Methodenartikel

Multi-orgaanverzameling uit muismodellen voor verouderingsstudies

DOI:

10.3791/69128

⸱

12 december 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde methode voor orgaanverzameling bij jonge en oude muizen om leeftijdsgebonden anatomische en histologische veranderingen over meerdere weefsels te beoordelen, wat zowel ethisch als kostenefficiënt experimenteel ontwerp ondersteunt.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veroudering is een systemisch en multifactorieel biologisch proces dat geleidelijk bijna alle organen en weefsels aantast, wat leidt tot structurele, cellulaire en moleculaire veranderingen. Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde en reproduceerbare benadering voor het evalueren van leeftijdsgebonden anatomische en morfologische veranderingen bij muizen door middel van uitgebreide orgaanverzameling voor latere histologische en moleculaire analyses. Met behulp van jonge (2-3 maanden oud) en oude (20-24 maanden) muizen beschrijven we stapsgewijze procedures voor grove anatomische dissectie en systematische oogst van belangrijke organen voor downstream doorsnijding, histologische kleuring en microscopische evaluatie. Het protocol maakt het mogelijk om een breed scala aan organen en weefsels te verzamelen (waaronder de hersenen, ogen, slokdarm, thymus, hart, aorta, longen, lymfeklieren, lever, alvleesklier, maag, dunne darm, colon, milt, nier, blaas, huid, skeletspier, bot en vetweefsel) van één dier. Door de dataopbrengst per proefpersoon te maximaliseren, ondersteunt deze workflow ethisch dierlijk gebruik door middel van reductie, verbetert het reproduceerbaarheid in alle studies en faciliteert het integratieve analyses van organismale veroudering.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veroudering is een systemisch proces dat bijna alle organen treft, maar de meeste experimentele studies richten zich op één enkel weefsel, waardoor de inzichten worden beperkt in hoe leeftijdsgerelateerde veranderingen samen plaatsvinden of interageren in het lichaam. Veroudering uit zich in zowel weefselspecifieke als systemische veranderingen, waaronder immuundisfunctie, metabole verschuivingen, verlies van regeneratievermogen en structurele degeneratie 1,2. Hoewel orgaanspecifieke onderzoeken waardevolle inzichten hebben opgeleverd, is een breder perspectief nodig om te begrijpen hoe cellulaire veroudering over systemen heen bijdraagt aan de achteruitgang van het hele organisme. Multi-orgaananalyse in preklinische in vivo modellen, zoals muizen, is essentieel om gecoördineerde structurele, cellulaire en moleculaire veranderingen te identificeren die bijdragen aan leeftijdsgebonden ziekten en verlies van fysiologische veerkracht 3,4.

De laboratoriummuis blijft een essentieel en goed gevestigd preklinisch model voor verouderingsonderzoek vanwege zijn genetische tractie, korte levensduur, geconserveerde verouderingsroutes en het vermogen om belangrijke kenmerken van menselijke veroudering te recapituleren, waaronder immuunstoornissen, weefselfibrose, metabole achteruitgang en verhoogde neoplasie 5,6,7. Efficiënte en gestandaardiseerde multi-orgaandissectieprotocollen worden echter niet veel gebruikt. Dergelijke protocollen zijn noodzakelijk om histologische vergelijkingen te optimaliseren, het gebruik van dieren te verminderen en omics-datasets te integreren over weefsels van hetzelfde onderwerp 8,9.

Hier presenteren we een reproduceerbaar, tijdbesparend protocol voor multi-orgaanperfusie, dissectie en behoud bij muizen. Dit protocol biedt een stapsgewijze gids voor de anatomische dissectie en verzameling van belangrijke organen van jonge (2-3 maanden) en oudere (20-24 maanden) muizen, waaronder de hersenen, ogen, thymus, hart, longen, aorta, inguinale lymfeklieren, maag-darmkanaal (slokdarm, maag, dunne darm, colon), lever, alvleesklier, milt, nieren, blaas, vetweefsel, skeletspier, bot en huid. Gedetailleerde instructies voor weefselbehoud die compatibel zijn met histologische, moleculaire en cryosectieworkflows zijn inbegrepen. Deze gestandaardiseerde benadering stelt onderzoekers in staat om orgaanspecifieke en systemische kenmerken van veroudering binnen dezelfde proefpersonen te beoordelen, wat geïntegreerd, hoogwaardig verouderingsonderzoekondersteunt.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C57BL/6J-muizen werden onderhouden aan de University of California, San Francisco. Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en onder toezicht van het Laboratory Animal Resource Center. Muizen werden gehuisvest volgens een licht-donker cyclus van 12 uur, met minder dan vijf volwassen muizen per kooi. Euthanasie werd uitgevoerd volgens de richtlijnen van de American Veterinary Medical Association (AVMA) voor de euthanasie van dieren13. Voor dit protocol werden jonge muizen geofferd op 3 maanden, en oudere muizen op 22 maanden. Voordat u doorgaat met de dissectie en orgaanverzameling, print en vul u de voorbereidingschecklist (Tabel 1) en de checklist voor weefselverzameling (Tabel 2) in en vul ze in. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Cervicale dislocatie

OPMERKING: Cervicale dislocatie moet worden uitgevoerd door een getraind persoon om overmatig trauma aan de cervicale structuren te minimaliseren.

  1. Houd de muis vast door de basis van de staart stevig vast te grijpen met één hand.
  2. Plaats duim en wijsvinger van de tegenovergestelde hand aan de basis van de schedel.
  3. Oefen stevige, snelle druk uit om de halswervels uit de compositie te brengen. Palpeer de nek om de scheiding tussen de schedel en de aangrenzende wervels te bevestigen.
  4. Bevestig succesvolle euthanasie (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen) door te zorgen voor ademhalingsstilstand en het ontbreken van reacties op schadelijke prikkels voordat je verder gaat.
  5. Noteer het lichaamsgewicht van de muis voordat de perfusie en weefselverzameling plaatsvindt.

2. Thoracotomie en perfusie

OPMERKING: Perfusie is optioneel. Voer alle procedures uit waarbij paraformaldehyde (PFA) wordt gebruikt in een gecertificeerde chemische dampkap, terwijl je passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) draagt, waaronder een labjas, nitrilhandschoenen en veiligheidsbril. Verwijder de PFA-oplossingen in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor chemische veiligheid. Verzamel al het afval van PFA en verontreinigde materialen (bijv. handschoenen, zakdoekjes, containers) in een duidelijk gelabelde container voor gevaarlijk afval en voer deze af via het kantoor voor Milieugezondheid en Veiligheid van de instelling, volgens protocollen die voldoen aan lokale, staats- en federale regelgeving.

VOORZICHTIG: Als je paraformaldehyde (PFA) gebruikt voor fixatie, voer dan alle stappen uit onder een dampkap om blootstelling aan formaldehydedampen te voorkomen.

  1. Plaats een piepschuimdeksel bedekt met een absorberend materiaal om vocht uit de perfusie op te vangen in een verzamelbak. Plaats de muis op dit dissectieoppervlak in rugligging en zet de ledematen vast met spelden om het lichaam te stabiliseren: voorpoten lateraal geplaatst om de thoracale holte te openen en achterpoten gestrekt om zachte spanning over de buikwand te creëren.
    OPMERKING: Deze positionering verbetert het zicht, minimaliseert obstructie en maximaliseert de werkruimte voor orgelverzameling.
  2. Breng 70% ethanol aan op het borstgebied.
  3. Gebruik een scherpe schaar om een dwars incisie te maken op het niveau van het middenrif, gevolgd door twee V-vormige sneden die uitlopen om de ribbenkast bloot te leggen (Figuur 1A).
  4. Met een stompe pincet tilt u de huid voorzichtig op en snijdt de resterende aanhechtingen door om het thoracale gebied volledig bloot te leggen.
  5. Maak twee V-vormige incisies van ongeveer 2 cm lang langs beide zijden van de ribbenkast om de borstholte te openen.
  6. Trek aan het borstbeen en spel het over de schouder van de muis naast het hoofd.
  7. Met een stompe tang maak je het hart voorzichtig bloot. Verwijder eventuele vastzittende luchtbellen uit de perfusielijn en steek vervolgens een vlindernaald of canule in de punt van de linker ventrikel tot een diepte van ongeveer 3-4 mm. Maak een incisie van ongeveer 5 mm lang in het rechter atrium om het perfusaat uit te laten stromen (Figuur 1B).
  8. Begin met perfusie met een calcium- en magnesiumvrije fysiologische oplossing (bijv. PBS, zoutoplossing of HBSS) om het bloedsomloopsysteem te zuiveren.
    OPMERKING: Perfusie kan worden uitgevoerd met een 20 mL spuit, pomp of zwaartekrachtgevoed systeem. Gemiddeld is 15-20 mL perfusieoplossing per muis nodig om volledige bloedverwijdering uit de bloedvaten te bereiken. Goede perfusie wordt aangegeven door snel leegmaken (blancheren) van de lever en longen, evenals het licht van de mond en tong die bleek lijken. Volledige perfusie zorgt voor een heldere, bloedvrije uitstroom van het hart.
  9. Indien gewenst, start PFA-perfusie door de perfusielijn te vervangen van calcium- en magnesiumvrije fysiologische oplossing (gebruikt voor pre-flushing en bloedverwijdering) naar een 50 mL spuit met 4% paraformaldehyde (PFA), terwijl de naald op zijn plaats blijft. Let erop dat je geen luchtbellen in de leiding introduceert. Blijf perfuseren met 4% PFA totdat de gewenste mate van fixatie wordt bepaald aan de hand van het geleidelijke versteviging van het lichaam. Ongeveer 30 ml fixatief is voldoende voor één muis.

3. Orgaan- en weefselverzameling

OPMERKING: De volgorde van orgaanverzameling is cruciaal bij het vergelijken van jonge en oude muizen. Organen bij oudere dieren zijn vaak kwetsbaar en gevoelig voor autolyse of mechanische schade, waardoor snelle en consistente weefselbehandeling noodzakelijk is. Het standaardiseren van de verzamelvolgorde minimaliseert postmortale variabiliteit, vermindert het hanteren van artefacten en zorgt voor een uniforme fixatiekwaliteit bij dieren14,15. Consistentie is essentieel voor het detecteren van subtiele leeftijdsgebonden morfologische veranderingen, omdat vertraagde of inconsistente steekproefneming tot bias kan leiden. Als er geen PFA-perfusie is uitgevoerd, moeten organen snel worden geoogst. De alvleesklier, maag, longen en hersenen zijn bijzonder gevoelig voor snelle autolyse en histologische afbraak als deze niet direct worden verwerkt. Omdat oudere muizen vaak neoplastische laesies ontwikkelen, moet je de milt, lever, lymfeklieren, longen en thymus zorgvuldig onderzoeken op asymmetrie, vergroting, knobbeltjes of verkleuring. Noteer deze bevindingen als onderdeel van de totale ziektelast (zie Tabel 2).

  1. Begin met het dier in rugligging na perfusie of cervicale dislocatie om de belangrijkste organen van de thoracale en buikholte te verzamelen (Figuur 1C).
  2. Breng na het vastzetten voorzichtig 70% ethanol aan met gaas of een spuitfles, wat de vachtbesmetting minimaliseert en de hydratatie van het weefsel in gevoelige gebieden behoudt. Deze methode is effectief gebleken in onze handen om vachtresten te verminderen en het zicht tijdens dissectie te verbeteren, terwijl de nadelen van volledige onderdompeling worden vermeden.
  3. Open voorzichtig met een schaar en een stompe tang de buikholte door een middenlijnincisie te maken van het middenrif naar het bekken, gevolgd door twee laterale incisies zoals aangegeven door de rode lijnen in Figuur 1A. Trek de huid en buikwand omhoog om de inwendige organen volledig bloot te leggen.
  4. Maag, dunne darm en colon: Losmaak de maag bij de slokdarmovergang terwijl het pylorusuiteinde continu blijft met de dunne darm. Maak voorzichtig het maagdarmkanaal vrij door de ondersteunende ligamenten door te snijden, en verwijder vervolgens het kanaal, inclusief de dunne darm en dikke darm. Snijd distaal bij het rectum.
    1. Om de luminale inhoud te verwijderen, snijd de dunne darm proximaal af bij de duodenojejunale buiging en distaal bij de ileocecale overgang. Voor de dikke darm, snijd proximaal bij het cekum. Spoel de dunne darm en colon door met ongeveer 20 ml fysiologische oplossing met een spuit met een voedingsnaald, terwijl je het weefsel voorzichtig vastzet met fijne pincetten om schade te voorkomen.
  5. Oesofagus: Isoleer de slokdarm van de cervicale naar de maagverbinding.
  6. Milt en alvleesklier: Isoleer de milt en alvleesklier van omliggende weefsels met fijne dissectie, zodat mechanische schade wordt geminimaliseerd. Verwijder voorzichtig de alvleesklier van de milt. Ontleed en snijd de alvleesklier onmiddellijk in kleine stukjes (≤5 mm) en dompel deze binnen 5 minuten na euthanasie in een fixatief om autolyse te minimaliseren en de optimale weefselmorfologie te behouden. Inspecteer de milt, let op grootte, kleur, vorm en de aanwezigheid van zichtbare afwijkingen.
  7. Lever: Met fijne pincetten grijp je het centrale bindweefsel tussen de leverkwabben en trek voorzichtig omhoog om spanning te creëren. Met een dissectieschaar snijd zorgvuldig alle aanhechtingen tussen de lever en aangrenzende organen door. Controleer de lever op kleur, consistentie en de aanwezigheid van knobbels of andere afwijkingen.
  8. Visceraal vet: Verzamel monsters van viscerale vetdepots.
    OPMERKING: Jonge dieren hebben doorgaans minimaal visceraal vet, terwijl oudere dieren vaak een verhoogde vetophoping vertonen, vooral rond de darmen, nieren en gonadale gebieden.
  9. Nieren en blaas: Verwijder beide nieren, samen met de aangesloten urineleiders en blaas. Maak voorzichtig de nieren los van het omliggende vetweefsel en bindstructuren met fijne schaar of stompe pincetten. Volg de urineleiders distaal naar de blaas en snijd eventuele resterende aanhechtingen door om de hele urineweg te isoleren. Controleer de nieren en blaas op grootte, kleur en afwijkingen voordat je verder onderzoek doet.
  10. Lymfeklieren: Trek de huid terug van het peritoneum om het liesgebied bloot te leggen. Identificeer de lymfeklieren in het borstvetkussen langs de lymfevaten. Isoleer en verwijder de klieren met fijne pincetten, zodat de verstoring van omringend vet en bindweefsel wordt geminimaliseerd.
  11. Hart: Verwijder het hart voorzichtig door de belangrijkste vaten door te snijden.
  12. Thymus: Verwijder de thymus zorgvuldig om de structuur te behouden. Wees je ervan bewust dat de thymus met de leeftijd involutie ondergaat, en bij oudere muizen kan er slechts minimaal of geen thymisch weefsel aanwezig zijn.
  13. Longen: Met een scherpe schaar en een fijne pincet verwijder je de longen samen met de aanhechtende luchtpijp zorgvuldig in één stuk.
  14. Aorta: Plaats gesloten tang tussen de aorta en de wervelkolom en maak de aorta voorzichtig los, waarbij deze langs het dorsale aspect wordt gescheiden. Zorg ervoor dat je het vat niet scheurt. Verwijder met fijne pincetten voorzichtig het omliggende vet- en bindweefsel van de aorta onder een dissectiemicroscoop.
  15. Skeletspier: Verwijder de huid boven de achterpoten om het dijbeen en de omliggende spieren bloot te leggen. Met een fijne schaar isoleer je zorgvuldig de spieren die aan het dijbeen vastzitten door ze los te maken van het omliggende bindweefsel en de peesinserties door te snijden om de vezelintegriteit te behouden.
  16. Bot (Tibia): Gebruik dissectieschaar, verwijder de bovenliggende huid en spier om het scheenbeen bloot te leggen. Met een dissectieschaar en een stompe pincet maakt u voorzichtig het scheenbeen bij de knie- en enkelgewrichten los. Verwijder eventueel overgebleven zacht weefsel zonder het bot te beschadigen.
  17. Ogen: Met een grote dissectieschaar onthoofd je de muis. Verwijder voorzichtig de ogen met een fijne pincett.
  18. Hersenen: Verwijder de hoofdhuid om de voorste schedel bloot te leggen. Met een scherpe schaar of een scalpel volg je de schedelnaden en til je de botsegmenten weg om de hersenen bloot te leggen (Figuur 1D). Snijd de reukbollen en ventrale bevestigingen door. Haal voorzichtig de hersenen uit de schedelholte. Bewerk het weefsel onmiddellijk om de morfologie te behouden.
  19. Huid: Als haarverwijdering nodig is voor latere toepassingen, verwijder dan haar met een elektrische trimmer. Knijp een deel van de rughuid met een stompe tang, verwijder het met een schaar en verzamel het weefsel voor verdere verwerking.
  20. Na het verwijderen van alle organen van interesse, plaats je het hele muizenkarkas in een 450 mL container die vooraf is gevuld met 4% PFA om onverwachte bevindingen te archiveren of vragen van beoordelaars te beantwoorden die mogelijk terugkeer naar nat gefixeerd weefsel vereisen.

4. Weefselbehoud en verwerking

OPMERKING: Om weefselintegriteit te behouden, minimaliseer de tijd tussen dissectie en conservering. Vertragingen kunnen de weefselmorfologie en moleculaire kwaliteit aantasten; verdere details voor de kritische timing van weefselverzameling en behoud zijn te vinden in Tabel 2.

VOORZICHTIG: Als je paraformaldehyde (PFA) gebruikt voor fixatie, voer dan alle stappen uit in een dampkap om blootstelling aan formaldehydedampen te voorkomen.

  1. Verwerk weefsels direct na de dissectie, waarbij het juiste protocol (stap 4.1, 4.2 of 4.3) wordt geselecteerd volgens de bedoelde downstream-toepassing.
    1. Paraformaldehyde (PFA) fixatie: Plaats weefsels die bedoeld zijn voor histologische analyse in 4% PFA bij 4 °C gedurende 12-24 uur. Na fixatie was je de weefsels grondig met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om de resterende fixatieve middelen te verwijderen, en doe deze vervolgens over naar 70% ethanol voor opslag tot paraffine-inbedding en sectie.
  2. Optimale Snijtemperatuur (OCT) compound-inbedding: Leg verse weefsels in OCT-verbinding. Plaats weefsels in inbeddingsmallen gevuld met OCT-verbinding, waardoor luchtbellen worden geëlimineerd, incubeer 5 minuten op kamertemperatuur en vries dan in de dampfase van vloeibare stikstof. Afdicht met aluminiumfolie en bewaar OCT-blokken op −80 °C tot het snijden.
  3. Snap freezing in vloeibare stikstofdampfase: Snap-freeze weefsels bedoeld voor RNA-, eiwit- of metabolietanalyse in de dampfase van vloeibare stikstof om de vorming van ijskristallen te minimaliseren. Plaats weefsels in gelabelde cryobuizen en hang ze boven vloeibare stikstof voor snelle bevriezing. Zodra volledig bevroren, breng je monsters over naar een opslag van −80 °C.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tijdens de nekropsie vertonen oude muizen vaak neoplastische laesies en moeten ze zorgvuldig onderzoek doen om pathologische bevindingen te documenteren 13,14,16,17,18. Figuur 2A toont een 22 maanden oude mannelijke C57BL/6-muis in rugligging na perfusie. Volledige blanchering van de longen bevestigt een effectieve perfusie, terwijl de lever slechts gedeeltelijk blancheren vertoont. Nadere inspectie van de lever toonde meerdere kwaadaardige knobbels (Figuur 2B), vergezeld van vergrote zaadblaasjes (Figuur 2A) en splenomegalie (Figuur 2C). Deze bevindingen komen vaak voor bij oudere muizen en moeten worden gedocumenteerd als onderdeel van de totale ziektelast18.

Figuur 3 toont macroscopisch normale organen die na dissectie en perfusie zijn verzameld, waardoor de anatomische integriteit en perfusie-efficiëntie kunnen worden beoordeeld. Het maag-darmkanaal werd doorspoeld met een fysiologische oplossing om verteerde inhoud te verwijderen, wat resulteerde in een schone, doorschijnende uitstraling van de maag, dikke darm en dunne darm (Figuur 3A). Aanvullende structuren, waaronder de slokdarm, alvleesklier, milt, viscerale vetdepots, nieren met blaas, lymfeklieren, hart en thymus, waren duidelijk te identificeren en konden intact worden geïsoleerd voor downstream-analyses (Figuur 3B, C, E-I).

De perfusiekwaliteit werd geëvalueerd door blanching te onderzoeken in sterk vasculariste weefsels. Zoals weergegeven in Figuur 3D en Figuur3J, vertoonden de lever en longen duidelijke verschillen tussen niet-doorbloede, goed doorbloede en gedeeltelijk doorbloede aandoeningen. Volledig blancheren bevestigde succesvolle perfusie, terwijl onvolledig blancheren op technische variabiliteit of onderliggende afwijkingen wees. Andere weefsels, waaronder aorta, skeletspier, tibia, hersenen, oog en huid, werden geïsoleerd met bewaard gebleven morfologie, geschikt voor verdere histologische, moleculaire of beeldvormende toepassingen (Figuur 3K-P). Deze gestandaardiseerde dissectieprocedure zorgt voor een consistente terugvinding van intact, goed bewaard gebleven weefsel en organen en maakt grove anatomische beoordeling mogelijk ter ondersteuning van diverse downstream-analyses. Dissectie en orgaanverzameling duurden ongeveer 40-60 minuten per dier, afhankelijk van de ervaring van de operator en de aanwezigheid van pathologische bevindingen.

Figuur 4 toont voorbeeldige verouderingsgerelateerde veranderingen in verzamelde organen na paraffine-inbedding, sectie en hematoxyline- en eosinekleuring (H&E). In huidsecties van oude muizen werden epitelale dunner en verlies van haarzakjes waargenomen in vergelijking met jonge controles (Figuur 4A). Niersecties toonden een vergroting van Bowman-capsules samen met fibrotische en necrotische veranderingen, evenals gebieden die consistent zijn met lymfomen (Figuur 4B). Bij pancreassecties werd een toename van apoptotische lichamen19 en lymfomatische regio's waargenomen bij oudere dieren, wat wijst op een verminderde weefselintegriteit met de leeftijd (Figuur 4C). Miltsecties toonden amyloïde-afzettingen en lymfoomgebieden bij oude dieren, wat extra kenmerken van leeftijdsgerelateerde pathologie weerspiegelt (Figuur 4D).

Deze resultaten benadrukken representatieve histopathologische kenmerken van veroudering over meerdere weefsels en tonen het nut van dit protocol aan om structurele kenmerken van leeftijdsgerelateerde achteruitgang te detecteren.

figure-results-1
Figuur 1: Schematisch overzicht van de muisdissectie en orgaanblootstellingsprocedures. (A) Incisieplaatsen voor het openen van de thoracale en buikholte (rode lijnen), inclusief een dwarsdoorsnijding op het niveau van het middenrif, gevolgd door V-vormige sneden aan beide zijden van de ribbenkast om de thoracale holte te openen, en een middenlijnincisie van het middenrif naar het bekken met bilaterale sneden om de buikholte volledig bloot te leggen. (B) Perfusie-opstelling met het inbrengen van een vlindernaald in de linker ventrikel en incisie van het rechter atrium om effectieve bloedafvoer mogelijk te maken. (C) Anatomische indeling van belangrijke thoracale en buikorganen na blootstelling van de holte. (D) Hoofddissectiestappen, inclusief het verwijderen van de hoofdhuid en het openen van de schedel langs de schedelhechtingen om de hersenen bloot te leggen. Rode lijnen geven de incisieplaatsen aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Identificatie van neoplastische laesies bij oude muizen. (A) Representatieve 22 maanden oude mannelijke C57BL/6 muis in rugligging na perfusie met 4% PFA. Volledige blanchering van de longen (roze pijlpunt) bevestigt effectieve perfusie, terwijl de lever (groene pijlpunt) slechts gedeeltelijke blanchering vertoont. Blauwe pijlpuntjes duiden op vergrote zaadblaasjes. (B) Gedetailleerde weergave van de lever met meerdere kwaadaardige knobbels (zwarte pijlpunten). (C) Vergrote milt van een oude C57BL/6 muis (rechterkant) in vergelijking met een normale milt van een jong dier (linkerkant). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Overzicht van belangrijke muizenorganen en weefselintegriteit na dissectie en perfusie. (A) Maag, dunne darm en dikke darm vóór en na het spoelen met een fysiologische oplossing om verteerde inhoud te verwijderen. (B) Slokdarm. (C) Alvleesklier met aangesloten milt. (D) Lever zonder perfusie, met volledige blanchering na effectieve perfusie, en met gedeeltelijke blanching die wijst op onvolledige perfusie of onderliggende pathologie. (E) Visceraal vetweefsel. (V) Nieren met aangesloten blaas. (G) Inguinale lymfeklieren. (H) Hart. (I) Thymus. (J) Longen zonder perfusie, met volledige blanchering na effectieve perfusie, en met gedeeltelijke blanchering. (K) Aorta. (L) Skeletspier geïsoleerd van het achterpoot. (M) Tibia met bewaard gehouden botstructuur. (N) Brein. (O) Oog. (P) Huid. Schaalbalken: 5 mm in A, C, D, E, F, J, L, N, P; 1 mm in alle andere panelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Histologische analyse van belangrijke organen met behulp van hematoxyline en eosine (H&E) kleuring. (A) Huiddoorsneden van 3 maanden oude (jonge) en 22 maanden oude (oude) muizen. Secties van oudere dieren tonen epitelverdunning en verlies van haarzakjes. (B) Niersecties die Bowmans capsules markeren. Secties van oude dieren tonen capsulevergroting, fibrotische en necrotische veranderingen, en lymfomen (oranje pijlpunten). (C) Alvleeskliersecties van jonge en oudere dieren, waarbij oudere dieren een toename van apoptotische lichamen (blauwe pijlpunten) en lymfoomregio's (oranje pijlpunten) vertonen. (D) Miltsecties van 3 maanden oude (jonge) en 22 maanden oude (oude) muizen. Doorsneden van oude dieren tonen amyloïde-afzettingen (limoengroene pijlpunten) en lymfoomregio's. Schaalbalk (A-C) 100 μm. Schaalbalk (D) 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Voorbereidingschecklist. Een stapsgewijze lijst van essentiële voorbereidingen voor het dissectie en behoud van muisweefsel, waaronder het labelen van buisjes en mallen, buffer- en fixatieve voorbereiding, opzetten voor cryo-inbedding, sterilisatie van dissectiegereedschap, werkplekindeling en documentatieplanning. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Checklist voor weefselverzameling. Gebruik de tabel om verzamelde weefsels te loggen. Voeg verzameltijd en aantekeningen over toestand of afwijkingen toe. Geef prioriteit aan de weefsels die cruciaal zijn voor je studie; Verzamel de meest relevante organen binnen de aanbevolen tijd om autolyse/degradatie van weefsels te voorkomen.*Noteer eventuele afwijkingen (waaronder orgaanverkleuring, knobbels, kwaadaardige groei, abnormale orgaangrootte). **Overweeg de documentatiemethode van behoud (inclusief PFA-fixatie, OCT-inbedding of snap freezing). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol biedt een reproduceerbare strategie voor de systematische verzameling van meerdere orgaansystemen bij jonge en oude muizen, waardoor anatomische, histologische en moleculaire analyses mogelijk zijn. Verschillende technische overwegingen kunnen de kwaliteit van het resultaat beïnvloeden en de beperkingen van de beschreven methode aanpakken. Ten eerste is variabiliteit in perfusiekwaliteit een belangrijke factor om te overwegen. Onvolledige perfusie kan achterblijven in bloed dat de histologie, immunohistochemie en moleculaire analyses aantast. Perfusie na een cervicale ontwrichting kan trauma aan het baarmoederhalsweefsel veroorzaken en leiden tot bloedbesmetting van de longen. Cervicale ontwrichting mag daarom alleen worden uitgevoerd door getraind personeel. Voor optimale resultaten dient de perfusie onder terminale narcose te worden uitgevoerd, zoals elders beschreven20,21 in overeenstemming met de IACUC- en AVMA-richtlijnen13. Ten tweede is fixatie een cruciale factor voor weefselintegriteit. Hoewel 4% paraformaldehyde (PFA) veel wordt gebruikt, kan het onvoldoende doordringen in grote of dichte organen, wat leidt tot slechte histologie en antigeenbehoud. Deze beperking kan worden verzacht door 10% neutrale gebuffreerde formaline (NBF) te gebruiken of weefsels in ≤5 mm secties te snijden om de penetratiete verbeteren. Ten derde ondergaan sommige weefsels, met name de alvleesklier, maag en hersenen, een snelle autolyse, waardoor fixatie of bevriezing binnen 5-10 minuten na euthanasie en het gebruik van voorgekoelde dissectietoolsvereist 23. Bij oudere muizen kan neoplasie de anatomie verder vervormen en de dissectie bemoeilijken. Extra artefacten kunnen ontstaan door onvoldoende fixatievolume of bevriezing, wat leidt tot krimp en randeffecten; deze kunnen worden geminimaliseerd door een fixatie-tot-weefselverhouding van minstens 10:1 te behouden, overbevolking te vermijden en OCT-mallen vooraf af te koelen voordat je inbedding doet. Tot slot brengt het gebruik van PFA en formaline zorgen voor veiligheid en verwijdering met zich mee; Fixatiemiddelen op basis van glyoxal bieden minder giftige alternatieven. Gestandaardiseerde behandeling, geoptimaliseerde fixatie en zorgvuldige timing zijn daarom essentieel voor het maximaliseren van reproduceerbaarheid, weefselkwaliteit en de betrouwbaarheid van downstream analyses24.

Door weefsels te oogsten van meer dan 15 organen binnen hetzelfde dier, maximaliseert deze workflow de biologische opbrengst per proefpersoon en sluit aan bij ethische voorschriften om het gebruik van dieren te verminderen. De systematische procedure kan eenvoudig worden opgeschaald naar medium-throughput studies die leeftijdsgebonden fysiologische achteruitgang en orgaanspecifieke pathologieën onderzoeken25.

Snelle verwerking van autolysegevoelige weefsels is essentieel om de histologische integriteit te behouden. Het gebruik van calcium- en magnesiumvrije fysiologische oplossingen, gevolgd door 4% PFA, behoudt de orgaanarchitectuur betrouwbaar en minimaliseert autolyse in gevoelige weefsels zoals de alvleesklier en het spijsverteringsstelsel. In tegenstelling tot protocollen die zich richten op individuele organen of ziektemodellen, maakt deze aanpak een snelle en consistente verzameling van meerdere organen mogelijk, waardoor variabiliteit wordt verminderd en de doorvoer verbetert. De volledige dissectie, van perfusie tot uiteindelijke weefselverwijdering, kan binnen 60 minuten per dier worden voltooid, waardoor het geschikt is voor grootschalige of tijdgevoelige studies 3,11,26. Naleving van een nauwkeurige perfusie-fixatiesequentie minimaliseert artefacten en maakt reproduceerbare resultaten mogelijk.

Consistentie in weefselverzameling, trimmen en inbedding is essentieel voor een nauwkeurige histopathologische beoordeling, vooral bij longitudinale of multicenterstudies. Variabiliteit in hoe weefsels worden behandeld kan artefacten introduceren, pathologische bevindingen verbergen of leiden tot een verkeerde interpretatie van de ziektelast. De herziene gidsen voor orgaanbemonstering en -trimmen bij ratten en muizen, zoals de RENI-trimgidsen, bieden gedetailleerde, gestandaardiseerde protocollen om dergelijke inconsistenties te minimaliseren22. De toepassing van deze geharmoniseerde methoden verbetert de vergelijkbaarheid van gegevens tussen studies en instellingen, versterkt de reproduceerbaarheid en versterkt de integriteit van pathologie-gebaseerde uitkomsten in ouder worden-onderzoek 4,9.

Het verzamelen van een veelheid aan organen is vooral belangrijk in verouderingsonderzoek, waar begrijpen hoe orgaansystemen samenwerken essentieel is om de processen te ontdekken die de fysiologische achteruitgang van het hele lichaam met de leeftijd aanjagen. Hoewel deze aanpak ook nuttig kan zijn voor diverse andere onderzoeksvragen, ligt de focus van dit protocol op het ondersteunen van verouderingsstudies waarbij leeftijdsgerelateerde veranderingen meerdere orgaansystemen gelijktijdig kunnen beïnvloeden. Het kan echter ook worden toegepast op studies die zich richten op fibrose, regeneratie en senescentie, met name die transcriptomics of multi-tissue biomarker discoveryintegreren 9,27,28.

Histologische beoordelingen toonden karakteristieke leeftijdsgebonden veranderingen aan het licht over meerdere weefsels (Figuur 4). In de huid vertoonden oudere dieren epitelale dunner worden en verlies van haarzakjes. In de nier toonden secties van oude muizen de capsulevergroting van Bowman, samen met fibrotische, necrotische en lymfomatische veranderingen. Alvleesklierweefsel van oudere dieren vertoonde een ophoping van apoptotische lichamen en lymfomen, terwijl miltsecties amyloïde afzettingen en extra lymfoomgebieden aan het licht brachten. Deze waarnemingen zijn consistent met gevestigde fenotypes van muisveroudering en tonen het nut van dit protocol aan voor het detecteren van representatieve histopathologische markers vanveroudering 1,18,19,27,29,30,31,32,33,34.

Samenvattend biedt dit protocol een betrouwbaar, schaalbaar kader voor het verzamelen en behouden van weefsels in preklinische verouderingsmodellen. Het kan zowel in verkennende als hypothesegedreven studies worden toegepast om weefselspecifieke en systemische mechanismen van veroudering, degeneratie en veerkracht te ontdekken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door een Start-Up Grant van de Larry L. Hillblom Foundation, de AFAR and Glenn Foundation for Medical Research Grant voor Junior Faculty, een Junior Investigator Award van de Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation en een Program for Breakthrough Biomedical Research (PBBR) New Frontier Research Award aan Hanna Martens. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Absorbant pad
Aged C57BL/6J muizen The Jackson Laboratory  #000664
Opvangbakken 
Snoerloze TrimmerBravMini+ CLP-41590Voor haarverwijdering
Ethanol Spray 70%Fisher Scientific50-163-3592
Extra Forceps 5 INOXDumontF6521-1EAExtra fijne tip forceps voor lymfeklieren
ForcepsMilliporeSigmaXX6200006PBlunt end forceps
Forceps 5 INOXDumontF6521-1EAFijne tip forceps
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 1x 500 mLGibco14025092
Micro-Dissectie Schaartjes (Recht, Scherp/Scherp, 25mm)Roboz SurgicalRS-5668Standaard micro schaar, roestvrij staal, 25 mm blad (M-37)
Micro-Dissectie Schaartjes (Recht, Scherp/Scherp, Fijne Bladen)Roboz SurgicalRS-5918Fijne dissectieschaart, 4.5" lengte (H-327)
NBFSigma HT501128Voor fixatie
Normale zoutoplossingCytiva76081-514
Optimal Cutting Temperature (OCT)Fisher Scientific23730571
Paraformaldehyde (PFA) 4%Electron Microscopy Sciences15710Voor fixatie
Petri schotels 100 mL x 15 mLMilliporeSigmaP5856-500EA
Phosphate-Buffered Saline (PBS)Gibco10010023
PinsEisco LabsDISPINS1Om de muis tijdens dissectie vast te zetten
Kunststof spuit 20 mL, luer lockFisherBrand302830Voor perfusie
Seal'N Freeze Box (Cryo Container)Ted Pella, Inc.20956
Seal'N Freeze CryotrayTed Pella, Inc.20956-1Voor het positioneren van monsters in de cryo container
Sol-Vet Butterfly Naald met AdapterSol-Millenium Medical110301070003voor perfusie
Styrofoam deksel
Tissue-Tek Cyromold (Biopsie)Sakura25608-922
Jonge C57BL/6J muizenThe Jackson Laboratory  #000664

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lopez-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. Hallmarks of aging: An expanding universe. Cell. 186 (2), 243-278 (2023).
  2. Schafer, M. J., et al. The senescence-associated secretome as an indicator of age and medical risk. JCI Insight. 5 (12), e133668(2020).
  3. Sladitschek-Martens, H. L., et al. Yap/taz activity in stromal cells prevents aging by controlling cGAS-STING. Nature. 607 (7920), 790-798 (2022).
  4. Tabula Muris, C. A single-cell transcriptomic atlas characterizes aging tissues in the mouse. Nature. 583 (7817), 590-595 (2020).
  5. Farooqi, I. S., Xu, Y. Translational potential of mouse models of human metabolic disease. Cell. 187 (16), 4129-4143 (2024).
  6. Marttala, J., Andrews, J. P., Rosenbloom, J., Uitto, J. Keloids: Animal models and pathologic equivalents to study tissue fibrosis. Matrix Biol. 51, 47-54 (2016).
  7. Yuan, R., Peters, L. L., Paigen, B. Mice as a mammalian model for research on the genetics of aging. ILAR J. 52 (1), 4-15 (2011).
  8. Wang, Q., et al. The mouse multi-organ proteome from infancy to adulthood. Nat Commun. 15 (1), 5752(2024).
  9. Zhuang, J., et al. Comparison of multi-tissue aging between human and mouse. Sci Rep. 9 (1), 6220(2019).
  10. Basisty, N., et al. A proteomic atlas of senescence-associated secretomes for aging biomarker development. PLoS Biol. 18 (1), e3000599(2020).
  11. Wu, C., et al. Spatially resolved transcriptome of the aging mouse brain. Aging Cell. 23 (5), e14109(2024).
  12. Yousefzadeh, M. J., et al. Tissue specificity of senescent cell accumulation during physiologic and accelerated aging of mice. Aging Cell. 19 (3), e13094(2020).
  13. Treuting, P. M., Snyder, J. M. Mouse necropsy. Curr Protoc Mouse Biol. 5 (3), 223-233 (2015).
  14. Antal, C., et al. Tissue collection for systematic phenotyping in the mouse. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 29 (Unit 29A), 24(2007).
  15. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Mouse tissue fixation. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), pdb.prot073403(2014).
  16. Brayton, C., Justice, M., Montgomery, C. A. Evaluating mutant mice: Anatomic pathology. Vet Pathol. 38 (1), 1-19 (2001).
  17. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Limited mouse necropsy. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), pdb.prot073395(2014).
  18. Pettan-Brewer, C., Treuting, P. M. Practical pathology of aging mice. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 1, (2011).
  19. Xiong, Y., et al. Arginase-II promotes tumor necrosis factor-alpha release from pancreatic acinar cells causing beta-cell apoptosis in aging. Diabetes. 66 (6), 1636-1649 (2017).
  20. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65, e3564(2012).
  21. Navarro, K. L., et al. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR J. 62 (1-2), 238-273 (2021).
  22. Morawietz, G., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 3. A joint publication of the Rita and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55 (6), 433-449 (2004).
  23. Zhao, H., et al. Identifying specific functional roles for senescence across cell types. Cell. 187 (25), 7314-7334 (2024).
  24. Aversa, Z., et al. Biomarkers of cellular senescence in idiopathic pulmonary fibrosis. Respir Res. 24 (1), 101(2023).
  25. Aghali, A., Koloko Ngassie, M. L., Pabelick, C. M., Prakash, Y. S. Cellular senescence in aging lungs and diseases. Cells. 11 (11), 1781(2022).
  26. Travaglini, K. J., et al. A molecular cell atlas of the human lung from single-cell RNA sequencing. Nature. 587 (7835), 619-625 (2020).
  27. Chen, S., et al. Integration of spatial and single-cell data across modalities with weakly linked features. Nat Biotechnol. 42 (7), 1096-1106 (2024).
  28. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).
  29. Hoj, K., et al. Age-related decline in pancreas regeneration is associated with an increased proinflammatory response to injury. Gastro Hep Adv. 3 (7), 973-985 (2024).
  30. Roeder, S. S., et al. Changes in glomerular parietal epithelial cells in mouse kidneys with advanced age. Am J Physiol Renal Physiol. 309 (2), F164-F178 (2015).
  31. Russell-Goldman, E., Murphy, G. F. The pathobiology of skin aging: New insights into an old dilemma. Am J Pathol. 190 (7), 1356-1369 (2020).
  32. Sparks, J., et al. Presence of systemic amyloidosis in mice with partial deficiency in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) in aging. App Sci. 11 (16), 7373(2021).
  33. Sun, P., Juskevicius, R. Histological and immunohistochemical features of the spleen in persistent polyclonal B-cell lymphocytosis closely mimic splenic B-cell lymphoma. Diagn Pathol. 7, 107(2012).
  34. Vannan, A., et al. Spatial transcriptomics identifies molecular niche dysregulation associated with distal lung remodeling in pulmonary fibrosis. Nat Genet. 57 (3), 647-658 (2025).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Verouderingsmodellen bij muizenhistologische analysemoleculaire analyseanatomische dissectiemorfologische veranderingenweefselwinningmicroscopische evaluatiestudies naar veroudering bij dierenethisch gebruik van dieren

Gerelateerde artikelen