In vitro Resident geheugen CD8 T-celdifferentiatie met behulp van het epitheliale organoïde-T-cel co-cultuursysteem

Samenvatting

Om de differentiatie en functie van CD8 T-cellen in vitro te bestuderen, kunnen CD8 T-cellen uit de muis worden geïsoleerd om langdurig te worden gekweekt met vooraf geïnfecteerde vaginale epiteelorganoïden van muis. Hier beschrijven we dit proces en beoordelen we de verwerving van residente geheugen T-celmarkers bij co-kweek.

Samenvatting

Barrière-mucosale weefsels spelen een belangrijke rol in de differentiatie en functie van residente T-cellen. Onder de diverse celpopulaties binnen deze weefsels zijn epitheelcellen belangrijke drijfveren van differentiatie van T-cellen. Ons begrip van de epitheelafgeleide signalen die de T-celbiologie in mucosale omgevingen vormgeven, blijft echter beperkt, grotendeels door het gebrek aan specifieke tools en de complexiteit van beschikbare modelsystemen. Hier beschrijven we een co-kweeksysteem van muisvaginale epitheliale organoïde en CD8 T-cel dat dynamische interacties modelleert tussen geïnfecteerd epitheel en virusspecifieke CD8 T-cellen. Dit protocol maakt fenotypische en functionele analyse van T-celresponsen mogelijk binnen een fysiologisch relevante driedimensionale epitheliale microomgeving. Met dit systeem demonstreren we de differentiatie van effector CD8 T-cellen in weefselresidente geheugen T-cellen (TRM). Dit veelzijdige in vitro kweeksysteem biedt reductionistische mogelijkheden om moleculaire details van epitheelsignalen achter de differentiatie van CD8 T-cellen te onderzoeken die beschermende immuniteit en immunopathologie in barrièreorganen regelen.

Inleiding

CD8 resident geheugen T-cellen (TRM's) vormen een unieke populatie geheugen CD8 T-cellen die permanent in het perifere weefsel worden vastgehouden zonder routinematig door bloed en lymfoïde weefsels te circuleren. Deze TRM-cellen zijn strategisch geplaatst in barrièreorganen, waaronder huid, longen, darmen en het voortplantingskanaal, waar ze fungeren als wachters tegen ziekteverwekkers en ontluikende tumoren ^1,2. Bij detectie van pathogeen geven CD8 TRM-cellen snel cytotoxische granules af om direct geïnfecteerde cellen te elimineren, terwijl ze tegelijkertijd inflammatoire cytokines afscheiden die omliggende weefselcellen waarschuwen en circulerende immuuneffectoren aanzetten om de verspreiding van pathogeen^te beheersen ^3,4. De effectiviteit van CD8 TRM's in antipathogeen immuniteit en kankerimmunotherapie is al aangetoond ^5,6. Daarom is het plaatsen van een overvloed aan functioneel competente CD8 TRM in barrièremucosale weefsels een cruciaal doel voor vaccins en immunotherapeutische strategieën.

De vorming en het behoud van CD8 TRM in perifere organen zijn kritisch afhankelijk van lokale weefselspecifieke programmering. Deze lokale omgevingssignalen omvatten unieke weefselafgeleide cytokines en metabole agenten, evenals intercellulaire interacties die gezamenlijk de weefselspecifieke TRM-identiteit ^7,8,9 versterken. Deze weefselprogrammering stelt TRM in staat zich aan te passen aan weefselspecifieke eisen bij de uitvoering van hun immunosurveillancetaken. Onze kennis van de aard van deze interacties is echter onvolledig, vanwege het ontbreken van robuuste modelsystemen die deze processen trouw vastleggen. Kleine diermodellen zijn, hoewel zeer informatief, vaak te maken met een sterk onderling verbonden, complex netwerk van interacties dat snelle hoge-doorvoerstudies belemmert.

Hier beschrijven we een in vitro alternatief voor het muismodel dat onderzoek mogelijk maakt naar de moleculaire details van epitheelcel-afgeleide aanwijzingen achter CD8 TRM-differentiatie. Door vooraf gevormde vaginale epitheliale organoïden (VEVO's) samen te cultiveren met geactiveerde CD8 T-cellen, genereerden we CD8 TRM in vitro. Een gedetailleerde beschrijving van het activatie- en cokweekproces van CD8 T-cellen maakt bredere adoptie van dit proces mogelijk in weefsels, wat leidt tot een beter begrip van cellulaire interacties die het CD8 T-celgeheugen in frontlinieweefsels vormgeven.

Protocol

Alle procedures met betrekking tot dieren zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van Brown University (protocolnummer 22-10-0001).

1. Basisopstelling en voorbereiding van een activatieplaat

1. Bereid een dag voor het begin van het experiment een niet-behandeld weefselkweekplaat voor voor het zaaien met naïeve CD8 T-cellen. Bereid een oplossing van activerende antilichamen voor in steriele dPBS bij een eindconcentratie van 1 μg/mL voor anti-CD3ε (2C11) en 0,167 μg/mL voor B7-1 Fc. Voor een 24-put plaat doseer 600 μL van deze oplossing per put. Broeden een nacht uit bij 4 °C tot het klaar is om te gebruiken.
2. Bereid Lymphocyte Enrichment Buffer voor in steriele dPBS door 2% houtskoolgestripte FBS en 1 mM EDTA toe te voegen aan steriel dPBS. Bewaar op 4 °C tot het klaar is om te gebruiken.
3. Bereid een ammoniumchloride-kalium rode bloedcel (ACK RBC) lysebuffer voor in ddH₂O door 10 mM kaliumbicarbonaat, 155 mM ammoniumchloride en 0,1 mM EDTA toe te voegen. Filter steriliseren en op kamertemperatuur houden.
4. Bereid de juiste hoeveelheid oogstmedium in RPMI voor door 5% houtskoolgestripte FBS toe te voegen. Bewaar op 4 °C tot het klaar is om te gebruiken. Voor elke muis die geoogst wordt, wordt 50 ml oogstmedium aanbevolen.
   OPMERKING: Penicilline/streptomycine en amphotericine B zijn optioneel, maar een eindconcentratie van 100 eenheden/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine en 0,2 μg/mL amfetericine B kan helpen bacteriële en schimmelinfectie van T-celkweek tijdens weefselisolatie te voorkomen, als dat een probleem is.
5. Bereid het T-celmedium voor in RPMI door 10% houtskoolgestripte FBS, 2 mM L-glutamine, 100 eenheden/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine, 1x niet-essentiële aminozuren en 1 mM natriumpyruvaat toe te voegen. Voor een 24-put plaat gebruik je 2 mL T-celmedium per put en 50 mL T-celmedium voor een volledige plaat. Bewaar op 4 °C tot het klaar is om te gebruiken.
6. Bereid dissectiegereedschappen voor (0,4 mm micro-dissectieschaar en 0,8 mm fijn gebogen micro-dissectie gekartelde tangen) door te autoklaveren in een sterilisatiezak of te weken in 70% ethanol.

2. Oogsten en dissociatie van volwassen muis secundaire lymfoïde organen

1. Snel koel een centrifuge tot 4 °C met geschikte adapters om 15 mL conische buizen vast te houden.
2. Bereid ijs voor voor het transport van weefsels en lymfocyten tijdens oogst- en incubatieperiodes.
3. Bereid een steriele 15 mL conische buis voor met minstens 5 mL oogstmedium per muis die wordt ontleed.
4. Verdoof en euthanaseer een volwassen CD8 T-cel transgene muis (~8 weken oud) volgens het institutionele protocol in een laminaire flowkap.
5. Speld de ledematen van de muis vast op een schoon polystyreenschuimoppervlak met naalden van elke maat en spuit de romp met 70% ethanol om te voorkomen dat vacht de incisie blokkeert en aan gereedschap blijft plakken.
6. Met schone micro-dissectiescharen en pincetten maak je een verticale incisie in de buik en scheid je de huid van de dunne bindweefsellaag eronder. Speld de huid op het polystyreenschuimoppervlak met naalden van elke maat en snijd door het resterende bindweefsel om de organen in de romp bloot te leggen.
7. Zoek de milt zorgvuldig en verwijder deze weg, verwijder overtollig vet met de gebogen pincet en breng het over in de 15 mL conische buis met oogstmedia. Laat de milt op ijs liggen en isoleer zoveel mogelijk lymfeklieren (bijv. iliacale en lies) om te combineren met de milt in dezelfde conische buis op ijs.
   OPMERKING: De iliacale lymfeklieren bevinden zich aan weerszijden van de cava cava cava cava in de onderbuik onder het maag-darmkanaal, en de inguinale lymfeklieren bevinden zich nabij de vertakking van de oppervlakkige epigastrische vena aan weerszijden van de huid van de onderbuik van de romp. Meer lymfeklieren isoleren om de opbrengst van CD8 T-cellen na verrijking te verbeteren; echter, het isoleren van de milt alleen is over het algemeen voldoende om enkele miljoenen CD8 T-cellen te leveren.
8. Breng de milt en lymfeklieren over naar een geslepen schaal van 60 mm en gebruik het platte uiteinde van een 3 ml spuitzuiger om mechanisch de milt en lymfeklieren te dissociëren door het weefsel te slijpen totdat er geen grote fragmenten meer overblijven.
9. Verzamel de suspensie door deze door een steriele 70 μm cel zeef in een verse steriele 15 mL conische buis te halen. Was de 60 mm schotel met 5 mL oogstmedium om volledige overdracht van gedisaggregeerde cellen te garanderen en filter in dezelfde 15 mL conische buis.
10. Centrifugeer de suspensie op 584 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en rek de buis door de onderkant snel en krachtig over het rooster van een centrifugebuishouder te laten lopen om de pellet los te maken.
11. Lyseer erytrocyten door de losgemaakte pellet opnieuw te suspenderen in 2 mL ACK RBC-lysebuffer. Vortex en 2 minuten op kamertemperatuur uitbroeden.
12. Na 2 minuten neutraliseer je de lysisbuffer door 2 ml oogstmedium toe te voegen. Aspireer de suspensie met een 5 mL serologische pipet en filter door een steriel 70 μm filter terug in dezelfde 15 mL conische buis.
    OPMERKING: Deze filtratie is belangrijk om het verwijderen van alle klonten te waarborgen.
13. Centrifugeer de suspensie op 584 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant en suspendeer de pellet opnieuw in 950 μL Lymphocyte Enrichment Buffer.

3. Verrijking en activatie van CD8 T-cellen

1. Ga verder met het verrijken van naïeve CD8 T-cellen uit lymfocyten met behulp van een commercieel verkrijgbare isolatiekit. Volg het protocol van de fabrikant.
2. Zodra CD8 T-cellen zijn verrijkt, wordt de verrijkte suspensie overgebracht naar een nieuwe steriele 15 mL conische buis en het volume tot 10 mL gevuld met oogstmedium.
3. Tel met een hemocytometer.
   OPMERKING: Van één volwassen muis is het mogelijk om minstens 5-10 miljoen naïeve CD8 T-cellen te isoleren bij >95% zuiverheid.
4. Plaat minstens 500.000 cellen in 2 mL T-celmedium per put van een 24-well-plaat. Meng T-cellen grondig vóór het plateren om een homogene single-cell suspension te garanderen. Vul het T-celmedium aan met een eindconcentratie van 100 eenheden/mL IL-2, 2,5 ng/mL IL-12 en 55 μM beta-mercaptoethanol.
5. Verwijder de voorheen met antilichamen gecoate weefselkweekplaat van de 4 °C en aspireer voorzichtig de coatingoplossing zonder de bodem van de holen aan te raken.
6. Onmiddellijk plaat-T-cellen. Incubeer bij 37 °C met 5%_CO2 gedurende 2 dagen.

4. Het verwijderen van activatiesignalen en het rusten van geactiveerde CD8 T-cellen

1. Bekijk geactiveerde putten onder een lichtmicroscoop. Na 2 dagen activatie zoek je naar kleine clusters van T-cellen in de putjes. Grotere clusters wijzen op meer activatie. Als er geen of weinig clusters zijn, incubeer de plaat dan nog één dag op 37 °C met 5%_CO2 voordat je verder gaat met rusten.
2. Bereid ijs voor om T-cel suspensie op te slaan tijdens incubatieperiodes en wanneer het niet wordt gebruikt.
3. Sussie T-cellen opnieuw met een P1000-pipet door meerdere keren op en neer te pipetteren in elke hoek van de put. Wanneer T-cellen zijn opgeheven, breng je de inhoud van de put over naar een steriele 50 mL conische buis en tel je af.
   OPMERKING: Het wassen van elke put met 1 mL dPBS is optioneel, maar het combineren van dPBS-wash met de T-cel suspension kan het T-cel opbrengst verhogen.
4. Herbeplat de T-cellen op dezelfde concentratie als in stap 3.4, 250.000 cellen/mL bij 2 mL per put. Bereid de juiste hoeveelheid T-celmedium voor, aangevuld met 100 eenheden/mL IL-2 en 55 μM beta-mercaptoethanol.
5. Centrifugeer de suspensie op 584 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C, gooi supernatant weg en suspendeer de pellet opnieuw in het juiste volume T-celmedium dat in de vorige stap is voorbereid voor het aantal putten dat geplateerd moet worden. Meng grondig om een homogene eencellige suspensie te garanderen.
6. Plaat 2 mL T-celsuspensie (500.000 cellen/put) in een nieuwe niet-behandelde weefselkweekplaat zonder antilichaamcoating. Incubeer bij 37 °C met 5%_CO2 gedurende 2 dagen.

5. Het infecteren van vooraf gevormde vaginale epitelorganoïden van de muis met virus

OPMERKING: We hebben zowel het Herpes Simplex-virus-2 (HSV-2) als het lymfatische choriomeningitisvirus (LCMV) gebruikt om virale infecties van de organoïden uit te voeren. Beide worden beschouwd als Biosafety Level-2 (BSL-2) agentia. Voer alle procedures met infectieuze agentia uit in een gecertificeerde BSL-2 bioveiligheidskast. Maak werkruimtes schoon met 70% ethanol zowel voor als na gebruik, en gooi alle materialen weg volgens de institutionele bioveiligheidsrichtlijnen. Voor dit protocol hebben we VEVO's vastgesteld uit vaginale epitheelcellen die zijn geoogst uit het vaginale epitheel van C57BL/6 vrouwelijke muizen zoals beschreven vóór¹⁰.

1. Plaat VEO's met een dichtheid van 10.000 cellen in 20 μL basale membraanextract (BME) per put van een 24-put plaat 7-10 dagen voor infectie.
2. Een dag voor co-kweek zet één put met VEVO's apart om te trypsiniseren en te tellen om een nauwkeurige multipliciteit van infectie (MOI) te verkrijgen. Voorwarm 0,25% trypsine-EDTA in een 37 °C waterbad gedurende 5 minuten.
   OPMERKING: 0,25% trypsine-EDTA zal niet worden gebruikt tijdens infectie; het is alleen nodig om de VEVO's te disassociëren tijdens MOI-berekeningen. Het coaten van plasticwaren (d.w.z. pipetpunten, conische buizen) met 2,5% BSA in dPBS is optioneel in deze stap, maar kan helpen om organoïde- en celverlies te verminderen voor nauwkeuriger tellen.
3. Aspiraat celkweekmedia uit de aangewezen put en was met dPBS.
4. Doseer 600 μL voorverwarmde 0,25% trypsine-EDTA in de put en suspensie grondig met een BSA-gecoate P1000-pipet om de BME mechanisch te verstoren. Breng de inhoud van de put over in een BSA-gecoate steriele 15 mL conische buis.
5. Broed 5 minuten uit in een waterbad van 37 °C. Voeg na 5 minuten 10 mL 10% FBS toe in RPMI om de trypsinisatie te dempen.
6. Centrifugeer de suspensie op 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant en suspendeer opnieuw met een BSA-gecoate pipettip in 100-300 μL T-cel-organoïde kweekmedium of gewone DMEM/F12.
   OPMERKING: Het volume hangt af van de grootte van de pellet. Als de pellet nauwelijks zichtbaar is, hersuspendeer dan in een lager volume.
7. Tel met een hemocytometer. Bereken de juiste hoeveelheid virus die nodig is om 0,1 MOI te bereiken met behulp van de bekende virale titer en celdichtheid per put van VEO's volgens de volgende vergelijking:
   
8. Aspiraat celkweekmedia uit de VEE-putten om te worden geïnfecteerd en spoel met 500 μL voorverwarmde (37 °C) dPBS. Incubeer de putten met dPBS gedurende 5 minuten bij 37 °C.
9. Na 5 minuten verwijder je de dPBS en voeg je 500 μL organoïde media toe per put met voldoende virale deeltjes om een MOI van 0,1 te bereiken. Incubeer bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende 1 uur met voorzichtig handmatig draaien van de weefselkweekplaat elke 20-30 minuten.
10. Na de 1 uur durende incubatie aspireer je het virale organoïde medium en spoel je met 500 μL voorverwarmde (37 °C) dPBS. Aspiratief dPBS en vervang door verse organoïde media.

6. Co-culturering van CD8 T-cellen met virusgeïnfecteerde, vooraf gevormde muriene vaginale epiteelorganoïden

1. Voor de co-cultuur (bij voorkeur 4-24 uur van tevoren) moet je de BME van -80 °C naar 4 °C brengen voor ontdooien. Verwacht de juiste hoeveelheid BME om te ontdooien op basis van het co-cultuur experimentele ontwerp: plan om 8 μL BME per put van een 96-put plaat en 20 μL BME per put van een 24-well plaat te bevatten.
   OPMERKING: BME is viskeus en een langere ontdooiperiode bij 4 °C vermindert de viscositeit en verbetert de wendbaarheid.
2. Bereid 2,5% BSA voor in dPBS en filter steriliseer. Gebruik deze BSA-oplossing om elk plastic oppervlak dat in contact komt met de VEO's (bijv. pipetten, conische buizen) te coaten.
   OPMERKING: Deze coating voorkomt dat VEVO's aan het plastic oppervlak blijven plakken en verloren gaan tijdens het hanteren.
3. Controleer VEVO's onder een lichtmicroscoop op grootte en algehele gezondheid. Bevestig dat VEU's 7-10 dagen na de kweek plaatsvinden en gemiddeld ~100 micron in diameter zijn. Gezonde VEVO's tonen weinig of geen enkele cellen en hebben een uniforme, ronde morfologie.
   OPMERKING: VEO's 1:1 opnieuw verplaten in co-cultuur als ze worden gekweekt in een 24-wells plaat en opnieuw verplaten in een 24-well plaat (d.w.z. één put met VEO's zal één put met T-cel-organoïde co-cultuur uitzaaien). Als je een 96-put plaat opnieuw inbrengt vanaf een 24-put plaat, herplat dan VEO 1:2 (d.w.z. één put met VEO zal twee putten van T-cel-organoïde co-cultuur uitzaaien).
4. Plaats het benodigde aantal steriele 96- of 24-put weefselkweekplaten voor de co-teelt in de 37 °C incubator.
   OPMERKING: Een verwarmde plaat versnelt de hechting en stolling van BME.
5. Bereid T-cel-organoïde kweekmedium voor in DMEM/F12 door 2% B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 100 eenheden/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine, 1x niet-essentiële aminozuren, 1 mM natriumpyruvaat en 0,2 μg/mL amfotericine B toe te voegen. Bewaar het in 4 °C tot het klaar is om te gebruiken.
6. Aspireer celkweekmedia uit VEE-putten en was elke put met 500 μL koude (2-8 °C) steriele dPBS.
7. Aspireer dPBS en voeg 200-500 μL koude (2-8 °C) organoïde oogstoplossing toe (minstens 10x volume organoïde BME-druppel). Pipette op en neer met een BSA-gecoate P200-pipet om de BME mechanisch te verstoren.
8. Incubeer de plaat met zacht schudden (~100 rpm) op een orbitale shaker bij 4 °C gedurende 20 minuten. Als er geen koude orbitale shaker beschikbaar is, incubeer dan de plaat op ijs met handmatig schudden elke 5 minuten. Als BME na 20 minuten niet is gedepolymeriseerd, verleng dan de incubatietijd indien nodig.
9. Breng de inhoud van de putten over met een BSA-gecoate pipettip naar een BSA-gecoate steriele 15 mL of 50 mL conische buis op ijs. Centrifugeer de suspensie op 500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
10. Gooi het supernatant weg en was VEO's met 5-10 mL koude (2-8 °C) dPBS (minstens 10x volume gecombineerde organoïde BME-druppels). Centrifugeer de suspensie op 500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
11. Verwijder de dPBS en suspendeer de pellet opnieuw in 1 mL T-cel-organoïde kweekmedium met behulp van een BSA-gecoate P1000-pipettip. Laat de VEE-suspensie op ijs staan totdat de T-cellen klaar zijn om geco-cultured te worden.
12. Begin met het verzamelen van de T-cellen voor co-kweek. Controleer rustende T-cellen onder een lichtmicroscoop op grootte en algehele gezondheid. Zonder signalen te activeren zullen T-cellen hun proliferatie vertragen, maar zouden ze toch clusters moeten hebben gevormd. Bevestig dat er geen celresten of fragmenten zijn, en dat T-cellen een vergrote morfologie hebben. Suspensieer T-cellen opnieuw met een P1000-pipet door meerdere keren op en neer te pipetteren in elke hoek van de put en tel het totale aantal levende CD8 T-cellen.
    OPMERKING: Per put van een 96-put plaat, zaad 100.000 T-cellen per co-kweek in 8 μL BME. Per put van een 24-put plaat zaad 200.000 T-cellen per co-cultuur in 20 μL BME.
13. Centrifugeer de suspensie op 584 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant en suspendeer de pellet opnieuw in 10 mL T-cel-organoïde kweekmedium. Combineer T-cellen met VEO's door een passend aantal T-cellen voor de putten te verplaatsen in de conische buis met de VEO's.
14. Centrifugeer op 584 × g gedurende 5 minuten op 4 °C. Gooi het supernatant weg en suspendeer VEO's en T-cellen opnieuw in de juiste hoeveelheid BME. Meng grondig met een BSA-gecoate pipettip en plaat op een voorverwarmde weefselkweekplaat, 20 μL per put van een 24-put plaat of 8 μL per put van een 96-well plaat.
    OPMERKING: Houd BME op ijs of in een koelblok op 4 °C tijdens het opmaken. Het plaatsen van pipettips in de 4 °C koelkast gedurende 30 minuten vóór het opmaken kan helpen om voortijdige stolling van de BME te voorkomen.
15. Plaats de plaat ondersteboven in de 37 °C incubator en wacht 30 minuten op volledige BME-hechting en stolling.
16. Tijdens deze incubatieperiode bereidt u het volledige T-cel-organoïde kweekmedium voor door 100 ng/mL muis EGF, 55 μM beta-mercaptoethanol en 10 eenheden/mL muis IL-2 toe te voegen aan het vooraf gemaakte T-cel-organoïde kweekmedium.
17. Na de incubatieperiode voeg je zorgvuldig 500 μL complete T-cel-organoïde kweekmedium toe per put van een 24-wellplaat of 250 μL complete T-cel-organoïde kweekmedium per put van een 96-well plaat. Geef media tegen de zijkanten van de put om te voorkomen dat de BME-druppel wordt verstoord. Vervang het medium elke 2 dagen totdat het geoogst wordt voor analyse.

7. Het verzamelen van geco-gekweekte CD8 T-cellen voor flowcytometrie-analyse

1. Zodra co-culturen ten minste dag 7 in de teelt hebben bereikt, oogst je voor analyse. Als T-cellen tegen dag 7 geen TRM-achtige markers in co-cultuur tot expressie brengen, optimaliseer dan de oogstdatum tussen dag 7-14, afhankelijk van fenotypische verwerving en de levensvatbaarheid van VEO en T-cellen.
2. Bereid een fluorescent geactiveerde celsortering (FACS) buffer voor voor flowcytometriekleuring en analyse door 0,2% w/v rundereserumalbumine en 0,1% w/v natriumazide toe te voegen aan dPBS.
   OPMERKING: Natriumazide is een acuut giftige chemische stof. Volg de institutionele aanbevelingen bij de omgang en verwijdering van al het afval in overeenstemming met de institutionele bioveiligheidsvoorschriften.
3. Bereid een fluorescerende antilichaamcocktail voor in een FACS-buffer voor oppervlaktekleuring, afhankelijk van welke markers voor analyse worden gewild. Voor elke put moet je minstens 50 μL antilichaamcocktail meenemen.
4. Bereid een fluorescerend levensvatbaarheidskleurstof voor in dPBS. Voor elke put moet minimaal 50 μL levensvatbaarheidskleurstof worden meegenomen.
5. Verwijder voorzichtig het medium in elke put en breng het grondig opnieuw in een koude (2-8 °C) FACS-buffer, waarbij je 10-20 keer omhoog en omlaag pipetteert om de BME mechanisch te verstoren. Breng de inhoud van elke put over op een gelabelde plaat met een ronde bodem met 96 putten.
6. Centrifugeer op 859 × g gedurende 2 minuten bij 4 °C. Verlaag de vertragingsramp voor alle centrifugatiestappen om monsterverlies door pellet-remixen te voorkomen.
7. Verwijder het supernatant door de plaat om te draaien en de vloeistof met één stevige neerwaartse beweging uit te stoten. Opnieuw suspenderen in 50 μL antistofcocktail. Pipette minstens 5 keer op en neer met een multikanaals pipet om een grondige resuspension van de celpellet te garanderen.
8. Incubeer 30 minuten op 4 °C of kamertemperatuur indien nodig, beschermd tegen licht. Voeg aan het einde van de incubatieperiode 150 μL dPBS toe aan elke put met een multikanaals pipet en centrifugeer je op 859 × g gedurende 2 minuten bij 4 °C.
9. Dekanteer het supernatant door de plaat ondersteboven te draaien en deze één keer onderuit te knippen in een continue beweging. Opnieuw ophef in 50 μL levensvatbaarheidskleurstof. Pipette minstens 5 keer op en neer met een multikanaals pipet om een grondige resuspension van de celpellet te garanderen.
10. Broed 15 minuten uit op kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Voeg aan het einde van de incubatieperiode 150 μL FACS-buffer toe aan elke put met een multikanaals pipet en centrifuge op 859 × g gedurende 2 minuten bij 4 °C.
11. Dekanteer het supernatant zoals voorheen en susse opnieuw in 150 μL FACS-buffer als monsters onmiddellijk op een flowcytometer worden uitgevoerd, of fixeer 150 μL 0,5% paraformaldehyde en laat het op 4 °C staan. Pipette minstens 5 keer op en neer met een multikanaals pipet om een grondige resuspension van de celpellet te garanderen. Filter vaste monsters om verstopping van het instrument te voorkomen en gebruik binnen 12-36 uur een flowcytometer om verlies van fluorescentie te voorkomen.
    OPMERKING: Paraformaldehyde wordt beschouwd als een gevaarlijke chemische stof. Volg de institutionele bioveiligheidsvoorschriften bij het omgaan en afvoeren.

Resultaten

Microscopische visualisatie van CD8 T-cel-geïnfecteerde organoïde co-cultuur
Voorgevormde muis-VEO's werden geïnfecteerd met LCMV en geco-kweken met LCMV-specifieke CD8 T-cellen. We hebben deze co-culturen ook uitgevoerd met het HSV-2 infectiemodel om de veelzijdigheid van het protocol vast te stellen, maar tonen microscopische gegevens voor het LCMV-model en hebben hieronder T-celdifferentiatiegegevens opgenomen in het HSV-2 model. De LCMV drukt een gele fluorescenti...

Discussie

CD8 TRM's vertrouwen op lokale omgevingssignalen voor differentiatie en onderhoud. Deze signalen stimuleren weefselspecifieke programmering die CD8 TRM's in staat stelt zich aan te passen aan hun omgeving en hun immunosurveillancetaken uit te voeren waar nodig. Helaas overleefden TRM's niet in vitro nadat ze uit het weefsel waren geëxtraheerd, wat hun gedetailleerde analyse beperkt^{heeft tot 12,13}. In dit protocol hebben ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	15710-S
24-Well Polystyrene Non-Treated Multiple Well Tissuce Culture Plates	VWR International	10861-558
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
3 mL Sterile Syringes	Fisher Scientific	14-955-457
5 mL, Snap Cap, Sterile, Round-Bottom Polystyrene Test Tubes	Falcon	352058
60 mm Petri Dishes	Fisher Scientific	FB0875713A
70 μm Sterile Cell Strainers	Fisher Scientific	22-363-548
96-well Non-treated Polystyrene Round Bottom Microplates	Greiner Bio-One	650101
96-Well Polystyrene Non-Treated Multiple Well Tissue Culture Plates	VWR International	10861-562
Albumin bovine/fraction V	Thermo Scientific Chemicals	J6465518
Ammonium Chloride	Fisher Scientific	A661-500
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A9528-100MG
B-27 Supplement	Gibco	17504044
ioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader
DMEM/F12 1:1 Medium	Cytiva	SH30271.FS
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x	Corning	21031CV
Ethylenediaminetetraacetic Acid (0.5 M Solution/pH 8.0)	Fisher Scientific	BP2482-500
Extra Fine Micro Dissecting Scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5882
Fetal Bovine Serum - Charcoal/Dextran Treated	R&D Systems	S11650
Flowjo v10 software	Becton, Dickinson and Company	FlowJo (RRID:SCR_008520)
Graefe Forceps	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5135
HEPES Solution	Cytiva	SH30237.01
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	A2916801
Magnet 5mL	Biolegend	480019
Mouse CD8 Naïve T Cell Isolation Kit	Biolegend	480044
Mouse EGF Recombinant Protein	Gibco	315091MG
Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Gibco	11140050
Penicillin-Streptomycin solution	Cytiva	SV30010
Potassium Bicarbonate	MP Biomedicals	0215255780
Purified anti-mouse CD3ε Antibody	Biolegend	100360
Recombinant Mouse B7.1 (CD80)-Fc Chimera (carrier-free)	Biolegend	555406
Recombinant Mouse IL-12 (p70) (carrier-free)	Biolegend	577004
Recombinant Mouse IL-2 (carrier-free)	Biolegend	575406
Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	R&D Systems	BME001-10
RPMI 1640 Media	Cytiva	SH30027.LS
Sodium Azide	Fisher Scientific	S227I-25
Sodium Pyruvate (100 mM)	Gibco	11360070
Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin	Cytiva	SH30042.02
Viability Dye (Red 780)	Cytek Biosciences	13-0865-T100