Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Onderzoeksartikel

Neuregulin1-ErbB4 Signaaloverdracht betrokken bij acupunctuur die myelineregeneratie bevordert bij ratten met ruggenmergletsel

450 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69166

⸱

20 februari 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Emergency and Intensive Care Unit, Beijing Anzhen Nanchong Hospital of Capital Medical University & Nanchong Central Hospital, 2Department of Neurology, Beijing Anzhen Nanchong Hospital of Capital Medical University & Nanchong Central Hospital, 3Department of Emergency and Intensive Care Unit, First Affiliated Hospital, Kunming Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie heeft als doel de effecten van elektroacupunctuur op myelineregeneratie in een rattenmodel van SCI te onderzoeken en te verifiëren of de Neuregulin1 (NRG1)-ErbB4 signaalweg een rol speelt in dit proces.

Samenvatting

Ruggenmergletsel (SCI) leidt vaak tot ernstige neurologische disfunctie, en myelineherstel is een cruciale stap in het herstel van neurologische functies. Elektroacupunctuur (EA), een therapeutische methode die traditionele acupunctuur combineert met elektrische stimulatie, wordt veel toegepast op het gebied van zenuwherstel. De specifieke signaalroutes die bij EA betrokken zijn, zijn echter nog niet volledig opgehelderd. Deze studie heeft als doel de effecten van EA op myelineregeneratie bij SCI-ratten te onderzoeken en te verifiëren of de Neuregulin1 (NRG1)-ErbB4 signaalweg een rol speelt in dit proces. SCI-ratten werden geïnduceerd door een aneurysmaclipletsel in het T10-wervelsegment. Een polyethyleen (PE) katheter werd geïmplanteerd in het wervelkanaal tussen de L5-6 tussenwervelruimtes en subcutaan vastgezet om een langdurig geneesmiddelafgiftesysteem op te zetten. Exogene NRG1 en de antagonist werden om de dag via de PE-katheter toegediend, met een volume van 20 μL per injectie. De EA-behandeling werd toegepast op de Dazhui (GV14) en Mingmen (GV4) acupunctuurpunten om de dag, waarbij elke sessie 4 opeenvolgende weken 30 minuten duurde. De resultaten toonden aan dat de behandeling met EA significant de expressie van myeline-basiseiwit (MBP) in het ruggenmergweefsel bevorderde en de motorische functie van de achterpooten bij ratten verbeterde. Bovendien veroorzaakte exogeen NRG1 vergelijkbare effecten als EA. Samenvattend speelt het NRG1-ErbB4-signaalpad een belangrijke rol bij door EA geïnduceerde myelineregeneratie bij SCI-ratten.

Inleiding

SCI is een traumatische aandoening die leidt tot ernstige neurologische tekorten, meestal geuit in motorische beperkingen, sensorisch verlies en autonome disfunctie, met een jaarlijkse incidentie van ongeveer 40-80 gevallen per miljoen mensen wereldwijd 1,2. Na een blessure zijn axonale ruptuur en myelineverlies de belangrijkste pathologische kenmerken die de geleiding van neurale signalen belemmeren3. Myeline wordt gevormd door oligodendrocyten in het centrale zenuwstelsel (CZS) en Schwann-cellen in het perifere zenuwstelsel (PNS), en de integriteit ervan is cruciaal voor de snelle geleiding van zenuwimpulsen4. De ontstekingsreactie, oxidatieve stress en de vorming van glialittekens in de lokale microomgeving na SCI remmen echter de myelineregeneratie significant, wat leidt tot chronische neurologische disfunctie5. Tegelijkertijd leidt het afsterven van oligodendrocyten (OL's) na SCI tot demyelinisatie van axonen, een proces dat chronisch en aanhoudend ontstaat. Studies hebben aangetoond dat axonale demyelinisatie in zowel menselijke als dierlijke modellen effectief kan worden hersteld door myelineregeneratie6. Daarom is het verkennen van strategieën om myelineherstel te bevorderen een van de belangrijkste richtingen in de behandeling van SCI.

Acupunctuur, als een oude traditionele medische techniek, is breed toegepast in de klinische praktijk in meerdere landen, waaronder China, Korea en Japan 7,8. EA, dat traditionele acupunctuur combineert met elektrische stimulatie, is breed toegepast in klinische omgevingen. Steeds meer bewijs toont aan dat EA therapeutische effecten heeft op verschillende ziekten, met name bij het bevorderen van myelineregeneratie na ruggenmergletsel. De keuze van acupunctuurpunten is cruciaal tijdens EA-behandelingen, zoals GV14 en GV49. GV14 bevindt zich onder het uitsteeksel van de zevendehalswervel, nabij de middenlijn van de wervelkolom, terwijl GV4 zich bevindt tussen de uitsteeksels van de2e en3e lumbale wervel. Eerdere studies hebben aangetoond dat ontstekingssignaleringsroutes, oxidatieve stress, neurotrofe factoren en autofagie een rol spelen bij EA-geïnduceerde myelineherstel 10,11,12. Bovendien suggereert toenemend bewijs dat specifieke acupunctuurpunten, zoals GV14 en GV4, een actieve rol spelen in het bevorderen van myelineregeneratie tijdens EA-behandeling 13,14,15. De moleculaire mechanismen waarmee EA myelineregeneratie na ruggenmergletsel reguleert, zijn echter nog niet volledig opgehelderd.

NRG1 behoort tot de epidermale groeifactorfamilie en kan op basis van zijn aminoterminale regio worden ingedeeld in zes typen (I-VI)16. NRG1 en zijn receptorfamilie, ErbB (ErbB1/2/3/4), spelen een belangrijke rol in de ontwikkeling en reparatie van het zenuwstelsel, waaronder processen zoals neuronale migratie, differentiatie, remyelinisatie en synaptogenese. Tijdens de ontwikkeling van het PNS vermeerderen en migreren Schwann-cellen (SC's) langs de axonen van neuronen om myeline te vormen, en speelt de NRG1-ErbB4-signaalweg een sleutelrol in de rijping van PNS Schwann-voorlopercellen17,18. Eerdere studies hebben aangetoond dat de NRG1-signaalroute betrokken is bij de differentiatie van neurale stamcellen naar Schwann-cellen en de myeline-reparatie van neurale cellen na SCI19 bevordert. Daarnaast heeft een studie aangetoond dat na een ruggenmergletsel de NRG1-ErbB4 signaalweg de transformatie van oligodendrocyten-voorlopercellen (OPC's) bevordert in Schwann-achtige cellen met remyelinispotentiaal20. Alex et al. construeerden een co-kweeksysteem van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide sensorische neuronen en ratten-Schwann-cellen en ontdekten dat het blokkeren van de NRG1-ErbB-signaalweg met medicijnen de neuronale myelinisatie significant inhibeerde, wat direct bewijs leverde voor de rol van deze route bij het bevorderen van menselijke sensorische axonmyelinisatie21. Een andere studie heeft ook aangetoond dat de behandeling met EA de expressie van NRG1 in het ruggenmerg kan verhogen en ontstekingspijn kan verlichten22.

Onderzoek naar de impact van EA op het NRG1-ErbB4 signaalpad bij SCI is beperkt en de onderliggende mechanismen blijven onduidelijk. Deze studie heeft als doel te onderzoeken of EA-stimulatie op de GV14- en GV4-acupunctuurpunten de signaaltransductie van NRG1-ErbB4 kan reguleren en de potentiële rol ervan bij het bevorderen van myelineregeneratie en herstel van neurologische functies bij SCI-ratten te onderzoeken. Dit is de eerste studie die de relatie onderzoekt tussen de NRG1-ErbB4 signaalroute en door EA geïnduceerde myelineregeneratie bij SCI-ratten, en levert experimenteel bewijs voor de ontwikkeling van nieuwe en effectieve behandelstrategieën voor SCI.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle ethische richtlijnen werden tijdens het experiment nageleefd om het lijden van dieren te minimaliseren. Het experimentele protocol en ontwerp werden goedgekeurd door de Dierproefcommissie van de Kunming Medische Universiteit (Goedkeuringsnummer KMMU2021051) en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor dieronderzoek van de universiteit. Volwassen mannelijke Sprague-Dawley-ratten (8 weken oud, gewicht 250-270 g, n = 60) werden verkregen van de Kunming Medical University (Yunnan, China).

Dierlijke bereiding

De dieren werden gehuisvest in een gecontroleerde omgeving met constante luchtvochtigheid, een matige temperatuur en een licht/donkercyclus van 12 uur. De dieren werden willekeurig toegewezen aan 11 groepen: Sham-operatiegroep (S, n = 6), SCI-groep (M, n = 6), SCI met EA-behandelgroep (M + EA, n = 6), SCI met NRG-1β behandelgroep (M + NRG-1β, n = 6), SCI met 5% DMSO-oplosmiddelgroep (M + D, n = 6), SCI met PD158780 inhibitor en NRG-1β behandelgroep (M + PD+NRG-1β), n = 6), SCI met PD158780 remmer en EA-behandelgroep (M + EA + PD, n = 6), SCI met oplosmiddel- en EA-behandelgroep (M + EA + D, n = 6), SCI met shRNA en EA-behandelgroep (M + EA + shRNA, n = 6), SCI met lentivirus-bevattend niet-targetend shRNA en EA-behandelgroep (M + EA + NC, n = 6), SCI met shRNA-behandelgroep (M + shRNA, n = 6). De huidige steekproefgrootte is bepaald op basis van onze eerdere ervaring met vergelijkbare modellen en interventies, die consequent significante effecten met dit aantal hebben laten zien. Bovendien observeerden we, ondanks de steekproefgrootte, statistisch robuuste en significante verschillen in belangrijke uitkomsten, wat het vertrouwen in de gerapporteerde bevindingen versterkt.

SCI-rattenmodel

Een Yasargill-aneurysmaclip (titanium, standaard sluitkracht van 70 g) werd gebruikt om een rattenmodel van SCI te maken met een klemtechniek (Figuur 1A). De ratten werden verdoofd met 2% natriumpentobarbital (30 mg/kg, intraperitoneaal) en op een operatietafel geplaatst. Er werd een incisie van 3-4 cm in de achterhuid gemaakt, gevolgd door laag-voor-laag dissectie van het subcutane weefsel en de spier om de T9-11 thoracale stekeluitsteeksels en wervelbogen bloot te leggen. Een vasculaire clip werd gebruikt om het T10 thoracale spinale uitsteeksel en de wervelboog te verwijderen, waardoor het ruggenmerg volledig blootkwam. De Yasargill-aneurysmaclip werd verticaal geplaatst over het gehele T10-segment en snel losgelaten na een verblijfstijd van 60 seconden. Het model werd als succesvol beschouwd als twee of meer van de volgende tekenen werden waargenomen: (1) spasmodische tremor van het lichaam, (2) kwispelende staartreflex en (3) zichtbare zwarte knijpsporen op het ruggenmerg. Na voldoende hemostase werd de incisie gedesinfecteerd en gehecht. In de schijnoperatiegroep werd dezelfde procedure uitgevoerd, behalve dat het ruggenmerg niet werd afgeklemd. Postoperatief kregen de ratten normale zoutoplossing (3 ml, intraperitoneaal) voor rehydratatie en penicilline (100.000 eenheden, intraperitoneaal) één keer in de ochtend en één keer 's avonds gedurende drie opeenvolgende dagen om infectie te voorkomen. Handmatige hulp bij het plassen werd gegeven totdat het spontane urineren was hersteld (2x daags).

Intrathecale buis en medicijnafgifte via ratten

Volgens de methode van Storkson et al.23 werd een katheter geïmplanteerd in de subarachnoïdale ruimte bij ratten, een week vóór de inductie van het SCI-model. Na de narcose werden de ratten op de operatietafel gefixeerd en werd de L5-6 intervertebrale ruimte blootgelegd. Een 19G-naald werd gebruikt om verticaal door de dura mater en het arachnoïdale membraan te dringen. De naald werd ongeveer 1-2 mm naar voren geschoven en na het doorbreken van het arachnoïdale membraan werd een gevoel van ruimte gevoeld, gevolgd door een heldere stroom van hersenvocht, wat wijst op een geslaagde punctie. Een PE-10 katheter (polyethyleen, binnendiameter 0,38 mm, buitendiameter 1,09 mm) werd in de subarachnoïdale ruimte langs de priknaald ingebracht. De katheter werd naar voren geschoven tot een lengte van ongeveer 3 cm, waarbij de kathetertip nabij het L3-wervellichaam werd geplaatst. Tijdens het inbrengen werden staartbewegingen en het trekken van de achterpooten bij de ratten waargenomen, en cerebrospinaal vocht stroomde via de katheter, waarmee de positie van de katheter in de subarachnoïdale ruimte werd bevestigd.

Zowel NRG-1β als PD158780 werden opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO) en vervolgens verdund met kunstmatig hersenvocht (ACSF), waardoor de uiteindelijke DMSO-concentratie onder de 0,5% bleef. De uiteindelijke werkconcentraties waren 20 nM voor NRG-1β en 20 μM voor PD15878024. Op de tweede dag na de SCI kregen ratten in de M + NRG-1β groep om de dag intrathecale injecties van 20 μL NRG-1β. Ratten in de M + EA + PD groep kregen 20 μL PD158780 intrathecaal25 uur toegediend, 2 uur voor de EA-behandeling.

EA-behandeling

Op dederde dag na de operatie werden ratten gefixeerd op de behandeltafel voor elektroacupunctuur (EA) therapie bij de acupunctuurpunten GV14 en GV4 (Figuur 1B). Twee acupunctuurnaalden (0,25 mm x 13 mm) werden in deze punten gebracht tot een diepte van 3-4 mm. EA-therapie werd toegediend met een elektroacupunctuurapparaat met een dun-dicht golfpatroon (spaarzame golf bij 2 Hz en dichte golf bij 10 Hz, met een frequentieverhouding van 1:5). De outputintensiteit werd ingesteld op 5 (ongeveer 0,5 mA) gedurende 30 minuten, om de dag.

Gedragsbeoordeling

Locomotorische functie werd geëvalueerd met behulp van de Basso, Beattie, and Bresnahan (BBB) schaal27, die ledematenbeweging, gang, coördinatie en pootplaatsing beoordeelt op de volgende tijdstippen: 0, 3, 7, 14, 21 en 28 dagen na de operatie ( Figuur 2D). De BBB-schaal varieert van 0 (volledige verlamming) tot 21 (wat een normale gang aangeeft). Alle beoordelingen werden onafhankelijk uitgevoerd door twee onderzoekers die blind waren voor de experimentele groepstoewijzingen.

Monsterverzameling

Na afloop van het experiment werden verdoofde ratten op een dissectieplatform geplaatst voor weefselverzameling. De buikholte werd geopend om het middenrif volledig bloot te leggen, dat zorgvuldig werd ingesneden met een irisschaar om vasculaire schade te voorkomen. De ribbenkast werd vervolgens langs beide ribranden opengesneden om het hart bloot te leggen, waarna een naald in de linker ventrikel bij de top werd ingebracht en ongeveer 300-400 ml voorgekoelde PBS snel werd geperfundeerd om systemisch bloed te zuiveren totdat helder vocht uit het rechter atrium stroomde. Voor moleculaire eiwitanalyse werd de perfusie in dit stadium gestopt en werd de wervelkolom ontleed. Na het verwijderen van aangrenzende ribben en spieren om de wervels bloot te leggen, werd het T10-segment gelokaliseerd, en een ruggenmergsegment van ongeveer 1 cm rostral en caudaal naar T10 werd met irisschaar verzameld, vervolgens met een knipbevriezer in vloeibare stikstof bevroren en opgeslagen bij -80 °C. Voor morfologisch onderzoek werd de perfusie na PBS vervangen door 4% paraformaldehyde, met succesvolle fixatie die werd aangegeven door spiercontractie en stijfheid van de romp. Hetzelfde spinale segment werd vervolgens zorgvuldig ontleed om de weefselarchitectuur te behouden en 4% paraformaldehyde bij 4 °C 48 uur lang vastgezet.

Hematoxyline- en eosinekleuring

De paraffinesecties van het ruggenmerg werden in een 60 °C oven geplaatst voor voorverwarming gedurende 30 minuten. Afwassen: Xyleen I gedurende 15 minuten, gevolgd door Xyleen II voor 15 minuten. Rehydratatie: Behandeld met 100% ethanol gedurende 2 minuten, daarna 95% ethanol gedurende 2 minuten, vervolgens met 80% ethanol voor 2 minuten, gevolgd door 70% ethanol voor 2 minuten. en tenslotte 5 minuten gedestilleerd water. Hematoxyline-kleuring werd 7 minuten uitgevoerd, gevolgd door spoelen met gedestilleerd water om de resterende kleuringsoplossing te verwijderen. Differentiatie in alcoholzuur van 1% zoutzuur werd 3 seconden uitgevoerd, gevolgd door spoelen met gedestilleerd water om de resterende vlekken te verwijderen. Blauwen met 5% ammoniakwater werd 2 minuten gedaan, gevolgd door het afwassen van de resterende blauwoplossing. Eosine-kleuring werd 30 seconden uitgevoerd, gevolgd door spoelen met gedestilleerd water om de achtergebleven kleuringsoplossing te verwijderen. De uitdroging van de secties werd gedaan met 70% ethanol gedurende 10 s, daarna 80% ethanol gedurende 10 s, en tenslotte met 100% ethanol gedurende 30 s. De verwijdering werd gedaan door 5 minuten te behandelen met Xyleen. Na het monteren werden de slides aan de lucht gedroogd en na het drogen werden beelden gemaakt.

Luxol snelle blauwe kleuring

De secties werden 2x met xyleen ontwist gedurende 10 minuten, daarna gekleurd met LFB myeline-kleuringsoplossing en een nacht geïncubeerd bij 37 °C. De volgende dag werd overtollige kleuroplossing verwijderd met 90% ethanol. De secties werden gedifferentieerd in Luxol-differentiatieoplossing voor 10 s (C0631S), gevolgd door onderdompeling in 75% ethanol gedurende 30 s totdat de grijze stof helder werd. Tot slot werden de secties 1 minuut lang tegengekleurd met eosine-kleuringsoplossing.

Westelijke verplettering

Eiwitmonsters werden 5 minuten in water gekookt. In totaal werd eerst 5 μL eiwitmarker in de elektroforesegel geladen, gevolgd door sequentiële lading van de testproteïnemonsters. Elektroforese werd gestart bij 80 V totdat de markerbanden duidelijk gescheiden waren, waarna de spanning werd verhoogd tot 130 V en gehandhaafd bleef tot de elektroforese voltooid was. Voorgesneden PVDF-membranen werden 1 minuut in methanol geactiveerd, vervolgens op filterpapier gelegd en overheen gelegd met de voorbereide gel. De eiwitoverdracht werd uitgevoerd met een constante stroom van 300 mA, waarbij de overdrachtstijd werd aangepast aan het molecuulgewicht (± 10 min). Na de overdracht werd het PVDF-membraan in een incubatiebox geplaatst, 5 minuten afgespoeld met TBST-buffer en vervolgens 2 uur geblokkeerd met 5% afgemagerde melk op kamertemperatuur op een shaker. Het membraan werd vervolgens 3 keer gewassen met TBST-buffer gedurende elk 5 minuten voordat het incubeerde met primaire antilichamen, waaronder GAPDH (1:2000), Tubulin (1:2000), NRG1 (1:1000), ErbB4 (1:1000) en MBP (1:1000), 's nachts bij 4 °C met zacht schudden. De volgende dag werd het membraan 3 keer gewassen met TBST-buffer gedurende 5 minuten, waarna het geïncubeerd werd met een secundair antilichaam, geitenanti-konijn (1:4000), op kamertemperatuur op een shaker gedurende 2 uur. Na het wassen met TBST werden eiwitbanden zichtbaar gemaakt met behulp van chemiluminescentie. Importeer de WB-afbeelding in de ImageJ-software en voer achtergrondsubtractie uit met een rollende balstraal van 50 pixels. Voor gekantelde banden gebruik je het Segmented Line-gereedschap om de banden recht te maken. Gebruik het Rechthoekgereedschap om de doelbanden te selecteren en een dichtheidsprofiel te genereren door Plot Lanes te selecteren om de grijstintenwaarden van de banden te visualiseren. Gebruik het Magic Wand-gereedschap om de pieken te segmenteren en de grijswaardenwaarden te extraheren. Na het opslaan van de gegevens gebruik je de GraphPad Prism-software om staafdiagrammen te maken.

Immunofluorescentie

Paraffinesecties werden 2x met xyleen 10 minuten gedewaxt en vervolgens gerehydrateerd via een gegradeerde ethanolserie. Antigeenwinning werd uitgevoerd door de secties 15 minuten te koken in 5% citroenzuuroplossing, gevolgd door blokkering met 10% geitenserum gedurende 2 uur. De secties werden vervolgens 's nachts geïncubeerd bij 4 °C met de volgende primaire antilichamen: muismonoklonale NRG-1 (1:200), konijn monoklonale ErbB4 (1:300) en menselijk monoklonaal MBP (1:300). Na drie wasbeurten met fosfaatgebuffte zoutoplossing met 0,1% Triton X-100 (PBST) gedurende elk 10 minuten, werden de secties 1 uur in het donker geïncubeerd met de volgende secundaire antilichamen: FITC-gelabelde geitenanti-muis IgG (1:500), FITC-gelabelde geitenanti-konijn IgG (1:500) en FITC-gelabelde geitenanti-menselijke IgG (1:500). De secties werden 3x met PBST gewassen gedurende elk 10 minuten, daarna vastgezet en gemonteerd met antifade-reagens om fluorescentiesignalen te behouden. De dia's werden in het donker opgeslagen bij 4 °C. Na het lokaliseren van de doelcellen onder een 10x objectief lens met een fluorescentiemicroscoop, schakel je over op een 40x lens om het fluorescentiebeeld vast te leggen.

Real-time Polymerasekettingreactie (RT-PCR)

Primers voor ErbB4 en het referentiegen GAPDH zijn ontworpen met behulp van de NCBI-website. De volgorde van de primers was als volgt: ErbB4 voorste primer: ACAGCCCTCCTCCTGCCTAC; ErbB4 omgekeerde primer: ATCTCAGCCGTTGCACCCT; GAPDH voorste primer: CCCAGCTTAGGTTCATCATCAGGT; GAPDH omgekeerde primer: TACGCCAAATCCGTTCACACA. Ongeveer soja-groot ruggenmergweefsel werd in een 1,5 mL centrifugebuis geplaatst, en 600 μL totale RNA-extractie-reagens werd toegevoegd. Het weefsel werd grondig gehomogeniseerd en 5 minuten op ijs geïncubeerd, gevolgd door centrifugatie op 12.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Het supernatant werd overgebracht naar een nieuwe 1,5 mL buis en 400 μL chloroform werd toegevoegd. Het mengsel werd grondig gemengd en gecentrifugeerd op 12.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Het supernatant werd opnieuw overgebracht naar een nieuwe buis en er werd 400 μL isopropanol toegevoegd. De oplossing werd 10 minuten op kamertemperatuur geïncubeerd, gevolgd door centrifugatie op 12.000 x g gedurende 10 minuten. Het supernatant werd weggegooid en de RNA-pellet werd gewassen met 400 μL van 75% ethanol. Na centrifugatie bij 7.500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C werd het supernatant afgevoerd en werd de buis omgekeerd om aan de lucht te drogen op een schoon oppervlak. De RNA-pellet werd opgelost in 60 μL RNA-vrij water, grondig gemengd, en de RNA-concentratie werd gemeten. De zuiverheid en concentratie van het RNA werden vastgelegd door absorptie te meten bij 260 nm en 280 nm, zodat de 260/280-verhouding ongeveer 2,0 was. Voor cDNA-synthese werden Reactie 1 (met gDNA-gum, enz.) en Reactie 2 (met reverse transcriptase, enz.) grondig gemengd, en het mengsel werd 15 minuten geïncubeerd bij 95 °C. Het fluorescentie-PCR-reactiesysteem werd voorbereid volgens de instructies van de cDNA-synthesekit. Een monster van 2 μL werd toegevoegd aan 23 μL PCR-reactiemix, en de versterking werd uitgevoerd volgens het fluorescentie-kwantitatieve PCR-kitprotocol. De gloeitemperatuur werd ingesteld op 60 °C, en de versterkingsvoorwaarden waren als volgt: Pre-denaturatie: 95 °C gedurende 30 seconden, 1 cyclus; PCR-reactie: 95 °C voor 3 seconden, 60 °C voor 30 seconden, 40 cycli; De analyse van de dissociatiecurve werd als volgt uitgevoerd: 95 °C voor 5 seconden, 60 °C voor 30 seconden, gevolgd door een geleidelijke toename van 60 °C naar 95 °C met continue fluorescentiesignaalacquisitie. CT-waarden werden gemeten en berekend met behulp van de Bio-Rad-computersoftware, en de relatieve mRNA-niveaus werden bepaald met de 2-ΔΔCt-methode .

Veiligheids- en omgangsrichtlijnen

Paraformaldehydefixatie: Gebruik paraformaldehyde uitsluitend in een goed geventileerde dampkap. Draag altijd geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), waaronder een mondkapje, handschoenen, een labjas en een veiligheidsbril. Bewaar paraformaldehydeoplossing in een goed afgesloten container, weg van direct zonlicht en warmtebronnen. Verwijder afvalparaformaldehyde volgens de laboratoriumveiligheidsrichtlijnen van de Kunming Medische Universiteit door het in een gevaarlijke afvalcontainer te plaatsen.

DMSO-oplossing: DMSO kan via de huid worden opgenomen en het lichaam binnendringen. Draag tijdens het hanteren geschikte PBM, inclusief handschoenen en veiligheidsbril. Bewaar DMSO in een afgesloten container op kamertemperatuur, weg van sterke oxiderende middelen. Afval DMSO wordt afgevoerd volgens de laboratoriumveiligheidsrichtlijnen van de Kunming Medische Universiteit door het in een container voor gevaarlijk afval te plaatsen.

Pentobarbitale anesthesie: Pentobarbital is een gereguleerde stof en mag alleen worden gebruikt door geautoriseerd personeel. Voorkom onbedoelde blootstelling tijdens het hanteren en zorg voor goede ventilatie tijdens het gebruik. Draag geschikte beschermende uitrusting. Bewaar pentobarbital in een afgesloten kast op kamertemperatuur, onder toezicht van geautoriseerd personeel. Verwijder pentobarbitalafval in overeenstemming met de richtlijnen van de Kunming Medical University voor gecontroleerde stoffen, waarbij de juiste gebruiksvergunning en afvalverwijderingsprocedures worden gegarandeerd.

Algemene afvalverwijdering: Alle gevaarlijke chemicaliën en reagentia moeten worden afgevoerd volgens de richtlijnen voor laboratoriumbeheer van de Kunming Medische Universiteit. Zorg ervoor dat alle afvalmaterialen correct zijn gelabeld en in geschikte containers worden geplaatst voor veilige verwijdering.

Statistische analyse

Alle experimenten werden in drievoud of meer uitgevoerd. De banddichtheidswaarden van de doeleiwitten werden genormaliseerd op die van de controlegroep om vergelijkingen tussen groepen te vergemakkelijken. De gegevens worden gepresenteerd als mediaan (interkwartielbereik) of gemiddelde ± standaarddeviatie, waarbij n het aantal ratten aangeeft. Voor normaal verdeelde gegevens werden significante verschillen tussen groepen beoordeeld met behulp van eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA). Voor niet-normaal verdeelde gegevens werd de Kruskal-Wallis H-test toegepast om groepen te vergelijken. De statistische significantie werd vastgesteld op p < 0,05.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

H&E-kleuring en BBB-score tonen de beschermende effecten van EA op SCI-ratten aan

H&E-kleuring werd gebruikt om de morfologie en structuur van de achterste hoorncellen van het ruggenmerg te onderzoeken (Figuur 2D). De H&E-resultaten toonden aan dat in groep S de achterste hoorncellen netjes waren gerangschikt, met goed gedefinieerde celcontouren en centraal gelegen kernen. Daarentegen werd het aantal achterste hoo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze studie toont aan dat EA-behandeling de ruggenmergcavitatie en demyelinisatie na een SCI verlicht, waardoor remyelinisatie wordt bevorderd door upregulatie van de expressie van MBP-eiwitten, en daardoor de motorische functie van de achterpoten bij ratten verbetert. Daarnaast identificeerden we de NRG-1/ErbB4 signaalweg als een cruciale mediator van neuronale remyelinisatie en een potentieel therapeutisch mechanisme waarmee EA remyelinisatie en herstel van de motorische achterpootfunc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Wij danken de auteurs voor hun bijdragen aan deze studie. Deze studie werd financieel ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (NSFC 81960817, 82260387) en het Basisonderzoek Speciaal Programma van het Wetenschaps- en Technologieplan van het Provinciale Departement Wetenschap en Technologie van Yunnan (202301AS070020). Wetenschappelijk Onderzoeks- en Ontwikkelingsproject van het Noord-Sichuan Medisch College (CBY22-QNA20)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BCA Protein Detection Kit Beyotime BiotechnologyP0012SKwantitatieve eiwitanalyse
Elektroacupunctuur apparaatHuatuo Electroacupunctuur Instrument, SDZ-V, Suzhou—Therapeutisch materiaal
FITC-gelabelde geiten anti-menselijke IgGBeyotimeA0556Fluorescente secundaire antilichaam
FITC-gelabelde geiten anti-muis IgGBeyotimeA0568Fluorescente secundaire antilichaam
FITC-gelabelde geiten anti-konijn IgGBeyotimeA0562Fluorescente secundaire antilichaam
FluorescentiemicroscoopOlympus——
Menselijke monoklonale MBPAbcamab209328Specifiek antilichaam
LFB myeline kleuring oplossingSolarbioG3240Myeline sheath kleuring
Millipore ECLMilliporeWBKLS0100Detectie reagentia
Muis monoklonale NRG-1 Santa CruzSC-57384Specifiek antilichaam
Nanodrop ND-1000LabTech—
NRG1-1 betaNovoprotein Technology CoC753Recombinant menselijke NRG1-1 beta
PD158780GlpBio TechnologyGC15925De epidermale groeifactor receptor (EGFR) tyrosine kinase remmer
PE-10 kanaalBecton, Dickinson and Company427401Intrathecale injectie
Penicilline natrium voor injectieHarbin Zhongjing Biotechnology Co80451182Postoperatieve anti-infectie therapie
Konijn monoklonale ErbB4Abcamab109273Specifiek antilichaam
RNAiso Plus KitTakara9109RT-PCR reagentia
RT Reagens KitTakaraRR037ART-PCR reagentia
Secundaire antilichaamBeyotime Biotechnology—Specifiek antilichaam
Natrium pentobarbitalSigma-Aldrich69020100Dierd anesthesie
Yasargil aneurysma clipRebstock Instruments GmbH—Constructie van een rat spinale cord letsel model

Referenties

  1. McDonald, J. W., Sadowsky, C. Spinal-cord injury. Lancet. 359 (9304), 417-425 (2002).
  2. Mohammadi, E., Villeneuve, L. M., Smith, Z. A. Spinal Cord Injury: The Global Incidence, Prevalence, and Disability From the Global Burden of Disease Study 2019. Spine. 48 (24), 1767(2023).
  3. Anjum, A., et al. Spinal Cord Injury: Pathophysiology, Multimolecular Interactions, and Underlying Recovery Mechanisms. Int J Mol Sci. 21 (20), 7533(2020).
  4. Fang, M., Chen, L., Tang, T., Qiu, M., Xu, X. The committed oligodendrocyte precursor cell, a newly-defined intermediate progenitor cell type in oligodendroglial lineage. Glia. 71 (11), 2499-2510 (2023).
  5. Hellenbrand, D. J., et al. Inflammation after spinal cord injury: a review of the critical timeline of signaling cues and cellular infiltration. J Neuroinflammation. 18 (1), 284(2021).
  6. Pukos, N., et al. Chronic demyelination and myelin repair after spinal cord injury in mice: A potential link for glutamatergic axon activity. Glia. 71 (9), 2096-2116 (2023).
  7. Birch, S., Robinson, N. Acupuncture as a post-stroke treatment option: A narrative review of clinical guideline recommendations. Phytomedicine. 104, 154297(2022).
  8. Jiang, K., Sun, Y., Chen, X. Mechanism Underlying Acupuncture Therapy in Spinal Cord Injury: A Narrative Overview of Preclinical Studies. Front Pharmacol. 13, 875103(2022).
  9. Wang, X., et al. Electroacupuncture at Dazhui (GV14) and Mingmen (GV4) protects against spinal cord injury: the role of the Wnt/β-catenin signaling pathway. Neural Regen Res. 11 (12), 2004-2011 (2016).
  10. Li, S. S., et al. Electroacupuncture treatment improves motor function and neurological outcomes after cerebral ischemia/reperfusion injury. Neural regen res. 17 (7), 1545-1555 (2022).
  11. Liu, C., et al. Electroacupuncture promotes oligodendrocyte differentiation and myelin repair in a rat model of vascular dementia: Investigation of the mechanism from NF-κB-mediated inflammation. Neuroscience. 572, 21-34 (2025).
  12. Tong, T., et al. Electroacupuncture ameliorates chronic unpredictable mild stress-induced depression-like behavior and cognitive impairment through suppressing oxidative stress and neuroinflammation in rats. Brain Res Bull. 206, 110838(2024).
  13. Ahn, S. M., et al. Electroacupuncture ameliorates memory impairments by enhancing oligodendrocyte regeneration in a mouse model of prolonged cerebral hypoperfusion. Sci Rep. 6, 28646(2016).
  14. Kong, Y., Yang, J., Fan, Y. Q., Wang, W. S., Zhang, Y. T. "Huayu Tongluo" moxibustion improves learning-memory ability and promotes myelin regeneration by regulating Sonic Hedgehog signaling pathway in vascular dementia rats. Zhen Ci Yan Jiu. 48 (6), 578-584 (2023).
  15. Chen, W. C., et al. Influence of electroacupuncture of Dazhui (EX-B2) and Mingmen (GV4) on NR2B expression in anterior horns of spinal cord in rats with acute spinal cord injury. Zhen Ci Yan Jiu. 44 (2), 95-101 (2019).
  16. Mei, L., Nave, K. A. Neuregulin-ERBB signaling in the nervous system and neuropsychiatric diseases. Neuron. 83 (1), 27-49 (2014).
  17. Birchmeier, C., Bennett, D. L. Neuregulin/ErbB Signaling in Developmental Myelin Formation and Nerve Repair. Curr Top Dev Biol. 116, 45-64 (2016).
  18. Chen, S., et al. Neuregulin 1-erbB signaling is necessary for normal myelination and sensory function. J Neurosci. 26 (12), 3079-3086 (2006).
  19. Bartus, K., et al. ErbB receptor signaling directly controls oligodendrocyte progenitor cell transformation and spontaneous remyelination after spinal cord injury. Glia. 67 (6), 1036-1046 (2019).
  20. Tao, F., et al. Role of neuregulin-1/ErbB signaling in stem cell therapy for spinal cord injury-induced chronic neuropathic pain. Stem cells. 31 (1), 83-91 (2013).
  21. Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140 (4), 898-913 (2017).
  22. Wan, C., et al. Neuregulin1-ErbB4 Signaling in Spinal Cord Participates in Electroacupuncture Analgesia in Inflammatory Pain. Front Neurosci. 15, 636348(2021).
  23. Tseropoulos, G., et al. Immobilized NRG1 Accelerates Neural Crest like Cell Differentiation Toward Functional Schwann Cells Through Sustained Erk1/2 Activation and YAP/TAZ Nuclear Translocation. Adv Sci (Weinh). 11 (33), e2402607(2024).
  24. Luo, M., et al. Neuronal activity-dependent myelin repair promotes motor function recovery after contusion spinal cord injury. Brain Res Bull. 166, 73-81 (2021).
  25. Hesp, Z. C., Goldstein, E. Z., Miranda, C. J., Kaspar, B. K., McTigue, D. M. Chronic oligodendrogenesis and remyelination after spinal cord injury in mice and rats. J Neurosci. 35 (3), 1274-1290 (2015).
  26. Levy, G., et al. Gtf2i-encoded transcription factor Tfii-i regulates myelination via Sox10 and Mbp regulatory elements. Nat Commun. 16 (1), 8518(2025).
  27. Cescon, M., et al. Gut microbiota depletion delays somatic peripheral nerve development and impairs neuromuscular junction maturation. Gut Microbes. 16 (1), 2363015(2024).
  28. Ayar, Z., et al. The effect of low-level laser therapy on pathophysiology and locomotor recovery after traumatic spinal cord injuries: a systematic review and meta-analysis. Laser Med Sci. 37 (1), 61-75 (2022).
  29. Ghane, N., Beigi, M. H., Labbaf, S., Nasr-Esfahani, M. H., Kiani, A. Design of hydrogel-based scaffolds for the treatment of spinal cord injuries. J Mater Chem B. 8 (47), 10712-10738 (2020).
  30. Laskin, J. J., Waheed, Z., Thorogood, N. P., Nightingale, T. E., Noonan, V. K. Spinal Cord Stimulation Research in the Restoration of Motor, Sensory, and Autonomic Function for Individuals Living With Spinal Cord Injuries: A Scoping Review. Arch Phys Med Rehabil. 103 (7), 1387-1397 (2022).
  31. Li, G., et al. Epidural Spinal Cord Stimulation Promotes Motor Functional Recovery by Enhancing Oligodendrocyte Survival and Differentiation and by Protecting Myelin after Spinal Cord Injury in Rats. Neurosci Bull. 36 (4), 372-384 (2020).
  32. Csomó, K. B., et al. A Minimally Invasive, Fast Spinal Cord Lateral Hemisection Technique for Modeling Open Spinal Cord Injuries in Rats. J Vis Exp. (181), e63534(2022).
  33. Li, J. J., et al. Animal Models for Treating Spinal Cord Injury Using Biomaterials-Based Tissue Engineering Strategies. Tissue eng part b-re. 28 (1), 79-100 (2022).
  34. Coman, I., Barbin, G., Charles, P., Zalc, B., Lubetzki, C. Axonal signals in central nervous system myelination, demyelination and remyelination. J Neurol Sci. 233 (1-2), 67-71 (2005).
  35. Inouye, H., Kirschner, D. A. Evolution of myelin ultrastructure and the major structural myelin proteins. Brain Res. 1641 (Pt A), 43-63 (2016).
  36. Chen, X., Li, H. Neuronal reprogramming in treating spinal cord injury. Neural Regen Res. 17 (7), 1440-1445 (2022).
  37. Huang, S., et al. Protective Effect of Electroacupuncture on Neural Myelin Sheaths is Mediated via Promotion of Oligodendrocyte Proliferation and Inhibition of Oligodendrocyte Death After Compressed Spinal Cord Injury. Mol Neurobiol. 52 (3), 1870-1881 (2015).
  38. Kang, Z., et al. Electroacupuncture promotes regeneration and repair of myelin sheath of corpus callosum in demyelination mice. Zhen Ci Yan Jiu. 45 (1), 1-7 (2020).
  39. Zhu, K., et al. Electroacupuncture Promotes Remyelination after Cuprizone Treatment by Enhancing Myelin Debris Clearance. Front Neurosci. 10, 613(2017).
  40. Lu, J. Y., et al. Effects of electroacupuncture at different acupoints on the histomorphology of neurogenic bladder and the expression of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels in interstitial cells of Cajal in a rat model of suprasacral spinal cord injury. Ann Palliat Med. 9 (6), 3830-3838 (2020).
  41. Tu, W. Z., et al. The regulatory effect of electro-acupuncture on the expression of NMDA receptors in a SCI rat model. Life Sci. 177, 8-14 (2017).
  42. Ding, Z., et al. Neuregulin-1 converts reactive astrocytes toward oligodendrocyte lineage cells via upregulating the PI3K-AKT-mTOR pathway to repair spinal cord injury. Biomed Pharmacother. 134, 111168(2021).
  43. Kataria, H., et al. Neuregulin-1 promotes remyelination and fosters a pro-regenerative inflammatory response in focal demyelinating lesions of the spinal cord. Glia. 66 (3), 538-561 (2018).
  44. Schmitd, L. B., et al. Deletion of murine Sarm1 results in a microenvironment that delays peripheral nerve regeneration after injury. Sci Transl Med. 17 (819), eadp9155(2025).
  45. Hu, X., et al. Pan-ErbB inhibition impairs cognition via disrupting myelination and aerobic glycolysis in oligodendrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (45), e2405152121(2024).
  46. Størkson, R. V., Kjørsvik, A., Tjølsen, A., Hole, K. Lumbar catheterization of the spinal subarachnoid space in the rat. J Neurosci Methods. 65 (2), 167-172 (1996).
  47. Rahimi-Movaghar, V., Jazayeri, S. B. When do we start Basso, Beattie, and Bresnahan assessment after experimental spinal cord injury. Acta Med Iran. 51 (8), 5183(2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Elektroacupunctuurbehandelingzenutherstelmyelidine basisproteïnefunctie van de achterpotenacupunctuurpuntenexogeen NRG1signaalroute
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.