenkomstige putjes in een v-bodem plaat met 96 putjes op ijs. Bewaar de rest voor supernatans voor Bradford-test (zie stap 2.15)
    OPMERKING: Indien gewenst kunnen extra monsteraliquots worden bewaard voor latere tests zoals immunoblotting.
    LET OP: Stappen 2.9 tot en met 2.14 vereisen behandeling van 14C. Gooi alle verontreinigde materialen weg op een manier die is goedgekeurd door de NRC.
  9. Verwijder de reactiemengplaat van 4 °C en verwarm tot 30 °C op de thermocycler met de film verwijderd. Verkrijg gedurende deze tijd 1 l -20 °C 66% ethanol en voeg toe aan een wasbeker met een roerstaaf op de roerplaat.
  10. Start de reactie door 25 μl monstersupernatans toe te voegen aan reactieputjes en 25 μl homogenisatiebuffer aan blanco en totale putjes. Gebruik een meerkanaalspipet om 1 rij tegelijk op de reactieplaat toe te voegen, wacht minimaal 1 minuut tussen de rijen. Noteer voor elke rij de tijd dat de reactie is gestart. Zie Tabel 2 voor meer informatie. Gebruik een meerkanaals pipet en zorg ervoor dat er gelijke hoeveelheden vloeistof worden toegevoegd.
  11. Wacht 10-15 minuten totdat de reactie is uitgevoerd; De looptijd tussen de rijen moet echter identiek zijn.
  12. Zuig 55 μl uit elk putje met behulp van een meerkanaalspipet en doseer op de respectieve eerder voorbereide chromatografiepapieren. Meng de reactie door op en neer te pipetteren voor het opzuigen. Zoek vloeistof in het midden van het chromatografiepapier.
  13. Verwijder papieren met totalen uit de klem met een tang nadat u vloeistof uit de put hebt gezien. Deze kunnen veilig op aluminiumfolie worden gelegd om te drogen. Laat al het andere chromatografiepapier in het roerende 66% ethanolbad vallen. Glycogeen is onoplosbaar in 66% ethanol, terwijl [14C]-UDP-glucose oplosbaar is en chromatografiepapier afwast.
  14. Herhaal stap 2.11 en 2.12 voor elke rij op het reactieplaatje. Zorg ervoor dat de reactietijd van elke rij hetzelfde is door de start- en stoptijden van de reactie te registreren.
  15. Zodra alle rijen zijn toegevoegd aan de roerende 66% ethanol, wast u deze gedurende 15 minuten.
    OPMERKING: Tijdens deze stap en de daaropvolgende wasstappen kunnen monsteraliquots worden voorbereid voor aanvullende tests, zoals de Bradford-test, die verantwoordelijk is voor het bepalen van het totale eiwitvolume voor normalisatie, wat nodig is bij het berekenen van de enzymatische activiteit.
  16. Gooi 66% ethanol weg zonder chromatografiepapier te verliezen. Wassen met 1 L nieuwe 66% ethanol gedurende 30 min. Deze 66% ethanol kan op kamertemperatuur zijn.
  17. Herhaal de vorige stap voor in totaal drie wasbeurten van 30 minuten met 66% ethanol.
    OPMERKING: Indien gewenst kan de 66% ethanol van de laatste wasstap worden opgeslagen en bij -20 °C worden bewaard voor volgende tests.
  18. Dompel na verwijdering van 66% ethanol al het chromatografiepapier onder in aceton in de wasbeker. Aceton vergemakkelijkt het droogproces.
  19. Verwijder chromatografiepapier van aceton en leg het op aluminiumfolie. Bewaar of gooi aceton weg.
  20. Droog chromatografiepapier 15 minuten onder een warmtelamp.
    OPMERKING: Droog papier kan voor onbepaalde tijd worden bewaard. Papieren kunnen veilig worden bewaard totdat ze klaar zijn om door te gaan met de detectie van scintillatie.

3. Activiteit meten met scintillatiedetectie

  1. Verplaats chromatografiepapier met een tang naar scintillatieflesjes die in scintillatierekken worden bewaard. Noteer hoe de voorbeeldpapieren zijn georiënteerd.
  2. Voeg 5 ml scintillatievloeistof toe aan elke injectieflacon met behulp van de pomp in het deksel. Schroef de doppen voor elke injectieflacon vast.
  3. Laad monsters in de scintillatiedetector en laad het stoprek achter de monsters. Zorg ervoor dat het programma voor het bewaken van 14C is geselecteerd. Begin met detecteren door Automatisch tellen te selecteren.
  4. Resultaten afdrukken
  5. Gooi de scintillatiebuizen en de inhoud weg op een door de NRC goedgekeurde wijze.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Volgens het protocol zal een afdruk gemaakt van de scintillatiedetector de gemeten hoeveelheid ioniserende straling bevatten die wordt uitgezonden door elk chromatografiepapier dat een injectieflacon bevat, direct gecorreleerd met het activiteitsniveau van glycogeensynthase. De scintillatiedetector berekent het aantal per minuut (CPM) van gedetecteerde straling voor elk monster, blanco, en totaal over een bepaalde tijd. Zet eerst CPM om naar DPM (desintegrations per min), die gebaseerd i...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Meting van de activiteit van het glycogeensynthase-enzym is een waardevol hulpmiddel voor het monitoren van het glycogeenmetabolisme in verschillende metabole en ziektetoestanden. Meting in de afwezigheid en aanwezigheid van glucose-6-fosfaat (G6P) biedt inzicht in de regulerende status van het enzym en een indirecte index van de fosforyleringstoestand. [U-14C]-UDP-glucose-incorporatietest is een efficiënte en goed gedocumenteerde techniek voor het meten van enzymatische activ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De financiering werd gedeeltelijk verstrekt door Ball State University, Indiana University School of Medicine-Muncie en Aro Biotherapeutics.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
[14C] Uridine 5-diphospho-glucoseAmerican Radiolabeled ChemicalsARC 0154
31 ETCHR chromatography paperWhatman3031 915
Benzamidine hydrochloride hydrateSigmaB6506
Beta mercaptoethanolSigmaM3148
Dry bathTorey Pines ScientificSC25
Ethanol (200 proof)PharmcoAaper111000200
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)SigmaE4378
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)SigmaE5134
Glucose-6-phosphate sodium saltSigmaG7879
Glycogen from rabbit liver (Type III)SigmaG8876
Microplate, flat-bottom, 96 wellGreiner655101
Microplate, pcr, 96 wellDOT Scientific951-PCR
Multi-Purpose Scintillation CounterBeckman CoulterLS 6500
Potassium fluoride dihydrateSigma221872
Protease inhibitor cocktailGoldBioGB-108-2
Scintillation cocktailReasearch Products International111195
Scintillation vialsReasearch Products International125509
Sodium fluorideSigmaS7920
Tissue TearorBiospec ProductsModel 398
Tosyllysine Chloromethyl Ketone (TLCK)SigmaT7254
Trizma base (99.9%)SigmaT1503
Trizma hydrochlorideSigmaT3253
Uridine 5-diphospo-glucoseSigmaU-4625

Referenties

  1. Preiss, J., Walsh, D. A. Biology of Carbohydrates. Ginsburg, V., Robbins, P. 1, John Wiley. 199-314 (1981).
  2. Pederson, B. A. Enzymology of Complex Alpha-Glucans. , CRC Press. 84-137 (2021).
  3. Wayllace, N. Z., et al. An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for glycogen synthases. Mol Biol Rep. 39 (1), 585-591 (2012).
  4. Wilson, W. A. Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism. J Vis Exp. (174), e63046(2021).
  5. Danforth, W. H. Glycogen synthetase activity in skeletal muscle. Interconversion of two forms and control of glycogen synthesis. J Biol Chem. 240, 588-593 (1965).
  6. Leloir, L. F., Olavarria, J. M., Goldemberg, S. H., Carminatti, H. Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose. Arch Biochem Biophys. 81 (2), 508-520 (1959).
  7. Schalin-Jantti, C., Harkonen, M., Groop, L. C. Impaired activation of glycogen synthase in people at increased risk for developing NIDDM. Diabetes. 41 (5), 598-604 (1992).
  8. Huang, X., Hansson, M., Laurila, E., Ahren, B., Groop, L. Fat feeding impairs glycogen synthase activity in mice without effects on its gene expression. Metabolism. 52 (5), 535-539 (2003).
  9. Holt, B. D., et al. A novel CD71 Centyrin: Gys1 siRNA conjugate reduces glycogen synthesis and glycogen levels in a mouse model of Pompe disease. Mol Ther. 33 (1), 235-248 (2025).
  10. Prats, C., et al. Phosphorylation-dependent translocation of glycogen synthase to a novel structure during glycogen resynthesis. J Biol Chem. 280 (24), 23165-23172 (2005).
  11. Perezleon, J. A., Osorio-Paz, I., Francois, L., Salceda, R. Immunohistochemical localization of glycogen synthase and GSK3beta: Control of glycogen content in retina. Neurochem Res. 38 (5), 1063-1069 (2013).
  12. Thomas, J. A., Schlender, K. K., Larner, J. A rapid filter paper assay for UDP-glucose-glycogen glucosyltransferase, including an improved biosynthesis of UDP-14C-glucose. Analytical Biochemistry. 25 (1), 486-499 (1968).
  13. Parker, G. J., Lund, K. C., Taylor, R. P., McClain, D. A. Insulin resistance of glycogen synthase mediated by O-linked N-acetylglucosamine. J Biol Chem. 278 (12), 10022-10027 (2003).
  14. Niederwanger, A., Kranebitter, M., Ritsch, A., Patsch, J. R., Pedrini, M. T. A gel filtration assay to determine glycogen synthase activity. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 820 (1), 143-145 (2005).
  15. Suzuki, Y., et al. Insulin control of glycogen metabolism in knockout mice lacking the muscle-specific protein phosphatase PP1G/RGL. Mol Cell Biol. 21 (8), 2683-2694 (2001).
  16. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Quick and humane sacrifice of a mouse by cervical dislocation. CSH Protoc. 2006 (1), prot4357(2006).
  17. Gomes, F. R., et al. Glycogen storage and muscle glucose transporters (GLUT-4) of mice selectively bred for high voluntary wheel running. J Exp Biol. 212 (Pt 2), 238-248 (2009).
  18. Greenberg, C. C., Jurczak, M. J., Danos, A. M., Brady, M. J. Glycogen branches out: new perspectives on the role of glycogen metabolism in the integration of metabolic pathways. Am J Physiol Endocrinol Metab. 291 (1), E1-E8 (2006).
  19. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  20. Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases. Anal Biochem. 47 (1), 20-27 (1972).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Glycogeenmetabolismeradiochemische assayskeletspierUDP glucose incorporatieglycogeensetouringsziektenvloeistofscintillatiechromatografisch papierglucose 6 fosfaat
Radiochemische beoordeling van de enzymactiviteit van glycogeensynthase in dierlijk weefsel
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.