Methodenartikel

Dynamische klemmethoden om verminderde neuronale prikkelbaarheid geassocieerd met autisme te onderzoeken

1.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69155

⸱

17 oktober 2025

 , 
1Department of Biology, Miami University

In dit artikel

Samenvatting

Dynamische klemelektrofysiologie kan causale verbanden leggen tussen neuronale vuurtekorten en disfunctie van ionkanalen. We beschrijven dynamische klemmethoden en protocollen in de cerebellaire Purkinje-neuronen van muizen, waarbij we nuttige bronnen en technische overwegingen opmerken. In een representatieve studie voegen we gemodelleerde natriumgeleiding toe aan Tsc1-/- Purkinje-neuronen om herhaald vuren te redden.

Samenvatting

Autismespectrumstoornis (ASS) komt voort uit een breed scala aan genetische en omgevingsfactoren. Hoewel talrijke ASS-gekoppelde mutaties de ontwikkeling of plasticiteit van synapsen verstoren, is aangetoond dat een toenemend aantal de expressie en werking van spanningsafhankelijke ionkanalen verandert, wat resulteert in tekorten in neuronale intrinsieke exciteerbaarheid. Spanningsklemopnames van hele cellen kunnen worden gebruikt om te karakteriseren hoe ASS-gerelateerde mutaties de ionkanaalfunctie beïnvloeden. Deze experimenten slagen er echter niet in om direct te beoordelen hoe een veranderde ionische geleiding het afvuren van neuronale actiepotentiaal beïnvloedt. Dynamische klemelektrofysiologie overbrugt deze kloof door real-time injectie van door de gebruiker gedefinieerde ionische geleiding in levende neuronen mogelijk te maken. Dit maakt causaal testen mogelijk van hoe veranderingen in ionkanaaleigenschappen de elektrische activiteit van een bepaald celtype beïnvloeden. In dit artikel over methoden beschrijven we hoe dynamische klemelektrofysiologie kan worden geïmplementeerd in Purkinje-neuronen van volwassen muizen die onder fysiologische omstandigheden worden geregistreerd in acuut geprepareerde cerebellaire hersenplakjes. Purkinje-neuronen zijn een bijzonder relevant model voor dit werk omdat ze een intrinsiek vermogen hebben om repetitieve, hoogfrequente (20-100 Hz) actiepotentialen af te vuren en consequent betrokken zijn bij ASS-gerelateerde disfunctie van het cerebellaire circuit. We richten ons op Tsc1, een gen waarvan de mutaties met functieverlies tot de meest voorkomende monogene oorzaken van ASS behoren. In Purkinje-neuronen van muizen is Tsc1-deletie ook in verband gebracht met verminderde expressie van spanningsafhankelijke natriumkanalen (Nav). We gebruiken Markov kinetische toestandsmodellen om de geleidingseigenschappen van Purkinje-neuronnav te simuleren en te reproduceren en gaan verder met het gebruik van een dynamische klem om direct te beoordelen hoe veranderingen in de Nav-geleiding het intrinsieke afvuren van intacte cerebellaire Purkinje-neuronen beïnvloeden. We bieden instructies en bronnen voor het wijzigen en afstemmen van ionische geleidingsmodellen. Door ionische geleidingsmodellering, dynamische klem en conventionele patch-clamp-technieken te integreren, biedt deze benadering een krachtig en flexibel kader voor het koppelen van genetische verstoringen aan fysiologische resultaten in ASS-relevante neuronen.

Inleiding

Eerdere onderzoeken naar de moleculaire en cellulaire drijfveren van autismespectrumstoornis (ASS) benadrukten vaak synaptische disfunctie als centraal in de pathofysiologie van de stoornis 1,2. Talrijke studies hebben een verhoogde excitatoire synapsdichtheidaangetoond 2,3,4, verminderde synaptische snoei 5 en veranderingen in postsynaptische dichtheidseiwitten 6,7 in ASS-modellen. Recent werk heeft echter aangetoond dat veranderingen in intrinsieke neuronale prikkelbaarheid ook aanjagers zijn van ASS-pathologie. ASS transgene muismodellen en van patiënten afgeleide cellijnen hebben bijvoorbeeld een verminderde generatie van actiepotentiaal aangetoond in cerebellaire Purkinje 8,9,10 en corticale piramidale neuronen11, evenals verzwakte dendritische exciteerbaarheid en synaptische integratie in subklassen van corticale piramidale neuronen12. Kanalopathieën met mutaties met functieverlies in SCN2A, dat codeert voor de spanningsafhankelijke natrium (Nav) kanaal Nav1.2 porievormende α-subeenheid, is nu een bekende monogene oorzaak van ASS13 en er is aangetoond dat ze tekorten veroorzaken in de intrinsieke prikkelbaarheid van verschillende klassen van centrale neuronen 14,15,16,17. Naarmate dit soort onderzoeken vordert, is het belangrijk om causale verbanden te leggen tussen pathogene veranderingen in ionische geleiding en de effecten van deze veranderingen op neuron- en circuitfunctie. Dynamische klemelektrofysiologie biedt een effectieve aanpak voor deze taak. Sharp et al. (1992 en 1993)18,19, samen met Robinson en Kawai (1993)20 beschreven aanvankelijk dynamische klemmethoden waarin een gesimuleerde niet-lineaire ionische geleiding, met of zonder spanningsafhankelijke eigenschappen, wordt geïnjecteerd/toegevoegd in levende neuronen, waardoor onderzoekers in real-time kunnen beoordelen hoe de eigenschappen of vermeende veranderingen in een spanningsafhankelijke ionische geleiding het neuronale vuren beïnvloeden21, 22. okt.

De implementatie van dynamische klemexperimenten is mogelijk gemaakt door verschillende vrij beschikbare softwaresystemen zoals RTXI23, QuB 24,25 en StdpC26; Recente ontwikkelingen hebben de implementatie van dynamische klemmen echter vereenvoudigd met commerciële plug-and-play-systemen waarmee modelgeleiding kan worden ontwikkeld, gewijzigd en toegepast op een enkele computer en binnen een enkel softwarepakket. Hier bieden we protocollen om dynamische klem uit te voeren met behulp van een Sutter dPatch-systeem27 en bieden we een voorbeeldonderzoek waarin we testen hoe de gerichte deletie van tubereuze sclerose 1 (Tsc1)9, een veel voorkomende plaats van mutaties voor ASS28, het intrinsieke vuren van cerebellaire Purkinje-neuronen beïnvloedt als gevolg van veranderingen in de expressie van de spanningsafhankelijke natriumgeleiding8.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de protocollen die zijn goedgekeurd door de richtlijnen van het Miami University Institutional Animal Care and Use Committee (Protocol #1044). Experimenten maakten gebruik van mannelijke en vrouwelijke wildtype C57BL/6J-muizen en transgene lijnen met een C57BL/6J-stamachtergrond. Voor elektrofysiologische experimenten waren de dieren 6-7 weken oud. Alle opnames zijn gemaakt van Purkinje-neuronen in lobben 5, 6 of 7 in de cerebellaire vermis.

1. Opstelling en weefselvoorbereiding voor Purkinje neuron patch-clamp experimenten

  1. Bereid 1 L kunstmatige cerebrale spinale vloeistof (ACSF) met: 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 en 25 mM dextrose bij pH 7,4 (~300 mOsM/L). Bereid ook 250 ml 'snijoplossing' voor met daarin: 240 mM sacharose, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 0,5 mM CaCl2 en 7 mM MgCl2. Spoel (bel) ACSF en snijoplossingen met carbogene (95 % O2/5 % CO2) gas gedurende ten minste 20 minuten vóór gebruik en continu tijdens alle experimenten.
  2. Bereid een hersenplakkamer gevuld met ACSF voor later gebruik. Zorg ervoor dat de cerebellaire plakjes (eenmaal toegevoegd aan de plakkamer) worden ondergedompeld en dat beide zijden van de cerebellaire plakjes worden blootgesteld aan ACSF. Bereik dit door ondergedompelde plakjes op een strak uitgerekt nylon gaas te plaatsen dat ook onder water is.
  3. Bereid het operatiestation voor. Maak vier stukjes tape klaar die zullen worden gebruikt om het verdoofde dier vast te pinnen. Plaats in een met ijs gevulde emmer of ijspan de onderste helft van een petrischaal in het ijs met de wanden naar beneden en de bodem van de petrischaal naar boven. Leg een filtreerpapier (≥ 3cm2) op de bodem van de petrischaal en verzadig met 2-3 ml snijoplossing.
    OPMERKING: Voor de beschreven experimenten wordt een compresstoom vibratoom gebruikt om 350 μM parasagittale cerebellaire plakjes te snijden. Met het kompresstoom wordt weefsel voor het snijden gelijmd op een plastic preparaatbuis die door een omringende dunne metalen buis past. Tijdens het snijden wordt de preparaatbuis door de metalen buis geduwd, die vast blijft zitten. Nadat het weefsel op de monsterbuis is gelijmd, wordt het weefsel ingebed in verwarmde 2% agarose. Het lemmet van het kompres is gelijmd op een vaste houder, die aan de arm van de vibratoom is bevestigd. Andere soorten vibratomen vereisen geen inbedding van weefsel in verwarmde agarose, maar zouden even goed moeten werken voor de beschreven experimenten.
  4. Leg ook een enkelzijdig scheermesje in het ijs en een klein bekerglas (10 ml) gevuld met snijoplossing. Bewaar een koelblok, dat wordt gebruikt om de opgewarmde agarose snel af te koelen zodra deze aan de monsterbuis is toegevoegd, evenals een spuit van 30 ml gevuld met snijoplossing die gekoeld op het ijs is bewaard. Zorg ervoor dat de spuit van 30 ml is aangesloten op een stuk intraveneuze (IV) slang van 30-60 cm (via Luer lock mannelijke tapsheid) dat is aangesloten (aan het afsluitende uiteinde) op een naald (≥ 26 G) met een Luer lock vrouwelijke basis.
  5. Plaats de resterende snijoplossing in een vriezer van -80 °C. Zodra deze snijoplossing een gesmeerde ijsconsistentie is geworden (20-25 min), haal je hem uit de vriezer van -80 °C en leg je hem op ijs.
  6. Verdoofd een volwassen muis van 5-8 weken oud met een intraperitoneale injectie van 1 ml/kg dierlijk gewicht ketamine (10 mg/ml)/xylazine (0,25 mg/ml) cocktail.
  7. Maak een 2% agarose-oplossing door 0,5 g agarose op te lossen in 25 ml snijoplossing. Nadat het dier is verdoofd (reageert niet op teenknijpen), verwarmt u de 2% agarose-oplossing (~30 s in de magnetron) en brengt u de verwarmde agarose-oplossing over naar een waterbad van 40 °C.
    OPMERKING: Stappen genummerd 1.8-1.18 moeten met spoed worden voltooid en voordat de opgewarmde agarose stolt.
  8. Speld de ledematen van het dier met tape vast aan de operatietafel. Open met een schaar de borstholte van het dier en zorg ervoor dat de longen en buikorganen niet worden doorgesneden. Gebruik een vergrendelingstang of hemostaten om de ribbenkast open te houden, waardoor het hart bloot komt te liggen. Om dit te bereiken, vergrendelt u de tang op het borstbeen en legt u deze voorzichtig in de richting van de voorkant van het dier (met de vingergaten van het gereedschap naast de kop van het dier).
  9. Steek de naald die is aangesloten op de spuit van 30 ml in de linkerventrikel en gebruik een tang om het weefsel rond de naald samen te drukken, waarbij de naald in de linker intraventriculaire kamer wordt gehouden. Maak met een chirurgische schaar een kleine snee in het rechter atrium en doordrenk het dier snel met de 25 ml gekoelde snijoplossing.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat perfusaat de linker hartkamer binnendringt en het rechter atrium verlaat, waardoor het bloed uit de bloedsomloop van het dier wordt verwijderd.
  10. Wanneer de perfusie is voltooid, onthoofdt u het dier snel en snijdt u de hoofdhuid langs de middellijn van het hoofd in de richting van de bregma om het oppervlak van de schedel bloot te leggen.
  11. Verwijder met een schaar bindweefsel van het achterste deel van de schedel en verwijder overtollig ruggenmergweefsel, waarbij u ervoor zorgt dat het ruggenmerg niet uit het foramen magnum steekt.
  12. Plaats een schaarblad in het foramen magnum en snijd langs de omtrek van de schedel op beide temporele aspecten in de richting van bregma, waarbij er wat schedelweefsel op zijn plaats blijft bij bregma.
  13. Plaats een schaarblad of een halve fijne tang in het foramen magnum en til het naar boven op, waarbij de schedel van de hersenen wordt gescheiden. Pas op dat u het schaarblad of de tang niet in de hersenen duwt tijdens het optillen van de schedel.
  14. Gebruik een spatelchirurgisch hulpmiddel om onder de hersenen (vanaf de voorkant) te scheppen en verwijder de hersenen voorzichtig in het bekerglas van 10 ml met gekoelde snijoplossing, waarbij u ervoor zorgt dat het cerebellum wordt beschermd terwijl de hersenen worden overgedragen. Trek in dit stadium schone handschoenen aan.
  15. Haal de hersenen voorzichtig uit het bekerglas (met behulp van de spatel) en leg deze op het filtreerpapier (op een petrischaaltje). Gebruik het enkelzijdige mes om langs de parasagittale as op enkele millimeters van de middellijn te snijden. Gooi het kleinere parasagittale doorsnede weefsel weg. Maak een tweede coronale snede halverwege de voorhersenen (voorste van het cerebellum). Gooi het coronaal gesneden weefsel weg dat zich vóór het cerebellum bevindt.
  16. Schuif het enkelzijdige mes onder het voorste deel van de voorhersenen en til het op om het resterende weefsel te draaien, zodat de kant van de initiële parasagittale snede naar beneden is gericht (op het filterpapier) en de ongesneden cerebellaire hemisfeer naar boven is gericht.
  17. Plaats de preparaatbuis rechtop in het ijs en breng een dunne laag secondelijm (cyanoacrylaatlijm) aan op het oppervlak van de buis. Breng met behulp van een spatel met een bocht van 90° het hersenweefsel voorzichtig over van het filterpapier naar het oppervlak van de monsterbuis, waarbij de weefseloriëntatie behouden blijft. Zorg ervoor dat de niet-gesneden cerebellaire halve bol naar boven gericht blijft. Zodra het weefsel op de preparaatbuis is geplaatst/gelijmd, schuift u de metalen buis omhoog zodat deze het hersenweefsel omringt.
  18. Gebruik een gemotoriseerde pipet van 10 ml om de monsterbuis te vullen met de opgewarmde agarose (inbedding van het hersenweefsel). Koel het weefsel (nu ingebed in verwarmde agarose) snel af door het koelblok ~30 s om de metalen buis te klemmen.
  19. Plaats de monsterbuis in de vibratome-badkamer en vul het bad met de geslugelde snijoplossing. Spoel de snijoplossing continu tijdens het snijden van hersenweefsel, maar stel de cerebellaire plakjes niet direct bloot aan gasbellen.
  20. Snijd 300-350 μm parasagittale plakjes en breng elke plak onmiddellijk over naar de plakkamer, gevuld met spoeld ACSF op kamertemperatuur. Zodra alle plakjes in de plakkamer zitten, incubeer je de plakkamer gedurende 25 minuten in een waterbad van 33 °C.
  21. Plaats na 25 minuten in het waterbad de plakkamer (opnieuw) op kamertemperatuur en wacht nog minstens 35 minuten voordat u patch-opnames probeert te maken van een van de cerebellaire plakjes.

2. Configureren van een op Markov gebaseerd geleidingsmodel in dynamische klem

OPMERKING: Dynamische klem is de real-time toepassing van een gemodelleerde geleiding op een levende cel. Membraanspanning wordt geregistreerd/gesampled via een scherpe of patch-elektrode en het gedigitaliseerde signaal wordt naar dynamische klemsoftware gestuurd, die met behulp van de toegepaste ionische geleidingsmodel(len) de juiste dynamische klemstroominjectie voor de bemonsterde spanning berekent. Het berekende dynamische stroominjectiesignaal wordt naar de versterker en de eindtrap gestuurd om (via de elektrode) in de cel te worden geïnjecteerd. Om een gemodelleerde geleiding op de juiste manier toe te voegen aan een cel die actiepotentialen afvuurt, die snelle transiënte veranderingen in membraanspanning veroorzaken, moet de frequentie van de spanningsbemonstering hoog genoeg zijn en moet de vertraging tussen het spanningsmonster en de dynamische klemstroominjectie (soms latentie genoemd) minimaal en invariant zijn29.

  1. Ontwikkel of verkrijg voorafgaand aan een dynamisch klemexperiment het wiskundige model voor de ionische geleiding(en) die in het dynamische klemexperiment moeten worden gebruikt. Deze modellen kunnen de vorm hebben van een Markov-kinetisch toestandsmodel, een Hodgkin-Huxley (HH)-model of passieve (lineaire) geleiding. Zorg ervoor dat het gekozen geleidingsmodel de kinetische en spanningsafhankelijke eigenschappen van de beoogde ionische geleiding nauwkeurig reproduceert.
    OPMERKING: Experimentatoren kunnen de eigenschappen van een gemodelleerde ionische geleiding bevestigen, voorafgaand aan gebruik in dynamische klemexperimenten, door de gemodelleerde geleiding (in silico) te testen in simulatiestudies met spanningsklemmen. Belangrijke eigenschappen en overwegingen van Markov kinetische toestands- en HH-geleidingsmodellen worden beschreven in de sectie Discussie. De onderstaande stappen beschrijven het opzetten van een Markov-geleidingsmodel in dynamische klemsoftware.
  2. Maak of verkrijg een Markov-toestandsovergangsdiagram voor het geleidingsmodel dat moet worden gebruikt in dynamische klemexperimenten. Gebruik dit diagram om het Markov-geleidingsmodel nauwkeurig samen te stellen binnen de dynamische klemsoftware (hieronder beschreven).
    OPMERKING: SutterPatch is de software voor gegevensverzameling van de dPatch-versterker. Dynamische klemexperimenten kunnen worden uitgevoerd binnen de software, waardoor de assemblage en toepassing van gemodelleerde geleidingen via stroominjectie tijdens stroomklemprotocollen mogelijk is. Een Markov-toestandsovergangsdiagram voor een gemodelleerde spanningsafhankelijke natriumgeleiding, gebaseerd op Nav-stroommetingen van Purkinje-neuronen van muizen, wordt weergegeven in figuur 1A. Dit model is ontwikkeld door Ransdell et al., 202230 en is gebruikt om de rol van de persistente en oplevende natriumstroomcomponenten bij het afvuren van Purkinje-neuronen te onderzoeken31. De poorttoestanden (C, IC, IF, IS en O) zijn met elkaar verbonden door overgangssnelheidsconstanten, aangeduid door variabelen (d.w.z. S0, S3, S1, S4). Dit model wordt gebruikt in de representatieve dynamische klemexperimenten en kan worden gedownload op GitHub: https://github.com/morenomdphd/Resurgent_INa.
  3. Open in de software voor gegevensverzameling het venster Dynamic Clamp Editor via het tabblad SutterPatch > Dynamic Clamp Editor of door op het bijbehorende pictogram in het dashboardvenster te klikken. Delen van het venster van de dynamische klemeditor worden weergegeven in Figuur 1B.
    OPMERKING: Het venster Dynamic Clamp Editor bevat alle benodigde instellingen om de gemodelleerde geleiding toe te passen tijdens een opnameprotocol voor de stroomtang. De interface van de geleidingspool (Afbeelding 1B, linksboven) stelt gebruikers in staat om groepen modelgeleiding te organiseren en tegelijkertijd te laden.
  4. Maak in de interface van de geleidingspool (Afbeelding 1B, linksboven) een pool door op Nieuw te klikken en deze naar wens een naam te geven. Zodra een geleidingsgroep is geselecteerd, selecteert u aan de rechterkant van het venster in de Headstage-selectorinterface (Figuur 1B, linksonder) het type model voor de respectieve geleidingspool (Model-Markov, Hodgkin-Huxley, variabele geleiding, enz.) en wanneer de modelgeleiding(en) moeten worden toegepast, zoals tijdens een routine/protocol (Actieve modus). Met de keuze-interface van de hoofdtrap kunnen ook de dynamische klemupdatesnelheid (in kHz) en de spanningssignaalbron worden geselecteerd (zie afbeelding 1B, rechts). Selecteer bij Voltage Signal Source de headstage die het voltage signaal.
  5. Selecteer in het keuzepaneel Headstage voor het voorbeeld Nav conductance Markov-model (Afbeelding 1A) de optie Markov-model voor Model, Tijdens Sweeps voor Actieve modus, 200 kHz voor Update Rate en Headstage 1 voor Voltage Signal Source. Controleer het Signaal toepassen en opdracht geven aan AuxOUT1 om modelberekeningen te starten als reactie op het spanningssignaal en voeg dynamische klemstroominjectie toe aan respectievelijk alle stroomklemprotocollen (Afbeelding 1B, linksonder).
  6. Onder de hoofdpanelen van de Dynamic Clamp Editor bevindt zich de toestandsmatrix (Figuur 1C, onderaan). Bewerk de statusmatrix door eerst te klikken op Modelparameters bewerken in de selectie-interface van het hoofdpodium (Afbeelding 1B, linksonder). Naast de editor verschijnt een nieuw venster met de naam Dynamic Clamp Markov Model Parameters. Voer in dit paneel de toestandsmatrixvergelijkingen in die de geleiding van het Markov-model vertegenwoordigen.
  7. Selecteer in het deelvenster Kanaalinstellingen (Afbeelding 1B, rechtsboven) welke opgeslagen geleidingsmodellen moeten worden toegepast (in dynamische klem). U kunt ook een leeg kanaal selecteren en beginnen met het maken van een nieuwe modelgeleiding. Voer aan de rechterkant van dit paneel de V-omkering in (gemodelleerde geleidingsion(en) omkeringspotentiaal). Voor onze studie waarbij gebruik wordt gemaakt van een natriumgeleiding, voert u 55,0 mV in om het omkeringspotentieel van natrium weer te geven op basis van de ACSF en de interne oplossing van de patch-elektrode.
  8. Geef ook in het deelvenster Kanaalinstellingen het aantal kinetische toestanden van de geselecteerde geleiding op (zie Afbeelding 1B, rechtsboven, rood vak). Voer hier 9 in om de 9 kinetische toestanden van de gemodelleerde geleiding weer te geven (zie afbeelding 1A).
  9. Onder het deelvenster Kanaalinstellingen bevindt zich het deelvenster Toestandsvergelijkingen . Plaats de vergelijkingen van de overgangssnelheid van de toestand op de juiste manier in de poorttoestandsmatrix om de topologische rangschikking van het Markov-model weer te geven. Voer de vergelijkingen in het deelvenster Toestandsvergelijkingen in en geef een ID op, beginnend bij "S0" (Figuur 1B, midden).
    OPMERKING: De volgorde waarin deze vergelijkingen worden ingevoerd is niet belangrijk, zolang deze variabelen maar op de juiste manier zijn ingevuld in de gating state-matrix om de topologie van het Markov-model weer te geven.
  10. Als u de matrix van de poorttoestand wilt vullen met de nu gedefinieerde variabelen voor de snelheidsconstante, klikt u op Toestandsmatrix bewerken aan de rechterkant van het deelvenster Toestandsvergelijkingen (Afbeelding 1B, midden). Elke kinetische toestand krijgt een getal, beginnend bij 0. Bijvoorbeeld, voor een model met twee kinetische toestanden, die toestanden X en Y bevatten, worden deze toestanden "0" en "1" genoemd en bevatten ze twee overgangssnelheidsconstanten a1 en b1, waarbij a1 overgaat van 0 naar 1 en b1 overgaat van 1 naar 0.
  11. Om deze vergelijkingen op de juiste manier met elkaar te verbinden met behulp van de State Matrix Editor (Figuur 1B, onder), voert u de snelheidsconstanten in een tabel in met genummerde rijen en kolommen, beide beginnend bij 0 (zie voorbeeld in Figuur 1C).
    OPMERKING: De verplaatsing van de ene toestand naar de andere wordt bepaald door hun positie in deze tabel in de vorm "rij naar kolom". In het voorbeeld van het tweetoestandsmodel in stap 2.1 is de overgang van toestand 0 naar toestand 1 bijvoorbeeld afhankelijk van de snelheidsconstante "a1" die vervolgens in rij 0, kolom 1 wordt geplaatst. De overgangssnelheidsconstante "b1" drijft overgangen van toestand 1 naar toestand 0 aan, en daarom moet de snelheidsconstante in rij 1, kolom 0 worden geplaatst. In Figuur 1C heeft het voorbeeld van de gating state-matrix snelheidsconstanten die de topologie van het Nav-geleidingsmodel weerspiegelen dat wordt weergegeven in Figuur 1A. "S0" is bijvoorbeeld de snelheidsconstante die de overgangen van de kinetische toestand van IC1 naar de IC2 definieert; daarom wordt "S0" in rij 0, kolom 1 van de Gating State Matrix geplaatst (Figuur 1C). De vergelijkingen van de overgangssnelheidsconstante die de variabele van elke snelheidsconstante definiëren, vullen vervolgens een gevulde toestandsmatrix (Figuur 1C, lager).
  12. Aangezien de vergelijkingen met de snelheidsconstante zijn verbonden via het bewerkpaneel van de toestandsmatrix, worden de verbindingen (de corresponderende rij en kolom) gevuld in het deelvenster Verbindingen naast de vergelijking (Afbeelding 1B, rechtsmidden). Let op de open/geleidende toestand in het representatieve natriumgeleidingsmodel (Figuur 1A), toegevoegd aan rij en kolom 7 van Figuur 1C (bovenaan, rode vakken), wat belangrijk is voor de volgende stap.
  13. Gebruik in afbeelding 1B (rechtsonder) het deelvenster Geleidingsvergelijkingen (nS) om de amplitude te definiëren van de modelgeleiding die wordt toegepast tijdens de dynamische klem. Selecteer de open/geleidende toestanden in het Markov-model en geef een geleidingswaarde op (Figuur 1B, onder, rood vak).
  14. Voer voor dit experiment "400 nS" in het vak "G7" in, dat piekwaarden voor Nav-stromen toevoegt die vergelijkbaar zijn met de piek-Nav-stromen die zijn gemeten in spanningsklemstudies op Purkinje-neuronen van muizen.
  15. Zodra de bovenstaande stappen zijn voltooid, klikt u op Laden om het model klaar te maken voor dynamische klemtoepassing zodra een stroomklemroutine is gestart.
  16. Gebruik een soortgelijk proces om HH-modellen te rangschikken; voeg echter vergelijkingen toe om onafhankelijke poorttoestanden (in poortvergelijkingen) en geleiding onder G maximum te definiëren.
  17. Om dynamische klemgeleiding toe te passen, maakt u eerst een stroomklemroutine met behulp van de Routine Editor (klik op het tabblad SutterPatch > Routine Editor) (Afbeelding 1D). Als u een stroomklemroutine wilt maken, selecteert u het bovenliggende uitgangskanaal (in dit voorbeeld is dit StimOut1). Dit opent een paneel waarmee de gebruiker de uitvoer van de stroomopdracht tijdens de routine kan definiëren. Zorg ervoor dat de opnamemodus is ingesteld op CC_Mode in de routine-editor.
    OPMERKING: In de representatieve experimenten, omdat dit protocol werkt met spontaan vurende cellen, wordt een gap-free stroomklemroutine/protocol met nulstroominjectie gebruikt.
  18. Definieer in de Routine Editor Input Channels (Figuur 1D, rechtsboven) invoersignalen, die tijdens experimenten de opgenomen scopevensters zullen vullen. Deze ingangen moeten een spanningssignaal bevatten en ook de commandostroominjectie van de routine, evenals de dynamische klemstroominjectie, respectievelijk Current1 en AuxIN1 genoemd (Figuur 1D, linksonder).
  19. Voor stroomtangroutines waarbij positieve en/of negatieve stroominjectie-opdrachten worden gegeven, wordt het commandostroominjectiesignaal automatisch gecombineerd met het dynamische klemstroomsignaal. Maak een virtueel scopevenster om het commandostroomsignaal af te trekken, zodat er een registratie is van de geïsoleerde dynamische klemstroominjectie. Om het nieuwe virtuele bereikvenster te maken, selecteert u eerst een extra invoerkanaal door het selectievakje Virtueel1 in te schakelen.
  20. Selecteer in de routine-editor onder Wiskundig type de optie Vergelijking en selecteer (onder Bronkanaal) het invoersignaal van de stroomklemroutine, in dit voorbeeld Current1. Voer een vergelijking in het open veld in om het stroomtang-opdrachtsignaal af te trekken van het dynamische stroominjectiesignaal.
    OPMERKING: Voor dit voorbeeldexperiment wordt dit gedaan met de vergelijking t[3]-t[2]. Het Virtual1 scope-venster geeft nu de dynamische klemstroominjectie weer (geïsoleerd van het stroomcommandosignaal). Gebruikers hebben de mogelijkheid om de labels van invoer- of uitvoerkanalen aan te passen door te dubbelklikken onder Label.

3. Het verkrijgen van stroomklemopnames van Purkinje-neuronen van muizen in parasagittale cerebellaire plakjes

  1. Rust de elektrofysiologie-installatie uit met een weefselplakkamer die (door zwaartekracht) is geperfundeerd met ACSF en is opgewarmd tot bijna fysiologische temperatuur (34-36 °C). Plaats voorzichtig een parasagittale cerebellaire schijf in de plakkamer en gebruik een plakharp om de cerebellaire schijf in een ondergedompelde en vaste positie te houden. Zorg ervoor dat een geslepen elektrode met chloride en een temperatuursonde ook ondergedompeld en stabiel zijn in de cerebellaire plakkamer.
  2. Lokaliseer de Purkinje-neuronlaag met behulp van een 40x onderdompelingsobjectieflens. Purkinje-neuronen zijn groot en druppelvormig. Het plasmamembraan van gezonde Purkinje-cellen ziet er meestal glad uit en de kern is niet zichtbaar.
  3. Zodra een gezond Purkinje-neuron is geïdentificeerd en gericht op patch-clamp-opname, stelt u de objectieflens van de microscoop naar boven in. Plaats en focus op de punt van een glazen micro-elektrode die is bevestigd aan een elektrodehouder en het hoofdpodium. Bedien de headstage/micro-elektrode door een 3-assige robotachtige micromanipulator.
    OPMERKING: Zorg er voor deze experimenten voor dat micro-elektroden weerstandswaarden hebben van 2-4 MΩ en gevuld zijn met een geschikte interne stroomklemoplossing. De interne oplossing die in representatieve experimenten wordt gebruikt, bevat: 144 mM K-gluconaat, 0,2 mM EGTA, 3 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 4 mM Mg-ATP en 0,5 mM Na-GTP.
  4. Voordat u het doelpurkinje-neuron nadert, voegt u 2-3 ml positieve luchtdruk toe aan de drukpoort van de elektrodehouder.
  5. Schakel over naar de VC-modus op het bedieningspaneel van de versterker en pas elektrodecompensatie en elektrodespanningsoffsetfuncties toe. In het voorbeeld hier doet u dit door op Auto te klikken naast de opties elektrodecompensatie en spanningsverschuiving.
  6. Begin met een continu testprotocol voor membraanafdichting (klik op Membraantest). Stel de membraantestparameters in op (of in de buurt van) 5 ms sweeps met een stap van 5 mV of 10 mV. Stel het houdpotentieel (V-holding) in op 0 mV.
  7. Beweeg de micro-elektrode in de richting van de doelcel en pas het brandvlak aan om de focus op of iets onder de punt van de elektrode te houden. Plaats de elektrode iets boven het plasmamembraan van de beoogde cel. Gebruik de micromanipulator en de positieve druk van de elektrodepunt om extracellulair vuil van de doelcelsoma weg te duwen en het oppervlaktemembraan te 'reinigen'.
  8. Nadat de doelcel vrij is van extracellulair puin, plaatst u de elektrode langzaam in de buurt van het oppervlak van het membraan aan het brede uiteinde van het Purkinje-neuron soma, van waaruit het axon zich uitstrekt vanuit het cellichaam. Als de elektrodepunt naar het membraan wordt neergelaten, zal er waarschijnlijk een kuiltje zichtbaar worden op het membraanoppervlak (vanwege de positieve druk van de elektrode). Laat nu de positieve druk los en gebruik mondzuiging om een kleine hoeveelheid negatieve druk uit te oefenen.
  9. Wijzig in het bedieningspaneel van de versterker de V-houdpotentiaal in -80 mV (was 0 mV). Bij het bewaken van de membraanafdichtingstest, wanneer de pipetweerstand ≥ 1 GΩ bereikt, verhoogt u de onderdruk en klikt u op de Zap-functie op het membraanafdichtingstestpaneel om het membraan te scheuren en een patch-clamp-configuratie voor de hele cel te bereiken.
  10. Gebruik een kort spanningsklemprotocol om de passieve eigenschappen van het membraan (capaciteit en ingangsweerstandswaarden) te meten voordat u via het bedieningspaneel van de versterker overschakelt naar de stroomklemmodus.
  11. Pas na het overschakelen naar de stroomklemmodus een brugbalanscompensatie toe tot ≥ 70%.
  12. Voordat een dynamische klemgeleiding met een patch-elektrode wordt toegepast, moet u de junctiepotentiaalfout corrigeren (die wordt berekend op basis van de samenstelling van de interne elektrode en ACSF-oplossingen). Pas voor de oplossingen in de representatieve experimenten een junctiepotentiaalcorrectie van 17,5 mV toe. In dynamische stroomtangstudies is een nauwkeurige junctiepotentiaalcorrectie van cruciaal belang, zodat een nauwkeurig spanningssignaal wordt gebruikt door geleidingsmodel(len) om dynamische klemstroominjecties te berekenen.

4. Toepassen van de dynamische klemgeleiding

  1. Omdat Purkinje-neuronen spontaan repetitieve actiepotentialen afvuren, registreren ze vuureigenschappen voordat ze een gemodelleerde ionische geleiding toevoegen (of aftrekken) om de gezondheid van de cel te testen en om basislijneigenschappen van membraanprikkelbaarheid te meten. Pas de gemodelleerde geleiding toe door op Laden te klikken in het venster met dynamische kleminstellingen . Er is nu een klein DynC-label zichtbaar op de dPatch-controller, dat CC overlapt (zie Figuur 1D, rode vakken).
  2. Nadat de dynamische klem is ingeschakeld/belast, wordt de dynamische klemgeleiding automatisch toegepast terwijl een stroomtangroutine/protocol actief is. Bekijk de dynamische klemstroominjectie op het scopevenster die overeenkomt met het door AuxIN1 geselecteerde ingangssignaal.
    OPMERKING: Afwisselende opnames van spontaan vuren met en zonder toepassing van dynamische, klemgemedieerde geleiding is belangrijk om te bepalen hoe de toegepaste modelgeleiding de prikkelbaarheid beïnvloedt en om te bepalen of de basislijnniveaus van prikkelbaarheid stabiel/consistent zijn gedurende het hele experiment.

Resultaten

In de gepresenteerde experimenten passen we, met behulp van een dynamische klem, een gemodelleerde spanningsafhankelijke natrium (Nav) geleiding toe op volwassen (6-7 weken oude) cerebellaire Purkinje-neuronen van muizen die acuut geïsoleerd zijn in een parasagittaal cerebellair plakpreparaat. De studies worden uitgevoerd op wildtype (controle) muizen en transgene muizen, waarbij Cre-loxP-recombinatie wordt gebruikt om tubereuze sclerose 1 (Tsc1) selectief uit cerebellaire Purkinje-neuronen te verwijderen. Tubereuze sclerose complex (TSC) is een multisysteemaandoening die wordt veroorzaakt door mutaties met functieverlies in TSC1 of TSC2 32,28,33. Personen met TSC worden vaak gediagnosticeerd met epilepsiestoornissen, cognitieve stoornissen en autismespectrumstoornis 34,35. Muizen met Purkinje-neuronspecifieke Tsc1-deletie, hier aangeduid als Tsc1mut/mut, vertonen verschillende ASS-gerelateerde gedragsfenotypes, waaronder stoornissen in motorische functie, sociaal interactiegedrag en vocalisaties, evenals overdreven repetitief gedrag 9,36. Tsc1mut/mut Van Purkinje-neuronen is ook aangetoond dat ze een verzwakt actiepotentiaal afvuren hebben (Figuur 2A,B), wat verband houdt met significant verminderde Nav-stroomamplitudes (Figuur 2C) en Nav-kanaalexpressie op de axon-initiële segmenten van Tsc1mut/mut Purkinje-neuronen8. Nav-stromen inTsc1mut/mut Purkinje-neuronen hebben vergelijkbare kinetische en spanningsafhankelijke eigenschappen als wildtype Purkinje-neuronen8. In dit transgene Tsc1mut/mut muismodel hebben we een dynamische klem gebruikt om te testen of het toevoegen van Nav-geleiding aan Tsc1mut/mut Purkinje-neuronen herhaald vuren kan redden. We gaan verder met testen of het aftrekken van Nav-geleiding in wild-type Purkinje-neuronen een vergelijkbare verzwakking veroorzaakt in het vuren van Purkinje-neuronen, zoals gemeten in Tsc1mut/mut Purkinje-neuronen (Figuur 2B). Om de native tot uitdrukking gebrachte Nav-geleiding af te trekken, hebben we de Nav-geleiding toegepast met behulp van een dynamische klem; De polariteit van de geleiding is echter omgekeerd.

Het Markov kinetische toestandsmodel (Figuur 1A) dat wordt gebruikt om de geleiding van Purkinje-neuron Nav te simuleren, bevat negen kinetische toestanden, waarvan er acht niet-geleidend zijn, die worden gelabeld als gesloten (C1, C2 en C3), geïnactiveerd-gesloten (IC1 en IC2), snel-geïnactiveerd (IF1 en IF2) en langzaam-geïnactiveerd (IS). Er is één open/geleidende (O) kinetische toestand30,31. Overgangssnelheidsconstanten, weergegeven tussen de gelabelde kinetische toestanden (Figuur 1A) bepalen het aandeel gesimuleerde kanalen/geleiding dat elke kinetische toestand inneemt. Membraanspanning beïnvloedt elk van de snelheidsconstanten van het model. Gesimuleerde Nav-stromen geproduceerd door dit model (in silico) in gesimuleerde spanningsklemexperimenten worden weergegeven (in rood) rechts van Nav-stromen gemeten van acuut geïsoleerde Purkinje-neuronen, die in zwart worden weergegeven (Figuur 1A, onder). Het spanningscommando dat deze gesimuleerde (rood) en Purkinje neuron (zwarte) Nav-stromen oproept, wordt weergegeven boven de stroomsporen in zwart. Merk op dat in het spanningscommando een eerste depolariserende stap (tot 0 mV) resulteert in een snel voorbijgaande inwaartse natriumstroom, die, in het gesimuleerde spoor, kanalen reflecteert die overgaan van de niet-geleidende gesloten toestanden naar de open kinetische toestand, waardoor een korte inwaartse stroom mogelijk is voordat open-toestandskanalen zich ophopen in de snel geïnactiveerde (IF1 en IF2) kinetische toestanden. Deze depolariserende spanningsstap is kort (5 ms) en de membraanpotentiaal wordt vervolgens opgevoerd naar een tussenliggende geherpolariseerde spanning van -45 mV, waarbij de potentiaal 80 ms wordt aangehouden (Figuur 1A, lager). Tijdens deze stap van de repolarisatiespanning is het opmerkelijk dat er een heropleving is van de inwaartse natriumstroom, een stroomcomponent die de oplevende natriumstroom (INaR) wordt genoemd. Tijdens deze stap van 80 ms naar -45 mV vertoont INaR een langzaam (vergeleken met INaT) verval in amplitude, en bereikt uiteindelijk een stabiele toestand van inwaartse stroom, de aanhoudende Nav-stroomcomponent (INaP). Activering van gemodelleerde INaR (Figuur 1A, onder, rood) tijdens membraanrepolarisatie reflecteert gesimuleerde kanalen die herstellen van de snel geïnactiveerde (IF1 + IF2) kinetische toestanden naar de open/geleidende toestand. Na verloop van tijd (vasthoudend op -45 mV) accumuleert een deel van de gesimuleerde kanalen die de open toestand innemen zich tot een absorberende langzaam geïnactiveerde (IS) kinetische toestand, die wordt gereflecteerd als INaR-verval, en een deel van deze kanalen blijft in de open/geleidende toestand, gereflecteerd als de steady-state INaP huidige component30,31.

In de representatieve experimenten/resultaten werd het Nav Markov-geleidingsmodel (Figuur 1A) toegevoegd aan volwassen Purkinje-neuronen in acuut geïsoleerde cerebellaire plakjes. Een cartoonweergave van deze experimentele opstelling wordt weergegeven in figuur 3A. Om de gemodelleerde Nav-geleiding toe te passen via dynamische klemstroominjectie, gebruikten we het dPatch-versterkersysteem (weergegeven in afbeelding 3B), dat volledig is geïntegreerd analoog-naar-digitaal (A/D) en digitaal-naar-analoog (D/A) conversie. Dit systeem zorgt ook voor signaaltransformaties via geïntegreerde ARM-kernprocessors (extern aan de pc) en heeft een geïntegreerd FPGA-circuit (field-programmable array) dat bijna onmiddellijke verwerking van ingangssignalen en feedback (verzending van uitgangssignalen) naar de stroominjectie-elektrode27 mogelijk maakt. De experimenten hier betroffen de toepassing (in dynamische klem) van een complex Markov-geleidingsmodel, dat we konden toepassen met huidige injectie-updatesnelheden tot 500 kHz.

Het toevoegen van de gesimuleerde Nav-geleiding (400 nS) aan Tsc1mut/mut Purkinje-neuronen tijdens gap-free stroomklemopnames resulteerde in duidelijke verhogingen van de repetitieve vuurfrequenties van cellen (Figuur 3C1, D1), wat aangeeft dat de toevoeging van Nav-geleiding in deze cellen voldoende kan zijn om tekorten in Tsc1mut/mut Purkinje-neuronprikkelbaarheid te redden, hoewel we niet het volledige repertoire van tekorten gerapporteerd in Tsc1mut/mut hebben onderzocht Purkinje neuron prikkelbaarheid8. Zoals blijkt uit de representatieve sporen in figuur 3C2 (boven), hebben wild-type Purkinje-neuronen een intrinsiek vermogen om repetitieve actiepotentialen op hoge frequenties af te vuren. Met behulp van een dynamische klem hebben we de gemodelleerde Nav-geleiding afgetrokken van wild-type Purkinje-neuronen door de gemodelleerde Nav-geleiding toe te passen met een omgekeerde (negatieve) polariteit (-400 nS). Het aftrekken van de gemodelleerde Nav-geleiding resulteerde in een onmiddellijke en duidelijke vermindering van herhaald vuren (Figuur 3C2, lager), wat ook consistent is met de hypothese dat verminderde Nav-stromen gemeten in Tsc1mut/mut Purkinje-neuronen bijdragen aan de verzwakte vuureigenschappen gemeten in deze cellen8. Over verschillende Tsc1mut/mut of wild-type Purkinje-neuronen resulteerden deze dynamische klemexperimenten, waarbij de Nav-geleiding respectievelijk werd opgeteld of afgetrokken, in consistente effecten op de vuurfrequentie. De toevoeging van Nav-geleiding verhoogde significant (P = 0,029) de vuurfrequentie van Tsc1mut/mut Purkinje-neuron (Figuur 3D1), en in wild-type Purkinje-neuronen verminderde het aftrekken van de Nav-geleiding significant (P = 0,031) verminderde de vuurfrequentie (Figuur 3D2) (Student's paired t-test).

figure-results-1
Figuur 1: Instellen van een Markov-model in dynamische klemsoftware. (A) Er wordt een Markov-toestandsovergangsdiagram getoond voor een model dat de Nav-geleidingseigenschappen reproduceert die zijn gemeten in de cerebellaire Purkinje-neuronenvan muizen 30. Dit model omvat negen kinetische toestanden. Hiervan zijn er 8 niet-geleidende toestanden: drie gesloten (C), twee geïnactiveerd-gesloten (IC), twee snel geïnactiveerd (IF) en één langzaam-geïnactiveerd (IS). Het model bevat één open (O) kinetische toestand, die geleidend is. Tussen aangrenzende kinetische toestanden wordt de overgang tussen verbindingen en toestandsbezetting in de loop van de tijd gedefinieerd door overgangssnelheidsconstanten, weergegeven als S0-S15. Merk op dat aan elke kinetische toestand ook een numerieke waarde (rood) wordt toegekend, waarmee gebruikers het Markov-model en de kinetische toestandtopologie kunnen definiëren in een poorttoestandsmatrix (weergegeven in paneel C, hieronder beschreven). (B) Panelen/grafische interfaces waarmee gebruikers werken in de SutterPatch Dynamic Clamp Editor worden gepresenteerd. Let op, de opstelling van deze Dynamic Clamp Editor-panelen komt niet overeen met de opstelling zoals deze wordt weergegeven in de dynamische klemsoftware. Bovendien worden niet alle panelen weergegeven die zijn gekoppeld aan de Dynamic Clamp Editor. (C) (bovenste paneel) Een voorbeeld van een poorttoestandsmatrix wordt weergegeven met ingevoerde variabelen die overeenkomen met de topologie van het toestandsovergangsdiagram dat wordt weergegeven in paneel A. Rode vakken op de poorttoestandsmatrix markeren rij en kolom 7, die overeenkomen met de open (O) kinetische toestand van het model. In kolom 7 worden alle snelheidsconstanten vermeld die overgangen naar de open (O) kinetische toestand definiëren, en in rij 7 worden alle snelheidsconstanten vermeld die overgangen definiëren die de open (O) kinetische toestand verlaten. Met deze organisatie beschrijft de gating state-matrix het aantal kinetische toestanden, de snelheidsconstante-variabelen en de topologie (onderlinge verbindingen tussen kinetische toestanden) van het model. Getoond in (D) zijn de SutterPatch-panelen/gebruikersinterfaces die zijn gekoppeld aan het laden van dynamische klemgeleidingsmodellen, samen met de interfaces die betrokken zijn bij het maken van huidige klemroutines. Gebruikersinteracties met deze modellen worden beschreven in Protocolstappen 2.17-2.20. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Tsc1mut/mut Purkinje-neuronen hebben een verzwakte membraanprikkelbaarheid in vergelijking met wild-type controles. (A) Opnames van de stroomklem van de hele cel van wildtype (boven, zwart) en Tsc1mut/mut (onder, blauw) Purkinje-neuronen onthullen verzwakt vuren in de Tsc1-mutante cel. (B) Verminderde vuurfrequenties in Tsc1mut/mut Purkinje-neuronen, vergeleken met wildtype controles, is consistent in alle cellen. De gemiddelde (±± SEM) spontane vuurfrequentie van Tsc1mut/mutPurkinje-neuronen is significant (P < 0,0001) lager in vergelijking met wildtype cellen (Welch's ongepaarde t-test; controle N = 13, n = 32; Tsc1mut/mut N = 6, n = 21). (C) Spanningsklemmetingen van Nav-stromen in volwassen Purkinje-neuronen laten zien dat de gemiddelde (±± SEM) sneltransiënte Nav-stroom (INaT) piek significant is verminderd in Tsc1mut/mut-cellen , vergeleken met wild-type controles. (P = 0,007, RM tweerichtings-ANOVA; wildtypecontrole: N = 6, n = 22, zwart; Tsc1mut/mut: N = 6, n = 16, blauwe vierkanten). Voorbeeld INaT-records , opgeroepen door een depolarisatiestap van -35 mV, worden weergegeven als een inzetpaneel rechts van paneel C. Gegevens eerder gepubliceerd in Brown et al.8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Met behulp van een dynamische klem worden de effecten van een ionische geleiding op de prikkelbaarheid van Purkinje-neuronen bepaald. Dynamische klem omvat het bemonsteren van membraanspanning (via een opname-elektrode) en het berekenen, op basis van de gesamplede spanning, de stroomoutput van een modelgeleiding. De berekende stroom wordt vervolgens met behulp van een stroominjectie-elektrode op een biologische cel toegepast. Paneel (A) verbeeldt deze experimentele opstelling. Als spanningsbemonstering wordt uitgevoerd met een voldoende frequentie en er een minimale vertraging (latentie) is tussen spanningsbemonstering en het toepassen van de berekende stroom, kan deze techniek worden gebruikt om te beoordelen hoe het optellen of aftrekken van een gemodelleerde geleiding het neuronaal vuren en de membraanexciteerbaarheid beïnvloedt. (B) In representatieve experimenten werden dynamische klemopnames verkregen met behulp van SutterPatch-software en het dPatch-versterkersysteem. dPatch is een patch-clamp-versterker met externe signaalprocessors en een volledig geïntegreerde digitizer, waardoor hij zeer geschikt is voor dynamische klemopnames (zie Discussie). (C) Representatieve stroomklemrecords van het spontaan afvuren van Purkinje-neuronen, voor en na het gebruik van een dynamische klem om 400 nS van de gemodelleerde Nav-geleiding op te tellen of af te trekken (weergegeven in figuur 1A). In C1 (links) zijn de records afkomstig van een Tsc1mut/mut Purkinje-neuron met verzwakt vuren. De toevoeging van 400 nS Nav-geleiding resulteert in een duidelijke toename van de vuurfrequentie van deze cel. Als alternatief, in C2, zijn de records afkomstig van een wildtype Purkinje-neuron. In dit experiment wordt de gemodelleerde Nav-geleiding toegepast met een omgekeerde polariteit (-400 nS), wat resulteert in het aftrekken van Nav-geleiding en een duidelijke vermindering van de repetitieve vuurfrequentie. Dynamische records voor stroominjectie, weergegeven in grijs, worden weergegeven onder de records voor het afvuren van de actiepotentiaal (voltage), weergegeven in zwart. (D) Resultaten van deze dynamische klemexperimenten, gepresenteerd als de veranderingen in spontane vuurfrequentie na het toevoegen van Nav-geleiding aan Tsc1mut/mut Purkinje-neuronen (D1, n = 3) of het aftrekken van Nav-geleiding van wildtype Purkinje-neuronen (D2, n = 3), onthullen consistente en significante effecten van het optellen of aftrekken van deze geleiding over Tsc1mut/mut (P = 0,029) en wildtype (P = 0,031) cellen, respectievelijk (gepaarde Student's t-toets). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Cerebellaire circuits functioneren bij proprioceptie en motorische controle37,38 maar zijn ook cruciaal voor complex gedrag zoals sociale interacties en emotionele verwerking 39,40,41. Pathologie in de cerebellaire structuur en functie is vaak gekoppeld aan ASS 42,43,44,45,46. De eenvoudige architectuur van cerebellaire circuits47 en de duidelijke rol van het cerebellum in ASS-pathologie maken het een aantrekkelijk hersengebied om de moleculaire en cellulaire oorzaken van ASS-gedragsstoornissen te onderzoeken, evenals potentiële therapieën. Dynamische klemelektrofysiologie biedt een belangrijk hulpmiddel voor deze onderzoeken, waardoor onderzoekers de causale verbanden tussen ASS-gerelateerde veranderingen in ionkanaaleigenschappen/ionische geleiding en het afvuren van cerebellaire neuronen direct kunnen testen. Hoewel dynamische klemmethoden bijzonder geschikt zijn voor onderzoek naar ASS-gerelateerde veranderingen in neuronale prikkelbaarheid, is deze techniek relevant voor het onderzoeken van een reeks pathologische mechanismen die cellen met prikkelbare membranen beïnvloeden. Bovendien blijft de dynamische klem een uitstekend hulpmiddel voor het ontleden van de complexe processen waarmee neuronen en spiercellen het afvuren van de juiste actiepotentiaal reguleren en behouden.

De nauwkeurige uitvoering van dynamische klemexperimenten vereist een zorgvuldige beheersing van technische parameters. In het bijzonder moeten onderzoekers de gevolgen kennen en begrijpen van de mogelijke variabiliteit in de vertraging tussen spanningsbemonstering en stroominjectie, vaak aangeduid als jitter29, evenals de passieve eigenschappen van de elektrode, de beperkingen van de ruimteklem en de fysiologische getrouwheid van het experimentele preparaat dat wordt onderzocht. Bettencourt et al. (2008)48 en Butera et al. (2001)29 hebben eerder aangetoond dat het bereiken van hoge bemonsteringsfrequenties van ten minste 50 kHz van cruciaal belang is voor het nauwkeurig vastleggen van snelle ionische geleiding, waarbij feedbacklatenties idealiter onder 25% (≤ 5 μs) van het bemonsteringsinterval worden gehouden. Nominale bemonsteringsfrequenties die worden gerapporteerd door commerciële systemen, met name Windows-gebaseerde platforms, kunnen misleidend zijn; daarom is vaak onafhankelijke prestatieverificatie nodig, wat in meer detail wordt besproken door Milescu et al. (2008)25 en Clausen et al. (2012)49. Er moet ook rekening worden gehouden met beperkingen van de ruimteklem, vooral bij het werken met intacte neuronen met complexe morfologieën en niet-isopotentiële membraaneigenschappen. Als u bijvoorbeeld probeert een geleiding toe te passen (of af te trekken) met een elektrode die distaal van de integrerende plaats is, zoals de AIS, zal dit resulteren in een onnauwkeurige weergave van de effecten van de toegepaste geleiding. Slechte (hoge) elektrodeweerstand, onvoldoende capaciteitscompensatie en/of het niet corrigeren van de junctiepotentiaalfout kunnen ook leiden tot een verkeerde voorstelling van spanningsmetingen (ingangssignaal) en bijgevolg tot een onjuiste toepassing van gemodelleerde ionische geleiding50,51.

Duizenden Markov- en HH-modellen zijn gratis beschikbaar voor onderzoekers in online databases zoals ModelDB52 en Channelpedia53, ondersteund door respectievelijk het Human Brain Project en The Laboratory of Neural Microcircuitry. Deze databases bevatten modellen voor synaptische geleiding, ionkanaalgeleiding en op geleiding gebaseerde neuronmodellen, die voornamelijk zijn geschreven in NEURON, MATLAB of Python. Databasebestanden bevatten doorgaans de benodigde modelvergelijkingen, evenals alle diverse informatie over het celtype of de celtypen en experimenten die het model hebben geïnformeerd.

Zowel Markov- als HH-geleidingsmodellen bevatten geleidende (het simuleren van kanalen-open/geactiveerd) en niet-geleidende (gesimuleerde kanalen-gesloten) poorttoestanden/variabelen. Deze modeltypen verschillen echter in de manier waarop de geleidingswaarde wordt berekend bij elke bemonsterde spanning, waarbij Markov-modellen meer rekenkracht vereisen, maar meer details bieden in de poorteigenschappen van gesimuleerde kanalen. In HH-modellen zijn bijvoorbeeld de geleidende en niet-geleidende toestanden onafhankelijke variabelen, elk bepaald door de spannings-ingangs- en gatingkinetiek van de respectieve toestand54,55. In tegenstelling tot Markov-modellen simuleren of beperken HH-modellen de overgangen tussen poorttoestanden niet, zoals de overgang van gesimuleerde kanalen van de geactiveerde/open kinetische toestand rechtstreeks naar de snel geïnactiveerde kinetische toestand in een spanningsafhankelijk natriumgeleidingsmodel25. Dit maakt HH-modellen minder rekenkundig complex54,55 en stelt onderzoekers in staat om meerdere HH-modellen met snelle geleiding tegelijk toe te voegen, met behoud van hoge bemonsterings- en updatesnelheden.

Markov kinetische toestandsmodellen zijn samengesteld uit discrete kinetische toestanden, die geleidend of niet-geleidend kunnen zijn, en deze toestanden zijn met elkaar verbonden in een vaste topologie. In Markov-modelsimulaties wordt de geleiding bij elke bemonsterde spanning berekend door het aandeel gesimuleerde kanalen dat de geleidende kinetische toestand(en) inneemt. Het aandeel gesimuleerde kanalen dat elke kinetische toestand (in de loop van de tijd) inneemt, wordt bepaald door snelheidsconstanten, dit zijn parameters die bepalen hoe snel de bezetting van de toestand overgaat van de ene kinetische toestand naar de andere. Snelheidsconstanten hebben eenheden van inverse seconden (s-1), die een overgangskans per tijdseenheid vertegenwoordigen. Afhankelijk van het model kunnen de waarden van de snelheidsconstante afhankelijk zijn van dynamische factoren zoals spanning of temperatuur.

In Markov-modellen worden gewone differentiaalvergelijkingen gebruikt om de tijdsafhankelijke bezetting van elke kinetische toestand te beschrijven. Deze vergelijkingen bepalen hoe de kans om in elke toestand te zijn in de loop van de tijd evolueert, op basis van de constanten van de overgangssnelheid. Dit wordt weergegeven door een tariefmatrix Q: figure-discussion-156. Zoals hierboven besproken, kunnen overgangssnelheidsconstanten (r), die de beweging tussen toestanden bepalen, worden beïnvloed door de ingangsspanning (V) en parameters α en β, die de kinetiek van de geleiding over spanningen weerspiegelen. Deze vergelijkingen kunnen worden beschreven als: figure-discussion-2, en kunnen visueel worden weergegeven in de vorm van grafieken die verbindingen (overgangssnelheidsconstanten) bevatten in en uit elke kinetische toestand van het model 56,57,58. Een nuttige discussie over de ontwikkeling van Markov-modellen en hun topologie is te vinden in Schoening en Silva (2024)56.

Sinds het begin van de dynamische klem in zijn huidige vorm, waarbij niet-lineaire ionische geleidingen worden gemodelleerd en toegepast (via een stroominjectie-elektrode) op levende cellenin realtime 19,59, zijn de methoden en middelen voor deze techniek geëvolueerd en zijn ze steeds toegankelijker en kosteneffectiever dankzij innovaties zoals op microcontrollers gebaseerde, goedkope systemen60 en gratis, open-source software23, 25,26. Commerciële systemen, zoals dPatch van Sutter Instrument of Cybercyte van Cytocybernetics, vergemakkelijken de snelle implementatie van dynamische klemexperimenten verder door middel van geïntegreerde hardware- en softwareoplossingen27,61.

De veelzijdigheid van dynamische klem maakt diverse toepassingen mogelijk, waaronder het creëren van virtuele chemische en elektrische synapsen, het inbedden van echte neuronen in kunstmatige netwerken (of vice versa) en het toevoegen van virtuele ionenkanalen62. Belangrijk is dat de spanningsafhankelijkheid, kinetische eigenschappen en amplitudes van een toegepaste geleiding snel kunnen worden aangepast, waardoor onderzoekers direct kunnen testen hoe het schalen van een of meer parameters de actiepotentiaal en membraanexciteerbaarheid beïnvloedt31. De huidige systemen bieden hoge bemonsteringsfrequenties, waardoor de nauwkeurige toepassing van snel voorbijgaande geleidingsmiddelen mogelijk is en kunnen gemakkelijk worden geïntegreerd met conventionele elektrofysiologische apparatuur60,63, waardoor dynamische klem een ideale methode is om ons begrip van neuronale functie en disfunctie te vergroten.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

We willen Telly Galiatsatos en Josh Stanford van Sutter Instrument bedanken voor hun hulp bij technische vragen. We erkennen en bedanken ook Jan Dolzer voor zijn hulp bij het initiëren van dPatch dynamische klemstudies.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CaCl2Fisher ChemicalC79-500 Reagens
Capillary glass tubing boroscilicate standard wall OD 1.5 mm ID 0.86 mm length 10 cmWarner Instruments64-0793Uitrusting
CleanBenchTMC63-9090EUitrusting
Compresstome VF-500-Z vibratome Prescisionary Instrumentshttps://precisionary.com/product-category/compresstome-parts/parts-by-model/vf-500-0z/Uitrusting
Dell OptiPlex 7080Dellhttps://www.dell.com/nl-nl/shop/desktop-computers/optiplex-7080-tower-en-klein-formaat/spd/optiplex-7080-desktop/s005o7080sffnlUitrusting
DextroseFisher ChemicalD16-500 Reagens
dPatch versterkersysteemSutter InstrumentFG-DPATCHUitrusting
EGTAEMD Millipore324626-25GMReagens
HEPESFisher Chemical7365-45-9Reagens
In-line heaterWarner Instruments64-0102Uitrusting
KClFisher ChemicalP330-500 Reagens
KetamineDechra Veterinary Products193.40620.3 Reagens
K-gluconaatTCI ChemicalsG0040Reagens
LinLab softwareScientificahttps://www.scientifica.uk.com/products/scientifica-linlab-2Uitrusting
LSE 6L Water BathCorning6783Uitrusting
Mg-ATPSigma-Aldrich74804-12-9Reagens
MgCl2Fisher Chemical012288.A9Reagens
Model P-1000 Pipette pullerSutter InstrumentFG-P1000Uitrusting
NaClFisher ChemicalS271-500 Reagens
Na-GTPMP Biomedicals56001-37-7Reagens
NaH2PO4J.T. Baker02-004-220 Reagens
NaHCO3Fisher ChemicalS233-500 Reagens
Ocular softwareDigital Optics Limitedhttps://www.scientifica.uk.com/products/qimaging-ocular-softwareUitrusting
Razor bladePersonna60-0139-CTNUitrusting
Slice harpWarner Instruments64-0255Uitrusting
SliceScope Pro 3000Scientificahttps://www.scientifica.uk.com/products/slicescope-pro-3000Uitrusting
SuperglueLoctite8040-00-142-9193Uitrusting
SutterPatch softwareSutter Instrumenthttps://www.sutter.com/amplifiers/sutterpatchUitrusting
Temperature controllerWarner Instruments64-2400Uitrusting
XylazineMP Biomedicals158307Reagens

Referenties

  1. Zoghbi, H. Y., Bear, M. F. Synaptic dysfunction in neurodevelopmental disorders associated with autism and intellectual disabilities. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (3), a009886-a009886 (2012).
  2. Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nat Commun. 5 (1), 4742(2014).
  3. Connor, S. A., et al. Altered cortical dynamics and cognitive function upon haploinsufficiency of the autism-linked excitatory synaptic suppressor MDGA2. Neuron. 91 (5), 1052-1068 (2016).
  4. Pagani, M., et al. mTOR-related synaptic pathology causes autism spectrum disorder-associated functional hyperconnectivity. Nat Commun. 12 (1), 6084(2021).
  5. Tang, G., et al. Loss of mTOR-dependent macroautophagy causes autistic-like synaptic pruning deficits. Neuron. 83 (5), 1131-1143 (2014).
  6. Fatemi, S. H., Eschenlauer, A., Aman, J., Folsom, T. D., Chekouo, T. Quantitative proteomics of dorsolateral prefrontal cortex reveals an early pattern of synaptic dysmaturation in children with idiopathic autism. Cereb Cortex. 34 (13), 161-171 (2024).
  7. Deneault, E., et al. Complete disruption of autism-susceptibility genes by gene editing predominantly reduces functional connectivity of isogenic human neurons. Stem Cell Rep. 11 (5), 1211-1225 (2018).
  8. Brown, S. P., Jena, A. K., Osko, J. J., Ransdell, J. L. Tsc1 deletion in Purkinje neurons disrupts the axon initial segment, impairing excitability and cerebellar function. Neurobiol Dis. 207, 106856(2025).
  9. Tsai, P. T., et al. Autistic-like behaviour and cerebellar dysfunction in Purkinje cell Tsc1 mutant mice. Nature. 488, 647-651 (2012).
  10. Sundberg, M., et al. Purkinje cells derived from TSC patients display hypoexcitability and synaptic deficits associated with reduced FMRP levels and reversed by rapamycin. Mol Psychiatry. 23, 2167-2183 (2018).
  11. Brumback, A., Sohal, V. Intrinsic excitability defects in specific subtypes of medial prefrontal cortex pyramidal neurons in a mouse model of autism. Neurology. 82 (10), I4-1.010(2014).
  12. Mitchell, D. E., Miranda-Rottmann, S., Blanchard, M., Araya, R. Altered integration of excitatory inputs onto the basal dendrites of layer 5 pyramidal neurons in a mouse model of Fragile X syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (2), e2208963120(2023).
  13. Sanders, S. J., et al. De novo mutations revealed by whole-exome sequencing are strongly associated with autism. Nature. 485, 237-241 (2012).
  14. Ben-Shalom, R., Keeshen, C. M., Berrios, K. N., An, J. Y., Sanders, S. J., Bender, K. J. Opposing effects on NaV1.2 function underlie differences between SCN2A variants observed in individuals with autism spectrum disorder or infantile seizures. Biol Psychiatry. 82 (3), 224-232 (2017).
  15. Spratt, P. W. E., et al. The autism-associated gene Scn2a contributes to dendritic excitability and synaptic function in the prefrontal cortex. Neuron. 103 (4), 673-685.e5 (2019).
  16. Nelson, A. D., et al. Physical and functional convergence of the autism risk genes Scn2a and Ank2 in neocortical pyramidal cell dendrites. Neuron. 112 (7), 1133-1149.e6 (2024).
  17. Zhang, J., et al. Severe deficiency of the voltage-gated sodium channel NaV1.2 elevates neuronal excitability in adult mice. Cell Rep. 36 (5), 100858(2021).
  18. Sharp, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. Artificial electrical synapses in oscillatory networks. J Neurophysiol. 67 (6), 1691-1694 (1992).
  19. Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends Neurosci. 16 (10), 389-394 (1993).
  20. Robinson, H. P. C., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. J Neurosci Methods. 49 (3), 157-165 (1993).
  21. Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends Neurosci. 27 (4), 218-224 (2004).
  22. Muñiz, C., Arganda, S., Rodríguez, F. B., De Polavieja, G. G. Realistic stimulation through advanced dynamic-clamp protocols. Computational Methods in Neural Modeling. Mira, J., Álvarez, J. R. , Springer. Berlin. 95-105 (2005).
  23. Ortega, F. A., Butera, R. J., Christini, D. J., White, J. A., Dorval, A. D. Dynamic clamp in cardiac and neuronal systems using RTXI. Methods Mol Biol. 1183, 327-354 (2014).
  24. Milescu, L. S., Tabak, J. Dynamic clamp on a Windows PC. Methods Mol Biol. 2188, 157-177 (2021).
  25. Milescu, L. S., Yamanishi, T., Ptak, K., Mogri, M. Z., Smith, J. C. Real-time kinetic modeling of voltage-gated ion channels using dynamic clamp. Biophys J. 95 (1), 66-87 (2008).
  26. Kemenes, I., et al. Dynamic clamp with StdpC software. Nat Protoc. 6 (3), 405-417 (2011).
  27. Dolzer, J. Patch clamp technology in the twenty-first century. Methods Mol Biol. 2188, 21-49 (2021).
  28. Crino, P. B., Henske, E. P. New developments in the neurobiology of the tuberous sclerosis complex. Neurology. 53 (7), 1384-1390 (1999).
  29. Butera, R. J., Wilson, C. G., DelNegro, C. A., Smith, J. C. A methodology for achieving high-speed rates for artificial conductance injection in electrically excitable biological cells. IEEE Trans Biomed Eng. 48 (12), 1460-1470 (2001).
  30. Ransdell, J. L., Moreno, J. D., Bhagavan, D., Silva, J. R., Nerbonne, J. M. Intrinsic mechanisms in the gating of resurgent Na+ currents. eLife. 11, e70173(2022).
  31. Brown, S. P., Lawson, R. J., Moreno, J. D., Ransdell, J. L. A reinterpretation of the relationship between persistent and resurgent sodium currents. J Neurosci. 44 (29), e2396232024(2024).
  32. European Chromosome 16 Tuberous Sclerosis Consortium. Identification and characterization of the tuberous sclerosis gene on chromosome 16. Cell. 75 (7), 1305-1315 (1993).
  33. Henske, E. P., Jóźwiak, S., Kingswood, J. C., Sampson, J. R., Thiele, E. A. Tuberous sclerosis complex. Nat Rev Dis Primers. 2 (1), 16036(2016).
  34. Wiznitzer, M. Autism and tuberous sclerosis. J Child Neurol. 19 (9), 675-679 (2004).
  35. Jeste, S. S., Sahin, M., Bolton, P., Ploubidis, G. B., Humphrey, A. Characterization of autism in young children with tuberous sclerosis complex. J Child Neurol. 23 (5), 520-525 (2008).
  36. Lawson, R. J., et al. Selective deletion of Tsc1 from mouse cerebellar Purkinje neurons drives sex-specific behavioral impairments linked to autism. Front Behav Neurosci. 18, 1474066(2024).
  37. Sherrington, C. S. The Integrative Action of the Nervous System. , Yale University Press. New Haven. (1911).
  38. Russell, J. S. R., Horsley, V. A. H. II Experimental researches into the functions of the cerebellum. Proc R Soc Lond. 55, 57-60 (1894).
  39. Rudolph, S., et al. Cognitive-affective functions of the cerebellum. J Neurosci. 43 (45), 7554-7564 (2023).
  40. Schmahmann, J. D. The cerebellum and cognition. Neurosci Lett. 688, 62-75 (2019).
  41. Beuriat, P. -A., Cristofori, I., Gordon, B., Grafman, J. The shifting role of the cerebellum in executive, emotional and social processing across the lifespan. Behav Brain Funct. 18 (1), 6(2022).
  42. Stoodley, C. J. Distinct regions of the cerebellum show gray matter decreases in autism, ADHD, and developmental dyslexia. Front Syst Neurosci. 8, 92(2014).
  43. Bruchhage, M. M. K., Bucci, M. -P., Becker, E. B. E. Cerebellar involvement in autism and ADHD. Handb Clin Neurol. 155, 61-72 (2018).
  44. Mosconi, M. W., Wang, Z., Schmitt, L. M., Tsai, P., Sweeney, J. A. The role of cerebellar circuitry alterations in the pathophysiology of autism spectrum disorders. Front Neurosci. 9, 296(2015).
  45. Weber, A. M., Egelhoff, J. C., McKellop, J. M., Franz, D. N. Autism and the cerebellum: evidence from tuberous sclerosis. J Autism Dev Disord. 30 (6), 511-517 (2000).
  46. Wang, S. S. -H., Kloth, A. D., Badura, A. The cerebellum, sensitive periods, and autism. Neuron. 83 (3), 518-532 (2014).
  47. Ransdell, J. L., Nerbonne, J. M. Voltage-gated sodium currents in cerebellar Purkinje neurons: functional and molecular diversity. Cell Mol Life Sci. 75 (19), 3495-3505 (2018).
  48. Bettencourt, J. C., Lillis, K. P., Stupin, L. R., White, J. A. Effects of imperfect dynamic clamp: computational and experimental results. J Neurosci Methods. 169 (2), 282-289 (2008).
  49. Clausen, C., Valiunas, V., Brink, P. R., Cohen, I. S. MATLAB implementation of a dynamic clamp with bandwidth of >125 kHz capable of generating INa at 37°C. Pflugers Arch. 465 (4), 497-507 (2013).
  50. Preyer, A. J., Butera, R. J. The effect of residual electrode resistance and sampling delay on transient instability in the dynamic clamp system. Annu Int Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2007, 430-433 (2007).
  51. Preyer, A. J., Butera, R. J. Causes of transient instabilities in the dynamic clamp. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 17 (2), 190-198 (2009).
  52. McDougal, R. A., et al. Twenty years of ModelDB and beyond: building essential modeling tools for the future of neuroscience. J Comput Neurosci. 42 (1), 1-10 (2017).
  53. Ranjan, R., et al. Channelpedia: an integrative and interactive database for ion channels. Front Neuroinform. 5, 36(2011).
  54. Carbonell-Pascual, B., Godoy, E., Ferrer, A., Romero, L., Ferrero, J. M. Comparison between Hodgkin-Huxley and Markov formulations of cardiac ion channels. J Theor Biol. 399, 92-102 (2016).
  55. Andreozzi, E., Carannante, I., D'Addio, G., Cesarelli, M., Balbi, P. Phenomenological models of NaV1.5. A side by side, procedural, hands-on comparison between Hodgkin-Huxley and kinetic formalisms. Sci Rep. 9 (1), 17493(2019).
  56. Schoening, M. E., Silva, J. R. Creating Computational Models of Ion Channel Dynamics. Potassium Channels: Methods and Protocols. , Springer. New York. (2024).
  57. Mangold, K. E., et al. Identification of structures for ion channel kinetic models. PLoS Comput Biol. 17 (8), e1008932(2021).
  58. Silva, J. R., Cooper, P., Nichols, C. G. Modeling KATP-dependent excitability in pancreatic islets. Biophys J. 107 (9), 2016-2026 (2014).
  59. Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. J Neurophysiol. 69 (3), 992-995 (1993).
  60. Desai, N. S., Gray, R., Johnston, D. A dynamic clamp on every rig. eNeuro. 4 (5), (2017).
  61. Han, L., et al. Reconciling computer models and stem cell models of human cardiac repolarization: reply. Cardiovasc Res. 106 (1), 6-7 (2015).
  62. Wilders, R. Dynamic clamp: a powerful tool in cardiac electrophysiology. J Physiol. 576 (2), 349-359 (2006).
  63. Kullmann, P. H. M., Wheeler, D. W., Beacom, J., Horn, J. P. Implementation of a fast 16-bit dynamic clamp using LabVIEW-RT. J Neurophysiol. 91 (1), 542-554 (2004).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

AutismespectrumstoornisspanningsklemPurkinje neuronenionkanaalfunctiepatchklemnatriumkanaalcerebellaire hersensnedenconductantiemodellering
Dynamische klemmethoden om verminderde neuronale prikkelbaarheid geassocieerd met autisme te onderzoeken
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.