Methodenartikel

Rat achterpootamputatiemodel en directe gerichte spierrenervatie

DOI:

10.3791/69119

⸱

22 mei 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plastic Surgery, Medical College of Wisconsin

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol toont aan hoe een onderknie-amputatie bij ratten kan worden uitgevoerd en direct gerichte spierrenervatie (iTMR) kan worden uitgevoerd om strategieën te onderzoeken om amputatiegerelateerde pijn te behandelen en te voorkomen en om de pijnmechanismen die met amputatie samenhangen beter te begrijpen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amputatiegerelateerde pijn vermindert de levenskwaliteit van patiënten, draagt bij aan opioïdengebruik en kan functionele revalidatie en prothesegebruik verminderen. Preklinische modellen die betrouwbaar postamputatiepijn veroorzaken terwijl hun mobiliteit behouden blijft, zijn essentieel voor het bestuderen van de biologische mechanismen achter deze uitkomsten. Hier presenteren we een gedetailleerd, reproduceerbaar chirurgisch protocol voor knaagdieren met Sprague-Dawley-ratten om achterpootamputatie onder de knie te modelleren. De procedure omvat het isoleren en doorsnijden van de takken van de ischiaszenuw, waaronder de tibiaszenuw, de nervus peroneus en de surale zenuwen, wat leidt tot langdurige zenuwpathologie na amputatie en pijngerelateerd gedrag. Ratten herstellen goed van deze ingreep en kunnen direct na de operatie zonder moeite met eten of drinken rondlopen. Dieren kunnen vervolgens worden geëvalueerd met reflexieve en spontane pijnmaatregelen. De pijngedragingen die voortkomen uit deze procedure zijn in de loop van de tijd robuust, en standaard reflexieve pijngedrag kan uit de stomp worden verkregen. Belangrijk is dat behouden mobiliteit longitudinale gedragstests mogelijk maakt zonder motorische beperkingen te verstoren. Hoewel dit protocol gericht is op amputatie, kan het gemakkelijk worden aangepast om gerichte spierrenervatie (TMR) als post-amputatieinterventie te integreren door doorgesneden zenuwen te coapsen naar nabijgelegen motorische takken van de zenuwen naar de biceps femoris en semimembranosus, wat onderzoek mogelijk maakt naar renervatie-interventies en hun effecten op pijn na amputatie. We hebben dit model eerder met succes gebruikt om geslachtsspecifieke verschillen in pijngedrag na amputatie te evalueren en om de effecten van TMR te bestuderen. Dit protocol biedt een robuust en flexibel platform voor het onderzoeken van amputatiegerelateerde pijn, neuromavorming en functionele uitkomsten, met toepasbaarheid op translationele studies die gericht zijn op het verbeteren van pijn na amputatie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chronische pijn is een van de meest slopende complicaties na een grote amputatie van een ledemaat en treft tot 70% van de patiënten 1,2,3. Conventionele pijnbestrijdingsstrategieën zoals farmacologische interventies, fysiotherapie, zenuwblokkades en psychologische therapieën bieden vaak beperkte of tijdelijke verlichting4. Er blijft dus een aanzienlijke klinische behoefte aan effectieve langetermijnstrategieën voor pijnbestrijding.

Gerichte spierrenervatie (TMR), oorspronkelijk ontwikkeld om de controle van myo-elektrische protheses te verbeteren, is uitgegroeid tot een veelbelovende methode om pijn na een amputatie van ledemaatste verlichten. De chirurgische techniek houdt in dat doorgesneden gemengde motorische zenuwen worden omgeleid naar nabijgelegen motorische takken. Klinisch gezien heeft TMR aanzienlijke verminderingen laten zien van fantoompijn, restpijn in ledematen en neuroom-gerelateerde symptomen 6,7,8. Regeneratieve perifere zenuwinterfaces (RPNI) zijn een andere chirurgische interventie die wordt gebruikt voor zenuwletsel en amputatiegerelateerde pijn. Geamputeerde zenuwuiteinden worden vastgenaaid en vervolgens omwikkeld in een vrije (gedenerveerde, avasculaire) spiertransplantatie9. De geamputeerde axonen neurotiseren de gedenerveerde neuromusculaire verbindingen om spiercontractie in het transplantaat te veroorzaken, die kan worden gebruikt om een signaal te genereren voor myoprosthescontrole. In tegenstelling tot TMR is RPNI uitgebreid bestudeerd in een knaagdiermodel. Net als TMR is aangetoond dat RPNI de vorming van neuromen voorkomt en pijn vermindert die samenhangt met zenuwdoorsnijdingsletsel10,11. Klinisch is aangetoond dat RPNI zowel fantoom- als restpijn in ledematen bij amputatiepatiëntenvermindert.

Ondanks klinische adoptie blijven de biologische mechanismen achter de analgetische effecten van TMR en RPNI slecht begrepen. Preklinische modellen zijn cruciaal om deze mechanismen te verduidelijken. Eerder onderzoek heeft zenuwdoorsnijdingsmodellen met aanpassingen gebruikt om de zenuw te superficialiseren en direct te testen op neuroompijn10,11. Deze modellen kunnen neuromateuze pijn met directe stimulatie en neuropathische pijn kwantificeren door het gedrag van spinale reflexen in de intacte zenuwverdeling in de voet te beoordelen. De gespaard zenuwbeschadiging, bijvoorbeeld, houdt de nervus surus in stand, en de zenuwen tibiale en de nervus peroneus common worden doorgesneden. Pijngedragstesten worden uitgevoerd op de laterale voet13. Het model van amputatie van de achterpoot vertegenwoordigt de ernstigst mogelijke verwonding aan het ledemaat. Daardoor is er sprake van wijdverspreid neuronaal verlies en de aanzienlijke ontstekings- en genezingseisen die gepaard gaan met een dergelijke verwonding. Wanneer er een zenuwletsel is, helpen de gezonde neuronen in de DRG om de beschadigde neuronen in stand te houden. Bij amputatie wordt de populatie van beschikbare gezonde neuronen sterk verminderd, en voor elke beschadigde zenuw is er meer neuronaal verlies dan wanneer slechts één zenuw gewond was 14,15,16. Eerdere meldingen van overlevingsoperaties voor een achterpootamputatie van knaagdieren zijn zeldzaam:17,18. Er zijn echter voordelen ten opzichte van een amputatie van de bovenste ledemaat, zoals de overvloed aan historische gegevens die pijn en regeneratie gerelateerd aan de ischiaszenuw onderzoeken, evenals meerdere ambulante gedragstests19,20.

Om deze kloof te dichten, hebben we onlangs een model voor rattenamputatie ontwikkeld met directe TMR (Figuur 1). De techniek voor het creëren van RPNI is eerder gepubliceerd en kan worden aangepast aan het achterpootamputatiemodel21. Dit model weerspiegelt nauwkeurig klinische procedures, waardoor we verschillende pijngedragingen, neuromavorming en neuronbehoud kunnen evalueren (Figuur 2)22. Ons werk heeft significante pijnstillende voordelen van TMR aangetoond ten opzichte van standaardamputatie, preventie van neuromen en seksueel dimorfe reacties bij kousensitiviteit22,23.

Het hier gepresenteerde protocol biedt een gedetailleerde, gestandaardiseerde visuele demonstratie van de chirurgische techniek, waarmee reproduceerbaarheid en consistentie in experimentele benaderingen worden gegarandeerd. Door duidelijk belangrijke stappen te illustreren, waaronder zenuwisolatie, precieze doorsnijding en spanningsvrije zenuwcoaptatie, biedt dit protocol onderzoekers een robuust kader voor het onderzoeken van de mechanismen achter TMR-gemedieerde analgesie en neuroompreventie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierprocedures moeten worden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en voldoen aan de National Institutes of Health (NIH) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. Preoperatieve voorbereiding

OPMERKING: Mannelijke en vrouwelijke Sprague-Dawley-ratten (Charles River Laboratories), 8–10 weken oud en met een gewicht van 250–300 g, werden gebruikt.

  1. Zet het verwarmingskussen aan en bereid een steriel chirurgisch veld voor. Plaats een steriel kussen loodrecht op het lichaam van de rat voor optimale blootstelling.
  2. Organiseer alle chirurgische instrumenten en materialen: steriele zoutoplossing (0,9% natriumchloride), povidon-jodium antiseptische oplossing, meloxicam, cauterie, 10-0 microhechtingen, 4-0 absorberbare gevlochten hechtingen, liniaal en huidlijm.
    OPMERKING: Alle chirurgische instrumenten moeten worden gesteriliseerd door autoclaving of hete kralensterilisatie.
  3. Induceer anesthesie door de rat in een inductiekamer te plaatsen met 4% isofluran, zuurstof bij 10 L/min en lucht bij 60%. Na 4 minuten of na een periode zonder respons, wissel je over op een neuskegel en stel je isofluraan aan op 1,5%–2,0% afhankelijk van de grootte van de ratten.
  4. Scheer de operatieplaats van de onderrug tot aan de gehele achterpoot. Voer een drievoudige voorbereiding uit met afwisselend povidon-jodium antiseptische oplossing en alcoholswabs, en eindig met alcohol.
  5. Dien 1 mg/kg meloxicam subcutaan toe met een tuberculinespuit (meestal 0,2 mL voor een rat van 200 g).

2. Amputatie onder de knie (Figuur 1)

  1. Gebruik een liniaal om de lijn van het kniegewricht te markeren en maak twee extra strepen van 2 cm en 3 cm distaal van de knie.
  2. Maak een circumferentiële huidincisie 3 cm distaal van de knie met een scalpel.
  3. Gebruik een stompe en scherpe dissectie om de huid omringend van de onderliggende spieren te scheiden totdat deze vrij terugtrekt.
  4. Herhaal dit ondermijningsproces met de onderliggende spieren, waarbij je voorzichtig naar beneden disseceert tot aan het bot terwijl je weefselvlakken behoudt. Markeer het scheenbeen/fibula 1 cm proximaal van de circumferentiële incisie met een steriele cauterisatie of marker.
  5. Gebruik een kleine botschaar om het scheenbeen en het kuitbeen op de gemarkeerde plek te doorsnijden. Gebruik cauterisatie om hemostase te bereiken. Onderzoek het botuiteinde op scherpe randen en bot of bijsnijd indien nodig.
  6. Met een 4-0 absorberbare gevlochten hechting sluit je de voorste en achterste spiercompartimenten boven het bot aan elkaar om een spierpad te creëren. Begin met het hechten van de voorrand over het scheenbeen, het primaire drukpunt. Gewoonlijk worden 4–6 onderbroken hechtingen gebruikt.
  7. Sluit de huid zijwaarts met onderbroken 4-0 absorberbare gevlochten hechtingen, waarbij je plaatst ze niet direct op de draagstomp. Breng huidlijm aan langs de incisielijn.

3. TMR-interventiechirurgie (Figuur 1)

  1. Maak een longitudinale gluteale gluteale splijtende incisie van 1,5–2 cm ongeveer 5 mm achter het dijbeen.
  2. Gebruik een stomp dissectie om de bilspieren en hamstringspieren te scheiden, waarbij de ischiaszenuw net proximaal van de trifurcatie in de tibias-, common peroneal- (CP) en surale zenuwen wordt blootgesteld.
  3. Identificeer proximale motorische takken: één grote tak loopt onder de caudofemoralis (CFM) door, wat aanleiding geeft tot de tak van CFM, semimembranosus (SM) en biceps femoris (BF).
  4. Verhoog de CFM met een wattenstaafje en verdeel het. Neurolyseer de SM- en BF-vertakkingen zorgvuldig met een stomp dissectie onder een chirurgische microscoop met microchirurgische fijne Dumont-tang.
    1. Gebruik een tang om het epineurium te grijpen en open, met fijne gebogen veerschaar, het epineurium en verdeel het in de lengte, en scheid de verschillende takken van elkaar.
    2. Behoud de CFM-tak en verdeel de andere bij de ischiasstam. De curvemotor vertakkt lager om coaptatie te vergemakkelijken.
  5. Neurolyseer de ischias-trifurcatie door het epineurium te openen en te delen met een fijn gebogen veerschaar. Voorzichtig de vertakkingen van de zenuw uit elkaar met fijne tangen. Grijp elk van de drie takken (CP, tibiaal, sural) 5–10 mm distal van de trifurcatie met behulp van de tang.
  6. Breng spanning en doorsnijd elke zenuw zo ver mogelijk. Grijp het afgesneden distale uiteinde vast en maak een schone snede naar het proximale uiteinde door minstens 5–10 mm uit te snijden.
  7. Voer de coaptisaties uit met 10-0 nylon hechtingen: de CP naar SM met één hechting, tibiaal aan de grote BF-tak met één tot twee hechtingen, en suraal aan de kleine BF-tak met één hechting. Gebruik minstens 3 knopen per hechting, zorg voor een spanningsvrije plaatsing, vermijd het aanspannen van de zenuw en leg coaptaties uit zonder scherpe hoek.

4. Amputatie-alleen-groep

  1. Ligateer CP, tibiale en surale zenuwen met een 5-0 zijde hechting. Behandel de zijde met Dumont hechtingstang. Zorg ervoor dat de ligatuur de zenuw vouwt en met 4 vierkante knopen wordt vastgezet.
  2. Trek voorzichtig aan elke zenuw proximaal met behulp van de knoop en snijd 1–2 mm distaal van de ligatuur. Verwijder 10 mm van het distale zenuwsegment.
  3. Ga door met amputatie zoals beschreven in sectie 2.

5. Postoperatieve zorg

  1. Breng de rat terug in een warme kooi tot hij in de loop is. Geef 24 uur later een tweede meloxicam dosis (0,2 ml) subcutaan.
  2. Houd dagelijks 7 dagen lang de wondintegriteit in de gaten, tekenen van infectie, pijn of stress, en grijp in indien nodig volgens de IACUC-richtlijnen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit model voor amputatie van de achterpoot veroorzaakte betrouwbaar neuropathisch pijngerelateerd gedrag terwijl het de loop- en verkennende capaciteit bij ratten behield. Zoals weergegeven in Figuur 2, resulteert doorsnijding van de perifere zenuw tijdens amputatie zonder distale target in ongeorganiseerde axonale groei en neuroomvorming op de ligatieplaats, zichtbaar met B-tubuline en calcitonine gen-related peptide (CGRP) immunokleuring. Daarentegen verto...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft essentiële chirurgische stappen om reproduceerbaarheid van het achterpootamputatiemodel te waarborgen en toont het behoud van het lopen en gedragsbetrokkenheid bij postamputatietests aan. Belangrijke chirurgische principes, waaronder zorgvuldige anatomische identificatie, minimale zenuwmanipulatie en spanningsvrije behandeling van doorgesneden zenuwen, worden benadrukt om consistentie en reproduceerbaarheid tussen chirurgen te waarborgen. Deze technische overwegin...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs geven geen belangenconflicten aan.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd ondersteund door het Medical College of Wisconsin Neuroscience Research Center, de Rita Allen Foundation en de Plastic Surgery Foundation. De auteurs bedanken de Comparative Medicine Unit voor de dierenzorg en ondersteuning.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10-0 nylon microsuture (Arosurgical)AROSurgicalT04A10N07-13Fine nerve coaptation suture. 10-0 micro suture. 
4-0 polyglycolic acid sutureEthiconAQ1268Sluitingsnaad voor spier en huid. Absorbeerbare 4-0 naald. 
5-0 zijde chirurgische naaldGenericGenericNerve ligatie naald
Volwassen Sprague-Dawley rattenCharles River LaboratoriesGenericExperimenteel dier
Alcohol prep padsDukal CorporationGenericHuid antisepticum
Betadine 10%Avrio Health LPGenericAntisepticum
BotenschaarFST16030Boten snijinstrument
CauterisatieapparaatFST18010-00Hemostase apparaat
Wattenstaafje applicator (ProAdvantage)ProAdvantageRef 76100Weefsel manipulatie
Gebogen microdissector schaarFST15019-10Fijne schaar voor neurolyse
Pincet (fijn Dumont)FST11254-20Nerf hantering instrument
Pincet (naaldknopen Dumont)FST11063-07Naald hantering instrument
Gaas USP type VII (Cardinal Health)Cardinal HealthRef 2146Onderhoudt steriele omgeving
Verwarmingskussen (TC1000 temperatuurregelaar)GenericTC1000Temperatuurregelapparaat
Inductiekamer (Braintree Scientific)Braintree Scientific Inc.GenericVoor anesthesie-inductie
Isofluraan (Isospire)PhoenixGenericAnesthetisch middel
Meloxicam (Ostilox)VetONE5 mg/mLAnalgetisch middel
LinialGenericGenericMeetinstrument voor anatomische kenmerken
Steriele zoutoplossingBaxter0.9 Sodium Lot Y425131Irrigatieoplossing
Chirurgisch mes 15 FST10015-00Huid incisie gereedschap
Tuberculin spuitGenericGenericMedicatie toediening
Verdamper (Surgivet model 100)SurgivetModel 100 S/N W2211123Voor anesthesie onderhoud
Vetbond weefsel lijmWorld Precision InstrumentsGenericHuidlijm

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Balakhanlou, E., Webster, J., Borgia, M., Resnik, L. Frequency and severity of phantom limb pain in veterans with major upper limb amputation: results of a national survey. PM R. 13 (8), 827-835 (2021).
  2. Resnik, L., Ekerholm, S., Borgia, M., Clark, M. A national study of veterans with major upper limb amputation: survey methods, participants, and summary findings. PLoS One. 14 (3), e0213578(2019).
  3. Ephraim, P. L., Wegener, S. T., MacKenzie, E. J., Dillingham, T. R., Pezzin, L. E. Phantom pain, residual limb pain, and back pain in amputees: results of a national survey. Arch Phys Med Rehabil. 86 (10), 1910-1919 (2005).
  4. R, L., et al. Prosthesis satisfaction in a national sample of veterans with upper limb amputation. Prosthet Orthot Int. 44 (2), 81-91 (2020).
  5. Kuiken, T. A., et al. Targeted muscle reinnervation for real-time myoelectric control of multifunction artificial arms. JAMA. 301 (6), 619-628 (2009).
  6. Valerio, I. L., et al. Preemptive treatment of phantom and residual limb pain with targeted muscle reinnervation at the time of major limb amputation. J Am Coll Surg. 228 (3), 217-226 (2019).
  7. Chang, B., Mondshine, J., Attinger, C., Kleiber, G. Targeted muscle reinnervation improves pain and ambulation outcomes in highly comorbid amputees. Plast Reconstr Surg. 148 (2), 376-386 (2021).
  8. Dumanian, G. A., et al. Targeted muscle reinnervation treats neuroma and phantom pain in major limb amputees: a randomized clinical trial. Ann Surg. 270 (2), 238-246 (2019).
  9. Woo, S. L., et al. Regenerative peripheral nerve interfaces for the treatment of postamputation neuroma pain: a pilot study. Plast Reconstr Surg Glob Open. 4 (12), e1038(2016).
  10. Dehdashtian, A., et al. Sexually dimorphic pattern of pain mitigation following prophylactic regenerative peripheral nerve interface (RPNI) in a rat neuroma model. Neurosurgery. 93 (5), 1192-1201 (2023).
  11. Senger, J., et al. A direct comparison of targeted muscle reinnervation and regenerative peripheral nerve interfaces to prevent neuroma pain. Neurosurgery. 93 (5), 1180-1191 (2023).
  12. Kuniak, C. A., et al. Prophylactic regenerative peripheral nerve interfaces to prevent postamputation pain. Plast Reconstr Surg. 144 (3), 421e-430e (2019).
  13. Decosterd, I., Woolf, C. J. Spared nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain. Pain. 87 (2), 149-158 (2000).
  14. Hu, P., McLachlan, E. M. Selective reactions of cutaneous and muscle afferent neurons to peripheral nerve transection in rats. J Neurosci. 23 (33), 10559-10567 (2003).
  15. Welin, D., et al. Survival and regeneration of cutaneous and muscular afferent neurons after peripheral nerve injury in adult rats. Exp Brain Res. 186 (2), 315-323 (2008).
  16. Jivan, S., Novikova, L. N., Wiberg, M., Novikov, L. N. The effects of delayed nerve repair on neuronal survival and axonal regeneration after seventh cervical spinal nerve axotomy in adult rats. Exp Brain Res. 170 (2), 245-254 (2006).
  17. Garg, R., Uygur, S., Cwykiel, J., Siemionow, M. Development of targeted muscle reinnervation model in hind limb amputated rats. J Reconstr Microsurg. 34 (7), 509-513 (2018).
  18. Lago, N., Navarro, X. Evaluation of the long-term regenerative potential in an experimental nerve amputee model. J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 108-120 (2007).
  19. Hogan, Q. Animal pain models. Reg Anesth Pain Med. 27 (4), 385-401 (2002).
  20. Sadler, K. E., Mogil, J. S., Stucky, C. L. Innovations and advances in modelling and measuring pain in animals. Nat Rev Neurosci. 23 (2), 70-85 (2022).
  21. Svientek, S. R., Ursu, D. C., Cederna, P. S., Kemp, S. W. P. Fabrication of the composite regenerative peripheral nerve interface (C-RPNI) in the adult rat. J Vis Exp. (156), e60841(2020).
  22. Zepeda, J. L., Mraz, G., Roth, E., Weihrauch, D., Hoben, G. Rat hindlimb amputation model shows analgesia and sexually dimorphic cold hypersensitivity with immediate targeted muscle reinnervation. J Pain. 33, 105460(2025).
  23. Roth, E., et al. Targeted muscle reinnervation prevents and reverses rat pain behaviors after nerve transection. Pain. 164 (2), 316-324 (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Amputatiemodel bij rattenamputatie van het achterste ledemaatpijn na amputatiedoorsnijding van de nervus ischiadicuspijngedragneuromavormingfunctionele resultatenchirurgisch protocol voor knaagdierenbehoud van mobiliteit
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen