Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

De Mettl3/Nrf2-as onderdrukt de progressie van de ziekte van Parkinson via remming van NLRP3-geïnduceerde pyroptose in serotonineneuronen

592 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69124

⸱

7 november 2025

 ,  , 
1Department of Neurosurgery, Feicheng People's Hospital, 2Department of Neurology, Yantai Yantaishan Hospital

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om te onderzoeken hoe Mettl3 Nrf2 reguleert via m6A-modificatie, waardoor microgliale pyroptose wordt onderdrukt en serotonineneuronen in modellen van de ziekte van Parkinson worden beschermd, met toepassingen in onderzoek naar epitranscriptomische neuro-inflammatie.

Samenvatting

De precieze mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathogenese van de ziekte van Parkinson (PD) blijven onvolledig begrepen, met name wat betreft de rol van microgliale ontsteking en overleving van serotonineneuronen. Dit protocol schetst een uitgebreid kader om te verduidelijken hoe methyltransferase-achtig 3 (Mettl3) nucleaire factor erytroïde 2-gerelateerde factor 2 (Nrf2) moduleert door middel van N6-methyladenosine (m6A) modificatie, waardoor microgliale pyroptose wordt verzwakt en serotonineneuronen behouden blijven in zowel in vitro als in vivo PD-modellen. Het primaire doel is om onderzoekers te voorzien van reproduceerbare methodologieën voor het ontleden van epitranscriptomische regulatie van neuro-inflammatoire routes, te beginnen met lipopolysaccharide (LPS)-geïnduceerde microgliale activering in BV2-cellen om ontstekingscascades te simuleren, gevolgd door gemethyleerd RNA immunoprecipitatie kwantitatieve PCR (MeRIP-qPCR) voor m6A-analyse. In vivo beschrijven we de oprichting van een MPTP-geïnduceerd PD-muismodel, aangevuld met stereotactische toediening van adeno-geassocieerde virus serotype 9 (AAV9) vectoren voor gerichte Nrf2-modulatie in het striatum. Gedragsevaluaties omvatten plaatsing van de voorpoten, het versnellen van rotarod en open veldtests om motorische tekorten te kwantificeren, terwijl moleculaire tests westerse blotting omvatten voor pyroptosemarkers (bijv. NLRP3, cleaved-caspase-1), enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA) voor cytokines en dihydroethidium (DHE) kleuring voor detectie van reactieve zuurstofspecies (ROS) in serotonineneuronen. Geavanceerde microscopietechnieken, zoals immunohistochemie voor Iba1 en TPH2, maken visualisatie van microgliale dynamiek en serotonerge integriteit mogelijk. De resultaten tonen aan dat Mettl3-deficiëntie de Nrf2-downregulatie, NLRP3-inflammasoomhyperactivering, pyroptotische celdood en de daaruit voortvloeiende degeneratie van serotonineneuronen verergert. Deze methode biedt niet alleen een robuuste experimentele steiger voor het onderzoeken van m6A-gemedieerde neuroprotectie, maar benadrukt ook potentiële therapeutische wegen om PD-progressie te verminderen door gerichte modulatie van de Mettl3/Nrf2-as in neurodegeneratieve contexten.

Inleiding

De ziekte van Parkinson (PD) is de op één na meest voorkomende neurodegeneratieve aandoening onder ouderen en treft ongeveer 2-3% van de personen van 65 jaar en ouder, wat een aanzienlijke last vormt voor zowel gezinnen als de samenleving1. Hoewel de precieze mechanismen achter PD gedeeltelijk worden begrepen, wijst het toenemende bewijs op een verband tussen de ontwikkeling van PD en uitdagingen in neuronale transmissie, samen met neuro-inflammatie aangedreven door microgliale cellen, wat een veel voorkomende eigenschap is die wordt gezien bij ouder wordende hersenen en verschillende neurodegeneratieve ziekten, waaronder PD 2,3,4,5 . Microglia dienen als de aangeboren immuuncellen in het centrale zenuwstelsel (CZS) en zijn van vitaal belang voor het behoud van de homeostase van de hersenen6. Aanhoudende overactivering van deze microglia kan echter chronische neuro-inflammatoire reacties veroorzaken, wat uiteindelijk bijdraagt aan de progressie van neurodegeneratieve ziekten.

Zowel centrale als perifere ontstekingsprocessen hebben een aanzienlijke invloed op de pathologie van PD 7,8. De activering van microgliacellen veroorzaakt ontstekingsreacties die de neuronale overleving beïnvloeden9, met opkomend bewijs dat de priming door ubiquitine-ligasenbenadrukt 10. Van de verschillende ontstekingsroutes levert NOD-, LRR- en pyrinedomeinbevattend eiwit 3 (NLRP3) inflammasoomactivering een primaire bijdrage aan microgliale ontstekingsregulatie11. Activering leidt tot NLRP3-expressie en daaropvolgende assemblage van het inflammasoomcomplex bestaande uit het caspase-activerings- en rekruteringsdomein (CARD) adaptereiwit en pro-caspase-1, culminerend in eiwitsplitsing en cytokine-afgifte12. Verhoogde NLRP3-activering is waargenomen bij PD-patiënten en verschillende diermodellen van de ziekte, resulterend in neuronale dood. Met name het remmen van NLRP3 heeft beschermende effecten aangetoond tegen PD-pathologie in muismodellen, wat de cruciale rol van het NLRP3-inflammasoom bij het ontstaan van PD onderstreept13,14.

Serotonine (5-HT) signalering is een belangrijk mechanisme van neurale regulatie, dat tal van gedragingen en fysiologische functies beïnvloedt door middel van interacties met ten minste 14 postsynaptische receptorsubtypes15,16, inclusief rollen in CZS-pathologie zoals beschreven in uitgebreide overzichten17. De uitgebreide neuromodulerende invloed van het 5-HT-systeem wordt bepaald door ongeveer 26.000 neuronen in de hersenen van knaagdieren18. Hoewel substantiële literatuur PD voornamelijk associeert met dopaminerge neuronverlies, wordt de relatie tussen 5-HT-neuronen en PD minder grondig onderzocht.

N6-methyladenosine (m6A)-modificatie, de meest voorkomende mRNA-modificatie in eukaryote cellen, is de sleutel tot het reguleren van mRNA-splitsing, stabiliteit en export, waardoor verschillende cellulaire activiteiten worden beïnvloed19. m6A-niveaus worden gemoduleerd door methyltransferasen en demethylasen. Verhoogde m6A-modificaties in de hersenen zijn in verband gebracht met neurologische ontwikkeling, waarbij de ontregeling nauw verbonden is met neurodegeneratieve aandoeningen20,21, waaronder veranderde METTL3-expressie in Alzheimer-modellen22. Zo is de accumulatie van methyltransferase-achtig 3 (METTL3) in de onoplosbare fractie van postmortale hersenweefsels van Alzheimerpatiënten positief gecorreleerd met niveaus van onoplosbaar Tau-eiwit23. Bovendien kan een significante afname van de m6A-spiegels in het striatum leiden tot een substantiële daling van de dopamine-neurotransmitterspiegels24. Met name twaalf m6A-gerelateerde single-nucleotide polymorfismen hebben significante associaties aangetoond met PD-gevoeligheid25. Dit protocol stelt uitgebreide methodologieën vast om te onderzoeken hoe METTL3-gemedieerde m6A-modificaties microgliale pyroptose reguleren via de Nrf2/NLRP3-as, wat uiteindelijk de overleving van serotonineneuronen in PD-modellen beïnvloedt. Het acute MPTP in vivo model en LPS in vitro model werden geselecteerd vanwege hun robuuste inductie van neuro-inflammatoire reacties, hoewel chronische paradigma's een aanvulling zouden kunnen zijn op toekomstige studies, zoals hieronder besproken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd onder goedkeuring van het Institutional Animal Care and Use Committee van het Feicheng People's Hospital (goedkeuringsnummer IACUC-2024-118) en uitgevoerd in strikte overeenstemming met institutionele richtlijnen en vastgestelde ethische principes voor proefdieronderzoek. De onderzoeksprotocollen zorgden voor humane zorg en behandeling van alle dieren, met bijzondere nadruk op het minimaliseren van lijden en angst, terwijl werd voldaan aan zowel institutionele normen als ARRIVE-richtlijnen voor verantwoorde dieronderzoekspraktijken.

1. Celcultuur en microgliaal activeringsmodel

  1. Voorbereiding en onderhoud van BV2-cellen
    1. Ontdooi bevroren BV2 microgliale celvoorraden snel in een waterbad van 37 °C gedurende 2 minuten, zorg voor zacht ronddraaien om thermische schokken te voorkomen.
    2. Centrifugeer de ontdooide celsuspensie bij 300 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) om het cryoprotectant te verwijderen.
    3. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de celpellet in 10 ml volledig DMEM-medium met een hoog glucosegehalte, aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline-streptomycine en 2 mM L-glutamine.
    4. Voer een beoordeling van de levensvatbaarheid van de cellen uit met behulp van de trypanblauwe uitsluitingsmethode (meng 10 μL celsuspensie met 10 μL 0,4% trypanblauw, tel met behulp van een hemocytometer), zorg voor >95% levensvatbaarheid voordat u verder gaat.
    5. Plaatcellen in T75-kweekkolven met een dichtheid van 1 × 10tot 6 cellen per kolf en in een bevochtigde celkweekincubator bij 37 °C met 5% CO2 bewaren.
    6. Passagecellen elke 48 uur bij het bereiken van 80-85% confluentie met behulp van standaard trypsinisatieprocedures.
      OPMERKING: Zorg voor consistente passagenummers (passages 3-8) om reproduceerbare ontstekingsreacties te garanderen. Alle celkweekexperimenten werden minstens drie keer onafhankelijk herhaald, met drie technische replicaten per conditie om de variabiliteit te minimaliseren.
  2. LPS-geïnduceerde microgliale activering
    1. Zaai BV2-cellen in platen met 6 putjes op 2 × 105 cellen per putje in 2 ml compleet medium 24 uur voor de behandeling.
    2. Bereid LPS-stockoplossing bij 1 mg/ml in steriel PBS, filtreer en steriliseer door een filter van 0,22 μm en bewaar in aliquots voor eenmalig gebruik bij -20 °C.
    3. Valideer LPS-activiteit met behulp van Limulus Amebocyte Lysate (LAL)-assay om de endotoxineconcentratie vóór elk experimentte bevestigen 26.
    4. Verdun LPS-voorraad tot een werkconcentratie van 1 μg/ml in serumvrije DMEM onmiddellijk voor gebruik.
    5. Verwijder het kweekmedium uit de putjes en was de cellen twee keer met steriel PBS.
    6. Voeg 2 ml LPS-bevattend medium (1 μg/ml eindconcentratie) toe aan de behandelingsputjes en serumvrije DMEM om de putjes te controleren.
    7. Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C met 5% CO2 voor ontstekingsactivering.
    8. Inclusief positieve controleputjes die zijn behandeld met 100 ng/ml tumornecrosefactor (TNF)-α en negatieve controleputjes met alleen vehiculum (PBS) om de ontstekingsreactie te valideren.
      OPMERKING: Bereid voor elk experiment een verse LPS-oplossing voor om een consistente bioactiviteit te behouden. Als de ontstekingsreactie zwak is (bijv. <2-voudige toename van het cytokine), controleer dan de stabiliteit van het reagens of verleng de incubatie tot 48 uur.
  3. Mettl3 overexpressie en knockdown
    1. Ontwerp en synthetiseer kleine interfererende RNA (siRNA)-sequenties gericht op Mettl3 en gecodeerde controlesequenties met behulp van standaard oligonucleotidesyntheseprotocollen. Selecteer doelsequenties uit het coderende gebied van Mettl3-mRNA (GenBank-toetreding: NM_019721) met een nucleotidelengte van 19-21, waarbij een GC-gehalte van 40-60%27 wordt gegarandeerd.
    2. Valideer siRNA-sequenties met behulp van BLAST-analyse om de specificiteit te bevestigen en off-target effecten te vermijden (zorg voor <70% homologie met niet-doelwitgenen).
    3. Bereid overexpressievectoren voor die Mettl3 cDNA van volledige lengte bevatten die zijn gekloond in de pcDNA3.1-vector met behulp van restrictieplaatsen EcoRI en XhoI.
    4. Transfecte cellen bij 70-80% samenvloeiing met behulp van een kationisch lipidetransfectiereagens:
      1. Meng 2 μL kationisch lipidetransfectiereagens met 50 pmol siRNA of 2 μg plasmide-DNA in 100 μL Opti-MEM-medium.
      2. Incubeer het mengsel gedurende 15 minuten bij RT.
      3. Voeg het transfectiecomplex druppelsgewijs toe aan cellen en incubeer gedurende 4-6 uur alvorens over te schakelen op vers volledig medium.
    5. Incubeer getransfecteerde cellen gedurende 48 uur vóór de LPS-behandeling om adequate veranderingen in de eiwitexpressie mogelijk te maken.
    6. Bevestig de transfectieefficiency gebruikend fluorescente reporter co-transfectie (100 ng pEGFP-C1 per put), die >70%-efficiency door fluorescentiemicroscopie richten alvorens verder te gaan.

2. Ontwikkeling van diermodellen en experimenteel ontwerp

  1. Voorbereiding en randomisatie van dieren
    1. Koop C57BL/6J-muizen van Vital River Laboratory, zorg voor gelijke man-vrouwverhoudingen, 8 weken oud, met een gewicht van 19-26 g.
    2. Huisvesting van dieren in specifieke pathogeenvrije (SPF) omstandigheden met een licht-donkercyclus van 12:12 uur, gecontroleerde temperatuur (22 ± 2°C) en vochtigheid (50-60%).
    3. Sta een acclimatisatieperiode van 7 dagen toe met ad libitum toegang tot standaard voer en water.
    4. Voer basisgedragsbeoordelingen uit tijdens acclimatisatie: Voer uitgebreide gedragsevaluaties uit, waaronder een plaatsingstest voor de voorpoten (10 proeven per kant), het versnellen van de rotarodbeoordeling (4-40 tpm gedurende 5 minuten) en analyse van de locomotorische activiteit in het open veld (sessies van 10 minuten in een apparaat van 50 cm × 50 cm × 50 cm)28,29,30.
    5. Wijs dieren willekeurig toe aan experimentele groepen (n = 6 per groep) met behulp van geautomatiseerde randomisatie om vertekening te minimaliseren: sham, Model, Model+Nrf2-KD, Model+oe-Nrf2.
    6. Implementeer een geblindeerd experimenteel ontwerp waarbij onderzoekers die gedragsbeoordelingen uitvoeren niet op de hoogte zijn van groepsopdrachten.
  2. 1-methyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)-geïnduceerd model voor de ziekte van Parkinson
    1. Bereid MPTP-oplossing in een dosis van 30 mg/kg in steriele zoutoplossing onmiddellijk voor injectie door 15 mg MPTP-hydrochloride op te lossen in 5 ml steriele zoutoplossing en het volume aan te passen op basis van het diergewicht.
      LET OP: MPTP is zeer neurotoxisch. Hanteren in een chemische zuurkast met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder dubbele handschoenen en een laboratoriumjas.
    2. Dien MPTP toe via intraperitoneale injectie in een dosis van 30 mg/kg lichaamsgewicht (injectievolume 10 ml/kg) gedurende drie opeenvolgende dagen op hetzelfde tijdstip elke dag (09:00 ± 30 min).
    3. Injecteer schijndieren van de groep met equivalente hoeveelheden steriele zoutoplossing volgens een identiek injectieschema.
    4. Controleer dieren dagelijks op tekenen van angst, gewichtsverlies (>15% beschouwd als eindpunt) of bijwerkingen tijdens de MPTP-toedieningsperiode met behulp van gestandaardiseerde scorebladen.
    5. Houd de dieren gedurende 8 dagen na de laatste injectie om de ontwikkeling van neurodegeneratie mogelijk te maken.
      OPMERKING: Dieren kunnen in deze periode normaal worden gehuisvest met voortdurende monitoring.
  3. Stereotactische virale injectie
    1. Bereid AAV9-virale vectoren voor door drievoudige transfectie van HEK293T cellen met behulp van polyethylenimine (PEI; 1:3 DNA:PEI-verhouding), oogst 72 uur na transfectie, zuivert met behulp van jodixanolgradiënt-ultracentrifugatie (177.000 × g gedurende 2 uur) en concentreert met behulp van centrifugale filterapparaten om 1 × 1012 genoomkopieën/ml te bereiken.
    2. Valideer virale titer via kwantitatieve polymerasekettingreactie (PCR) met behulp van primers gericht op de ITR-regio's, zodat titers 1 × 10¹² genoomkopieën/ml bereiken met standaard curve-analyse.
    3. Valideer virale titer met behulp van SYBR Green-gebaseerde kwantitatieve PCR met ITR-specifieke primers, het uitvoeren van seriële verdunningen van bekende standaarden en het berekenen van genoomkopieën met behulp van standaardcurve-analyse. Bevestig de afwezigheid van replicatiecompetente virusbesmetting met behulp van p24 ELISA.
    4. Verdoof muizen met isofluraan (3% inductie, 1,5-2% onderhoud) toegediend met een zuurstofdebiet van 0,8-1,0 l/min door een neuskegel, waarbij de ademhalingsfrequentie (60-100 ademhalingen/min) en teenknijpreflex tijdens de procedure worden gecontroleerd. Zet de muis vast in het stereotactische frame en breng oogzalf aan om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
    5. Zet de muis vast in het stereotactische frame en breng oogzalf aan om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
    6. Maak een incisie in de middellijn van de hoofdhuid van 1,5 cm met behulp van een steriel scalpelmes en identificeer het bregma-oriëntatiepunt met behulp van stereotactische coördinaten met een precisie van 0,1 mm.
    7. Bereken injectiecoördinaten voor striatum: anterieur-posterieur -0,5 mm, mediaal-lateraal ±2,0 mm, dorsaal-ventrale -3,0 mm vanaf bregma.
    8. Voer pilotinjecties uit met fluorescerende tracer (bijv. groen fluorescerend eiwit [GFP]) om de nauwkeurigheid van het richten te valideren, waarbij >80% co-lokalisatie met microgliale markers (Iba1) via immunohistochemie wordt bevestigd vóór experimentele injecties.
    9. Laat de injectienaald (33-G) zakken tot de doeldiepte met een snelheid van 1 mm/min en injecteer 2 μL virale suspensie met 0,2 μL/min met behulp van een microspuitpomp met een geautomatiseerde controller. Laat de injectienaald zakken tot de doeldiepte en injecteer 2 μl virale suspensie met een snelheid van 0,2 μl/min met behulp van een microspuitpomp.
    10. Houd de naaldpositie gedurende 5 minuten na de injectie om terugstroming te voorkomen.
    11. Trek de naald langzaam terug met een snelheid van 0,5 mm/min, sluit de incisie met 4-0 zijden hechtingen volgens een onderbroken patroon en laat herstel van de anesthesie toe op een verwarmd herstelkussen.
    12. Dien postoperatieve analgesie toe (carprofen 5 mg/kg subcutaan eenmaal daags gedurende 3 dagen) en controleer het herstel gedurende 24 uur met gedetailleerde observatiebladen.

3. Moleculaire biologie technieken en validatie

  1. RNA-extractie en kwaliteitscontrole
    1. Oogst cellen of striatale hersenweefselmonsters onmiddellijk na experimentele eindpunten door dieren humaan te euthanaseren via CO2 -inhalatie gevolgd door cervicale dislocatie; ontleed weefsel op ijs, hak fijn en dissocieer enzymatisch met 0,25% trypsine gedurende 10 minuten bij 37 °C als er cellen worden geoogst.
    2. Extraheer totaal RNA met behulp van TRIzol-reagens (1 ml per 1 106 cellen of 100 mg weefsel) met mechanische homogenisatie (20-25 slagen in een dounce-homogenisator) en chloroformfasescheiding (0,2 ml chloroform per 1 ml TRIzol).
    3. Beoordeel de RNA-kwaliteit met behulp van spectrofotometrie (A260/A280-verhouding 1,8-2,0) en gelelektroforese (1% agarose) om 28S- en 18S-ribosomale banden te bevestigen.
    4. Kwantificeer de RNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer.
    5. Bewaar RNA-monsters bij -80 °C in nucleasevrij water bij -80 °C met toevoeging van RNaseremmer (40 eenheden/μL) tot analyse.
  2. Nucleair-cytoplasmatische fractionering
    1. Oogst cellen (minimaal 2 × 106 ) en was twee keer met ijskoude PBS (5 ml per wasbeurt, 5 minuten centrifugeren op 300 × g).
    2. Gebruik een in de handel verkrijgbare celfractioneringskit met het volgende protocol.
      1. Resuspendeer de celpellet in 200 μL cytoplasmatische extractiebuffer met proteaseremmers.
      2. Incubeer 10 minuten op ijs met vortex om de 3 minuten.
      3. Centrifugeer bij 16.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en verzamel supernatans (cytoplasmatische fractie).
      4. Was de pellet twee keer met cytoplasmatische extractiebuffer.
      5. Resuspendeer de pellet in 100 μL nucleaire extractiebuffer.
      6. Incubeer 40 minuten op ijs met vortex om de 10 minuten.
      7. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 16.000 × g bij 4 °C en vang het bovenstaande (nucleaire fractie) op
    3. Valideer de fractioneringsefficiëntie door de distributie van nucleaire markers (U6) en cytoplasmatische markers (GAPDH) te analyseren met behulp van Western blot.
    4. Extraheer RNA uit nucleaire en cytoplasmatische fracties afzonderlijk.
    5. Analyseer Nrf2-mRNA-niveaus in elke fractie met behulp van RT-qPCR met fractiespecifieke referentiegenen.
  3. Kwantitatieve real-time PCR (RT-qPCR)
    1. Synthese van cDNA uit 1 μg totaal RNA met behulp van een reverse transcriptiereagenskit met willekeurige primers.
    2. Voer qPCR uit met behulp van de Premix Ex Taq II-kit met genspecifieke primers op een real-time PCR-systeem.
    3. Valideer de specificiteit van de primer met behulp van smeltcurve-analyse en bevestig een enkele amplicon door gelelektroforese.
    4. Gebruik de volgende thermische cyclusomstandigheden: eerste denaturatie bij 95 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door 40 cycli van 95 °C gedurende 15 s, 60 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 30 s.
    5. Bereken relatieve mRNA-expressieniveaus met behulp van de 2-ΔΔCt-methode met β-actine als interne referentie.
    6. Neem controles zonder sjabloon op en valideer de stabiliteit van het referentiegen onder experimentele omstandigheden met behulp van geNorm-analyse (stabiliteitswaarde M < 0,5).
      OPMERKING: Reproduceerbaarheidsscores: intra-assay variatiecoëfficiënt (CV) <10% over drie onafhankelijke runs.
  4. MeRIP-qPCR voor m6A-modificatieanalyse
    1. Extraheer totaal RNA (minimaal 20 μg) en fragmenteer tot 100-200 nucleotiden met behulp van RNA-fragmentatiereagens (10 mM ZnCl2, 10 mM Tris-HCl, pH 7,0) bij 70 °C gedurende 5 min.
    2. Voer immunoprecipitatie uit met behulp van m6A-specifiek antilichaam (2 μg per 20 μg RNA) 's nachts bij 4 °C met rotatie (10 rpm) in immunoprecipitatiebuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 750 mM NaCl, 0,5% NP-40).
    3. Valideer de antilichaamspecificiteit met behulp van bekende m6A-gemodificeerde en niet-gemodificeerde RNA-controles.
    4. Was immunoprecipiteerde complexen vijf keer met wasbuffer.
    5. Elute gebonden RNA en reverse transcribeer met behulp van willekeurige primers.
    6. Reverse transcribeert geëlueerd RNA met behulp van willekeurige primers en voer qPCR-analyse uit met behulp van Nrf2-specifieke primers die potentiële m6A-sites bestrijken.
    7. Voer qPCR-analyse uit met behulp van Nrf2-specifieke primers en bereken de verrijking ten opzichte van het ingevoerde RNA.
      OPMERKING: Als de detectie inconsistent is, optimaliseer dan de fragmentatietijd (4-6 min) om de reproduceerbaarheid te verbeteren; kwantitatieve benchmark: signaal-ruisverhouding >15:1 in vergelijking met IgG-regelaars.

4. Eiwitanalyse en validatie

  1. Eiwitextractie en kwantificering
    1. Lysecellen (1 × 106 cellen) of homogeniseren weefselmonsters (100 mg striataal weefsel) in 200 μL radioimmunoprecipitatietest (RIPA) buffer die proteaseremmers bevat (1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), 1 μg/ml leupeptine, 1 μg/ml pepstatine A) en fosfataseremmers (1 mM natriumorthovanadaat, 5 mM natriumfluoride).
    2. Incubeer lysaten op ijs gedurende 30 minuten met periodieke vortexing (elke 10 minuten gedurende 10 s).
    3. Centrifugeer bij 12.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C om celresten te verwijderen en supernatant te verzamelen.
    4. Kwantificeer de eiwitconcentratie met behulp van bicinchoninezuur (BCA)-assay met runderserumalbuminestandaarden (0, 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000 μg/ml) in drievoudmetingen.
    5. Valideer de eiwitintegriteit door het huishoudeiwitgehalte (GAPDH, verwachte MW: 36 kDa) in alle monsters te analyseren met behulp van Western blot.
  2. Analyse van de westerse vlek
    1. Bereid eiwitmonsters voor met een gelijkmatige lading (30-50 μg) in natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) laadbuffer (eindconcentraties: 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% glycerol, 5% β-mercaptoethanol, 0,003% broomfenolblauw) en denatureer bij 95 °C gedurende 5 minuten.
    2. Scheid eiwitten door SDS-PAGE met behulp van 10% polyacrylamidegels, draaiend op 80 V gedurende 30 minuten gevolgd door 120 V gedurende 90 minuten in Tris-glycine-SDS-buffer.
    3. Breng eiwitten over naar polyvinylideenfluoride (PVDF)-membranen met behulp van een halfdroog overdrachtssysteem (400 mA gedurende 90 min) in overdrachtsbuffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% methanol).
    4. Bevestig de overdrachtsefficiëntie met behulp van omkeerbare eiwitkleuring (Ponceau S: 0,1% in 5% azijnzuur gedurende 5 minuten) voordat u overgaat tot incubatie van antilichamen.
    5. Blokkeer membranen met 5% magere melk in TBST (TBS + 0,1% Tween-20) gedurende 1 uur bij RT met zacht roeren.
    6. Incubeer met primaire antilichamen verdund 1:1000 in blokkeerbuffer 's nachts bij 4 °C met zacht roeren.
    7. Was de membranen driemaal met TBST (elk 10 minuten) en incubeer met HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen (verdunning 1:5000) gedurende 1 uur bij RT.
    8. Detecteer eiwitbanden met behulp van verbeterde chemiluminescentie en kwantificeer met behulp van densitometrie.
    9. Normaliseer de expressie van doeleiwitten naar laadcontrole (GAPDH) en valideer de antilichaamspecificiteit met behulp van de juiste controles (peptideblokkering voor primaire antilichamen, alleen secundaire controles).

5. Gedragsbeoordeling en functionele analyse

  1. Plaatsingstest van de voorpoot
    1. Laat de muis 30 minuten wennen aan de testomgeving (stille ruimte, 22 °C, gedimd licht) voordat u de beoordeling uitvoert.
    2. Pak de muis voorzichtig bij de dorsale huid vast en hang alle vier de ledematen ongeveer 0,5 cm boven de tafelrand en zorg ervoor dat de muis het tafeloppervlak niet kan zien.
    3. Borstel vibrissae aan elke kant tegen de tafelrand om de plaatsingsreflex op gang te brengen en registreer een succesvolle plaatsing van de voorpoot binnen 2 s.
    4. Voer 10 proeven per kant uit met intervallen van 30 s tussen de proeven, afwisselend aan de linker- en rechterkant.
    5. Voer tests uit in consistente lichtomstandigheden (50-100 lux) en tijd van de dag (13:00-17:00) om circadiane invloeden te minimaliseren.
    6. Bereken het slagingspercentage als percentage van succesvolle plaatsingen: (geslaagde plaatsingen/totaal aantal proefversies) × 100.
  2. Versnellen van de rotarod test
    1. Stel het rotaroid-apparaat in op een begintoerental van 4 tpm met lineaire versnelling tot 40 tpm gedurende een duur van 5 minuten.
    2. Train muizen op de rotarod gedurende 3 opeenvolgende dagen (3 proeven per dag, intervallen van 15 minuten) voordat u gaat testen om leereffecten te minimaliseren.
    3. Standaardiseer testomstandigheden, waaronder RT (22 ± 2 °C), verlichting (100 lux) en achtergrondgeluidsniveaus (<50 dB).
    4. Plaats de muis op de roterende stang die naar voren is gericht en start onmiddellijk het acceleratieprotocol.
    5. Registreer de latentie tot vallen (tijd vanaf het begin tot de val van de muis of het voltooien van de proef van 5 minuten) voor elke proef, waarbij 5 keer per dier wordt getest met rustintervallen van 15 minuten.
    6. Bereken de gemiddelde latentie van de drie langste proeven om de variabiliteit als gevolg van motiverende factoren te minimaliseren.
  3. Open veld test
    1. Gebruik een open veldapparaat (50 cm × 50 cm × 50 cm doorzichtige acryldoos) met een videovolgsysteem dat 1 m boven de arena is geplaatst.
    2. Reinig het apparaat met 70% ethanol tussen de dieren (spuiten en afvegen, 5 minuten aan de lucht laten drogen) om geursignalen te elimineren.
    3. Plaats de muis in het midden van het apparaat en registreer de activiteit gedurende 10 minuten bij constante verlichting (200 lux) met video-opname met 30 fps.
    4. Analyseer meerdere parameters met behulp van geautomatiseerde trackingsoftware:
      Totale afgelegde afstand (cm)
      Middenzonetijd (gedefinieerd als 10 cm van muren, gerapporteerd in s)
      Bewegingssnelheid (cm/s)
      Tijd doorgebracht in periferie versus centrumzones
  4. Definieer de centrale zone als 10 cm van de muren en kwantificeer de tijd die wordt doorgebracht en de afgelegde afstand in het midden versus de periferiezones.

6. Geavanceerde microscopie en beeldvorming

  1. DHE-kleuring voor ROS-detectie
    1. Bereid direct voor gebruik een verse dihydroethidium (DHE)-oplossing bij 10 μM in PBS (beschermen tegen licht).
    2. Voer co-immunofluorescentiekleuring uit door DHE te combineren met tryptofaanhydroxylase 2 (TPH2)-antilichaam (verdunning 1:500) om serotonineneuronen specifiek te identificeren.
      OPMERKING: Deze dual-labeling-benadering maakt het mogelijk om de ROS-productie in TPH2-positieve neuronale cellichamen te onderscheiden van oxidatieve stress in omliggende gliacellen, gebaseerd op het principe dat DHE, bij oxidatie door superoxide, membraan-impermeant fluorescerende producten vormt die gelokaliseerd blijven in de cel van oorsprong.
    3. Incubeer weefselcoupes (20 μm dikte) met DHE-oplossing gedurende 30 minuten bij 37 °C in donkere omstandigheden in een bevochtigde kamer.
    4. Voeg negatieve controles (geen DHE) en positieve controles (100 μM H2O2 behandeling gedurende 30 minuten) toe om de specificiteit van de ROS-detectie te valideren.
    5. Was secties drie keer met PBS en monteer ze met anti-fade montagemedium.
    6. Afbeelding met behulp van fluorescentiemicroscopie (DHE: 518 nm excitatie/605 nm emissie, TPH2: 488 nm excitatie/525 nm emissie) met consistente belichtingsinstellingen (200 ms) over monsters; Beeldvormingssystemen werden wekelijks gekalibreerd met behulp van standaard fluorescentiekralen (signaal-ruisverhouding > 20:1).
    7. Kwantificeer de fluorescentie-intensiteit in TPH2-positieve cellen alleen met behulp van ImageJ-software met gestandaardiseerde analyseprotocollen (drempel: 50-255, deeltjesgrootte: 10-∞ pixels2). Bepaal ROI-grenzen op basis van TPH2-immunoreactiviteit om meting van oxidatieve stress specifiek in serotonerge neuronen te garanderen, terwijl signalen van aangrenzende microglia, astrocyten of andere celtypen worden uitgesloten. Analyseer voor elk dier minimaal 50 TPH2-positieve neuronen in meerdere weefselsecties.
  2. Immunohistochemie
    1. Fixeer weefselcoupes in 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 24 uur bij 4 °C met zacht roeren.
    2. Dehydrateer door middel van een gegradueerde ethanolserie (70%, 80%, 90%, 95%, 100% × elk 2, 1 uur) en veranker in paraffine met behulp van een geautomatiseerde processor.
    3. Snijd secties van 5 μm met behulp van een microtoom en monteer ze op geladen, zodat u 3-4 secties per dia krijgt.
    4. Deparaffineer secties met xyleen (2 × 10 min) en rehydrateer door gesorteerde ethanol tot water.
    5. Voer het ophalen van antigeen uit met behulp van citraatbuffer (10 mM natriumcitraat, pH 6,0) in een magnetron (750 W gedurende 10 minuten met afkoelintervallen van 2 minuten).
    6. Valideer de specificiteit van antilichamen met behulp van geschikte negatieve controles (geen primair antilichaam) en positieve controleweefsels (hersensecties waarvan bekend is dat ze doeleiwitten tot expressie brengen).
    7. Blokkeer de endogene peroxidase-activiteit met 3% waterstofperoxide in methanol gedurende 10 minuten bij RT.
    8. Breng primaire antilichamen 's nachts bij 4 °C aan in een bevochtigde kamer.
    9. Detecteer met behulp van HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen (1:500 verdunning, 1 uur bij RT) en DAB-chromogeen (incubeer tot zich een bruine kleur ontwikkelt, meestal 2-5 minuten).
    10. Tegenvlekken met hematoxyline (30 s), dehydrateren, helder en monteren met permanent montagemedium.
    11. Kwantificeer positieve cellen met behulp van stereologische methoden met systematische willekeurige steekproeven (elke 5e sectie, 3 telframes per sectie, vergroting van 40×).

7. Statistische analyse en validatie van gegevens

  1. Statistische opzet en analyse
    1. Voer een vermogensanalyse uit om voldoende steekproefgroottes te bepalen voor het detecteren van biologisch betekenisvolle verschillen (effectgrootte ≥ 0,8, vermogen ≥ 0,80, α = 0,05) met behulp van G*Power 3.1.9.7-software.
    2. Valideer de normaliteit van de gegevens met behulp van de Shapiro-Wilk-test en beoordeel de homogeniteit van de variantie met behulp van de Levene-test vóór parametrische analyse.
    3. Analyseer gegevens met behulp van statistische software met de juiste statistische tests op basis van experimenteel ontwerp en gegevensdistributie.
    4. Pas eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) toe voor vergelijkingen met één factor en tweerichtings-ANOVA voor factoriële ontwerpen (bijv. behandelings- × tijdsinteracties).
    5. Gebruik de post-hoctest van Tukey voor meerdere vergelijkingen wanneer ANOVA significantie vertoont (p < 0,05), en pas indien nodig Bonferroni-correctie toe.
    6. Stel de statistische significantiedrempel in op p < 0,05 voor alle analyses met aanvullende notatie voor p < 0,01 en p < 0,001.
    7. Rapporteer effectgroottes (Cohen's d of η2) en 95% betrouwbaarheidsintervallen naast p-waarden om een uitgebreide statistische interpretatie te bieden.
    8. Presenteer gegevens als gemiddelde ± SEM van minimaal drie onafhankelijke experimenten, waarbij individuele gegevenspunten worden weergegeven wanneer n ≤ 10.
      OPMERKING: Alle celkweekexperimenten moeten ten minste drie keer onafhankelijk worden herhaald, waarbij elk experiment de juiste controles en meerdere technische replicaten bevat, en de waargenomen variabiliteit (bijv. CV <15% voor gedragsgegevens) werd geminimaliseerd door blindering en gestandaardiseerde timing.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het protocol toont met succes aan dat de expressie van Mettl3 afneemt in met LPS behandelde microgliacellen (Figuur 1), zoals blijkt uit zowel mRNA- als eiwitniveauverlagingen in vergelijking met controlegroepen (Figuur 1B,C). ELISA-analyse bevestigt succesvolle LPS-gemedieerde inflammatoire activering door verhoogde IL-6- en TNF-α-spiegels in kweeksupernatanten (Figuur 1A).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Er zijn verschillende cruciale stappen die zorgvuldige aandacht vereisen om reproduceerbare resultaten te garanderen. De timing van de LPS-activering is cruciaal - ontstekingsreacties pieken 24 uur na de behandeling, en we raden ten zeerste aan om voor elk experiment een nieuwe LPS-oplossing te bereiden, aangezien opgeslagen oplossingen bioactiviteit kunnen verliezen19,20. Voor de MeRIP-qPCR-analyse staat de kwaliteit van de anti...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige financiële belangen of belangenconflicten met betrekking tot dit werk. Geen enkele auteur heeft een financiële relatie met bedrijven waarvan de producten in dit artikel worden genoemd.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken de technische staf van het Feicheng People's Hospital en het Yantai Yantaishan Hospital voor hun hulp bij experimentele procedures en dierenverzorging.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AAV9 virale vectorenVector Core FacilityAangepastBevat Nrf2-constructen
Accelerating rotarodUgo Basile47600Voor gedragstesten
Anti-GAPDH-antilichaamCell Signaling Technology5174Primair antilichaam, 1:5000
Anti-GSDMD-antilichaamAbcamab219800Primair antilichaam, 1:1000
Anti-Iba1-antilichaamWako019-19741Primair antilichaam, 1:500
Anti-NLRP3-antilichaamAdipoGenAG-20B-0014Primair antilichaam, 1:1000
Anti-Nrf2-antilichaamAbcamab62352Primair antilichaam, 1:1000
Anti-SLC6A4-antilichaamNovus BiologicalsNBP1-85726Primair antilichaam, 1:500
Anti-TPH2-antilichaamMilliporeMAB847Primair antilichaam, 1:500
BCA-eiwitanalysekitPierce23225Voor eiwitkwantificering
BV2 microgliale cellenShengen BiologySG-BV2Muis-microglia-cellijn
C57BL/6J-muizenVital River Laboratory2138 weken oud, 19-26 g
CelfractioneringkitCell Signaling Technology9038Nucleair-cytoplasmatisch scheiding
Complete DMEM met hoge glucoseGibco11965092Celcultuurmedium
DAB ChromogenVector LaboratoriesSK-4100Voor immunohistologie
TandboorFine Science Tools18000-17Voor het boren van een burr-gat
DHE (Dihydroethidium)Molecular ProbesD11347ROS-detectie
ELISA-kit (IL-1β)R&D SystemsMLB00CMuis IL-1β-detectie
ELISA-kit (IL-18)R&D Systems7625Muis IL-18-detectie
ELISA-kit (IL-6)R&D SystemsM6000BMuis IL-6-detectie
ELISA-kit (TNF-α)R&D SystemsMTA00BMuis TNF-α-detectie
Foetaal rundsserumGibco16000044Celcultuursupplement
HRP-geconjugeerd secundair antilichaamJackson ImmunoResearch111-035-003Anti-konijn, 1:10000
IsofluraanRWD Life ScienceR510-22Anesthetisch middel
LAL-analysekitLonza50-647ULPS-activiteitsvalidatie
Lipofectamine-transfectiemiddelInvitrogen11668019Voor celtransfectie
LPS (Lipopolysacharide)Sigma-AldrichL2630Van E. coli, 1 mg/mL stock
m6A-antilichaamSynaptic Systems202003Voor MeRIP, 1:200
MicrosyringepompHarvard Apparatus70-3007Voor stereotactische injectie
MPTPSigma-AldrichM0896Neurotoxine, 30 mg/kg
Open veldapparaatANY-mazeAangepast50 cm ´ 50 cm ´ 50 cm
ParaformaldehydeSigma-AldrichP61484% in PBS
pcDNA3.1-vectorInvitrogenV79020Expressievector
Penicilline-StreptomycineGibco15140122Antibioticumoplossing
Premix Ex Taq II-kitTakaraRR820AVoor qPCR
PrimeScript RT-kitTakaraRR037AOmgekeerde transcriptie
PVDF-membraanMilliporeIPVH00010Voor Western blot
RIPA-bufferCell Signaling Technology9806Eiwitextractie
siRNA (Mettl3)RiboBioAangepastDoelsequentievalidatie
Stereotactisch frameRWD Life Science68001Voor hersenchirurgie
TRIzol-reagensInvitrogen15596026RNA-extractie
TrypanblauwSigma-AldrichT8154Celviabiliteitskleuring

Referenties

  1. Poewe, W. Parkinson disease primer-a true team effort. Nat Rev Dis Primers. 6 (1), 31(2020).
  2. Badanjak, K., Fixemer, S., Smajić, S., Skupin, A., Grünewald, A. The contribution of microglia to neuroinflammation in Parkinson's disease. Int J Mol Sci. 22 (9), 4676(2021).
  3. Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration. Cell. 140 (6), 918-934 (2010).
  4. Lee, Y., Lee, S., Chang, S. -C., Lee, J. Significant roles of neuroinflammation in Parkinson's disease:therapeutic targets for PD prevention. Arch Pharm Res. 42 (5), 416-425 (2019).
  5. Yao, L., et al. Translational evaluation of metabolic risk factors impacting DBS efficacy for PD-related sleep and depressive disorders:preclinical, prospective and cohort studies. Int J Surg. 111 (1), 543-566 (2025).
  6. Rodríguez-Gómez, J. A., et al. Microglia:agents of the CNS pro-inflammatory response. Cells. 9 (7), 1717(2020).
  7. Nguyen, M., Palm, N. W. Gut instincts in neuroimmunity from the eighteenth to twenty-first centuries. Semin Immunopathol. 44 (5), 569-579 (2022).
  8. Pajares, M., Rojo, A. I., Manda, G., Boscá, L., Cuadrado, A. Inflammation in Parkinson's disease:mechanisms and therapeutic implications. Cells. 9 (7), 1687(2020).
  9. Sampson, T. R., et al. Gut microbiota regulate motor deficits and neuroinflammation in a model of Parkinson's disease. Cell. 167 (6), 1469-1480.e12 (2016).
  10. Yao, L., et al. LRRK2 Gly2019Ser mutation promotes ER stress via interacting with THBS1/TGF-β1 in Parkinson's disease. Adv Sci. 10 (30), e2303711(2023).
  11. Haque, M. E., et al. Targeting the microglial NLRP3 inflammasome and its role in Parkinson's disease. Mov Disord. 35 (1), 20-33 (2019).
  12. Huang, Y., Xu, W., Zhou, R. NLRP3 inflammasome activation and cell death. Cell Mol Immunol. 18 (9), 2114-2127 (2021).
  13. Lee, E., et al. MPTP-driven NLRP3 inflammasome activation in microglia plays a central role in dopaminergic neurodegeneration. Cell Death Differ. 26 (2), 213-228 (2018).
  14. Humphries, F., et al. The E3 ubiquitin ligase Pellino2 mediates priming of the NLRP3 inflammasome. Nat Commun. 9 (1), 1560(2018).
  15. Berger, M., Gray, J. A., Roth, B. L. The expanded biology of serotonin. Annu Rev Med. 60 (1), 355-366 (2009).
  16. Filip, M., Bader, M. Overview on 5-HT receptors and their role in physiology and pathology of the central nervous system. Pharmacol Rep. 61 (5), 761-777 (2009).
  17. Yao, L., et al. MicroRNA-124 regulates the expression of MEKK3 in the inflammatory pathogenesis of Parkinson's disease. J Neuroinflammation. 15 (1), 13(2018).
  18. Fyodorov, D., Nelson, T., Deneris, E. Pet-1, a novel ETS domain factor that can activate neuronal nAchR gene transcription. J Neurobiol. 34 (2), 151-163 (1998).
  19. Deng, J., Chen, X., Chen, A., Zheng, X. m6A RNA methylation in brain injury and neurodegenerative disease. Front Neurol. 13, 995747(2022).
  20. Livneh, I., Moshitch-Moshkovitz, S., Amariglio, N., Rechavi, G., Dominissini, D. The m6A epitranscriptome:transcriptome plasticity in brain development and function. Nat Rev Neurosci. 21 (1), 36-51 (2019).
  21. Jiang, L., Li, X., Wang, S., Yuan, Z., Cheng, J. The role and regulatory mechanism of m6A methylation in the nervous system. Front Genet. 13, 962774(2022).
  22. Yao, L., et al. MicroRNA-124 regulates the expression of p62/p38 and promotes autophagy in the inflammatory pathogenesis of Parkinson's disease. FASEB J. 33 (7), 8648-8665 (2019).
  23. Huang, H., Camats-Perna, J., Medeiros, R., Anggono, V., Widagdo, J. Altered expression of the m6A methyltransferase METTL3 in Alzheimer's disease. eNeuro. 7 (5), (2020).
  24. Mathoux, J., Henshall, D. C., Brennan, G. P. Regulatory mechanisms of the RNA modification m6A and significance in brain function in health and disease. Front Cell Neurosci. 15, 671932(2021).
  25. Guo, F., et al. Genome-wide identification of m6A-associated single nucleotide polymorphisms in complex diseases of nervous system. Neurosci Lett. 817, 137513(2023).
  26. Romaschin, A. D., Klein, D. J., Marshall, J. C. Bench-to-bedside review:clinical experience with the endotoxin activity assay. Crit Care. 16 (6), 248(2012).
  27. Zhong, L., et al. METTL3 induces AAA development and progression by modulating N6-methyladenosine-dependent primary miR34a processing. Mol Ther Nucleic Acids. 21, 394-411 (2020).
  28. Justice, J. N., et al. Battery of behavioral tests in mice that models age-associated changes in human motor function. Age (Dordr). 36 (2), 583-592 (2014).
  29. Seibenhener, M. L., Wooten, M. C. Use of the Open Field Maze to measure locomotor and anxiety-like behavior in mice. J Vis Exp. (96), e52434(2015).
  30. Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785(2014).
  31. Roundtree, I. A., Evans, M. E., Pan, T., He, C. Dynamic RNA modifications in gene expression regulation. Cell. 169 (7), 1187-1200 (2017).
  32. Song, M. -Y., Lee, D. -Y., Chun, K. -S., Kim, E. -H. The role of NRF2/KEAP1 signaling pathway in cancer metabolism. Int J Mol Sci. 22 (9), 4376(2021).
  33. He, F., Ru, X., Wen, T. NRF2, a transcription factor for stress response and beyond. Int J Mol Sci. 21 (13), 4777(2020).
  34. Schöller, E., et al. Interactions, localization, and phosphorylation of the m6A generating METTL3-METTL14-WTAP complex. RNA. 24 (4), 499-512 (2018).
  35. Li, G., et al. METTL3 plays a crucial function in multiple biological processes. Acta Histochem. 124 (6), 151916(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

NLRP3-pyroptosemicrogliële inflammatiem6A-modificatieMeRIP-qPCRMPTP-muismodelWestern blotimmunohistochemie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.