Methodenartikel

Ruimtelijke moleculaire beeldvorming van het glyaom met behulp van massaspectrometrie

1.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69154

⸱

28 november 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Advanced Spatial Biomolecule Research (CASBR), University of Florida, Gainesville, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Florida, Gainesville, 3Markey Cancer Center, University of Kentucky, 4Department of Pathology & Laboratory Medicine, University of Kentucky

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de belangrijkste stappen om rigoureuze en reproduceerbare metingen van zowel glycogeen- als N-gekoppelde glycanen mogelijk te maken met behulp van massaspectrometriebeeldvorming.

Samenvatting

De ruimtelijke organisatie van het glycome binnen weefsels is essentieel voor de moleculaire basis van fysiologische functie. Het diverse en dynamische glycome is cruciaal voor fundamentele cellulaire processen, waaronder metabolisme, signaaloverdracht en adhesie. Innovaties in de ruimtelijke biologie hebben nieuwe wegen geopend voor ruimtelijke moleculaire beeldvorming van diverse glycomeklassen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol voor ruimtelijke biomoleculaire beeldvorming van het glyzeeom in versbevroren muizenlever. De workflow omvat (1) snelle oogst en invriezing, (2) cryostatsectie op optimale dikte en positie, (3) weefselvoorbereiding en enzymdigestie op het weefsel met koolhydraatactieve enzymen, (4) matrixapplicatie en gegevensverzameling met matrixondersteunde laserdesorptie/ionisatie massaspectrometrie beeldvorming (MALDI-MSI), en (5) gegevensverwerking en visualisatie om de bevindingen in een biologische context te plaatsen. Het gebruik van deze methode maakt het mogelijk om gedetailleerde ruimtelijke kaarten van N-gekoppelde glycanen en glycogeen te verkrijgen, waardoor belangrijke fysiologische en cellulaire kenmerken aan het licht komen. Deze gegevens maken het mogelijk om belangrijke ruimtelijke glycomische heterogeniteit te definiëren die samenhangt met leverfunctie en -disfunctie. Deze workflow maakt zeer reproduceerbare en gevoelige ruimtelijke glycomics van de muizenlever mogelijk. Daarnaast is het gemakkelijk aanpasbaar aan andere weefsels of soorten, wat nieuwe ruimtelijke inzichten in glycomebiologie in gezondheid en ziekte mogelijk maakt.

Inleiding

Het vakgebied ruimtelijke biologie breidt zich snel uit en biedt cruciale inzichten in de dynamische ruimtelijke biomoleculaire complexiteit van levende organismen. Er worden meerdere benaderingen gebruikt om verschillende biomoleculen in een biologische context te bestuderen. Hoewel sommige zeer gespecialiseerde technieken zijn, is massaspectrometrie (MS) uitgegroeid tot een belangrijke algemene techniek om een breed scala aan biomoleculen te kwantificeren in de context van cellen, weefsels of organismen.

Matrix-geassisteerde laser desorptie/ionisatie massaspectrometrie beeldvorming (MALDI-MSI) is een van de opkomende algemene technieken voor multiomische ruimtelijke biomolecuulbeeldvorming. Het werd aanvankelijk opgericht voor de visualisatie van eiwitten en peptiden in weefselslices1. Sindsdien is het uitgebreid naar vele diverse biologische monsters en moleculen2. De techniek kan worden toegepast op cellulaire monsters3, organoïden4, modeldieren5 en patiëntmonsters 6,7. Sommige moleculaire klassen kunnen direct worden gemeten met MSI-gebaseerde benaderingen, waaronder veel metabolieten en lipiden, terwijl andere typen complexere biomoleculen, zoals eiwitten en glycanen, enzymatische of chemische behandeling vereisen om geschikt te zijn voor MSI-gebaseerde detectie 2,8.

MALDI-MSI is ook toegepast op de ruimtelijke analyse van N-gekoppelde glycanen en glycogeen, waarbij werkprocessen worden gebruikt die enzymatische verwerking vereisen om glycanfragmenten te produceren die geschikt zijn voor MSI-detectie 9,10,11,12,13,14,15. N-glycanen worden gesplitst uit het asparagineresidu van eiwitten met PNGase F, en glucoseketens van glycogeen worden gesplitst met isoamylase. De belangrijkste voordelen van de MALDI-glycogeenanalyse zijn dat het een ruimtelijke definitie van de glycogeenverdeling in het biologische monster biedt, relatieve kwantificatie en informatie over de vertakking van de glucoseketens. Omdat zowel N-glycaan als glycogeenworkflows enzymatische verwerking van het monster vereisen voor MSI-analyse, zijn ze gecombineerd tot een geïntegreerde workflow voor glycome-analyse (Figuur 1A). Deze workflow vereist zorgvuldige voorbereiding van biologische monsters en specifieke verwerking om MS-analyse van het glycome, gevolgd door gegevensverzameling en -verwerking. Hoewel de workflow een reeks gespecialiseerde stappen vereist, levert het rijke, hoogwaardige ruimtelijke glycome-data op die zeer reproduceerbaar is en kan worden aangepast aan veel verschillende soorten samples16. Daarnaast is de workflow modulair, zodat de monsterverwerkingsstappen door onafhankelijke onderzoekslaboratoria kunnen worden uitgevoerd voordat de monsters worden ingediend bij gespecialiseerde faciliteiten die de laatste stappen van MALDI-MSI dataverzameling en -analyse uitvoeren.

Protocol

Dit onderzoek werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de institutionele Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de University of Florida. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Het oogsten van de lever

  1. Dierlijke euthanasie en dissectie
    1. Voer een cervicale ontwrichting en onthoofding uit om de muis te laten inslapen (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
      OPMERKING: Voor dit voorbeeld werd een 6 maanden oude wild-type C57BL/6J-muis gebruikt. Op deze leeftijd wegen muizen ~25-33 g. Een breed scala aan leeftijden, maten en stammen is goed geschikt voor deze analyse.
    2. Plaats het dier onmiddellijk op een absorberend onderkussen en leg de buikholte bloot met een steriel scalpel.
    3. Met steriele tangen en schaar isoleer je de lever met minimale manipulatie en weefselschade.
      OPMERKING: Metabole veranderingen vinden snel plaats. Vermijd perfusie of sedatie indien mogelijk en zorg ervoor dat de dissectiestappen zo snel mogelijk worden uitgevoerd17.
  2. Was en maak het weefsel snel schoon.
    1. Doop de lever voorzichtig in 1x fosfaatgeborde zoutoplossing (PBS) om eventueel bloed te verwijderen.
    2. Doop het weefsel twee keer in gedeïoniseerd (DI) water.
    3. Dep overtollig water door het tissue voorzichtig op een schone taaglemmer te drukken.
      OPMERKING: Monsters die groter zijn dan wat op een standaard microscoopglaasje past, moeten vóór het bevriezen in stukken worden gesneden.
  3. Monsterbevriezing
    1. Plaats de gereinigde lever direct in een voorgekoelde wegwerpboot van polystyreen die op vloeibare stikstof drijft.
    2. Zodra het weefsel van kleur verandert naar een glanzend ondoorzichtig verschijnsel, plaats je het tissue ongeveer 3 minuten in kant-en-klare en gelabelde aluminiumfoliezakjes op droogijs.
    3. Plaats de aluminiumfolieverpakkingen met de monsters in een vriezer van -80 °C voor opslag. De monsters kunnen langdurig worden opgeslagen bij -80 °C.

2: Bereiding van een biologisch monster

  1. Voorbereiding op cryosectie
    1. Zorg ervoor dat de cryostaat wordt ingeschakeld en in evenwicht is gebracht tot een temperatuur die geschikt is voor het weefsel, tussen -16 °C en -20 °C. De exacte temperatuur hangt af van het type weefsel. De lever moet bij een iets warmere temperatuur worden gesneden, ongeveer -16 °C tot -17 °C, om scheuren in het weefsel te voorkomen, terwijl andere weefsels bij -20 °C moeten worden gesneden.
    2. Zorg ervoor dat er minstens twee chucks, twee dunne verfkwasten, een dun pincet en een 70 mm glazen inzetstuk op de temperatuur in de cryostaat aanwezig zijn. Label daarnaast dia's met potlood voordat je ze in de cryostaat plaatst om eraan te wennen.
    3. Breng het weefsel van de -80 °C vriezer over naar de cryostaat op droogijs.
    4. Laat de weefsels minstens 30 minuten wennen aan de temperatuur in de cryostaat.
    5. Zorg ervoor dat er geen schade is aan de rand van het glazen inzetstuk en dat deze glad is waar het weefsel de anti-roll geleider raakt, door met een handschoen bedekte vinger langs de rand te laten glijden.
    6. Plaats het glazen inzetstuk in de anti-roll geleider.
    7. Neem een laagprofiel lemmet en schuif het voorzichtig in de open bladhouder, en sluit de meshouder. Plaats de rode bladbeschermer over het blad tot je het snijdt.
    8. Bevestig het tissue op de chuck met M1 montagemedia, dat compatibel is met MS. Plaats kamertemperatuur M1 montagemateriaal op de chuck binnenin de cryostaat, waarbij minstens twee ringen op de chuck worden bedekt zodat het tissue op zijn plaats zit.
      OPMERKING: Optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding wordt vaak gebruikt bij cryosectie; het veroorzaakt echter ionenonderdrukking in MS-toepassingen en moet worden vermeden. Als OCT moet worden gebruikt, moet een extra meerstapprotocol worden gebruikt om de OCT te minimaliseren of te verwijderen. Bovendien zullen sommige MS-resourcecentra geen monsters analyseren die in OCT zijn ingebed.
    9. Neem een gekoeld pincet en haal het tissue uit de aluminiumfolie. Gebruik de pincet om het weefsel in de gewenste oriëntatie op de chuck te plaatsen.
    10. Plaats de chuck in de cryostaat zodat het montagemateriaal kan bevriezen, ongeveer 2 minuten. Zodra het bevroren is, wordt het gehard en lijkt het ondoorzichtig.
  2. Cryosectie van leverweefsel
    1. Plaats de chuck met het gemonteerde tissue in de chuckhouder. Plaats de chuck zo dat het weefsel onder een hoek van 90° ten opzichte van het lemmet snijdt.
    2. Trek de chuckhouder terug totdat het weefsel geen contact meer heeft met het mesje. Breng de chuck langzaam naar binnen totdat het weefsel direct naast het mesje ligt om te beginnen met snijden.
    3. Begin met het snijden met een dikte van 30 μm om ongewenst weefsel te verwijderen.
    4. Zorg ervoor dat de diepte van de rolplaat een gladde doorsnede vormt en dat het weefsel niet bovenop de rolplaat rolt. Als dat het geval is, maak dan de rolplaat iets losser. Als het weefsel de rolplaat beweegt en deze een tweede keer raakt bij het resetten van de rotatie, draai dan de rolplaat iets strakker.
    5. Naarmate de gewenste doorsnede nadert, verlaag je de beoogde dikte van de snede tot 10 μm, of een andere gewenste dikte die geschikt is voor de specifieke toepassing.
    6. Maak 10 omwentelingen zodat de chuck de juiste dikte heeft om achterlopen en oneffen delen te voorkomen.
    7. Gebruik een gekoelde penseel om het podium schoon te maken ter voorbereiding op het delen van de sneden. Sluit de rolplaat over het lemmet en neem langzaam een stuk van het weefsel af.
    8. Til de rolplaat op en gebruik de twee gekoelde, dunne penseeltjes om het stuk voorzichtig van het blad af te trekken. Trek het gedeelte naar de zijkant van het podium voor het gemak om het op de slide te monteren.
    9. Neem een gekoelde preparaat van een glaasdrager in de cryostaat en plaats een wijsvinger aan de andere kant van de glaas, waar het weefsel 10 seconden zal liggen.
    10. Leg de glaasglaas voorzichtig op het tissue en til hem weer omhoog. Druk niet hard naar beneden, want dan scheurt het weefsel af. Het weefsel zou op het preparaat moeten smelten en doorschijnend worden.
    11. Breng de glaasjes snel over in een desiccator om te drogen. Droog de glaasje 1 uur in de desiccator.
    12. Na het drogen kunnen de glaasjes direct worden verwerkt voor MS of vacuümverpakt worden en opgeslagen bij -80 °C.

3. Slide-voorbereiding voor MSI van glycomics

  1. Bereiding van enzymen
    OPMERKING: MS-geschikte, laagzout gelyofilieerde PNGase F kan worden gekocht en direct gebruikt.
    1. Isoamylase vereist dialyse om overtollig zout te verwijderen voor MS-toepassingen. Bereid één of meer dialysebekers voor door ze 15 minuten in HPLC-water te plaatsen.
    2. Dialyseer 200 μL standaard isoamylase met een 500 μL dialysebeker in 14,3 mL HPLC-water gedurende 2 uur bij 4 °C, zonder te roeren. Vervang de 14,3 mL HPLC-water door vers HPLC-water en dialyseer nog eens 16 uur ('s nachts) bij 4 °C. Vervang de 14,3 mL HPLC-water door vers HPLC-water en dialyseer nog eens 8 uur bij 4 °C.
    3. Verwijder voorzichtig de isoamylase uit het kopje met een pipet en plaats het in een 1,5 microcentrifugebuis. Meet het totale volume isoamylaseoplossing na dialyse (in μL). Uit de startactiviteit van de voorraad, typisch 200 eenheden/mL, en het uiteindelijke volume, wordt het totale benodigde volume berekend voor 3 eenheden isoamylase.
    4. Pipet-aliquoten van 3 eenheden isoamylase in dunne wandige PCR-buizen. Vriesbuizen in vloeibare stikstof. Bewaar bij -80 °C. Voor elk spuitprotocol kan één tube gedialyseerde isoamylaseoplossing worden gebruikt, wat voldoende is voor vier glaasjes. Vermijd vries-/ontdooicycli om de enzymactiviteit te behouden.
  2. Fixatie en wassen van weefsel
    1. Plaats de glaasjes in een glaashouder en dompel ze onder in een glazen container gevuld met 10% Neutral Buffered Formaline (NBF) gedurende 1 uur.
    2. Verwijder de dia's van de NBF. Doe de slides 2 uur onder in 70% ethanol.
    3. Maak vier Coplin-potten klaar met 70%, 80%, 90% en 100% ethanol. Label elke pot duidelijk om verwarring tijdens het opeenvolgende wassen te voorkomen.
    4. Achtereenvolgens worden de overdrachtsslides als volgt uitgevoerd: 70% ethanol gedurende 5 minuten, 80% ethanol gedurende 5 minuten, 90% ethanol gedurende 5 minuten, 100% ethanol gedurende 5 minuten.
    5. Doe de glaasjes over in een glazen petrischaaltje gevuld met verse 100% xyleen. Zorg dat de glijbanen volledig ondergedompeld zijn. Incubeer de glaasjes op een shaker op 70 rpm gedurende 1 uur, afhankelijk van het lipidengehalte van het weefsel. Herhaal deze stap nog twee keer met verse xyleen per was.
      OPMERKING: Dit protocol is ontworpen om maximale delipidatie mogelijk te maken, aangezien lipiden bekend staan om ionenonderdrukking en dus maximale reproduceerbaarheid. Dit resulteert echter wel in delokalisatie van signalen, waardoor de verkregen resolutie afneemt. Verminderde wasstappen, het beperken van de verwerkingstijd en zorgvuldige controle van de luchtvochtigheid kunnen delokalisatie verminderen en zo leiden tot een verbeterde gegevensresolutie.
    6. Leg de slides 's nachts in een desiccator om te drogen.
    7. Plaats de glaasjes in 70% ethanol voor 1 minuut om te hydrateren. Plaats de slides 3 minuten in DI-water. Herhaal de DI-waterwas met vers DI-water.
    8. Droog de glaasjes 10 minuten in een droogwater, of tot ze helemaal droog zijn.
  3. Voorbereiding van glaasjes voor enzymtoepassing
    1. Bereid een HTX-vochtigheidskamer voor voor door een keukenpapier dat is doordrenkt met DI-water onder het metalen rek te leggen. Plaats de kamer in een broedmachine van 37 °C.
    2. Maak een voedselstomer klaar door het waterreservoir tot de rand te vullen met kraanwater. Zet de timer op 60 minuten om het apparaat aan te zetten.
    3. Bereid citraconische buffer voor door 50 mL HPLC-kwaliteit water, 25 μL citraconzuur anhydride en 2 μL 12 M HCl toe te voegen aan een 50 mL Falcon-buis. Vortex de oplossing 10 seconden om het goed te mengen. Elke 50 mL centrifugebuis met citraconische buffer is voldoende voor vier slides. Controleer of de pH van de oplossing 3,0 is (acceptabel bereik: 2,5-3,5).
    4. Vul elke mailer met de voorbereide citraconische buffer. Plaats het glaasje met het weefsel naar binnen gericht om te voorkomen dat het weefsel de zijkanten raakt en om effectieve antigeenwinning mogelijk te maken. Per mailer kunnen twee dia's worden gebruikt, waarbij de twee randposities worden gebruikt waarbij beide dia's weefsels naar binnen hebben gericht.
    5. Controleer of er stoom wordt uitgestoten door de voedselstomer. Plaats de mailers in de voedselstoommachine en laat ze 30 minuten incuberen.
    6. Breng de mailers over naar een diep waterbad voor 5 minuten. Vervang de helft van de citraconische buffer in de mailer door DI-water en laat het nog eens 5 minuten staan. Herhaal deze verdunning nog twee keer.
    7. Verwijder alle oplosmiddelen en was de glaasjes door 100% DI-water toe te voegen aan de diamailer en daarna het DI-water te verwijderen. Gebruik een laboratoriumdoekje om plekken waar geen weefsel aanwezig is, spotdroog te drogen.
    8. Teken een cirkel en een driehoek op de achterkant van elke slide om de interne standaardlocaties aan te geven. Breng 1 μL 1 mg/mL mierikswortelperoxidase (HRP; cirkel) en 1 μL 10 mg/mL konijnenleverglycogeen (driehoek) aan op de voorkant van de preparat.
    9. Leg de glaasjes 15 minuten in de droogmachine om volledig te drogen.
  4. Enzymbesproeiing en vertering
    1. Verwijder één buisje van 100 μg gelyofilieerde PNGase F (500 eenheden/μg) en één buisje van 3 eenheden isoamylase en laat het 10 minuten ontdooien. Draaibuizen van ~2000 x g gedurende 5 seconden in een microcentrifugebuis. Dit is voldoende enzym om 4 glaasjes te spuiten.
    2. Pipetteer 50 μL DI water naar elke gelyofilieerde PNGase F-buis, vortex zachtjes gedurende 10 s, en draai in een microfuge op ~2000 x g gedurende 5 s. Pipetteer de oplossing van 50 μL PNGase F direct in de isoamylasebuis. Voeg HPLC-water toe aan een uiteindelijke hoeveelheid van 1 mL.
    3. Vortex de duale enzym microcentrifugebuis 10 s en spin naar beneden bij ~2000 x g gedurende 5 s.
    4. Zet de HTX M5-sproeier aan en open de HTX M5-software. Zorg ervoor dat het traytype op Ambient staat onder het tabblad Systeem .
    5. Zet de Knauer-pomp uit door op de stopknop aan de rechtervoorkant te drukken. Zet de externe spuitpomp aan via de schakelaar op het achterpaneel.
    6. Selecteer in de HTX-software onder het tabblad Methods de juiste methode voor dual enzyme spraying. De parameters moeten worden ingesteld op mondstuktemperatuur van 45 °C, 15 passes, debiet van 0,025 mL/min, snelheid van 1200 mm/min, spoorafstand van 3 mm, CC-patroon, druk ingesteld op 10 psi, gasdebiet van 3 L/min en mondstukhoogte van 40 mm.
    7. Ga naar het tabblad Temperatuur en stel de temperatuur van de spuitnozzle in op 45 °C. Gebruik een moersleutel om de spuitlijn naar de bovenste connector te verplaatsen.
    8. Open het ultra-zuivere stikstofgasventiel en zorg ervoor dat de spuitdruk 10 psi is. Stel op de spuitpomp de debiet in op 95 μL/min.
    9. Vul met een verse spuit en naald 4 ml HPLC-water. Verwijder alle bellen. Laat 2 ml water door een ~15 cm lange sectie van de spuitleiding naar een afvalbeker.
    10. Sluit de spuit aan op de spuitleiding en laat het water door de spuitpomp lopen door te starten en te draaien op 95 μL/min gedurende 5 minuten.
    11. Plak tijdens het doorspoelen van de spuitpomp de slides aan de linkerbenedenhoek van de verwarmde bak met een metalen uitlijningsgeleider om te zorgen dat het weefsel binnen het spraygebied ligt. Definieer onder het tabblad Sample de X- en Y-parameters voor het spraygebied, waarbij je lichte overspray toestaat om volledige dekking van de dia's te garanderen.
    12. Na 5 minuten pauzeer je de pomp, koppel je de spuit los, zuig je lucht erin en duw je dan lucht door de sproeileiding om eventueel restwater te verwijderen. Herhaal indien nodig.
    13. Laad de dubbele enzymoplossing in een nieuwe spuit en sluit deze aan op de pomp, zodat er geen belletjes achterblijven.
    14. Bevestig de spuit aan de sproeibuis. Stel bij de spuitpomp de debiet aan op 25 μL/min.
    15. Zodra de spuitnozzle 45 °C bereikt, druk je op Start onder het tabblad Cyclus . Klik op Nee als je wordt gevraagd om de Knauer-pomp aan te zetten. Druk op Start op de spuitpomp om te beginnen met spuiten.
    16. Plaats een lege schuif onder de sproeinozzle om de zichtbare enzymspraydepositie te bevestigen. Zodra je dit hebt waargenomen, klik je op Doorgaan in de software, plaats je het glazen deksel op de spuit en controleer je de spray op een gelijkmatige aanvulling, zoals aangegeven door gelijkmatige natmaking.
    17. Wanneer de spuitcyclus voltooid is, druk je op stop op de pomp, zet je het stikstofgas uit en klik je op Klepbelasting bevestigen. Maak de leiding en het niveau van de spuit schoon en zet de spuit uit, zodat de Knauer-pomp weer aanstaat.
    18. Incubeer de glaasjes in de HTX-vochtigheidskamer bij 37 °C gedurende 2 uur, waarbij je de glaasjes naar boven plaatst. Als het klaar is, plaats je de slides 15 minuten in de desiccator. Slides kunnen een nacht in de desiccator blijven, of het protocol kan worden voortgezet.
  5. MALDI-matrixvoorbereiding en -toepassing
    1. Maak vóór het aanbrengen van de matrix een optisch beeld van de dia-plaat met een scanner.
    2. Weeg 40 mg vaste CHCA in een 15 mL conisch buisje. Los het CHCA-poeder op in een oplossing van 0,1% trifluorazijnzuur en 50% acetonitril (ACN) bij een concentratie van 7 mg/mL.
    3. Sonicaer de matrixoplossing gedurende 10 minuten met cycli van 90 seconden aan en 30 seconden uit. Herhaal deze stappen vijf keer om volledige oplossing en homogeniteit te garanderen.
    4. Zet de HTX M5-sproeier aan en open de HTX M5-software. Open het stikstofgasventiel en zet de systeemdruk op 10 psi.
    5. Selecteer in de HTX-software onder het tabblad Methods de juiste methode voor CHCA-matrixspuiten. Parameters ingesteld op nozzle-temperatuur van 79 °C, 10 passes, debiet van 0,1 mL/min, snelheid van 1300 mm/min, spoorafstand van 3 mm, CC-patroon, druk ingesteld op 10 psi, gasdebiet van 3 L/min en nozzlehoogte van 40 mm.
    6. Ga naar het tabblad Temperatuur , stel de temperatuur van de spuitnozzle in op 79 °C. Onder het tabblad Pomp stel je de debiet in op 100 μL/min.
    7. Plak de geleiders met een metalen geleider vast aan de linkerbenedenhoek van de verwarmde tray om een goede uitlijning in het spuitgebied te garanderen. Definieer onder het tabblad Sample de X- en Y-parameters voor het spraygebied, waarbij je lichte overspray toestaat om volledige dekking van de dia's te garanderen.
    8. Gebruik een wegwerpspuit en naald om 5,5 mL 50% ACN te trekken (verwijder bellen).
    9. Zet de sproeier op LAAD-modus . Steek de ACN-spuit in en injecteer de ACN. Verwijder de ACN-spuit en vervang deze onmiddellijk door een nieuwe spuit met 5,5 mL gefilterde CHCA-oplossing, injecteer en zorg ervoor dat je bellen vermijdt. Zet de spuit op SPRAY-modus .
    10. Zodra de spuitspuit 79 °C bereikt, druk je op Start onder het tabblad Cyclus . Klik op Ja als je erom vraagt.
    11. Gebruik een blanco testglaasje en plaats het onder de spuitmond. Om zichtbare matrix spraydepositie te bevestigen, wordt er een gele matrixdepositie op de glaasglaas gevonden. Zodra je dit hebt waargenomen, klik je op Doorgaan, plaats je het glazen deksel op het instrument en controleer je de spray op consistentie. Consistente spray zorgt voor een slide met een uniforme ondoorzichtigheid.
    12. Wanneer de spuitcyclus voltooid is, zet je de spuit op LAADMODUS en klik je op Klepbelasting bevestigen.
    13. Maak de sproeier schoon door de pomp op 300 psi te zetten en de temperatuur te verlagen tot 30 °C. Neem 5 ml 50% acetonitril twee keer op en duw 5 ml 50% methanol twee keer op en door de leiding. Veeg het podium schoon met 100% methanol. Zodra de temperatuur 30 °C bereikt, schakel je over op LOAD, zet je het gas uit, zet je de spuit uit en zorg je ervoor dat de Knauer-pomp weer aanstaat.
    14. Plaats de glaasjes 15 minuten in de desiccator totdat de matrix volledig droog is. De slides moeten zo snel mogelijk na het spuiten worden uitgevoerd, maximaal binnen 14 dagen, om betrouwbare gegevensverzameling met de juiste signaal-ruisverhouding te waarborgen.

4. MALDI-MSI glycomics-gegevensverzameling

  1. Voorbereiding op gegevensverzameling
    1. Bevestig de schuif met de schuifadapter in de monsterhouder van het MALDI-instrument. Plaats de monsterhouder in de MS en zorg dat deze goed zit voor beeldvorming.
    2. Open de flexImaging-software en importeer de eerder opgenomen optische diabeeld, zie stap 3.4.1. Indien nodig kalibreer de beelduitlijning met de instrumententrap zodat de weefselsecties en standaardplekken correct zijn gepositioneerd voor regioselectie.
    3. Definieer de beeldvormingsgebieden voor de weefselsecties, de HRP-standaard, de glycogeenstandaard en het controlematrix-vierkant in de software. Maak elk een apart gebied.
    4. Stel de rasterstapgrootte in op 50 μm, wat een pixelresolutie van 50 × 50 μm oplevert.
    5. Selecteer in de instrumentbesturingssoftware de positieve-ion MS-modus en stel het scanbereik in op m/z 500 - 4000 met een laag-massa cutoff van 700,00 m/z.
    6. Laad de vooraf geoptimaliseerde MALDI imaging tuning parameter set in de instrumentenbesturingssoftware (of voer de waarden handmatig in indien nodig). Controleer of de bron- en ionenoptische spanningen zijn ingesteld op de gespecificeerde waarden: MALDI Plate Offset 50,0 V; Doorbuiging 1 Delta 70.0 V; Schoorsteen 1 RF 500.0 Vpp; Schoorsteen 2 RF 500.0 Vpp; Multipolige RF 500,0 Vpp; Ionenenergie 5,0 eV. Bevestig de botsingscel en de tijdsinstellingen van de TOF: Botsingsenergie 10,0 eV; Botsing RF 4000.0 Vpp; Overdrachtstijd 180,0 μs; Prepulse opslag 25,0 μs.
    7. Bevestig de laserinstellingen onder het tabblad Laser. Selecteer Imaging 50 μm als standaard applicatie.
    8. Kalibreer de massaspectrometer met een extern kalibermengsel zoals tune mix. Introduceer het kaliber en voer de kalibratieroutine van het instrument uit. Pas de kalibratie zo aan dat de massanauwkeurigheidsfout binnen 0,001% ligt en de kalibratienauwkeurigheidsscore 100%.
    9. Stel de acquisitie in op een burst van 320 lasershots op een frequentie van 10.000 Hz. De laserdemping moet worden ingesteld op 37% om de signaalintensiteit binnen het optimale dynamisch bereik te houden. Pas lasershots en demping aan waar nodig.
    10. Gebruik de geautomatiseerde bundeluitlijningsfunctie, doelprofielaanpassing en focusinstelling van het instrument om ervoor te zorgen dat de laser goed op het monster is gericht. In een gebied buiten het weefsel voer je de Auto Beam Adjust uit onder het Laser-tabblad in de besturingssoftware om de laser uit te lijnen met de ionenoptiek. Dit zorgt ervoor dat de laser en het trap worden afgesteld voor optimale gegevensverzameling. Voer tenslotte doelprofielgeneratie en focusafstemmingsaanpassingen uit in het tabblad voor de sample carrier.
    11. Bevestig dat de interne standaardspots de verwachte ionpieken produceren, wat aangeeft dat ze gereedheid voor gegevensverzameling zijn. De HRP zou een duidelijke glycanpiek moeten hebben van 1211,42. Glycogeen zou regelmatig prominente pieken moeten hebben verspreid, met de hoogste intensiteitspieken op 1013,32, 1175,37 en 1337,43.
      OPMERKING: Als er problemen zijn met de intensiteit, bekijk dan de laserconfiguratie opnieuw. Als er problemen zijn met massanauwkeurigheid, herbekijk dan de kalibratie.
  2. MALDI-MSI gegevensverzameling
    1. Begin met de MALDI-MS beeldvormingsopname voor de gedefinieerde regio's door op de Startknop in de beeldvormingssoftware te klikken. Het instrument rastert de laser automatisch over elk gedefinieerd gebied met intervallen van 50 μm, waarbij bij elke pixel een positief ion MS1-spectrum (m/z 500-4000) wordt verkregen. De gebruikelijke tijd voor een leverdoorsnede bij deze resolutie is 135 minuten.
      OPMERKING: Na de run slaat het instrument automatisch de spectra op voor elke pixel die wordt verkregen, waardoor een .d-map met de ruwe data wordt aangemaakt.

5. MALDI-MSI data-analyse

  1. Data-import en -export
    1. Importeer de dataset in SCiLS Lab, of vergelijkbare MSI-analysesoftware, om intensiteitskaarten van het glycome over de weefselsecties te visualiseren.
    2. Open het SCiLS-lab. Selecteer Nieuw. Selecteer het .mis-bestand uit de MALDI-run.
    3. Zodra het .mis-bestand opent in SCiLS, klik je op Volgende. Selecteer Automatisch bereik voor m/z bereik. Selecteer de automatische as voor Asparameters. Selecteer de absolute bin-grootte. Klik op Volgende en vervolgens op Importeren. Selecteer de map waar het bestand wordt opgeslagen.
    4. Nadat de import is voltooid, open je het nieuwe .slx-bestand.
    5. Klik op bestand, Importeren, en selecteer de optie voor functielijst uit bestand. Importeer glycome-annotaties en maak ionenafbeeldingen door naar het featurelijstvenster te gaan, de juiste lijst te selecteren en op de knop 'maak ionenafbeeldingen' te klikken.
      OPMERKING: Uitgebreide functielijsten zijn beschikbaar voor N-glycans16, 18, 19 en glycogeen13.
    6. Normaliseer de gegevens, waar nodig. Totale ionentelling (TIC) is de meest gebruikte normalisatie.
    7. Zodra de ionenbeelden geladen zijn, ga je door de featurelijst en zorg je voor correcte piekintegratie, waarbij je handmatig de features aanpast waarin de piek niet volledig geïntegreerd is. Om aan te passen, klik met de linkermuisknop op de piek terwijl je shift ingedrukt houdt. Zodra de piek geïntegreerd is, druk je op control en spatiebalk op het toetsenbord. Dit genereert een nieuw ionenbeeld voor de aangepaste piek.
    8. Na het herhalen voor de rest van de feature-lijst, selecteer je binnen het ion-afbeeldingspaneel de Lijst met Functies Opslaan , noem de lijst en klik op Opslaan.
    9. Ga naar bestand, featuretabel en open de featurelijsttabel die net is opgeslagen. Sorteer op m/z. De aangepaste functies verschijnen met een lege cel in de naamkolom. Hernoem de aangepaste pieken door de naam te kopiëren en te plakken en de oorspronkelijke piek te verwijderen door de knop 'verwijder geselecteerde rij uit de featurelijst' te selecteren, die zich bovenaan in het midden van de featuretabel bevindt.
    10. Na het aanpassen van alle namen wordt een definitieve geannoteerde pieklijst verkregen. Klik op de knop 'intensiteit toevoegen ' die zich bij de verwijderknop bevindt. Selecteer vanaf hier de geïnteresseerde samples om de gemiddelde intensiteit van de geannoteerde kenmerken voor elke afgebeelde regio te exporteren.
    11. Zorg ervoor dat je de Peak Area interval verwerkingsmodus en Total Ion Count selecteert voor de normalisatie. Klik op OK. Nieuwe kolommen verschijnen met de bijbehorende gegevens. Om de gegevens te exporteren, selecteer je de pijl die naar buiten wijst en sla je op als .csv.

Resultaten

Zorgvuldige verwerking van een lever van een wildtypemuis, inclusief het doorsnijden van een volledige transversale doorsnede (Figuur 1A), maakte de definitie van het glycome mogelijk door MALDI-MSI, met diverse glycogeen-afgeleide oligosacchariden en N-gekoppelde glycanen over een bereik van m/z (Figuur 1B). Glycogeen was breed gelokaliseerd in de leverhepatocyten en ontbrak aan vaten en bindweefsel in de portale banen, zoals verwacht (Figuur 1C,D). Belangrijk is dat de MALDI-MSI-gegevens het mogelijk maakten zowel de ruimtelijke verdeling van glycogeen als de ketenlengteverdeling te meten, een belangrijk kenmerk van glycogeen in normale stofwisseling en ziektetoestanden (Figuur 1D). Daarnaast vertonen diverse N-gekoppelde glycans diverse organisaties. De waargenomen ruimtelijke verdeling varieert van wijdverspreid in hepatocyten (Figuur 1E) tot regionale foci, consistent met de sinusvormige organisatie van de lever (Figuur 1F), tot specifieke etikettering van portale baanelementen (Figuur 1G-I).

figure-results-1
Figuur 1: MALDI-MSI glycome-analyse van muizenlever. (A) Schematisch voor kritieke methoden bij monstervoorbereiding, gegevensverzameling en analyse. (B) Monster van massaspectra afgeleid van de benadering. Pijlen in rood tonen de regelmatig gespreide oligosacchariden afkomstig van glycogeen, die verschillen door één glucosemonosacharide. Pijlen in blauw duiden N-glycans aan, die verspreid over het spectrum voorkomen. In de lever zijn glycogeenpieken over het algemeen prominenter, vooral bij hogere m/z-waarden. (C) Ruimtelijke verdeling van maltohexaose (DP6) afkomstig van glycogeen in de lever. (D) Verdeling van glycogeenketenlengtes in de lever. (E-G) Ruimtelijke verspreiding van verschillende N-gekoppelde glycansoorten in de lever. (H) Hematoxyline en Eosin (H&E) kleuring voor een gefocust centraal gebied, samen met anatomische annotaties. (I) Overeenkomstige gefocuste inset die de ruimtelijke lokalisatie van extra N-gekoppelde glycaan (Hex5dHex1HexNAc5) in portale tractieelementen toont. Schaalbalken: 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

MALDI-MSI is een opkomend hulpmiddel voor glycome ruimtelijke biologie. Belangrijk is dat, hoewel dit protocol zich richt op gegevensverzameling met specifieke hardware, het gemakkelijk kan worden aangepast aan MALDI-MSI platforms van meerdere leveranciers13. De monsterverwerking is identiek tot en met methode 4, hoewel sommige leveranciers het gebruik van gespecialiseerde dia's vereisen. Aanpassingen van gegevensverzameling, met gebruik van parameters specifiek voor het MALDI-MSI-platform, maken snelle aanpassing van dit protocol mogelijk. Leveranciersspecifieke software voor gegevensverwerking kan worden gebruikt, zoals beschreven in stap 5, of als alternatief kunnen platforms voor rigoureuze en reproduceerbare MALDI-MSI gegevensverwerking worden ingezet19.

MALDI-MSI is een bijzonder nuttig hulpmiddel om biologie te begrijpen, omdat verschillende organen, weefsels en cellen verschillende patronen voor hun glycame hebben. Lever is goed geschikt voor glycome-analyse omdat het hoge glycogeenniveaus en diverse N-gebonden glycanen13 bevat. Andere organen hebben hogere niveaus en diversiteit van N-gebonden glycanen en lagere niveaus vanglycogeen-13. Belangrijk is dat het glycome in verschillende organen varieert afhankelijk van de metabole en ziektetoestand van het organisme, en daarom levert het glycome een rijke bron van biologische informatie 5,14,15,20. De voortdurende ontwikkeling van unieke koolhydraatactieve enzymen voor MALDI-MSI-analyse belooft de glycome-analyse uit te breiden naar andere orthogonale biomoleculen in het glycome.

Hoewel het veel voordelen heeft, is MALDI-MSI momenteel beperkt in resolutie vergeleken met andere hulpmiddelen die in ruimtelijke biologie worden gebruikt. Dit protocol maakte gebruik van dataverzameling met een resolutie van 50 μm. Hoewel uitstekend voor fysiologische analyse, zouden data met enkelcelresolutie het veld21 aanzienlijk vooruithelpen. In het bijzonder kan delokalisatie een aanzienlijke belemmering vormen voor verhoogde resolutie in methodologieën die enzymspuiten en daaropvolgende incubatie onder vochtige omstandigheden gebruiken. Recente ontwikkelingen in monsterverwerkingshardware, monsterverwerkingsmethoden, hardware voor gegevensverwerving, het gebruik van selectieve etikettering en gegevensverwerking maken het mogelijk dat MALDI-MSI-gegevensverzameling cellulaire resolutie22,23 nadert. Er zijn echter afwegingen tussen resolutie en signaal-ruis, en inherente beperkingen gebaseerd op de huidige methoden voor het voorbereiden van monsters voor MALDI die in overweging moeten worden genomen. Zeer specifieke toepassingen bereiken al het doel van single-cel opgeloste MALDI-MSI met innovaties in zowel sample processing24 als nieuwe algoritmen, wat suggereert dat algemene oplossingen voor deze problemen binnen bereikzijn 25,26,27.

Na gegevensverzameling kan de diaa worden gekleurd via H&E voor histologische annotatie. Cellulaire en weefselschade zijn echter geassocieerd met MALDI-MSI gegevensverzameling, waardoor deze strategie de mate van cellulaire annotatie beperkt. Alternatief kunnen sequentiële weefselsneetjes worden gebruikt voor H&E. Deze strategie levert hoogwaardige data, maar vereist uitlijning en integratie van discrete steekproefknipsels.

Opmerkelijk is dat formaline-gefixeerde paraffine-ingebedde (FFPE) weefsels zeer goed geschikt zijn voor glycome-analyse door MALDI-MSI met kleine wijzigingen in het protocol voor monstervoorbereiding13. FFPE-weefsel kan echter niet effectief worden gebruikt voor metabolomics en andere soortgelijke analyses, dus vers ingevroren monsters, zoals hier beschreven, worden geprefereerd voor multiomics-benaderingen28. Monstervoorbereiding is een cruciaal onderdeel van elke MSI-pijplijn voor labiele biomoleculen, wat speciale benaderingen vereist voor het oogsten en omgaan met monsters 17,29,30.

Methodologieën om de algemene en brede toepassing van MALDI-MSI-gebaseerde benaderingen uit te breiden, maken snel vooruitgang met dramatische verbeteringen in hardware en software19. Daarnaast zijn recente geavanceerde multiomic28 - en multimodale21-benaderingen gecombineerd met machine learning en kunstmatige intelligentie bijzonder veelbelovend voor het verwerken van deze zeer complexe datasets31.

Openbaarmakingen

R.C.S., M.S.G. en C.W.V.K. zijn co-directeuren van het Center for Advanced Spatial Biomolecule Research (CASBR) aan de University of Florida en medeoprichters van Sugar3 LLC. R.C.S. heeft onderzoekssteun en/of adviesvergoedingen ontvangen van Maze Therapeutics. M.S.G. heeft onderzoeksondersteuning, onderzoeksverbindingen of adviesvergoedingen ontvangen van Maze Therapeutics, Valerion Therapeutics, Ionis Pharmaceuticals, PTC Therapeutics en Aro Biotherapeutics. M.S.G. is lid van de wetenschappelijke adviesraad van Chelsea's Hope, de Glut1-Deficiency Syndrome Foundation en de Adult Polyglucosan Body Disease Foundation.

Dankbetuigingen

Wij erkennen leden van de Vander Kooi-, Sun- en Gentry-laboratoria voor vruchtbare discussies. Deze studie werd ondersteund door subsidies van National Institutes of Health (NIH) aan de Biospecimen Procurement & Translational Pathology Shared Resource Facility van het University of Kentucky Markey Cancer Center, P30CA177558 aan D.B.A., R01AG066653, R01CA266004, R01AG078702, R01CA288696, RM1NS133593 aan R.C.S., R35NS116824 aan M.S.G., R01DC019054 aan C.W.V.K. en aan het University of Florida College of Medicine.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Absorbent onderlaagDenville ScientificB1623
Acetonitrile (ACN)Sigma-Aldrich34851-4X4L
AluminiumfolieFisher Scientific 15078292
CitracoonanhydrideSigma-Aldrich125318
Conische buis (15mL)Alkali ScientificCW5600
Coplin-pottenDWK Life Sciences900570
Cryostat LeicaCM1860
Cryostat-klemLeica14041926491
DessiccatorBel ArtF424004131
DialysebekerThermo Fisher88400
EthanolFisher Scientific 22032601
VoedselstomerRival CKRVSTLM21  
Glazen inleg (70 mm)Gel CompanyLGI50
GlycogenSigma-AldrichG8876Standaard
Horseradish Peroxidase (HRP)Sigma-AldrichP8125Standaard
HPLC-waterSigma-Aldrich270733-4X4L
HTX-sproeierHTX TechnologiesM5
ZoutzuurFisher Scientific A144-500
IsoamylaseMegazymeE-ISAMY
Knauer-pompKnauerP 4.1 S
LaagprofielmesElectron Microscopy Sciences63059-01
M1-montagemediumEpredia1310
MassaspectrometerBruker DaltonicstimsTOF fleX
Microfugebuis (1,5mL)Alkali ScientificCN3016
NaaldBD305109
Neutraal gebufferd formaline NBFMillipore sigmaHT501128-4L
Stijgend gasAirgasNIUHP300
PBSFisher Scientific SH30256.FS
PCR-buisjesMedSupply Partners62-1091-1
PNGase F PRIME-LY ULTRA Bulldog BioNZPULT10LY
SCiLS LabBruker Daltonics1889000
SchudlerThermo Scientific88882007
Glijschaaltje  Electron Microscope Sciences71873-02
Glijschaaltje-mailRPI products212620A
Sonicater (Bioruptor Pico)DiagenodeB01080010
Steriele pincetDR InstrumentsS08098
Steriele scalpelWPIWPI-500240
Steriele schaarFine Science Tools14084-08
Spuit  Grainger19G342
SpuitpompNew EraNE-300
LintFisher Scientific 15-901-R
Dunne verfkwastAnezus#00
TrifluorazijnzuurSigma-AldrichT6508-1L
Tune Mix, ESI lage concentratieAgilentG1969-85000
WeegschalenSigma-AldrichHS120882
XyleenSigma-Aldrich534056
α-cyano-4-hydroxycininezuur (CHCA)Cayman Chemical Company15254

Referenties

  1. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: Localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).
  2. Buchberger, A. R., Delaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: A review of emerging advancements and future insights. Anal Chem. 90 (1), 240-265 (2018).
  3. Ouedraogo, R., Daumas, A., Capo, C., Mege, J. L., Textoris, J. Whole-cell MALDI-TOF mass spectrometry is an accurate and rapid method to analyze different modes of macrophage activation. J Vis Exp. 82, e50926(2013).
  4. Khalil, S. M., Cappuccio, G., Li, F., Maletic-Savatic, M. Molecular imaging of human brain organoids using mass spectrometry. J Vis Exp. 211, e66997(2024).
  5. Sun, R. C., et al. Brain glycogen serves as a critical glucosamine cache required for protein glycosylation. Cell Metab. 33 (7), 1404-1417 (2021).
  6. Aichler, M., Walch, A. Maldi imaging mass spectrometry: Current frontiers and perspectives in pathology research and practice. Lab Invest. 95 (4), 422-431 (2015).
  7. Conroy, L. R., et al. High-dimensionality reduction clustering of complex carbohydrates to study lung cancer metabolic heterogeneity. Adv Cancer Res. 154, 227-251 (2022).
  8. Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).
  9. Powers, T. W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization imaging mass spectrometry workflow for spatial profiling analysis of N-linked glycan expression in tissues. Anal Chem. 85 (20), 9799-9806 (2013).
  10. Drake, R. R., Powers, T. W., Norris-Caneda, K., Mehta, A. S., Angel, P. M. In situ imaging of N-glycans by MALDI imaging mass spectrometry of fresh or formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Curr Protoc Protein Sci. 94 (1), e68(2018).
  11. Stanback, A. E., et al. Regional n-glycan and lipid analysis from tissues using MALDI-MS imaging. STAR Protoc. 2 (1), 100304(2021).
  12. Hawkinson, T. R., Sun, R. C. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging of glycogen in situ. Methods Mol Biol. 2437, 215-228 (2022).
  13. Young, L. E. A., et al. In situ mass spectrometry imaging reveals heterogeneous glycogen stores in human normal and cancerous tissues. EMBO Mol Med. 14 (11), e16029(2022).
  14. Conroy, L. R., et al. Spatial metabolomics reveals glycogen as an actionable target for pulmonary fibrosis. Nat Commun. 14 (1), 2759(2023).
  15. Clarke, H. A., et al. Glycogen drives tumor initiation and progression in lung adenocarcinoma. Nat Metab. 7 (5), 952-965 (2025).
  16. Wallace, E. N., et al. An N-glycome tissue atlas of 15 human normal and cancer tissue types determined by MALDI imaging mass spectrometry. Sci Rep. 14 (1), 489(2024).
  17. Veerasammy, K., et al. Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging. J Vis Exp. 166, e62008(2020).
  18. Mcdowell, C. T., et al. Imaging mass spectrometry and lectin analysis of N-linked glycans in carbohydrate antigen-defined pancreatic cancer tissues. Mol Cell Proteomics. 20, 100012(2021).
  19. Palmer, A., et al. FDR-controlled metabolite annotation for high-resolution imaging mass spectrometry. Nat Methods. 14 (1), 57-60 (2017).
  20. Colpaert, M., et al. Neurological glycogen storage diseases and emerging therapeutics. Neurotherapeutics. 21 (5), e00446(2024).
  21. Taylor, M. J., Lukowski, J. K., Anderton, C. R. Spatially resolved mass spectrometry at the single cell: Recent innovations in proteomics and metabolomics. J Am Soc Mass Spectrom. 32 (4), 872-894 (2021).
  22. Chan, Y. H., et al. Gel-assisted mass spectrometry imaging enables sub-micrometer spatial lipidomics. Nat Commun. 15 (1), 5036(2024).
  23. Lim, M. J., et al. Maldi Hiplex-IC: Multiomic and multimodal imaging of targeted intact proteins in tissues. Front Chem. 11, 1182404(2023).
  24. Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J Am Soc Mass Spectrom. 18 (9), 1646-1652 (2007).
  25. Rappez, L., et al. Spacem reveals metabolic states of single cells. Nat Methods. 18 (7), 799-805 (2021).
  26. Grgic, A., Cuypers, E., Dubois, L. J., Ellis, S. R., Heeren, R. M. A. Maldi MSI protocol for spatial bottom-up proteomics at single-cell resolution. J Proteome Res. 23 (12), 5372-5379 (2024).
  27. Dressman, J. W., Bayram, M. F., Angel, P. M., Drake, R. R., Mehta, A. S. Single-cell multiomic MALDI-MSI analysis of lipids and N-glycans through affinity array capture. Anal Chem. 97 (24), 12493-12502 (2025).
  28. Clarke, H. A., et al. Spatial mapping of the brain metabolome, lipidome, and glycome. Nat Commun. 16 (1), 4373(2025).
  29. Juras, J. A., et al. In situ microwave fixation provides an instantaneous snapshot of the brain metabolome. Cell Rep Methods. 3 (4), 100455(2023).
  30. Cantrell, A. R., et al. Protocol for high-power, brain-focused microwave fixation to define rodent metabolism. STAR Protoc. 6 (2), 103794(2025).
  31. Ma, X., et al. An AI-driven framework to map the brain metabolome in three dimensions. Nat Metab. 7 (4), 842-853 (2025).

Herprints en machtigingen

Tags

Glycoommappingmassaspectrometrie-beeldvormingMALDI MSIN-gebonden glycanenglycogenlokalisatieenzymatische weefselverteringglycomica van muizenleverkoolhydraat-actieve enzymenruimtelijke glycomische heterogeniteit
Ruimtelijke moleculaire beeldvorming van het glyaom met behulp van massaspectrometrie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.