Geoptimaliseerde analyse van eiwitten uit xenopus-eicellen en embryo's door immunoblotting

Samenvatting

Dit artikel beschrijft een protocol voor het analyseren van eiwitten uit Xenopus-eicellen en embryo's door middel van immunoblotting. Verzamelingsstappen worden beschreven, gevolgd door stappen die overeenkomen met monsterverwerking, SDS-PAGE, overdracht, antilichaamkleuring en beeldvorming. Het protocol legt de nadruk op het bestuderen van translationele regulerende eiwitcomplexen met endogene antilichamen en antilichamen tegen eiwitaffiniteitslabels.

Samenvatting

Analyse van eiwitten door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) gevolgd door immunoblotting (western blotting) is een essentieel onderdeel van de toolkit van de moleculair bioloog. Deze techniek scheidt een complex eiwitmengsel op molecuulgewicht en test vervolgens de aanwezigheid van doeleiwitten met behulp van specifieke antilichamen. Immunoblotting heeft een verscheidenheid aan toepassingen. Voorbeelden hiervan zijn gebruik als een gerichte benadering om eiwit-eiwitinteractoren te bestuderen of als een controle om expressie of uitputting van eiwitdoelen te bevestigen. De succesvolle uitvoering van immunoblotting vereist echter gecompliceerde experimenten in meerdere stappen. Protocollen moeten worden geoptimaliseerd voor elk organisme, doeleiwit en toepassing. Daarom bestaan er kennislacunes voor het gebruik van immunoblots in veel modellen, waaronder de modelkikker Xenopus laevis.

Vanwege hun grote omvang, overvloedig materiaal voor biochemische experimenten en gemakkelijke hantering, zijn X. laevis eicellen en embryo's van vitaal belang geweest voor het bestuderen van principes van translationele controle. Deze soort mist echter specifieke protocollen voor robuuste en routinematige immunoblotting. Hier bieden we een diepgaand protocol voor western blotting, geoptimaliseerd voor samples uit meerdere Xenopus-ontwikkelingsstadia . Vervolgens analyseren we translationele regulatoren in de ontwikkeling.

Inleiding

Om cellulaire mechanismen te begrijpen, moeten specifieke eiwitsoorten worden gemonitord. Veel voorkomende vragen zijn onder meer hoe ze ruimtelijk en tijdelijk in expressie veranderen, met welke eiwitten ze interageren en of ze worden gemodificeerd als reactie op verschillende omstandigheden. Immunoblotting, in de volksmond bekend als 'Western blotting', is een belangrijke methodologie om deze uitdagingen aan te gaan. Een immunoblot-experiment scheidt eiwitten van een complex monster - bijvoorbeeld lysaat van hele cellen - en identificeert ze met behulp van antilichamen. In het bijzonder worden eiwitten gedenatureerd en vervolgens gescheiden door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) op grootte. De gefractioneerde eiwitten worden overgebracht naar een vaste drager, zoals een nitrocellulosemembraan, en het eiwit van belang wordt geïdentificeerd met behulp van antilichaamreagentia. Immunoblotting is een standaard onderdeel geworden van de toolkit van de moleculair bioloog. Het wordt vaak gebruikt voor het monitoren van eiwitexpressie in verschillende contexten of als eindpunt voor experimenten zoals immunoprecipitatietesten. Ondanks deze voordelen blijkt analyse van steady-state eiwitniveaus met immunoblotting een uitdaging, aangezien de test voor elke stap en experimentele context moet worden geoptimaliseerd (Figuur 1).

Een uitdagende context is het analyseren van materiaal van de Afrikaanse klauwkikker Xenopus laevis. X. laevis is een belangrijk organisme voor het bestuderen van RNA-eiwitinteracties. Dit systeem heeft tal van voordelen, waarvan de belangrijkste is dat X. laevis honderden eicellen produceert en vervolgens synchroon embryo's ontwikkelt. Elke eicel heeft ~25 μg niet-dooiereiwit¹, wat overvloedig materiaal levert voor biochemische experimenten. De grote omvang (~1250 μm)¹ van eicellen en embryo's vergemakkelijkt ook mRNA-micro-injectie om gelabelde of gemuteerde eiwitten exogeen tot expressie te brengen op schaal². Deze eigenschappen maken krachtige experimenten mogelijk om translationele controle te testen in X. laevis, zoals de tethered function assay, waarbij de impact van een translationeel regulerend eiwit op een mRNA kan worden getest, ongeacht het vermogen van dat eiwit om RNA te binden ^3,4,5,6. Immunoblotting in Xenopus-eicellen en -embryo's gaat echter gepaard met moeilijkheden, waaronder interferentie van grote massa's dooierbloedplaatjes in deze vroege cellen⁷, die de resultaten zullen verdoezelen als ze niet worden verwijderd.

Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor effectieve immunoblotting in X. laevis, met de nadruk op het detecteren van translationele regulerende eiwitten. We geven instructies voor het verzamelen en verwerken van eicellen en embryo's tot het in beeld brengen van de uiteindelijke immunoblot. Ook inbegrepen zijn gedetailleerde instructies voor het optimaal laden en visualiseren van eiwitten, evenals het voorkomen van dooierbesmetting van het monster. Daarnaast bespreken we mogelijke protocolaanpassingen en strategieën om antilichamen te vinden die compatibel zijn met Xenopus-eiwitten . We zijn van plan onderzoekers begeleiding te bieden om moeiteloos immunoblotting uit te voeren als onderdeel van hun eigen experimenten in dit onderbenutte modelorganisme.

Figuur 1: Workflow voor de voorbereiding van Xenopus-monsters en de daaropvolgende immunoblotanalyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

Al het werk met dieren (X. laevis) die in dit protocol worden weergegeven, is in overeenstemming met en is goedgekeurd door de UW-Madison Institutional Animal Care and Use Committee. Details van de gebruikte apparatuur, gebruikte reagentia en gebruikte antilichaamconcentraties staan vermeld in de materiaaltabel. Een selectie van de apparatuur kan worden bekeken in figuur 2 hieronder.

Figuur 2: Verwerkt embryo-extract en apparatuur voor immunoblotting. (A) Gecentrifugeerd X. laevis stadium VI eicelextract. Lipiden en in vet oplosbare eiwitten stijgen naar boven, terwijl vitellogenine (dooier) en gepigmenteerd puin een pellet vormen. (B) Apparatuur voor SDS-PAGE om eiwitten te scheiden op molecuulgewicht. (i) Voeding, (ii) Verticale elektroforesetank, (iii) Deksel van de elektroforesetank, (iv) Elektrodeassemblage, (v) Bufferdam, (vi) Geprefabriceerde elektroforesegel; Let op de groene kam (boven) en blauwe sticker (onder), die elk moeten worden verwijderd. (C) Apparatuur voor membraanoverdracht. De verticale elektroforesetank en het deksel worden na een grondige spoeling hergebruikt voor overdracht. (i) Rol om luchtbellen te verwijderen, (ii) Transferclip, (iii) Kleine roerstaaf, (iv) Nitrocellulosemembraan tussen twee beschermende blauwe vellen papier, (v) Cellulosechromatografiefilterpapier, (vi) Transfersponskussens, (vii) Glazen ovenschaal voor transferassemblage, (viii) IJspak, (ix) Transferkern. (D) Andere apparatuur. (i) Gellosser (voor het trimmen van gelwellen vóór de overdracht), (ii) Hefboom voor het openen van de gelcassette, (iii) Pincet (voor het hanteren van membraan), (iv) Container (voor het vasthouden van membraan), (v) Deksel van de container. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Verzameling van Xenopus-eicellen en -embryo's

1. Bereiding van de eicel
   1. Verkrijg gedefolliculeerde X. laevis-eicellen bij een commerciële leverancier (Ecocyte Bio Science, Austin, Texas) of isoleer en defolliculeer zoals beschreven⁸.
   2. Kweek geïsoleerde eicellen in gemodificeerde Barth's oplossing (MBS; 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,4 mM CaCl₂, 0,33 mM Ca(NO₃)₂, 0,8 mM MgSO₄, 5 mM Tris-HCl, 2,4 mM NaHCO₃, pH 7,4) tot gebruik.
2. Embryo voorbereiding
   1. Isoleer X. laevis eieren en bevrucht ze zoals beschreven ^9,10.
   2. Kweek bevruchte embryo's in 0,25x Marc's Modified Ringer's solution¹¹ (MMR) (1x MMR: 0,1 M NaCl, 2,0 mM KCl, 1 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 5 mM HEPES).
   3. Bereid een oplossing van 2% cysteïne in 0,1x MMR met de pH aangepast naar 8,2 met behulp van NaOH.
   4. Verwijder 0,25x MMR uit de schaal die voor de bevruchting is gebruikt en bedek de embryo's met de cysteïneoplossing om de geleilaag¹² te verwijderen. Meng de oplossing voorzichtig zodat de embryo's gelijkmatig worden blootgesteld.
   5. Houd embryo's nauwlettend in de gaten met een stereomicroscoop van 2x tot 25x vergroting. Nadat de geleilaag is opgelost (meestal 3-5 minuten), zullen de embryo's dicht bij elkaar pakken. Vermijd langdurige blootstelling aan cysteïne.
   6. Verwijder de cysteïneoplossing en spoel de embryo's meerdere keren met 0,25x MMR.
   7. Kweek in 0,25x MMR tot het gewenste groeistadium.
3. Verzamel het gewenste aantal embryo's of eicellen (aanbevolen ten minste vijf per monster) in een buisje van 1,5 ml.
4. Verwijder overtollige media met een pipettor, om beschadiging van de cellen te voorkomen.
5. Gebruik monsters direct of bewaar bij -80 °C tot gebruik. Eicellen en embryo's kunnen meerdere jaren worden bewaard.

2. Bereiding van Xenopus-extract

1. Ontdooi monsters op ijs als ze bevroren zijn.
2. Voeg 10 μL gekoelde 10x cellysisbuffer verdund tot 1x toe met dubbel gedeïoniseerd water (zie Materiaaltabel) per embryo/eicel en homogeniseer monsters met een microstamper op ijs.
3. Draai de monsters bij 5000 g bij 4 °C in een tafelcentrifuge gedurende 10 minuten tot pellets, met inbegrip van dooier en onoplosbare pigmenten.
4. Verwijder het bovenstaande in een aparte buis van 1,5 ml en zorg ervoor dat de pellet wordt vermeden (Figuur 2A).
5. Voeg een gelijk volume 2x Laemmli monsterbuffer aangevuld met 5% m/v 2-mercaptoethanol toe aan het bovenstaande en kook gedurende 10 minuten bij 95-100 °C om de monstereiwitten te denatureren.
6. Gebruik monsters onmiddellijk of bewaar ze maanden tot jaren bij -20 °C.

3. SDS-PAGINA

1. Bereid SDS-loopbuffer voor: 1x Tris-MOPS-SDS-buffer (6,06 g Tris-basis, 10,46 g 3- (N-morfolino)propaansulfonzuur [MOPS], 1,0 g SDS, 0,3 g ethyleendiaminetetra-azijnzuur [EDTA], dubbel gedeïoniseerd water tot 1000 ml).
2. Haal een 4-12% bis-tris SDS precast gel uit de verpakking. Verwijder de sticker aan de onderkant van de gel.
3. Steek de gel in de elektrodeconstructie tegenover een bufferdam. Plaats de elektrodeconstructie in de verticale elektroforesetank (Figuur 2B).
4. Vul de elektrode-eenheid en de bodem van de elektroforesetank met 1x Tris-MOPS-SDS loopbuffer.
5. Verwijder voorzichtig de gelkam van de gel en de pipet die buffer in de putjes laat lopen om luchtbellen te verwijderen en de buffer in evenwicht te brengen.
6. Doe voorzichtig 5 μL voorgekleurde eiwitstandaarden in het eerste putje en 10 μL van elk monster in de extra putjes.
7. (OPTIONEEL) Laad de resterende putjes met 10 μL 1x Laemmli-monsterbuffer om de gel gelijkmatiger te laten lopen.
8. Plaats het deksel op de elektroforesetank en sluit deze aan op een stroomvoorziening. Breng 200 V aan.
9. Stop de elektroforese wanneer het front van de bufferkleurstof van het monster de gel verlaat.

4. Natte overdracht van eiwitten op een membraan

1. Terwijl de monsters worden geëlektroforeerd, bereidt u 1 L overdrachtsbuffer voor (3,0 g Tris Base, 4,08 g bicine, 900 ml dubbel gedeïoniseerd water, 100 ml methanol). Koel de overdrachtsbuffer voor bij 4 °C.
   LET OP: Behandel geconcentreerde methanolvoorraden in een zuurkast en vermijd contact met de huid. Methanol kan worden vervangen door ethanol.
2. Voordat de elektroforese is voltooid, begint u met het monteren van de overdracht "sandwich" in de overdrachtsclip (Figuur 2C).
   1. Vul een glazen ovenschaal met gekoelde transferbuffer. Zorg er bij de volgende assemblagestappen van de sandwich voor dat materialen in deze buffer zijn ondergedompeld.
   2. Plaats de transferclip in de schaal met de zwarte helft tegen de bodem van de schaal, de witte helft open en naar boven gericht, en de transferclip open naar links.
   3. Leg een of twee vezelsponzen plat op de zwarte helft van de transferclip.
   4. Knip twee cellulosechromatografiepapiertjes van 0,35 mm (filterpapier) op maat en leg er een op de sponzen.
3. Nadat de elektroforese is voltooid, verwijdert u de gel uit de elektroforesetank.
4. Wrik de platen van de gel voorzichtig uit elkaar met de openingshendel van de gelcassette en zorg ervoor dat de gel aan een van de platen blijft zitten (Figuur 2D). Snijd de putjes vanaf de bovenkant van de gel af met de gel releaser.
5. Plaats de gel, die nog aan de ene helft van de plastic cassette vastzit, op het filterpapier. Verwijder de cassettehelft zodat de gel op het filterpapier blijft liggen.
6. Snijd een vierkant van 0,45 μm nitrocellulosemembraan om in de afmetingen van de gel te passen. Verwijder het membraan van het beschermpapier, maak het kort nat in de transferbuffer en plaats het op de gel.
   OPMERKING: Pak het membraan voorzichtig bij de hoeken vast met handschoenen of een tang om ongewenste eiwitbesmetting van het membraan te voorkomen.
7. Plaats een tweede filtreerpapier op het nitrocellulosemembraan. Verwijder eventuele luchtbellen voorzichtig maar stevig met behulp van een roller op het filterpapier.
8. Stapel nog een tot twee vezelsponzen op het filterpapier.
9. Sluit de transfercassette en klem deze stevig dicht, zodat de 'sandwich' compleet is.
10. Steek de transfersandwich in de transferkern met de transferclip naar boven gericht en de zwarte kant van de transferclip naar de zwarte kant van de kern.
11. Plaats de overdrachtskern in de elektroforesetank. Voeg een ijspak en een roerstaaf toe aan de tank zodat de roerstaaf vrij kan draaien.
    OPMERKING: Naast of in plaats van een koelpak kan de overdracht worden uitgevoerd in een koelruimte bij 4 °C in stap 4.13.
12. Vul de tank met gekoelde overdrachtsbuffer. Zet het deksel stevig vast aan de bovenkant.
13. Sluit het overdrachtsapparaat aan op de voeding en zorg ervoor dat de elektrodekleuren op elkaar zijn afgestemd. Laat de overdracht 1 uur draaien, 100 V, bij 4 °C, met draaiende roerstaaf.

5. Membraanverwerking na overdracht

1. Bereid 10x Tris-gebufferde zoutoplossing voor (100 mM Tris-basis; 1,5 M NaCl). Stel de pH in op 8 en steriliseer met filter.
2. Bereid 1x Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween-20 (TBSTw) door 10x TBS-oplossing 1:10 te verdunnen in 500 ml dubbel gedeïoniseerd water en 500 μL Tween-20 toe te voegen.
3. Bereid blokkeerbuffer voor (500 ml TBSTw, 25 g magere melkpoeder).
   OPMERKING: Magere melk kan worden vervangen door 2-5% runderserumalbumine (BSA) in de blokkeerbuffer. BSA moet worden gebruikt als de experimentele toepassing bestaat uit het visualiseren van gebiotinyleerde eiwitten, aangezien melk biotine bevat.
4. Zodra de overdracht is voltooid, verwijdert en demonteert u de sandwich voorzichtig en verwijdert u het nitrocellulosemembraan. Markeer aan welke kant van het membraan in contact kwam met de gel en houd deze kant in de volgende stappen naar boven.
5. Bereid 50 ml Ponceau-kleuring (0,5% Ponceau S, 1% azijnzuur), een omkeerbare kleuring voor eiwitvisualisatie.
   LET OP: Ponceau vlek is bijtend. Vermijd contact met de huid.
6. Plaats het membraan in een kleine container (zoals weergegeven in afbeelding 2D) zodat deze gelijk tegen de bodem van de container ligt. Bedek het membraan met Ponceau-beits tot onderdompeling en schud voorzichtig op een wip gedurende 5-10 minuten.
7. Giet de Ponceau-vlek eraf.
   LET OP: Ponceau beits kan meerdere keren worden hergebruikt.
8. Spoel het membraan herhaaldelijk af met dubbel gedeïoniseerd water totdat overtollig Ponceau is verwijderd en de eiwitbanden in de banen beginnen op te lossen.
9. Bevestig de efficiëntie van de overdracht door de aanwezigheid van rechte, gelijkmatige rijstroken met duidelijk opgeloste banden.
10. Giet de resterende vloeistof weg en dompel de vlek onder in een blokkeerbuffer om te voorkomen dat niet-specifieke antilichamen zich in stroomafwaartse stappen aan het membraan binden.
11. Schommel zachtjes op een wip gedurende 30-60 minuten op kamertemperatuur.

6. Incubatie van antilichamen

1. Verdun het primaire antilichaam in 10 ml verse blokkeerbuffer tot de gewenste concentratie.
   OPMERKING: De optimale concentratie zal empirisch moeten worden bepaald voor elk nieuw antilichaam. Een typisch uitgangspunt is 1:1000, of volg de aanbevelingen van de fabrikant.
2. Verwijder de blokkeerbuffer en vervang deze door het antilichaammengsel. Incubeer, wiegend zachtjes, een nacht (~16 uur) bij 4 °C.
3. Giet de primaire antilichaamoplossing af en spoel het membraan met TBSTw door het onder te dompelen in de oplossing en snel af te gieten.
   OPMERKING: De meeste antilichaammengsels kunnen twee tot drie keer worden bewaard en hergebruikt. Dit moet voor elk antilichaam empirisch worden bepaald.
4. Was het membraan door het onder te dompelen in TBSTw en 5 minuten zachtjes op kamertemperatuur te schommelen. Voer in totaal drie wasbeurten van 5 minuten uit.
5. Verdun het secundaire antilichaam in 30 ml TBSTw tot de gewenste concentratie.
   OPMERKING: De concentratie moet voor elk antilichaam empirisch worden bepaald. We gebruiken meestal 1:30.000.
6. Giet de TBSTw-wasoplossing af en vervang deze door het secundaire antilichaammengsel. Incubeer, zachtjes wiegend, gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
7. Spoel het membraan één keer snel uit met TBSTw, gevolgd door drie TBSTw-wasbeurten van 5 minuten.

7. Beeldvorming van het membraan op een filmontwikkelaar

1. Zet in een donkere kamer de filmontwikkelaar aan en laat hem opwarmen.
2. Knip twee vierkanten plasticfolie af die groot genoeg zijn om het membraan te omvatten. Plaats met een tang het nitrocellulosemembraan 'met de bedrukte kant naar boven' op het eerste vierkant plasticfolie.
3. Meng in een buisje van 1,5 ml gelijke hoeveelheden van de verbeterde chemoluminescentie (ECL) Luminol- en Enhancer-reagentia. Het gebruik van 1 ml van de gemengde oplossing zou de meeste membranen moeten bedekken.
4. Pipetteer het ECL-reagens op het membraan en manipuleer het membraan voorzichtig met behulp van de plasticfolie om volledige dekking te garanderen. Incubeer gedurende 1 min.
5. Verwijder overtollig ECL-reagens door het membraan met een tang vast te pakken en de vloeistof voorzichtig af te schudden of de vloeistof af te voeren door een hoek van het membraan tegen een papieren handdoek te tikken.
6. Plaats het membraan met de bedrukte zijde naar boven op het tweede vierkant plasticfolie en vouw de plasticfolie over het membraan totdat deze losjes is afgesloten. Plak het verpakte membraan stevig vast in een autoradiografiecassette.
7. Plaats in de donkere kamer een film in de cassette die het afgeplakte membraan bedekt. Sluit de cassette goed af en stel de film 1 minuut bloot aan het membraan.
8. Verwijder de film voorzichtig en zorg ervoor dat de belichte film niet langs het membraan wordt gesleept. Voer het in bij de filmontwikkelaar.
9. Pas na evaluatie van de ontwikkelde film de belichtingstijd aan met volgende films totdat de gewenste eiwitvisualisatie is bereikt. Als de eiwitvisualisatie een zwak signaal geeft, herhaalt u de incubatiestap van het ECL-reagens met een gevoeliger ECL-reagens en maakt u het beeld opnieuw.
10. Lijn de ontwikkelde film uit met de glow-in-the-dark-markeringen en gebruik deze referentie om de positie van de voorgekleurde eiwitstandaarden op het membraan op de film te markeren.
11. Zodra de beeldvorming is voltooid, verwijdert u voorzichtig het membraan van de plasticfolie en dompelt u het onder in TBSTw om het resterende ECL-reagens weg te spoelen.

8. (Optioneel) Extra antilichaamincubaties

OPMERKING: Het strippen van een immunoblot verwijst naar het verwijderen van de initiële primaire en secundaire antilichamen met een denatureringsoplossing (stripbuffer), zodat de blot opnieuw kan worden onderzocht met een ander antilichaam. Met hersondering kan dezelfde immunoblot worden geanalyseerd op expressie van verschillende eiwitdoelen en kunnen onbekende eiwitten worden vergeleken met goed gekarakteriseerde eiwitten die als standaard functioneren. Sonde met het antilichaam dat als eerste het relatief zwakste signaal produceert. Dit voorkomt artefacten veroorzaakt door onvolledig gestripte antilichamen bij latere blootstellingen en minimaliseert de impact van eiwitverlies door herhaaldelijk strippen van een vlek.

1. Strip de gebonden antilichamen door het membraan onder te dompelen in een stripbuffer en 5-10 minuten zachtjes te schommelen.
2. Verwijder het membraan van de stripbuffer en spoel kort in TBSTw om eventuele resterende stripoplossing te verwijderen.
3. Dompel het membraan onder in een blokkeerbuffer en steen voorzichtig gedurende 30 minuten.
4. Maak een nieuwe oplossing van primair antilichaam in blokkeerbuffer met de gewenste concentratie.
5. Voeg de nieuwe verdunning van primaire antilichamen toe aan het membraan en incubeer zachtjes schommelend een nacht bij 4 °C.
6. Ga verder vanaf stap 6.3. Het membraan kan nog drie keer worden gestript en opnieuw worden onderzocht.

Resultaten

Om de efficiëntie van ons immunoblotting-protocol aan te tonen, analyseerden we affiniteitsgelabelde en endogene translationele controle-eiwitten in drie soorten X. laevis-monsters: stadium VI-eicellen, stadium 7-embryo's (blastula) en stadium 10,5-embryo's (gastrula). Deze fasen zijn gekozen omdat ze de mid-blastula-overgang overspannen (fase 8.5), die het begin markeert van robuuste zygote transcriptie^13,14. Omdat ontwikkeling voorafgaand aan de mid-blastula-overgang plaatsvindt in afwezigheid van transcriptie, zijn prezygote (d.w.z. maternale gecontroleerde) embryo's sterk afhankelijk van translationele controlemechanismen om cellot-eiwitten tot expressie te brengen met de juiste temporele en ruimtelijke resolutie¹⁵. Daarom is de mid-blastula-overgang een vitale context om RNA-eiwitinteracties te bestuderen.

Om eiwitexpressie via immunoblotting te analyseren, werden X. laevis-eicellen en -embryo's geïnjecteerd met 500 pg mRNA dat codeert voor de C-terminale helft van X. laevis Bicaudal-C (Bicc1) gefuseerd met 3x hemagglutinine (HA) affiniteitslabels. We hebben ervoor gekozen om Bicc1 te analyseren vanwege de relevantie ervan voor Xenopus-biologie en eiwit-RNA-interacties. Bicc1 is een mRNA-bindend eiwit en translationele repressor die beslissingen over het lot van cellen in het vroege embryo^begeleidt 16,17,18. Later in de ontwikkeling heeft het invloed op links-rechtspatronen 19,20,21 en de functie van organen, inclusief de nieren 22,23,24,25. Bicc1 bevat een regio die translationele repressie⁵ en hnRNP K homologie (KH) domeinen aanstuurt die binding aan specifieke mRNA's bemiddelen 5,26,27,28.

Er werden extracten bereid van vijf met HA-Bicc1 geïnjecteerde eicellen of embryo's, samen met de bijbehorende niet-geïnjecteerde monsters als negatieve controles. Een tiende van elk extract werd geëlektroforeerd op een bis-tris-gel met een gradiënt van 4-12% en nat overgebracht op een nitrocellulosemembraan. Ponceau-kleuring van het membraan om het totale eiwit te detecteren, bevestigde succesvolle overdracht (Figuur 3A). Als onderdeel van onze studies hebben we een antilichaam bij konijnen gegenereerd dat de C-terminale helft van het menselijke Bicc1-eiwit herkent. Dit antilichaam werd gebruikt om endogeen en exogeen Xl-Bicc1-eiwit te detecteren (Figuur 3B). Eerder werk toonde aan dat Bicc1-eiwit afwezig is in X. laevis-eicellen , maar tot expressie wordt gebracht in pre-MBT-embryo's, voordat het zygote genoom actief is¹⁶. Dit suggereert dat hoewel Bicc1-mRNA zich ophoopt tijdens de oögenese, het translationeel wordt onderdrukt. In overeenstemming met dit eerdere werk werd endogeen Bicc1 niet gedetecteerd in eicellen. Daarentegen herkende het antilichaam endogeen Bicc1 (~MW 107 kDa) in zowel stadium 7 als 10,5 embryo's. Samen bevestigen deze resultaten dat het antilichaam het endogene Bicc1-eiwit herkent (Figuur 3B, bovenpaneel, rode pijlpunt). Het Bicc1-antilichaam herkende een kleiner eiwit van ongeveer 70 kDa in extracten bereid uit met mRNA geïnjecteerde monsters (Figuur 3B, bovenpaneel, zwarte pijlpunt, vergelijk banen 2, 4 en 6 met banen 1, 3 en 5). Als controle voor de specificiteit van het Bicc1-antilichaam werd het membraan gestript en opnieuw onderzocht met een antilichaam tegen het HA-affiniteitslabel. Het HA-antilichaam identificeerde het 70 kDa-eiwit in de geïnjecteerde monsters, maar herkende het endogene Bicc1 niet (Figuur 3B, tweede paneel, zwarte pijlpunt). Detectie van de HA-Bicc1 C-term varieert in intensiteit tussen stadia als gevolg van verschillen in eiwitexpressie van geïnjecteerd mRNA in de verschillende celtypen.

Vervolgens hebben we de resultaten uitgebreid door de expressie te testen van endogene translationele regulerende eiwitten die interageren met Bicc1. Eerst analyseerden we de expressie van Ccr4-Not Transcription Complex Subunit 1 (Cnot1), een groot steigereiwit en onderdeel van het Ccr4-Not deadenylase (CNOT) complex. Het multi-subeenheid CNOT-complex is een van de belangrijkste eukaryote deadenylasen en is vooral bekend voor het trimmen van de poly(A)-staart aan het einde van boodschapper-mRNA's als opmaat naar hun degradatie. Dit complex heeft echter verschillende rollen in translationele controle die verder reiken dan deadenylatie²⁹. We waren geïnteresseerd in het analyseren van Cnot1-expressie vanwege het belang van het CNOT-complex voor mRNA-regulatie en eerdere waarnemingen dat Cnot1 interageert met Bicc1^20,30. Om de expressie van Cnot1 te analyseren, gebruikten we een antilichaam dat het endogene Cnot1-eiwit herkent. Het identificeerde twee eiwitten van 250 kDa en 270 kDa in elk monster, de voorspelde grootte van Cnot1 (Figuur 3B, derde paneel). Dit protocol stelt ons dus in staat om gemakkelijk een cruciaal onderdeel van een regelgevingscomplex te identificeren. Bovendien ondersteunen deze gegevens het vermogen van het protocol om eiwitten met een hoog molecuulgewicht met succes te identificeren.

Om de generaliseerbaarheid van deze resultaten verder te testen, analyseerden we vervolgens monsters op de aanwezigheid van een prominente DEAD-box helicase die betrokken is bij translationele repressie, DEAD-box helicase 6 (Ddx6, voorheen bekend als xp54 in Xenopus en me31b in Drosophila). Ddx6 is een belangrijk onderdeel van ribonucleoproteïnekorrels, is betrokken bij mRNA-opslag en interageert met Bicc1 en Cnot1 ^6,31,32. Een antilichaam dat het endogene Ddx6 herkent, identificeerde een eiwit van ongeveer 54 kDa in elk monster (Figuur 3B, vierde paneel). De expressie was verminderd in zygote embryo's (Figuur 3B, vergelijk banen 5 en 6 met 1-4), zoals eerder gerapporteerd³³.

Ten slotte, om er zeker van te zijn dat de verschillen die we tussen de monsters waarnamen, te wijten waren aan verschillen in expressie, hebben we de immunoblot gestript en opnieuw onderzocht met een antilichaam dat het enzym glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase (Gapdh) herkent. Gapdh dient als een alomtegenwoordig uitgedrukte 'laadcontrole'. Equivalente niveaus van Gapdh-expressie bevestigen de Ponceau-kleuring: een gelijke hoeveelheid totaal eiwit wordt geanalyseerd over de monsters (Figuur 3B, vijfde paneel).

Samen bevestigen deze resultaten de werkzaamheid van deze immunoblot-methode. We waren in staat om exogene en endogene Bicc1 te identificeren in meerdere X. laevis ontwikkelingsstadia die relevant zijn voor de studie van RNA-eiwitinteracties: eicellen en pre-MBT-embryo's, die alleen door de moeder gedeponeerde mRNA's bevatten, en post-MBT-embryo's, die ook zygotisch getranscribeerde mRNA's bevatten. We waren in staat om deze resultaten te generaliseren door de expressie van meerdere translationele controle-eiwitten te analyseren met een verscheidenheid aan molecuulgewichten (Bicc1, Cnot1 en Ddx6) en een belastingscontrole (Gapdh). We laten ook zien dat dit protocol kan worden gebruikt voor X. tropicalis-embryo's met modificatie om de hoeveelheid materiaal te vergroten die wordt gebruikt om rekening te houden met hun kleinere formaat (aanvullende figuur 1).

Figuur 3: Identificatie van niveaus van translationele regulerende eiwitten door middel van immunoblotting in X. laevis. (A) Ponceau-kleuring van de immunoblot om het totale eiwit van X. laevis stadium VI eicellen, stadium 7 embryo's en stadium 10,5 embryo's te identificeren. Elke baan vertegenwoordigt 10% van het eiwit bereid uit een extract (0,5 eicel of embryo). (B) Immunoblotanalyse van geselecteerde X. laevis translationele regulerende eiwitten in stadium VI eicellen, stadium 7 embryo's en stadium 10,5 embryo's. Banen 2, 4 en 6 komen overeen met monsters die voorafgaand aan de analyse zijn gemicro-geïnjecteerd met HA-Bicc1-mRNA, terwijl banen 1, 3 en 5 dienen als negatieve (niet-geïnjecteerde) controles. α-Bicc1-antilichaam werd gebruikt om de expressie van endogeen Bicc1 in verschillende stadia te testen (bovenste paneel). De vlek werd vervolgens gestript en opnieuw onderzocht met een antilichaam tegen de HA-affiniteitstag als controle voor α-Bicc1-antilichaamspecificiteit (tweede panel). Blots werden gestript en opnieuw onderzocht op aanvullende regulerende eiwitten met behulp van α-Cnot1 (derde paneel) en α-Ddx6 (vierde paneel). α-Gapdh (bodempaneel) diende als controle voor een gelijkmatige eiwitbelasting. Rode pijlpunten markeren de locatie van endogene Bicc1, terwijl zwarte pijlpunten de locatie van exogeen tot expressie gebrachte HA-Bicc1 C-term markeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Immunoblot-analyse van Bicc1-eiwit in Xenopus laevis versus Xenopus tropicalis. α-Bicc1-antilichaam werd gebruikt om de expressie van endogeen en exogeen Bicc1 te testen in verschillende hoeveelheden X. laevis en X. tropicalis embryo-extract. Baan 1: 0,5 niet-geïnjecteerd X. laevis embryo. Baan 2: 0,5 HA-Bicc1 geïnjecteerd X. laevis embryo. Baan 3: 3 niet-geïnjecteerde X. tropicalis-embryo's . Baan 4: 1 niet-geïnjecteerd X. tropicalis embryo. Baan 5: 0,5 niet-geïnjecteerd X. tropicalis embryo. Er werden twee antilichamen gebruikt die endogene Bicc1 herkennen: één verhoogd tegen humaan Bicc1 (bovenste paneel) en de andere verhoogd tegen X. laevis Bicc1 (middelste paneel). α-Gapdh (onderpaneel) werd gebruikt om te controleren op een gelijkmatige eiwitbelasting. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Hoewel het concept eenvoudig is, is immunoblotting in de praktijk moeilijk vanwege meerdere stappen die meerdere dagen duren. Als zodanig is het vaak een uitdaging om consistente resultaten van hoge kwaliteit te bereiken. Desalniettemin is immunoblotting een essentieel en alomtegenwoordig onderdeel van de moderne biologie. Immunoblotting is bijvoorbeeld van cruciaal belang voor het bevestigen van succesvolle translatie en expressie van het microgeïnjecteerde mRNA in X. laevis-eicellen en embryo's, wat het belang ervan voor X . laevis-onderzoek benadrukt. Bovendien maken immunoprecipitatie-experimenten gebruik van immunoblotting om in vivo eiwit-eiwitinteracties te analyseren. Efficiënte detectie van specifieke eiwitten zal grotendeels afhangen van hun overvloed en de kwaliteit van de antilichaamdetectiereagentia. In deze studie variëren de geschatte concentraties van het endogene eiwit dat we hebben geanalyseerd bijna 500 keer in het Xenopus-ei (Bicc1: 37,22 nM, Cnot1: 115,08 nM, Ddx6: 980,55 nM, Gapdh: 17.907,26 nM)³⁴, maar ze werden allemaal gemakkelijk gedetecteerd. Onder dit bereik kunnen wijzigingen worden aangebracht in de workflow bij vrijwel elke stap van een immunoblot - van monsterafname tot beeldvorming - om de nauwkeurigheid en efficiëntie van de detectie te verbeteren, indien nodig.

Welk type SDS-PAGE-gel en membraan u moet gebruiken, zijn belangrijke overwegingen voor elk immunoblotting-experiment. Onze ervaring is dat geprefabriceerde gels gemakkelijker en reproduceerbaarder zijn dan gels die in eigen huis worden geproduceerd. Geprefabriceerde gels hebben als bijkomend voordeel dat ze verkrijgbaar zijn in gradiëntformaten waarbij de gels geleidelijk toenemen in polyacrylamideconcentratie van boven naar beneden. Gradiëntgels stellen onderzoekers in staat om een breed scala aan eiwitten met enorm verschillende molecuulgewichten op te lossen en te analyseren. Dit vermijdt de typische afweging tussen het kiezen van een gel met een laag acrylamidepercentage (<7%), die eiwitten met een hoog molecuulgewicht oplost, versus een gel met een hoog percentage (>12%), die beter is in het oplossen van eiwitten met een laag moleculair gewicht. Het is ook belangrijk om te overwegen of u een nitrocellulose- of polyvinylideenfluoride (PVDF)-membraan wilt gebruiken voor eiwitoverdracht. Het mechanisme en de voordelen van elk membraantype zijn uitgebreid besproken^35,36. Kortom, PVDF heeft een hoger eiwitbindend vermogen (en dus een hogere gevoeligheid) dan nitrocellulosemembraan en is duurzamer voor herhaald gebruik. PVDF vereist echter extra behandeling in de vorm van activering door methanolincubatie en is duurder. Hoewel we vinden dat beide membranen geschikt zijn voor de meeste toepassingen, gebruiken we vanwege kostenoverwegingen routinematig nitrocellulose.

Het in beeld brengen van de immunoblot is een cruciaal onderdeel van het protocol. Tijdens deze stap moeten onderzoekers hun oordeel vellen om een beeld van een immunoblot vast te leggen dat alle benodigde informatie overbrengt, maar achtergrondgeluid tot een minimum beperkt. Er zijn twee belangrijke beeldvormingsmethoden voor standaard HRP-geconjugeerde antilichamen: röntgenfilm of digitale beeldvormingssystemen. Onze ervaring is dat het maken van beelden met röntgenfilm veel voordelen heeft. Röntgenfilms zijn over het algemeen veel gevoeliger dan digitale beeldvormingssystemen, waardoor de detectie van eiwitten met een lage abundantie wordt vergemakkelijkt. Röntgenfilms produceren ook een fysiek verslag van het experiment dat met hoge resolutie kan worden geannoteerd en gedigitaliseerd. Een digitaal beeldvormingssysteem heeft echter een veel beter lineair bereik - de relatie tussen signaalsterkte en beeldintensiteit - dan een filmontwikkelaar. Door zijn gevoeligheid kan een röntgenfilm snel overbelicht raken, waardoor kwantitatieve informatie verloren gaat. Daarom moet een onderzoeker die op zoek is naar een nauwkeurige kwantificering van zijn resultaten, een digitaal beeldvormingssysteem gebruiken of er speciaal op letten dat ontwikkelende immunovlekken niet worden overbelicht met röntgenfilm.

Als de resultaten van immunoblotting onbevredigend zijn na het volgen van het protocol zoals we hebben geschetst, zoals vage of "wazige" banden bij beeldvorming, kunnen meerdere aanpassingen worden gemaakt om de uitkomst te verbeteren. Zo kan bijvoorbeeld de hoeveelheid geanalyseerd Xenopus-eiwitmengsel worden aangepast. Totaal eiwit van slechts een vijfde van een embryo kan sterke resultaten opleveren, hoewel het mogelijk is om tot twee embryo's of eicellen per gelbaan te laden. Het laden van te veel eiwitten kan resulteren in artefacten of valse hoge achtergrondsignalen tijdens de beeldvorming. Bovendien leidt elektroforese bij een lagere spanning (100 V) voor een langere looptijd over het algemeen tot scherpere eiwitbanden. Evenzo kan het uitvoeren van de eiwitoverdracht 's nachts bij 4°C bij lage spanning (30 V) in plaats van een uur bij 100 V de eiwitdetectie verbeteren, vooral voor soorten met een hoog molecuulgewicht. Ten slotte detecteren sommige incubaties van primaire antilichamen hun doelen robuuster met behulp van incubaties van 1 uur bij kamertemperatuur, in tegenstelling tot 4 °C 's nachts. Deze protocolwijziging moet worden getest op elk primair antilichaam.

Het identificeren van antilichamen om endogene eiwitten te detecteren vormt een grote uitdaging voor immunoblotting in Xenopus, aangezien er relatief weinig Xenopus-specifieke antilichamen in de handel verkrijgbaar zijn. Onderzoekers kunnen profiteren van niet-commerciële bronnen van Xenopus-antilichamen zoals Xenbase³⁷ (https://www.xenbase.org/xenbase/), de Developmental Studies Hybridoma Bank (https://dshb.biology.uiowa.edu/) en het European Xenopus Resource Centre (https://xenopusresource.org/). Als alternatief kunnen antilichamen die worden gegenereerd om menselijk of muizeneiwit te herkennen, nuttig zijn voor het detecteren van homologe Xenopus-eiwitten, afhankelijk van de conservering van de regio's die worden gebruikt voor de productie van antilichamen. Een Bicc1-antilichaam dat in dit protocol wordt gepresenteerd, werd bijvoorbeeld verhoogd tegen het menselijke Bicc1-eiwit. Voor dergelijke reagentia moet het vermogen om te kruisreageren met Xenopus-eiwitten empirisch worden bepaald. Hoewel de exacte epitoop die bedrijven gebruiken om antilichamen te maken over het algemeen eigendom zijn, zullen velen op verzoek een aminozuurbereik voor de epitoop leveren. Dit gebied kan dan worden uitgelijnd met het overeenkomstige gebied van het homologe Xenopus-eiwit. Hoewel succes niet gegarandeerd is, hebben we meestal succes gehad wanneer het epitoop dat wordt gebruikt voor de productie van antilichamen in de doelsoort ten minste 75% of meer gelijkenis vertoont met het vergelijkbare sequentiestuk in Xenopus. Antilichamen die tegen niet-Xenopus-eiwitten worden gegenereerd, moeten worden gevalideerd voordat ze op grote schaal worden gebruikt, aangezien onjuiste verificatie van antilichamen een belangrijke bijdrage levert aan niet-reproduceerbaar onderzoek^38,39. Dit kan worden gedaan door een gelabeld Xenopus-eiwit van belang in embryo's tot expressie te brengen door middel van mRNA-micro-injectie⁴⁰. Het analyseren van dezelfde monsters met een antilichaam tegen de affiniteitstag wordt vervolgens gebruikt om te bevestigen dat het antilichaam tegen het endogene eiwit en het antilichaam tegen het gelabelde eiwit beide dezelfde entiteit herkennen (zoals in figuur 3B).

Analyse van RNA-bindende eiwitten, vooral die met regulerende functies zoals Bicc1, kan een uitdaging zijn vanwege een gebrek aan reagentia en een typisch lage expressie van krachtige regulerende moleculen. Dit probleem wordt duidelijker bij immunoblotting, waar elk reagens afzonderlijk moet worden geoptimaliseerd, en het vinden van antilichamen met voldoende specificiteit en gevoeligheid kan moeilijk zijn. Onze bedoeling met dit protocol is om specifieke beperkingen van immunoblotting in Xenopus aan te pakken en stappen uit te werken die van toepassing zijn op andere systemen, zodat onderzoekers de moeilijkheden bij het analyseren van RNA-bindende eiwitten kunnen overwinnen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
100 sq ft Heavy Duty Premium Wrap	Saran	2570000130
10x Cell Lysis Buffer	Cell Signaling Technology	#9803
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
2-Quart Oblong Baking/Serving Dish	Pyrex	71160010116
2x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	#1610737
Anti-HA High Affinity Antibody	Roche	11867423001	Prepared as directed and used at 1:10,000 dilution.
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074S	Used at 1:30,000 dilution.
Autoradiography Cassette, 5 x 7 Inches	Research Products International	420057	Not necessary if using a digital imaging system.
Bel-Art Disposable Pestles	Millipore Sigma	BAF199230001
Bicaudal-C (Human) Rabbit Antibody	Envigo Bioproducts (now Inotiv)	N/A	Custom ordered. Used at 1:20,000 dilution.
Bicaudal-C (Xenopus) Rabbit Antibody	Envigo Bioproducts (now Inotiv)	N/A	Custom ordered. Used at 1:20,000 dilution. Ref. Park et al., 2016
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A3294	A substitute for nonfat milk in blocking buffer.
Centrifuge 5425	Eppendorf	13-864-456
CL-XPosure Film	ThermoFisher Scientific	34091	Not necessary if using a digital imaging system.
CNOT1 (D5M1K) Rabbit Monoclonal Antibody	Cell Signaling Technology	#44613	Used at 1:2,000 dilution.
DDX6/RCK (D26C11) Rabbit Monoclonal Antibody	Cell Signaling Technology	#8988	Used at 1:5,000 dilution.
E-Z Store and Pour Developer	MXR Imaging	103633	Not necessary if using a digital imaging system.
E-Z Store and Pour Fixer	MXR Imaging	114511	Not necessary if using a digital imaging system.
GAPDH Monoclonal Antibody	ProteinTech	60004-1-Ig	Used at 1:40,000 dilution.
Gel Releaser	Bio-Rad	#1653320
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	Invitrogen	A16066	Prepared as directed and used at 1:40,000 dilution.
Ice Pack, 8 oz, 5 x 3 x 1"	Uline	S-18256
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7352
Medical Film Processor	Konica Minolta	SRX-101A	Not necessary if using a digital imaging system.
Mini-PROTEAN Cassette Opening Lever	Bio-Rad	#4560000
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell	Bio-Rad	#1658004
MSE PRO 700ml Western Blot Electrophoresis Tank	MSE Supplies	BB2369
Nitrocellulose Membrane, 0.45 µm	Bio-Rad	#1620115
Nonfat Dry Milk	Sanalac	1570000180
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rat IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	112-035-003	Prepared as directed and used at 1:100,000 dilution.
Polysorbate (Tween) 20	Fisher Bioreagents	BP337-500
Ponceau S	VWR Life Science	K793-500ML	An approximation can be made with 0.5% Ponceau S, 1% acetic acid
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
PR1MA Variable Speed 2D Rocker	MidSci	R2D-30
Precision Plus Protein Dual Color Standards Ladder	Bio-Rad	#1610374	Any protein ladder of choice can be used.
Pure Cellulose Chromatography Filter Paper, 0.35 mm	Fisher Scientific	05-714-4
Restore Western Blot Stripping Buffer	ThermoFisher Scientific	#21059
Sodium Chloride	Fisher Chemical	S640-10
Storage Box 300 mL	Rosti Mepal	RST46608	For nitrocellulose membrane blocking, antibody incubation, and washes
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	ThermoFisher Scientific	#34094	An enhanced chemiluminescent (ECL) substrate containing two components: luminol and enhancer. This ECL reagent has a low-femtogram sensitivity.
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate	ThermoFisher Scientific	#34580	An enhanced chemiluminescent (ECL) substrate containing two components: luminol and enhancer. This ECL reagent has a picogram to femtogram sensitivity.
SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 4–12%, 10 Well Polyacrylamide Gels	GenScript	M00652
Transfer Buffer Powder	GenScript	M00652
Tris Base Ultrapure	USBiological	77-86-1
Tris-MOPS-SDS Running Buffer Powder	GenScript	M00138