Methodenartikel

Een innovatieve methode voor endosoomisolatie uit hartweefsels van muizen en co-cultuur met cardiomyocyten

DOI:

10.3791/69146

⸱

10 oktober 2025

 ,  ,  , 
1Pharmacological and Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Houston

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endosomen zijn een verzameling intracellulaire sorteerorganellen die deel uitmaken van de transportroute van het endocytaire membraan. We ontwikkelden een nieuwe methode voor het isoleren van endosomen uit hartweefsel met behulp van automatische nanofiltratieapparatuur en onderzochten de cellulaire opname van endosomen door ze samen te kweken met primaire cardiomyocyten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endosomen zijn membraangebonden organellen die een essentiële rol spelen bij intracellulair transport, signaaltransductie en membraanrecycling. Hoewel hun functies in de cardiovasculaire biologie steeds meer erkenning krijgen, blijft efficiënte isolatie van endosomen uit hartweefsel een belangrijke technische uitdaging. We hebben een snel en hoogrenderend protocol ontwikkeld voor het isoleren van endosomen uit hartweefsel van muizen door subcellulaire fractionering te combineren met een ultrasnel nanofiltratie-isolatieplatform. Deze methode omvat sequentiële centrifugatie, nanofiltratie en nanoporeuze membraangebaseerde extractie van blaasjes. Geïsoleerde endosomen werden gekenmerkt door western blotting, dynamic light scattering (DLS) en nano-flow cytometrie (NanoFCM) analyse. Om de bioactiviteit te beoordelen, werden gezuiverde endosomen samen gekweekt met primaire neonatale cardiomyocyten. De endosomale markers EEA1 en Rab7 waren sterk verrijkt in geïsoleerde blaasjes. DLS-analyse onthulde een gemiddelde blaasjesdiameter van 187,30 ± 23,42 nm en een zeta-potentiaal van -26,60 ± 5,79 mV (n = 12). NanoFCM-kwantificering leverde ongeveer 1,07 ± 0,31 × 1012 deeltjes/ml (n = 12) op uit 100 mg hartweefsel. Functionele opname van endosomen door cardiomyocyten werd waargenomen na in vitro co-cultuur, wat wijst op behoud van de integriteit en activiteit van de blaasjes. Dit geïntegreerde isolatieplatform biedt een reproduceerbare en efficiënte methode voor de extractie van zeer zuivere endosomen uit hartweefsels. Het protocol vergemakkelijkt downstream biochemische en functionele studies en biedt een waardevol hulpmiddel voor het onderzoeken van de rol van endosomen in cardiovasculaire fysiologie en ziekte.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endosomen zijn essentiële intracellulaire organellen die endocytose, het sorteren van vracht en signaalroutes reguleren 1,2. Geactiveerde signaalreceptoren en andere gedownreguleerde eiwitten worden aanvankelijk gesorteerd in intralumenale blaasjes (ILV's) in vroege endosomen (EE's), die vervolgens uitgroeien tot multivesiculaire lichamen (MVB's) of endosomale dragerblaasjes (ECV's). Deze blaasjes versmelten vervolgens met late endosomen (LE's), die dienen als secundaire sorteerhubs voor het leiden van vracht naar lysosomale afbraak of alternatieve routes. ILV's kunnen ook worden uitgescheiden als exosomen na endosoomfusie met het plasmamembraan 3,4 . Tegelijkertijd levert de autofagieroute cytosolisch materiaal aan LE's via autofagosomen, die een afbraakcapaciteit verwerven bij fusie met late endocytische compartimenten5. Endosomen worden nu erkend als kritische regulatoren van receptorrecycling6, ionkanaallokalisatie7, exosoombiogenese8 en intercellulaire communicatie9-processen die vooral relevant zijn in gespecialiseerde cellen zoals neuronen en cardiomyocyten.

Opkomend bewijs heeft de cruciale rol van endosomale routes in de cardiovasculaire functie benadrukt. Eps15 Homologie Domein proteïne 3 (EHD3) reguleert de endosomale recycling van belangrijke cardiale ionentransporters, waaronder de Na+/Ca2+ -wisselaar en L-typeCa 2+ -kanalen. EHD3-deficiëntie bij muizen leidt tot bradycardie, geleidingsanomalieën en gewijzigde Ca2+ -behandeling10. Functioneel endosoom-lysosoomtransport in vasculaire gladde spiercellen voorkomt fosfaatgeïnduceerde mediale calcificatie, die relevant is voor chronische nierziekte en atherosclerose11. Desalniettemin blijven de functionele rol van endosomen bij hart- en vaatziekten en hun potentieel als therapeutische doelen onvolledig begrepen, wat verder onderzoek rechtvaardigt.

Meerdere methoden hebben de biochemische isolatie van functioneel intacte endosomen mogelijk gemaakt. Marsh en collega's combineerden eerst dichtheidsgradiëntcentrifugatie met free-flow elektroforese om vroege en late endosomen te herstellen, met behoud van hun verzuring en structurele integriteit12. Recente methodologieën, zoals de sucrosegradiëntbenadering, bieden een gestandaardiseerde route voor het scheiden van vroege en late endosomale populaties, essentieel voor stroomafwaartse proteomische en lipidomische studies13. Commerciële kits op basis van spinkolommen zijn ontwikkeld voor toepassingen met een hoge doorvoer.

Exosoomisolatie via het automatische ultrasnelle isolatiesysteem maakt gebruik van innovatieve ultrasone nanofiltratietechnologie, die een nanofiltratiesysteem met twee membranen heeft dat is geïntegreerd met periodieke negatieve drukoscillatie en dubbel gekoppelde harmonische oscillaties om de isolatie van zeer zuivere exosomen uit biovloeistoffen mogelijk te maken14. Hier combineerden we subcellulaire fractionering met endosoomisolatie met behulp van het automatische ultrasnelle isolatiesysteem om een nieuwe methode te bereiken voor snelle endosoomisolatie met een hoge opbrengst en hoge zuiverheid van muizenhartweefsel.

Bovendien hebben we de geëxtraheerde endosomen in vitro gekweekt met primaire cardiomyocyten (CM) en ontdekten dat de exogene endosomen de CM met succes binnenkwamen. Met behulp van een endosoomreporter, waarin het endosoom-gelokaliseerde eiwit Numb was gefuseerd met mCherry rood fluorescerend eiwit15,16, zagen we mCherry-fluorescentie gelokaliseerd in CM's met een puncta-patroon.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health on the Use of Laboratory Animals en met goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Houston.

OPMERKING: Voordat de isolatieprocedure wordt gestart, is het essentieel om ervoor te zorgen dat alle vereiste buffers vers zijn bereid en afgekoeld tot 4 °C. Gesteriliseerde instrumenten, weefselkweekplaten en geschikte buisjes moeten op de aangewezen werkplekken worden opgesteld, waarbij alle materialen op ijs of bij 4 °C worden bewaard, tenzij anders aangegeven. Centrifuges en rotoren moeten vóór gebruik gedurende ten minste 2-3 uur op 4 °C worden voorgeëquilibreerd. De fractioneringsbuffer moet vóór de dag van het experiment worden bereid en bij 4 °C worden bewaard, en tijdens het experiment op ijs worden bewaard totdat hij nodig is. Tenzij anders aangegeven, moeten alle incubatie- en centrifugatiestappen bij 4 °C worden uitgevoerd.

1. Bereiding van hartlysaat

  1. Desinfecteer het operatiegebied met 70% ethanol, gevolgd door het plaatsen van een steriel absorberend kussen op het werkoppervlak, waarop gesteriliseerde chirurgische instrumenten worden geplaatst.
  2. Euthanaseer muizen (C57BL/6 mannetjes, 8-12 weken, 20-25 g, en mCherry: NumbKI mannetjes, 8-12 weken, 20-25 g) via CO2 inhalatie (10-30% CO2 gedurende 3-5 min) of door een alternatieve methode die is goedgekeurd door de relevante institutionele commissie voor dierenverzorging en -gebruik.
    LET OP: Werk in een open ruimte en zorg ervoor dat de CO2 -cilinder op tijd sluit om lekkage te voorkomen. Muizen moeten tijdens de euthanasie worden gecontroleerd om bewustzijnsverlies en de juiste procedure te bevestigen. Eenmaal bewusteloos, gebruik dan een secundaire methode, zoals cervicale dislocatie, thoracotomie of verbloeding, om de dood te garanderen.
  3. Plaats de muis in rugligging en reinig het thoracale gebied met 70% ethanol.
    1. Open de borstholte snel om het hart te oogsten en breng het hart over in ijskoude Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) in een schaal van 60 mm die op ijs is geplaatst.
    2. Verwijder het resterende bloed voorzichtig uit de hartkamers met een pincet en spoel het hart heel goed totdat er geen bloed meer in de kamers achterblijft. Houd het hart tijdens de verwerking op ijs.
      OPMERKING: Bewaar 50-100 mg hartweefsel voor western blot (WB) analyse als positieve controle. Het hart kan worden ingevroren in vloeibare stikstof en tot 6 maanden bij -80 °C worden bewaard.
  4. Voeg 8 ml fractioneringsbuffer (tabel 1) toe aan een buis van 50 ml op ijs. Breng 100-120 mg vers of bevroren hartweefsel van de muis over in een buisje met de fractioneringsbuffer.
    OPMERKING: Elk deel van het hartweefsel van de muis kan worden gebruikt om endosomen te extraheren. Er is minimaal 100 mg hartweefsel nodig om voldoende endosomen te verkrijgen voor latere analyses. Om consistentie in de experimentele groepen te garanderen, moet het weefsel nauwkeurig worden gewogen voordat het aan de fractioneringsbuffer wordt toegevoegd.
    LET OP: Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen bij het gebruik van de fractioneringsbuffer om direct contact met het lichaam te vermijden.
  5. Hak het weefsel in ongeveer 1 mm3 stukken met behulp van een microchirurgische schaar in fractioneringsbuffer op ijs, de hele tijd.
  6. Homogeniseer met een elektrische homogenisator op gemiddelde snelheid, in een werkcyclus van 40 s en 30 s. Homogeniseren gedurende 5-7 cycli (Figuur 1A).
    OPMERKING: Een grondig homogenisatieproces is essentieel en zal helpen de uiteindelijke concentratie van endosomen te verhogen.
  7. Sonificeer het gehomogeniseerde hartlysaat gedurende 10 minuten in het ijswaterbad met een ultrasoonbad (Figuur 1A).

2. Subcellulaire fractionering

  1. Plaats een celzeef van 40 μm over een centrifugatiebuis van 50 ml en filtreer het gehomogeniseerde hartlysaat door de zeef (Figuur 1A).
  2. Voor de nucleaire pellet: centrifugeer het hartlysaat bij 1.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Breng het bovenstaande over en plaats het in een vers geëtiketteerd buisje.
    NOTITIE: Verzamel de pellet, de nucleaire fractie, en suspendeer de nucleaire pellet in 200 μL WB Lysis Buffer als de nucleaire fractie nodig is voor WB. Piket de nucleaire pellet voorzichtig met radio-immunoprecipitatietest (RIPA), buffer 20 keer op en neer en sonificeer gedurende 10 minuten. Centrifugeer het nucleaire lysaat bij 14.000 × g gedurende 10 minuten. Verzamel het bovenstaande en bewaar het bij -80 °C voor verder gebruik. Stap 2.2 is optioneel; Het kan worden overgeslagen als er alleen blaasjes nodig zijn.
  3. Voor de mitochondriale fractie: centrifugeer het bovenstaande opnieuw bij 10.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. De korrel bevat de mitochondriale fractie. Breng het bovenstaande over en plaats het in een verse ultragecentrifugeerde buis.
    OPMERKING: Als een mitochondriale fractie gewenst is voor WB, sla de pellet dan op als stap 2.2 zoals beschreven in de vorige OPMERKING.
  4. Breng de buizen zorgvuldig in evenwicht. Weeg elke buis en voeg een extra koude fractioneringsbuffer toe aan de lichtere buis om een gelijk gewicht te garanderen. Koel de ultracentrifugerotor en de adapters 2-3 uur voor bij 4 °C. Ultracentrifugeer het bovenstaande gedurende 30 minuten bij 160.000 × g bij 4 °C.
    OPMERKING: Tijdens de ultracentrifugatiestap is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat alle ultracentrifugebuisjes goed in balans zijn en met buffer zijn gevuld tot ongeveer 0.5-1 cm onder de rand. Onvoldoende vulling kan leiden tot vervorming of instorting van de buis als gevolg van de hoge centrifugale krachten die worden uitgeoefend.
  5. Verwijder het bovenstaande in een nieuw buisje. Het bovenstaande bevat endosomen. Plaats een spuit van 10 ml die is bevestigd aan een spuitfilter van 0.45 μm bovenop een centrifugeerbuis van 50 ml en filtreer het bovenstaande in de buis. Voeg 5 ml gesteriliseerde PBS-buffer toe om de oplossing te verdunnen en verstopping van het filter te voorkomen.
    OPMERKING: De filterstap zorgt ervoor dat alle endosomen in het bovenstaande <450 nm zijn bij het starten van de isolatiestappen.
  6. Resuspendeer de pellet met 5 ml gesteriliseerde PBS-buffer uit stap 2.4 en pipetteer minstens 20 keer op en neer om de pellet goed te mengen. De pellet bevat andere intracellulaire blaasjes. Plaats een spuit van 10 ml die is bevestigd aan een spuitfilter van 0.45 μm bovenop een centrifugatiebuis van 50 ml en filtreer de pelletoplossing in de buis. Voeg een extra 5 ml gesteriliseerde PBS-buffer toe om de oplossing te verdunnen en verstopping van het filter te voorkomen.
    OPMERKING: De filterstap zorgt ervoor dat alle blaasjes van de pellet <450 nm zijn bij het starten van de isolatiestappen.

3. Isolatieproces van endosomen en andere intracellulaire blaasjes

  1. Verdun het gefilterde bovenstaande middel uit stap 2.5 en de gefilterde pelletoplossing uit stap 2.6 met gesteriliseerde PBS-buffer tot een eindvolume van 30 ml in buisjes van respectievelijk 50 ml. Bewaar de monsters bij 4 °C (figuur 1A).
    OPMERKING: De monsters kunnen 24 uur bij 4 °C worden bewaard. Als er niet genoeg tijd is om de volgende stappen op dezelfde dag uit te voeren, kunnen ze in de koelkast bij 4 °C worden bewaard en vervolgens wachten tot de volgende dag om het experiment voort te zetten.
  2. Zet het instrument aan en start het dagelijkse reinigingsprogramma, dat meestal 20 minuten duurt.
  3. Kies het Medium EXODUS isolatieapparaat (M EID) voor isolatie. Installeer een slangadapter van 50 ml en plaats de slang van 50 ml met het monster in de monsterpositie. Tik op EID op het scherm en laad M EID.
    OPMERKING: De Medium EID is voor een monster van 20-50 ml, waarbij 30 ml wordt aanbevolen.
  4. Programma instellen:
    1. Voer de monsternaam en het monstervolume in.
    2. Selecteer monstertype: Plasma.
    3. Selecteer programma: Plasma. Sterk-MA. A03.
    4. Selecteer een centrifugebuis: 50 ml.
    5. Schakel de modus Hoge zuiverheid in.
    6. Selecteer Programma-optie 3000.
    7. Tik op OK om te beginnen.
      OPMERKING: Het hele isolatieproces duurt 1-2 uur. Een hogere concentratie van monsters duurt langer.
  5. Herstel endosomen en andere intracellulaire blaasjes:
    1. Haal de EID op en breng deze naar de motorkap voor de volgende stappen.
    2. Breng 200 μL gesteriliseerde PBS-buffer over in de EID met een pipet van 200 μL. Spoel beide zijden van het nanoporeuze membraan respectievelijk 20 keer af.
    3. Verzamel de endosomen of andere intracellulaire blaasjes, suspendeer in 200 μL in een tube van 1,5 ml. Bewaar het bij 4 °C bij gebruik in 24-48 uur, of bij -80 °C voor langdurige opslag.
      OPMERKING: Het eluaat bevat de endosomen of andere intracellulaire blaasjes en wordt gebruikt voor verdere analyse en co-cultuur met cardiomyocyten. Het monster van endosomen is stabiel wanneer het gedurende 5 maanden bij -80 °C wordt bewaard, op basis van de verkregen gegevens.
  6. Elute-endosomen en andere intracellulaire blaasjes voor WB:
    1. Haal de EID op. Breng 80 μL WB-lysisbuffer over naar de EID. Spoel beide zijden van het nanoporeuze membraan respectievelijk 20 keer af.
    2. Incubeer de EID gedurende 30 minuten op ijs om volledige oplosbaarheid te garanderen, pipetteer elke 10 minuten een pipetbuffer in de EID. Verzamel de endosomen of andere intracellulaire blaasjeslysaat in buisjes van 1,5 ml. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 14.000 × g bij 4°C. Verzamel en bewaar supernatant bij -80 °C voor langdurige opslag. Gooi de pellet weg als er nog pellet in de tube zit.

4. Kwantificering van endosoomeiwitten en karakterisering van blaasjes

  1. Analyse van de westerse vlek
    1. Sla 5 μL van elk monster op om de eiwitconcentratie te kwantificeren met behulp van een bicinchoninezuur (BCA)-test.
    2. Verdun de monsters in 4× Laemmli-monsterbuffer en meng grondig door middel van vortexen. Verwarm de monsters gedurende 10 minuten bij 95 °C om eiwitten te denatureren.
    3. Centrifugeer de gedenatureerde monsters gedurende 10 minuten bij 14.000 ×g bij 14.000 g bij 4 °C en verzamel het resulterende bovenstaande middel voor analyse.
    4. Monteer polyacrylamidegels in het elektroforese-apparaat en vul de kamer met natriumdodecylsulfaat (SDS) lopende buffer.
    5. Laad een molecuulgewichtmarker en de voorbereide eiwitmonsters op de gel en selecteer een geschikt acrylamidepercentage op basis van het molecuulgewicht van de doeleiwitten.
      OPMERKING: Doorgaans wordt 20 μg eiwit per putje geladen voor zowel hartweefsellysaten als endosoomlysaten.
    6. Laat de gel ongeveer 120 minuten op 6 V draaien of totdat het verffront de bodem van de gel bereikt.
    7. Breng eiwitten over van de gel naar een polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan met behulp van een western blotting transfer system.
      OPMERKING: De natte overdrachtsmethode werkt ook goed.
    8. Spoel het PVDF-membraan kort met Tris-gebufferde zoutoplossing die 0,05% Tween-20 (TBST) bevat.
    9. Blokkeer het membraan met TBST aangevuld met 1% runderserumalbumine (BSA) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    10. Incubeer het membraan een nacht bij 4 °C met een primair antilichaam (Table of Materials) dat specifiek is voor de geselecteerde endosomale marker, door middel van zacht schommelen.
    11. Was het membraan de volgende dag drie keer met TBST, elke wasbeurt duurt 10 minuten op kamertemperatuur op een wip.
      OPMERKING: Goed wassen is essentieel om niet-specifieke achtergrond te verminderen; Zorg ervoor dat het membraan tijdens het hele proces volledig gehydrateerd blijft.
    12. Incubeer het membraan met het juiste secundaire antilichaam (Materiaaltabel) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    13. Was het membraan drie keer met TBST, elke wasbeurt duurt 10 minuten op een wip op kamertemperatuur.
    14. Breng chemiluminescerend substraat aan op het membraan voor de detectie van antilichaamgebonden eiwitten.
    15. Met behulp van een gelbeeldvormingssysteem om het membraan bloot te leggen en foto's van de eiwitten te maken.
  2. Analyse van dynamische lichtverstrooiing (DLS)
    1. De deeltjesgrootte en het zeta-potentieel van endosomen worden gemeten met behulp van de dynamische lichtverstrooiing (DLS) techniek17. met behulp van een Litesizer 500 (Anton Paar) uitgerust met Kalliope software versie 2.10.4. DLS-metingen worden in drievoud uitgevoerd met behulp van een laser van 658 nm met een detectiehoek van 90° bij 25 °C.
    2. Maak een verdunning van "standaard nanobolletjes" in ultrapuur water, voeg 1 ml volume toe aan de wegwerpcuvet en plaats deze in de kamer.
      OPMERKING: Gebruik standaard nanobolletjes (klein of groot) volgens de verwachte grootte van het onbekende monster.
    3. Open de DLS-software en klik op het nieuwe tabblad Meting . Selecteer de deeltjesgrootte in de meetmodus. Geef het bestand een naam in het veld Naamloos en voer de invoerparameters in (oplosmiddel, temperatuur, enz.) en klik op start. Nadat u de grootte van de standaarddeeltjes hebt bepaald, haalt u de cuvet uit de kamer.
    4. Maak een verdunning van "zeta potentieel referentiemateriaal" in ultrapuur water, plaats het in de zeta potentiaal omega cuvet en plaats het in de kuvettenkamer. Klik op het nieuwe tabblad Meting in de software. Selecteer zeta-potentiaal in de meetmodus. Geef het bestand een naam in het veld Naamloos en voer de invoerparameters in (oplosmiddel, temperatuur, enz.) en klik op start.
    5. Voor de bepaling van de deeltjesgrootte en het zeta-potentieel van endosomen, verdunt u het endosoommonster in ultrapuur water, doet u het in de respectievelijke cuvetten en plaatst u ze in de kuvettenkamer. Voer de metingen uit op dezelfde manier als beschreven voor de normen.
      OPMERKING: Maak een verdunning van de onbekende monsters volgens de concentratie van de monsters in ultrapuur water.
  3. NanoFCM-analyse
    OPMERKING: Endosoomdeeltjesconcentraties worden bepaald met behulp van NanoFCM Flow NanoAnalyzer met Professional Suite V2.3-software18. Deeltjessignaalacquisitie wordt gedurende 2 minuten uitgevoerd met behulp van een 488 nm blauwe laser ingesteld op 20 mW met 0,2% SS-verval en/of een 638 nm rode laser ingesteld op 8 mW met 10% SS-verval, bij een bemonsteringsdruk van 1,0 kPa gemoduleerd en onderhouden door een op lucht gebaseerde drukmodule. Het monster is gericht op 1,4 μm met behulp van ultrapur water als omhulselvloeistof via een zwaartekrachtvoeding. De optimale laseruitlijning wordt getest en gekalibreerd met behulp van silica nanosphere cocktail QC-kralen (S16M-Exo). Metingen van de groottekalibratie worden voorafgaand aan de analyse uitgevoerd met behulp van S16M-Exo-maatstandaardkralen (silica-nanodeeltjescocktail met 68, 91, 113 en 155 nm diameters van deeltjes met een bekende concentratie van 2,17 × 1010/ml).
    1. Concentratie standaard verwerving:
      1. Opstarten en initialiseren van de fluïdica van nanoFCM. Verdun de QC-korrels (1:100) in 0,22 μm membraangefilterd ultrapuur water, voeg toe aan een buis van 0,5 ml en plaats ze op het laadperron. Selecteer QC FL SiNP's in het vervolgkeuzemenu Sample Inf en voer de verdunningsfactor van het QC-kralenmonster in.
      2. Selecteer in het vervolgkeuzemenu Sample Flow de optie boosting om het QC-monster met hoge snelheid te introduceren en de reinigingsoplossing gedurende 45 s uit het systeem te verwijderen. Stel tijdens het boosten het laservermogen in op 20/50 mV voor de 488 nm blauwe laser en 20/100 mW voor de 638 nm rode laser, met 0,2% SS-verval.
      3. Selecteer sampling in het vervolgkeuzemenu Sample Flow en pas de drempel aan voor het grote signaal. Pas tijdens de bemonstering de uitlijning van de signaalcondenserende lens handmatig aan en indien nodig de uitlijning van de laserfocuslens vanuit de software. De automatische drempelaanpassing voor een groot signaal moet tussen 50-120 blijven voor het zijverstrooiingskanaal en minder dan 75 voor beide fluorescentiekanalen.
      4. Klik op Tijd om op te nemen om de gegevens voor 120 s op te halen. Zorg ervoor dat het interessegebied (ROI) tussen 1500-15000 ligt bij het verkrijgen van de gegevens. Sla het resultaatbestand op in de pop-upmap met de extensie "nfa" en verwijder de monsterbuis.
        NOTITIE: Gebruik na elke monsterrun reinigingsoplossing (1x) om het verwerkte monster uit de slang te verwijderen door het gedurende 45 s te stimuleren. Dompel vervolgens de capillaire punt in ultrzuiver water om de resterende reinigingsoplossing van de buitenkant van het capillair te verwijderen voordat u het volgende monster laadt.
    2. Grootte standaard acquisitie:
      1. Verdun de "size standard beads" (1:100) in 0,22 μm membraangefilterd ultrpaure water en plaats ze op het laadperron. Selecteer 68-155 S16M-Exo in het vervolgkeuzemenu Sample Inf en voer de verdunningsfactor van het monster van de standaardkralen van de grootte in.
      2. Selecteer in het vervolgkeuzemenu Sample Flow de optie boosting om de maat standaardkralen in te voeren en verwijder de reinigingsoplossing gedurende 45 s uit het systeem. Stel tijdens het boosten het laservermogen in op 8/50 mV voor de 488 nm blauwe laser en 20/100 mW voor de 638 nm rode laser, met 10% SS-verval.
      3. Selecteer Bemonstering in het vervolgkeuzemenu Sample Flow en pas de drempel aan voor een klein signaal. Vier verschillende pieken (68 nm, 91 nm, 113 nm, 155 nm) moeten zichtbaar zijn in het venster. Klik op Tijd om op te nemen om de gegevens voor 120 s op te halen. Sla het resultaatbestand op in de pop-upmap met de extensie "nfa" en verwijder de monsterbuis.
    3. Blanco standaard acquisitie:
      1. Gebruik ultrapuur water of (buffer/verdunningsmiddel van het monster) om de meting uit te voeren in hetzelfde proces als hierboven beschreven, sla het bestand met de naam "leeg" op in de map met de extensie "nfa" en verwijder de monsterbuis.
    4. Bepaling van de deeltjesconcentratie van endosomen
      1. Verdun het endosoommonster in ultrapuur water en plaats het in het laadperron.
      2. Nadat u het monster hebt gepromoot en bemonsterd, klikt u op Tijd om op te nemen om de metingen te starten. Als de drempelwaarde niet binnen het bereik van 50-120 ligt voor het zijverstrooiingskanaal, of als de ROI meer dan 15.000 is, overweeg dan om het monster te verdunnen.
    5. Gegevensanalyse:
      1. Schakel over van het tabblad Acquisitie naar het tabblad Analyse in de software en open de opgeslagen "nfa"-bestanden. Stel de concentratiestandaard in door het opgeslagen bestand met QC-resultaten te openen date__QC FL SnNPs.nfa, stel de drempel in op groot signaal door op de drempel instellen te klikken.
      2. Selecteer de deeltjesconcentratie met behulp van het cirkelpoortgereedschap. Klik op STD tellen en controleer de concentratie van QC-kralen (2,17 × 1010/ml) voordat u het venster sluit.
      3. Als u de groottestandaard wilt instellen, opent u het bestand date_68-155 S16M-Exo.nfa. Klik op de Grootte tool om het standaard curvegeneratievenster te openen en stel de drempel voor het kleine signaal in door op de set drempel tool te klikken.
      4. Selecteer S16 exo 68-155 nm in het door de gebruiker gedefinieerde vervolgkeuzemenu. Klik op Pieken zoeken om de piek-SS-intensiteiten van de populaties van vier groottes te identificeren.
      5. Selecteer het lege bestand en klik op Leeg instellen om het aantal valse positieven voor verwijdering van het monster te identificeren. Om de endosoomconcentratie te analyseren, selecteert u eerst het monster en stelt u de drempelwaarde in op een klein signaal door op de ingestelde drempeltool te klikken. Presenteer de gekwantificeerde gegevens als een rapport over grootte (nm) en concentratie (deeltjes/ml).

5. Primaire cardiomyocytencultuur

OPMERKING: Isoleer cardiomyocyten met behulp van een primaire cardiomyocytenisolatiekit, die voldoende reagentia biedt voor de isolatie van cardiomyocyten uit maximaal 50 neonatale muizen- of rattenharten. De kit bevat ook componenten die geschikt zijn voor het ondersteunen van de primaire cardiomyocytencultuur. Alle media en buffers moeten met de nodige voorzichtigheid worden verwijderd om storende cellen te voorkomen. Handmatig pipetteren met een pipetpunt van 1000 μl wordt aanbevolen, vacuüminaspiratie moet worden vermeden. Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) moet worden voorgekoeld tot 4 °C voordat de procedure wordt gestart.

  1. Reconstitueer Cardiomyocyte Isolation Enzyme 1 (met papaïne), verkrijgbaar in de kit, door 2 toe te voegen. ml gekoelde HBSS in één injectieflacon. Meng voorzichtig gedurende ongeveer 5 minuten of tot het enzym volledig is opgelost. Houd de enzymoplossing tijdens de procedure op ijs.
    OPMERKING: Een enkele injectieflacon met gereconstitueerd enzym 1 is voldoende voor de isolatie van cardiomyocyten uit 10 neonatale harten. Het kan tot 6 maanden worden bewaard bij -20 °C en is stabiel voor twee vries-dooicycli. Indien bewaard bij 4 °C, moet de oplossing binnen 1 week worden gebruikt om de enzymatische activiteit te garanderen.
  2. Plaats vers ontlede neonatale harten in individuele steriele 1. ml microcentrifugebuisjes en voeg onmiddellijk 500 μL ijskoude HBSS toe aan elk buisje.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om één hart per buis te verwerken om de opbrengst en reproduceerbaarheid te maximaliseren.
  3. Hak hartweefsel in fragmenten van 1 mm³ met behulp van een steriele dissectieschaar. Was elk monster twee keer met 500 μL ijskoude HBSS om achtergebleven bloed te verwijderen.
  4. Voeg aan elk buisje 200 μL gereconstitueerd Cardiomyocyte Isolation Enzyme 1 (papaïne) en 10 μL Cardiomyocyte Isolation Enzyme 2 (met thermolysine) toe, verkrijgbaar in de kit. Meng de buisjes voorzichtig en incubeer ze 30-35 minuten bij 37 °C.
    OPMERKING: Cardiomyocyte Isolation Enzyme 2 wordt geleverd als een suspensie in HBSS en moet voor gebruik op ijs worden ontdooid. Homogeniseer het enzym door op en neer te pipetteren om een uniforme suspensie te garanderen voordat het aan de monsters wordt toegevoegd.
  5. Zuig na enzymatische vertering de enzymoplossing voorzichtig op en was elk monster twee keer met 500 μL ijskoude HBSS.
  6. Voeg ml Complete DMEM voor primaire celisolatie toe aan elke buis. Tritureer het weefsel voorzichtig door 25-30 keer op en neer te pipetteren met behulp van een steriele pipetpunt van 1,0 ml. Minimaliseer de vorming van luchtbellen tijdens deze stap.
    OPMERKING: Het verstoren van weefsel door pipetteren verbetert de celopbrengst. Overmatig pipetteren kan echter leiden tot celbeschadiging.
  7. Centrifugeer het bovenstaande gedurende 5 minuten bij 300 × g.
  8. Verwijder de Complete DMEM voorzichtig met een pipet. Voeg 1 ml verse Complete DMEM toe aan de buis en pipetteer 25-30 keer op en neer met behulp van een steriele pipetpunt van 1,0 ml. Vermijd luchtbellen tijdens het pipetteren.
  9. Nadat het weefsel voornamelijk een eencellige suspensie is, voegt u 0,5 ml volledige DMEM voor primaire celisolatie toe aan elke buis om het totale volume op 1,5 ml te brengen. Combineer individuele celsuspensies voor de bepaling van de celconcentratie en de levensvatbaarheid van de cellen.

6. Co-cultuur endosoom met cardiomyocyten

  1. Zaai de cardiomyocyten in een schaaltje van 60 mm en voeg Complete DMEM toe aan het totale volume.
    OPMERKING: Van elk neonataal muizenhart wordt verwacht dat het in één schaal wordt gezaaid en het totale volume van elk putje zal naar verwachting 5 ml zijn (Figuur 1B).
  2. Incubeer de 60 mm schaal bij 37 °C in een 5% CO2 incubator gedurende 24 uur. Vervang het medium na 24 uur door een equivalent volume verse complete DMEM voor primaire celisolatie met cardiomyocytengroeisupplement verdund 1000x.
  3. Breng het endosoomeluaat dat in stap 3 is geproduceerd gedurende 1 uur over van -80 °C naar -20 °C. Leg vervolgens de endosomen op ijs en ontdooi ze geleidelijk.
    OPMERKING: Geleidelijk ontdooien op ijs kan het membraan van endosomen intacter maken en degradatie verminderen.
  4. Meng na 48 uur elke 100 μL endosoomeluaat met 5 ml verse Complete DMEM en vervang het oude medium in elk gerecht. Co-cultuur endosomen met cardiomyocyten gedurende 24 uur.
  5. Was de cardiomyocyten met 2 ml koude steriele PBS. Voeg ijskoude lysisbuffer toe aan elk gerecht met 80-100 μL lysisbuffer. Schraap de cellen met een koude plastic celschraper en verzamel de cellen in buisjes van 1,5 ml.
  6. Voer het WB-protocol uit dat wordt beschreven in stap 4.1.
  7. Voor immunokleuring (IF) volgt u de onderstaande stappen.
    1. Zaad cardiomyocyten in een dia met 8 putjes. Verdun de eencellige suspensie met voltooide DMEM van 1,5 ml tot 3 ml.
    2. Zaai 300 μL van de suspensie in elke kamer. Herhaal stap 6.2-6.4.
    3. Fixeer de cardiomyocyten met 200 μL 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en was driemaal met 200 μL steriele PBS. De 8-well kamerdia is klaar voor IF.
      LET OP: Draag bij het hanteren van 4% PFA de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen. Gooi na gebruik 4% PFA weg in een geschikte verpakking.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We onderzochten de expressieniveaus van markers voor vroege endosomen, late endosomen, lysosomen en autofagosomen in vijf groepen: lysaat van hartweefsel, nucleaire fractie, mitochondriale fractie, andere intracellulaire blaasjes uit stap 2.6 en stap 3.6, en endosomen uit stap 2.5 en stap 3.6. Het resultaat van de Western blot toonde aan dat EEA1 (Early Endosome Antigen 1) het hoogste expressieniveau had in endosomen en bijna niet tot expressie kwam in andere groepen (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie presenteren we een snelle en reproduceerbare methode voor het isoleren van zeer zuivere endosomen uit hartweefsel van muizen door subcellulaire fractionering te combineren met een ultrasnel isolatieplatform14. Traditionele benaderingen voor endosoomisolatie, zoals dichtheidsgradiëntcentrifugatie12 of immuunisolatie, zijn vaak tijdrovend en arbeidsintensief en vereisen grote hoeveelheden weefsel of gespecialiseerde antilichame...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidies: National Heart, Lung, and Blood Institute grant 2R01HL121700-06A1 en R01HL172834-01 aan M.W., American Heart Association 24TPA1303770 en 25EIA1422015 grant aan M.W. US EPA84045701 aan X.L.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
µ-Slide 8 Well highibidi80806-90
1.5 mL graduated microcentrifuge tubeUSA Scientific1615-5500
10x Tris/Glycine BufferBio Rad1610734
4x Laemmli Sample BufferBio Rad1610747
Benchtop centrifugeEppendorfEppendorf Centrifuge 5810R
Bovine serum albumin SigmaA9418
cell strainerCorningCLS431750Pore size 40 μm, steriele
CELLSTAR Tissue Culture DishesVWR82050-546Polystyrene, steriele, 60 mm & acute; 15 mm
ChemiDoc imaging systemBio RadChemiDoc XRS+
Cleaning SolutionNanoFCM17159
DMEM for Pierce Primary Cell Isolation KitsFisher ScientificPI88287
DTTFisher ScientificBP172
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Scientific10010023
ECL western blotting detection reagentBio Rad1705061
EDTASigmaE4884
EEA1Cell signaling3288SWB (1:1000)
EGTASigmaE-4378-25
EIDEXODUSMA03 EID
ERp72Cell signaling5033SWB (1:1000)
EthanolUH Research Store200 Proof, 5 Gallon
EXODUS H-600EXODUSH-600
GAPDHProteintech10494-1-APWB (1:5000)
Hank’s balanced salt solution (HBSS)Thermo Scientific14175095
HEPESSigmaH3375
HomogenizerFisher Scientific15340167
KClSigmaP3911
Lamp1Abcamab320851WB (1:2000)
LC3Cell signaling2775SWB (1:1000)
Litesizer 500 Anton PaarLitesizer 500Ander apparatuur zoals Zetasizer (Malvern) of DLS  (Wyatt) kan worden gebruikt
mCherryBiorbytorb66657WB (1:500)
MgCl2Fisher ScientificBP214-500
NaClSigmaS7653
NanoFCMNanoFCMFlow NanoAnalyzer
Nanospheres Size StandardsThermo Scientific3020A
Nikon AXR confocal microscopeNikonAXR
Paraformaldehyde solution 4% in PBSSanta Cruz Biotechnologysc-281692
Phalloidin Labeling ProbesInvitrogenA22284IF (1:500)
Pierce BCA Protein Assay KitsThermo Scientific23227
Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation KitThermo Scientific88028
Polyethersulfone syringe filterMilliporeSLHPR33RSPore size 0.45 μm, steriele
Precast Protein GelsBio Rad4561093
QC BeadsNanoFCMQS2503
Rab7Cell signaling9367SWB (1:1000)
RIPA Lysis and Extraction BufferThermo Scientific89900
Roche PhosSTOP (PI Cocktail)Roche4906837001
Silica NanospheresNanoFCMS16M-Exo
SucroseSigma84097
Swinging-bucket rotorBeckman CoulterSW55Ti
Trans-Blot Turbo Transfer System RTA Transfer KitsBio Rad1704270
Tween 20Bio Rad1662404
UltracentrifugeBeckman CoulterOptima XE-90
Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter326819
Ultrasonic Cleaning BathBranson UltrasonicsCPX952238R
VWR Tube Cent 50 mLVWR89039-656
VWR Tube Centrifuge 15 mLVWR89039-666
Zeta Potential Reference MaterialAnton Paar175108

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (11), 679-696 (2018).
  2. Gould, G. W., Lippincott-Schwartz, J. New roles for endosomes: from vesicular carriers to multi-purpose platforms. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (4), 287-292 (2009).
  3. Bissig, C., Gruenberg, J. Lipid sorting and multivesicular endosome biogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (10), a016816(2013).
  4. Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30 (17), 3481-3500 (2011).
  5. Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. The autophagosome: origins unknown, biogenesis complex. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 759-774 (2013).
  6. Singh, J., et al. Endosome transcriptomics reveal trafficking of Cajal bodies into multivesicular bodies. bioRxiv. , (2025).
  7. Scott, C. C., Gruenberg, J. Ion flux and the function of endosomes and lysosomes: pH is just the start: the flux of ions across endosomal membranes influences endosome function not only through regulation of the luminal pH. Bioessays. 33 (2), 103-110 (2011).
  8. Lopez-Verrilli, M. A. Exosomes: mediators of communication in eukaryotes. Biol Res. 46 (1), 5-11 (2013).
  9. Corbeil, D., et al. Uptake and fate of extracellular membrane vesicles: nucleoplasmic reticulum-associated late endosomes as a new gate to intercellular communication. Cells. 9 (9), 1931(1931).
  10. Curran, J., et al. EHD3-dependent endosome pathway regulates cardiac membrane excitability and physiology. Circ Res. 115 (1), 68-78 (2014).
  11. Kapustin, A. N., et al. Vascular smooth muscle cell calcification is mediated by regulated exosome secretion. Circ Res. 116 (8), 1312-1323 (2015).
  12. Marsh, M., et al. Rapid analytical and preparative isolation of functional endosomes by free flow electrophoresis. J Cell Biol. 104 (4), 875-886 (1987).
  13. de Araújo, M. E., Lamberti, G., Huber, L. A. Isolation of early and late endosomes by density gradient centrifugation. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (11), 1013-1016 (2015).
  14. Chen, Y., et al. Exosome detection via the ultrafast-isolation system: EXODUS. Nat Methods. 18 (2), 212-218 (2021).
  15. Miao, L., et al. Cardiomyocyte orientation modulated by the Numb family proteins-N-cadherin axis is essential for ventricular wall morphogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (31), 15560-15569 (2019).
  16. Miao, L., et al. The spatiotemporal expression of Notch1 and Numb and their functional interaction during cardiac morphogenesis. Cells. 10 (9), 2192(2021).
  17. Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential-what they are and what they are not. J Control Release. 235, 337-351 (2016).
  18. Chen, J., et al. Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method. Stem Cell Rev Rep. 18 (3), 1067-1077 (2022).
  19. Wilson, J. M., et al. EEA1, a tethering protein of the early sorting endosome, shows a polarized distribution in hippocampal neurons, epithelial cells, and fibroblasts. Mol Biol Cell. 11 (8), 2657-2671 (2000).
  20. Dumas, J. J., et al. Multivalent endosome targeting by homodimeric EEA1. Mol Cell. 8 (5), 947-958 (2001).
  21. Bucci, C., et al. Rab7: a key to lysosome biogenesis. Mol Biol Cell. 11 (2), 467-480 (2000).
  22. Langemeyer, L., Fröhlich, F., Ungermann, C. Rab GTPase function in endosome and lysosome biogenesis. Trends Cell Biol. 28 (11), 957-970 (2018).
  23. Wang, C., et al. Investigation of endosome and lysosome biology by ultra pH-sensitive nanoprobes. Adv Drug Deliv Rev. 113, 87-96 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Hartweefsel van muissubcellulaire fractioneringnanofiltratieplatformsequenti le centrifugatienano flowcytometriedynamische lichtverstrooiingco cultuur van cardiomyocytenendosomale markerskarakterisering van blaasjes

Gerelateerde artikelen