Methodenartikel

Voorbereiding en verwerking van verkalkte slagader met geconserveerde morfologie en RNA voor digitale ruimtelijke profilering

DOI:

10.3791/69159

⸱

23 januari 2026

 ,  ,  , 
1Division of Vascular Surgery, Department of Surgery, University of Washington, 2Department of Laboratory Medicine and Pathology, University of Washington, 3Division of Vascular Surgery, VA Puget Sound Health Care System

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol omvat een stapsgewijze workflow voor verkalkte vasculaire monsters: weefselbehandeling, decalcificatie, RNA-validatie, detectie van calcificatieniveaus en strategieën voor het selecteren van interessegebieden op de Nanostring GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). Het doel is om een uitgebreide methode te presenteren voor het behouden van vasculaire weefselmorfologie en RNA voor betrouwbare ruimtelijke transcriptomische analyse.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ruimtelijke transcriptomica brengt profielen van hele transcriptomen direct in kaart op weefselsecties, correleert cellulaire buurten en genexpressie en hoe deze activiteiten gezondheid en ziekte stimuleren. Hoewel deze aanpak de oncologie, neurowetenschappen, immunologie, ontwikkelingswetenschappen en vele vakgebieden heeft getransformeerd, is het minder breed gebruikt in de vaatbiologie, hoewel vaatziekten wereldwijd een belangrijke doodsoorzaak blijven. Twee obstakels springen op: slagaders en aders bieden weinig vlak oppervlak voor het snijden, en zieke exemplaren, vaak atherosclerotisch, getrombeerd, vol plaque of verkalkt, vereisen harde behandelingen zoals ontkalking die de morfologie en de integriteit van RNA in gevaar brengen. Toch zijn dezezelfde vaten, met hun concentrische intima, media- en adventitia-gelaagde structuren, ideaal voor ruimtelijke analyse omdat elke laag verschillende celtypen en genprogramma's herbergt die over de muur interageren.

Enkele gedetailleerde protocollen behandelen hoe vaatweefsels voorbereid moeten worden op ruimtelijke transcriptomics. Dit tekort beperkt het vermogen van onderzoekers om het volledige potentieel van de techniek te benutten. Om de kloof te overbruggen, presenteren we een stapsgewijze workflow die is geoptimaliseerd voor menselijke tibia-slagaders met geavanceerde laesies. Het protocol omvat weefselbehandeling, fixatie en juiste decalcificatie die structuur en RNA-kwaliteit behouden, gevolgd door histologische kleuring om de ernst van de verkalking te beoordelen. We beschrijven ook de constructie van weefselmicroarray (TMA) om batch-effecten en strategieën voor het selecteren van interessegebieden (ROI) te beperken op de NanoString GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP).

Door technische barrières te verlagen, stelt dit protocol vasculaire onderzoekers in staat betrouwbare ruimtelijke transcriptomische gegevens te genereren en laagspecifieke transcriptieactiviteiten te bestuderen in gezonde en zieke vaten. We verwachten dat het de ontdekking van mechanismen achter verkalking, ontsteking, intime atherosclerose en andere vasculaire pathologieën zal versnellen en een bredere adoptie van ruimtelijke transcriptomics in de vasculaire biologie zal bevorderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In het afgelopen decennium zijn next-generation sequencing en hogeresolutiebeeldvorming samengekomen om ruimtelijke transcriptomics te verbeteren, een methode voor volledige transcriptomkwantificatie terwijl de precieze locatie van elk transcript in weefselsecties 1,2 behouden blijft. In combinatie met het snel rijpende single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) veld bieden ruimtelijke benaderingen een efficiënte route om gensignaturen te koppelen aan specifieke celtypen, toestanden en niches binnen een weefsel of orgaan, wat ons begrip van ziektemechanismen aanzienlijk verrijkt 3,4,5,6,7 . Meerdere commerciële platforms worden ontwikkeld, zoals 10X Visium, NanoString GeoMx en CosMx, Slide-seq en DBiT-seq, elk ondersteund door protocollen die geoptimaliseerd zijn voor zachte, sterk cellulaire weefsels zoals tumoren en hersenweefsel. Het vakgebied maakt een explosieve groei door, met PubMed die in 2023 ongeveer 150 publicaties indexeert, in 2024 bijna 300, en op weg is om in 2025 de 500 te overschrijden. Ondanks deze toename blijft de vaatbiologie ondervertegenwoordigd in vergelijking met kanker, neurowetenschappen en immunologie.

Harde of gemineraliseerde weefsels, zoals bot, kraakbeen, tanden en plaque-beladene, verkalkte slagaders of aderen, zijn veel minder toegankelijk gebleken. De technische obstakels zijn veelzijdig. Ten eerste vereisen weefsels met dichte mineraalmatrices chelatie of zuurverwijdering, agressieve behandelingen die RNA kunnen fragmenteren en de weefselmorfologie kunnen vervormen. Ten tweede bevatten zieke weefsels, ofwel beschadigd of fibrotisch, vaak weinig levende cellen ingebed in een overvloedige extracellulaire matrix (ECM), wat de transcriptopbrengst vermindert en de normalisatie van gegevens bemoeilijkt. Daarnaast hebben vaatweefsels een dunne, concentrische structuur (intima, media, adventitia) die zich om een holle lumen wikkelt. Beperkte wanddikte, vooral de enkelcellige intima-laag, betekent dat capture-gebieden mogelijk weinig weefsel bevatten, en secties kunnen scheuren of loslaten tijdens meerurige kleurings- en hybridisatiestappen. Daardoor blijven ruimtelijke transcriptomische studies van vaatweefsel schaars, hoewel hart- en vaatziekten consequent tot de belangrijkste oorzaken van sterfte en ernstige morbiditeit wereldwijd behoren. Protocolartikelen die wel bestaan, leggen overweldigend de nadruk op dataverwerking, visualisatie of andere platforms dan NanoString GeoMx 8,9,10,11,12,13. Van deze artikelen beschrijven er maar weinig methoden op laboratoriumniveau voor het verwerken van zieke tibiale slagaders, een klinisch relevant vat bij perifere arterieziekte (PAD), vooral voor diabetische patiënten die een steeds groter deel van de getroffen bevolking uitmaken.

Om deze kloof te dichten, presenteren we een uitgebreide workflow voor verkalkte menselijke tibia-arteries, verkregen van PAD-patiënten die een amputatie hebben ondergaan. Het protocol omvat: (1) weefseltrim en dissectie direct na de oplevering in de operatiekamer; (2) juiste weefselfixatie en decalcificatie die de integriteit van weefselmorfologie en RNA behouden; (3) de constructie van kostenbesparende weefselmicroarrays (TMA's) om batcheffecten te minimaliseren; (4) RNAscope in situ hybridisatie en histologische calciumkleuring voor kwaliteitscontrole; en (5) Regio van belang (ROI) selectiestrategie specifiek ontworpen voor verkalkte tibiale slagaders op het GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) platform. Deze stappen omvatten alle procedures voorafgaand aan de monsterverzameling op het DSP-instrument, bibliotheekvoorbereiding, sequencing en data-analyse.

Hoewel gedemonstreerd op het gerefereerde DSP-platform, kunnen de principes weefselvoorbereiding voor 10X Visium of andere platforms sturen, en is de methodologie gemakkelijk aan te passen aan extra vaatbedden of diermodellen. Dit protocol kan worden aangepast voor biobank- en postmortale weefsels, maar het succes ervan hangt van cruciaal belang af van weefselconservering, fixatie en opslag. Weefsels moeten direct na de oogst worden hersteld om de ischemische tijd te minimaliseren (bij voorkeur binnen 1 uur). Standaard 10% neutral-gedempte formaline (NBF) wordt aanbevolen voor minstens 16 uur bij kamertemperatuur (RT). Weefsels moeten direct na fixatie worden ingebracht en mogen niet langer dan 3 dagen in ethanol worden bewaard. Formaline-gefixeerde paraffine-ingebedde (FFPE) blokken die onder aanbevolen omstandigheden worden verwerkt en opgeslagen, blijven ongeveer 3 jaar geschikt voor ruimtelijke profilering, hoewel de RNA-kwaliteit afneemt met de ouderdom van het blok. Daarom wordt RNA-kwaliteitsbeoordeling aanbevolen voor monsters met lage cellulariteit, blokken die over 6 maanden worden opgeslagen, biobankmonsters en postmortale weefsels. De minimaal acceptabele RNA-kwaliteit hangt af van de geselecteerde assay, ROI-selectie, gewenste resolutie en aanbevelingen van de kernfaciliteit. In de praktijk worden ongeveer 50-100 kernen per segment aanbevolen voor robuuste resultaten. Het DSP-platform ondersteunt zowel FFPE als verse bevroren weefsels. In dit protocol richten we ons op FFPE-weefsels.

Hoewel deze studie zich richt op ruimtelijke transcriptomics, is het gemakkelijk te integreren met scRNA-seq. Met behulp van gepubliceerde scRNA-seq datasets en computationele ruimtelijke deconvolutie kunnen celtypeverhoudingen voor elke ruimtelijke plek worden geschat, en scRNA-seq gedefinieerde celtoestanden kunnen worden geprojecteerd op weefselarchitectuur. Door zowel structuur als RNA-integriteit te behouden, maakt ons protocol downstream single-cel- of single-molecule-validatie mogelijk, waarbij biologische inzichten uit kostbare vasculaire monsters worden gemaximaliseerd en ruimtelijke transcriptomics in vasculaire biologie worden geïntroduceerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures voor het verzamelen van menselijke arteriële monsters zijn goedgekeurd door de University of Washington Human Subjects Division Institutional Review Board (IRB) en de IRB van het VA Puget Sound Health Care System (Seattle, WA). Schriftelijke geïnformeerde toestemmingen werden van de patiënten verkregen vóór de weefselafname. De materialen en apparatuur die voor deze studie zijn gebruikt, zijn vermeld in de Materiaallijst.

1. Weefsel bijsnijden en repareren

  1. Weefseltrimning
    1. Bereid de transporttas voor met meerlaagse verpakkingen, met een binnenband, een tweede container, een buitenste verzendcontainer en een biohazard-monstertas. Vul de binnenste 50 mL centrifugebuis met 30 mL opslagmedium van Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) dat 1% 4-[2-hydroxyethyl]-1-piperazineethanesulfonzuur (HEPES) en 1% penicilline-streptomycine (P/S) bevat.
    2. Plaats de geoogste voorste tibiale (AT), posterior tibiale (PT) en peroneale tibiale (PR) slagaders (bij voorkeur > 5 cm lang) apart in de 50 mL centrifugebuizen. Breng de containers op ijs van de operatiekamer naar de weefselkweekkamer.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen dat de geoogste monsterlengte minimaal 5 cm bedraagt om replicaten en voldoende weefsel te laten cryo-bewaren voor andere beoordelingen of validatie.
    3. Breng elke slagader over in een 100 mm petrischaal met het medium. Verwijder overtollig perivasculair bindweefsel met steriele schaar en pincet, zodat alleen de arteriële wand (adventitia naar binnen) overblijft.
      OPMERKING: Behandel en trim de weefsels in een bioveiligheidskast die is afgeveegd met een RNase-inactivatieoplossing om RNA-besmetting te voorkomen. Gebruik steriele scalpels en pincetten; Spoel ze tussen de monsters door in steriel en nucleasevrij water om residuen te verwijderen en veeg grondig af met 70% ethanol.
    4. Spoel de getrimde slagader kort af met Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een nieuwe petrischaal. Leg een steriel snijplank in een verse schaal en plaats de slagader erop.
    5. Snijd de slagader dwarsdoorsnede in segmenten van 1 cm met een chirurgisch mesje.
  2. Weefselfixatie en opslag
    1. Snap-freeze twee segmenten in cryotubes voor cryopreservatie in vloeibare stikstof (LN2) en sla ze op voor toekomstig eiwit/RNA-werk.
    2. Plaats de overige segmenten in 15 mL buisjes met 10% NBF en fixeer op 4 °C gedurende 24-48 uur voor 1 cm arteriële segmenten.
      OPMERKING: Het gebruik van 10% NBF wordt aanbevolen. Als je 4% paraformaldehyde (PFA) gebruikt, bereid het dan vers of controleer een neutrale pH voor gebruik om RNA-schade te minimaliseren.

2. Decalcificatie, weefselverwerking en doorsnijden

  1. Bereid de decalcificatieoplossing: los vast ethyleen-diamine-tetraazijnzuur (EDTA) op tot 10% (w/v) in RNA-stabilisatieoplossing (RSS). Filtratie is niet nodig. Stel de pH aan naar 9,2 met natriumhydroxide (NaOH) pellets om de EDTA volledig op te lossen, en verlaag daarna naar 5,2 met 10 M HCl, wat de typische werk-pH van RSS is en helpt de integriteit van RNA te behouden.
  2. Spoel de vaste weefsels kort handmatig af in PBS. Breng elk monster over in een 15 mL buisje met de decalcificatieoplossing en roer bij 4 °C gedurende 72 uur.
  3. Wanneer de ontkalking voltooid is, was je de monsters met PBS (2 × 5 min). Plaats weefsels in cassettes en laad ze in een weefselprocessor met een 4-uur verwerkingsprogramma.
  4. Plaats meerdere arteriesegmenten per weefselblok. Markeer het beperkte weefselgebied op de slidebacks en controleer of alle secties binnen dit gebied vallen.
  5. Snijd overtollige paraffine weg. Snijd de blokken op 5 μm met een microtoom en laagprofielbladen, en monteer de weefselsecties binnen het gemarkeerde diagebied.
    OPMERKING: Gooi de eerste paar secties weg na het afstellen en verzamel de volgende weefselsecties. Gebruik RNase-vrije kwasten en maak het waterbad schoon tussen de batches monsters door.
  6. Bereid minstens vier seriële secties per blok voor voor verschillende kleuringen en het digitale ruimtelijke profilering (DSP) experiment. Bewaar de glaasjes op 4 °C tot gebruik (bij voorkeur < 6 maanden).

3. RNAscope In-situ hybridisatie (ISH) en histologische kleuring

  1. RNAscope ISH
    1. Bak dia's een nacht in een droge oven op 60 °C om de hechting van het weefsel aan de slides te verbeteren.
    2. Deparaffinisatie: Onderdompeling in xyleen (3 × 5 min), gevolgd door 100% ethanol (2 × 3 min). Droog glijdplaten op 60 °C gedurende 7 minuten.
    3. Voer de RNAscope 2.5 HD Red ISH-test uit volgens het protocol van de fabrikant. Blokkeer endogene peroxidase met 3% H2O2 gedurende 10 minuten bij RT; spoel af in gedestilleerd (DI) water.
    4. Incubeer de glaasjes in een voorverwarmde 100 °C terughaalbuffer (verdund 1:10 in DI-water) gedurende 15 minuten (gebruik 200 mL ophaalbuffer voor een rek van maximaal 24 glaasjes in een stoommachine), doop 5 keer in 100% ethanol en droog de glijbanen bij 60 °C gedurende 7 minuten. Creëer een hydrofobe barrière voor oplossingen rond het weefsel met een hydrofobe barrière PAP-pen.
    5. Plaats de glaasjes in een hybridisatierooster, voeg 200 μL spijsverteringsenzymsupplement toe (door de leverancier vooraf verdund in druppelflesjes) aan elke glaasje, en incubeer bij 40 °C gedurende 15 minuten. Spoel de slides twee keer af in DI-water.
    6. Breng positieve controle probe Human PPIB toe op de glaasjes en incubeer 2 uur bij 40 °C. Was de slides twee keer in wash buffer.
    7. Voer sequentiële versterking uit: AMP1 bij 40 °C gedurende 30 minuten; AMP2 op 40 °C gedurende 15 minuten; AMP3 bij 40 °C gedurende 30 minuten; AMP4 op 40 °C gedurende 15 minuten; AMP5 op RT voor 30 minuten; en AMP6 op RT voor 15 minuten. Was het 2 x 2 minuten tussendoor.
    8. Voeg Fast Red werkende oplossing toe, incubeer 10 minuten bij RT. Laat de glijbanen aflopen, dompel ze onder in DI-water, en doop dan 5 keer in vers DI-water. Bevestig dat de PPIB positieve controlevlekken verschijnen als discrete, gepunteerde rode stippen.
    9. Contrastkleur met 1 hematoxyline van Gill, doop 5 keer in 2 wissels DI-water, blauw in 0,02% ammoniumhydroxide, en doop 5 keer in 2 wisselingen DI-water. Bevestig dat de kernen blauw kleuren en de weefselmorfologie behouden blijft. Laat de slides een nacht drogen en schuif de deksel af met montagemedium.
  2. Alizarin Red S-kleuring
    1. Voor aanvullende seriële secties herhaalt u deparaffinisatie en rehydratatie in stappen 3.1.2.
    2. Bevestig dat de pH van de werkoplossing van Alizarin Red S 4,1-4,3 is.
    3. Dompel de glaasjes in Alizarin Red S gedurende 30-60 seconden, of totdat calciumafzettingen een oranje-rode kleur ontwikkelen.
    4. Schud overmatige kleurstof eraf. Dehydrateer met 20 snelle dips in 100% aceton, daarna 20 dips in aceton:xyleen (1:1).
    5. Maak de slides leeg in twee verse baden xyleen, elk 3 minuten. Dekmantel met montagemedium.

4. GeoMx DSP-diavoorbereiding en ROI-selectie

  1. Maak voor start alle apparatuur en containers schoon met RNAse-inactiverende oplossing en droog of spoel met met DEPC-behandeld water om RNA-besmetting te voorkomen. Volg de instructies voor de ruimtelijke RNA-profileringsassay.
  2. Bak dia's een nacht in een droge oven op 60 °C om de hechting van het weefsel aan de slides te verbeteren.
  3. Deparaffinisatie en rehydratatie: Onderdompel glaasjes in xyleen (3 × 5 min), gevolgd door 100% ethanol (2 × 5 min), en 95% ethanol verdund in DEPC-behandeld water gedurende 5 minuten. Zet de dia's over naar 1× PBS voor 1 minuut.
  4. Incubeer de glaasjes in een voorverwarmde, 100 °C Tris/EDTA pH 9,0 antigeenterugwinningsbuffer gedurende 20 minuten, en plaats de glaasjes op 1× PBS voor 5 minuten bij RT.
  5. Incubeer glaasjes in voorverwarmde 1,0 μg/ml Proteinase K gedurende 15 minuten en spoel af in 1× PBS gedurende 5 minuten bij RT.
  6. Postfix de dia's in 10% NBF (200 μL per dia) voor 5 minuten bij RT, en was 5 minuten in PBS.
  7. Haal de glaasjes uit PBS, tik op een papieren handdoek, veeg overtollig vocht rondom het tissue weg met een Kimwipe en zet het in het hybridisatie-kleurrek.
  8. Voeg 200 μL hybridisatieoplossing (verdund 1:10 in Buffer W) toe aan elke slide en breng een hybridisatieslip toe. Sluit de hybridisatiekamer, plaats hem in de oven en breng hem een nacht uit bij 37 °C.
  9. Dompel glijbanen in zout-natriumcitraat buffer (SSC, 2×) en laten de hybridisatiesslippen binnen 5 minuten vanzelf afschuiven.
  10. Was de glaasjes in een strenge washbuffer, bestaande uit gelijke delen 4× SSC en gedeïoniseerd formamide bij 37 °C, 25 minuten per was. Was de dia's in 2× SSC-buffer, 2 minuten per was.
  11. Blokkeer de slides met Buffer W op RT voor 30 minuten.
  12. Bedek het weefsel 1 uur in de primaire antilichaamoplossing (Rabbit anti-CD45) in de vochtigheidskamer bij RT, spoel 3 keer met 2× SSC-buffer.
  13. Breng een secundaire antilichaamoplossing (Goat anti-Rabbit IgG-AF647) 1 uur aan en was in 2× SSC-buffer.
  14. Bedek het weefsel in een gelabeld antilichaam (Muis anti-SMA-AF488) gedurende 1 uur in de vochtigheidskamer diadoos bij RT. Was in 2× SSC-buffer.
  15. Kleur de glaasgladen 10 minuten in een 2 μM Syto83 nucleaire marker, verdund in Buffer W, gedurende 10 minuten.
  16. Scan de glaasjes met een RNA-profileringsinstrument om de morfologische markerkleuring te visualiseren. Selecteer ROI's proximaal en distaal van verkalkte laesies van elk arterieweefsel, waarbij de laagspecifieke locatie van elke ROI wordt geannoteerd.
    OPMERKING: Wees voorzichtig om luchtbellen te voorkomen bij het aanbrengen van de hybridisatieslip op de weefselsecties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier beschreven protocol begeleidt onderzoekers van het ontvangen van tibia-arterieën tot de generatie van TMA-glaasjes die zowel morfologie als RNA-integriteit behouden voor ruimtelijke transcriptomics-analyse. Het beschrijft ook histologische methoden voor het visualiseren van calciumafzettingen in slagaders, morfologische markerkleuring en ROI-selectiestrategieën.

In Figuur 1 zijn de slagaders gefixeerd in 10% NBF (stap 2)....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om verkalkte menselijke tibia-arteries voor te bereiden op ruimtelijke transcriptomische profilering op de NanoString GeoMx DSP. Tibiale slagaders, net als alle vaten, bezitten concentrische lagen intima, mediale en adventitia, elk met aparte celpopulaties die schade en herstel orkestreeren. Het behouden van de architectuur van deze lagen is essentieel voor laagopgeloste transcriptomische analyses, maar verschillende vaak over het hoofd g...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door een startsubsidie van de VA Puget Sound, VA Merit Award I01 BX004975-02, en middelen en het gebruik van faciliteiten in het VA Puget Sound Health Care Center.  Het werk is dat van de auteurs en weerspiegelt niet noodzakelijkerwijs de positie of het beleid van het Department of Veteran Affairs of de Amerikaanse overheid.  Wij willen graag de beeldvormingsdienst erkennen die wordt geleverd door de Histology and Imaging Core (HIC) aan de Universiteit van Washington.  We willen Dr. Shreeram Akilesh bedanken voor zijn begeleiding bij DSP-experimenten aan de University of Washington en zijn groep bij MANTIS Labs: UW Spatial Biology Core.  We willen ook Nishi Ivanov van het Diabetes Research Center van de University of Washington erkennen voor histologische kleuring.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate Thermo Fisher Scientific11995065
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffer solution, 1 MThermo Fisher Scientific15630080
Penicillin-Streptomycin (P/S), 10,000 U/mLThermo Fisher Scientific15140122
10% Neutral Buffered Formalin (NBF)Millipore Sigma65346-M
Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA)Millipore Sigma3620
RNAlater Stabilization SolutionThermo Fisher ScientificAM7024RNA stabilisatieoplossing (RSS)
Hydrogen peroxide (H2O2)Advanced Cell Diagnostics, Inc322335
Target retrieval solutionAdvanced Cell Diagnostics, Inc322001
Protease PlusAdvanced Cell Diagnostics, Inc322331digestief enzymsupplement
DapB (negative control)Advanced Cell Diagnostics, Inc310043
RNAscope wash buffer (RNAscope 2.5 HD Red ISH assay kit)Advanced Cell Diagnostics, Inc320058
AMP1Advanced Cell Diagnostics, Inc324511
AMP2Advanced Cell Diagnostics, Inc324512
AMP3Advanced Cell Diagnostics, Inc324513
AMP4Advanced Cell Diagnostics, Inc324514
AMP5 RedAdvanced Cell Diagnostics, Inc324515
AMP6 RedAdvanced Cell Diagnostics, Inc324516
Fast Red AAdvanced Cell Diagnostics, Inc324517
Human PpibAdvanced Cell Diagnostics, Inc313901
Gill’s hematoxylineMillipore SigmaGHS132
Antigen retrieval, Tris/EDTA pH 9Thermo Fisher Scientific00-4956-58
Proteinase KThermo Fisher ScientificAM2546
Hybridization solution-Hs WTANanostring121401102
Hybrisliphybridisatieslip
Hybridization solution-Buffer RNanostring121300313
Rabbit anti-CD45 Cell Signaling1317
Buffer WNanostring121300313
Goat anti-Rabbit IgG-AF647Jackson Immunoresearch111-605-144
Mouse anti-SMA-AF488 Thermo Fisher Scientific53-9760
Syto83 Thermo Fisher ScientificS11364
Surgical bladeBD Biosciences371110
Superfrost  Plus Microscope SlidesThermo Fisher Scientific1255015
ImmEdge pen
Microtome bladesThermo Fisher Scientific22-500-125
RNase AWAYRNase-inactiveringsoplossing
Equipment
HybEZ hybridization oven Advanced Cell Diagnostics, Inc321710
GeoMx Digital Spatial ProfilerNanostring Model: GeoMx DSP
Data access platform: GeoMx DSP Control Center (Version 3.1.2.12)		Channel scan setting: voor FITC, expositietijd is 300 ms, en fluorofoor is AlexaFluro 488; voor kanaal Cy3, is de expositietijd 50 ms, en fluorofoor is Syto83; en voor kanaal Cy5, is de expositietijd 300 ms, en fluorofoor is AlexaFluor 647.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rao, A., Barkley, D., França, G. S., Yanai, I. Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature. 596 (7871), 211-220 (2021).
  2. Dries, R., et al. Advances in spatial transcriptomic data analysis. Genome Res. 31 (10), 1706-1718 (2021).
  3. Schmitd, L. B., et al. Spatial and transcriptomic analysis of perineural invasion in oral cancer. Clin Cancer Res. 28 (16), 3557-3572 (2022).
  4. Bassiouni, R., et al. Spatial transcriptomic analysis of a diverse patient cohort reveals a conserved architecture in triple-negative breast cancer. Cancer Res. 83 (1), 34-48 (2023).
  5. Hirz, T., et al. Dissecting the immune suppressive human prostate tumor microenvironment via integrated single-cell and spatial transcriptomic analyses. Nat Commun. 14 (1), 663(2023).
  6. Wang, F., et al. Single-cell and spatial transcriptome analysis reveals the cellular heterogeneity of liver metastatic colorectal cancer. Sci Adv. 9 (24), eadf5464(2023).
  7. Eyers, M., et al. Digital spatial profiling of the microenvironment of muscle invasive bladder cancer. Commun Biol. 7 (1), 737(2024).
  8. Del Rossi, N., Chen, J. G., Yuan, G. C., Dries, R. Analyzing spatial transcriptomics data using giotto. Curr Protoc. 2 (4), e405(2022).
  9. Sona, S., Bradley, M., Ting, A. H. Protocols for single-cell RNA-seq and spatial gene expression integration and interactive visualization. STAR Protoc. 4 (1), 102047(2023).
  10. Ibarra-Lopez, V., et al. Spatial profiling of protein and rna expression in tissue: An approach to fine-tune virtual microdissection. J Vis Exp. (185), e62651(2022).
  11. Mancinelli, L., Schoedel, K. E., Weiss, K. R., Intini, G. Methods to enable spatial transcriptomics of bone tissues. J Vis Exp. (207), e66850(2024).
  12. Sun, P., Li, M., Ye, K. Protocol to decipher complex spatial transcriptomics data using stminer. STAR Protoc. 6 (2), 103838(2025).
  13. Luo, Z., Schmitz, R. J. Protocol for preparing fresh frozen soybean tissues for spatial transcriptomics. STAR Protoc. 6 (2), 103790(2025).
  14. Li, B., et al. Spatial gene expression of human coronary arteries revealed the molecular features of diffuse intimal thickening in explanted hearts. Int J Mol Sci. 26 (5), 1949(2025).
  15. Pelisek, J., et al. Swiss vascular biobank: Evaluation of optimal extraction method and admission solution for preserving RNA from human vascular tissue. J Clin Med. 12 (15), 5109(2023).
  16. Nam, S. K., et al. Effects of fixation and storage of human tissue samples on nucleic acid preservation. Korean J Pathol. 48 (1), 36(2014).
  17. Juwayria,, et al. Microarray integrated spatial transcriptomics (MIST) for affordable and robust digital pathology. NPJ Syst Biol Appl. 10 (1), 142(2024).
  18. Wang, H., et al. Systematic benchmarking of imaging spatial transcriptomics platforms in ffpe tissues. bioRxiv. , (2023).
  19. Smith, K. D., et al. Rigor and reproducibility of spatial transcriptomics performed on clinically sourced human tissues. Lab Invest. 104190, (2025).
  20. Amancherla, K., et al. Dynamic responses to rejection in the transplanted human heart revealed through spatial transcriptomics. bioRxiv. , (2025).
  21. Bolen, M., Xue, Q. -S., Tansey, M. G. Ffpe tissue microarray protocol. , (2024).
  22. Wisner, L., Larsen, B., Maguire, A. Manual construction of a tissue microarray using the tape method and a handheld microarrayer. J Vis Exp. (184), e63086(2022).
  23. Zhao, P., et al. Single-cell RNA-seq reveals a critical role of novel pro-inflammatory endothelial cells in mediating adverse remodeling in coronary artery-on-a-chip. Sci Adv. 7 (34), eabg1694(2021).
  24. Fu, M., et al. Single-cell RNA sequencing of coronary perivascular adipose tissue from end-stage heart failure patients identifies SPP1+ macrophage subpopulation as a target for alleviating fibrosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 43 (11), 2143-2164 (2023).
  25. Mao, A., et al. Single-cell RNA-seq reveals coronary heterogeneity and identifies CD133+ TRPV4high endothelial subpopulation in regulating flow-induced vascular tone in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (3), 653-665 (2024).
  26. Li, C., et al. Single-cell RNA sequencing of the carotid artery and femoral artery of rats exposed to hindlimb unloading. Cell Mol Life Sci. 82 (1), 50(2025).
  27. Deroo, E., et al. A vein wall cell atlas of murine venous thrombosis determined by single-cell RNA sequencing. Commun Biol. 6 (1), 130(2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Ruimtelijke transcriptomicaRNA preserveringweefseldecalcificatieRNAscope hybridisatiehistologische kleuringAlizarinerood kleuringweefselmicroarrayregio van interesse

Gerelateerde artikelen