Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

CLCF1 door inspanning geïnduceerd myokineprotocol voor het onderzoeken van RANKL/OPG-botbeschermingsmechanismen bij postmenopauzale osteoporose

598 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69172

⸱

7 november 2025

 ,  , 
1Department of Trauma Center, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel presenteert een uitgebreid protocol voor het onderzoeken van cardiotrofine-achtige cytokinefactor 1 (CLCF1) als een door inspanning geïnduceerde mediator van botbescherming door middel van RANKL/OPG-asmodulatie bij postmenopauzale osteoporose.

Samenvatting

Recente studies hebben cardiotrofine-achtige cytokinefactor 1 (CLCF1) geïdentificeerd als een door inspanning geïnduceerd "jeugdmolecuul" dat musculoskeletale voordelen bemiddelt, maar afneemt met de leeftijd. Dit protocol beschrijft een systematische aanpak om de regulerende rol van CLCF1 bij inspanningsgemedieerde botbescherming te onderzoeken via overspraakmechanismen tussen immuunsysteem en bot. De methodologie omvat klinische monsteranalyse, moleculaire karakteriseringstechnieken en functionele assays om de invloed van CLCF1 op de receptoractivator van de nucleaire factor-KB-ligand (RANKL)/osteoprotegerine (OPG) signaleringsas op te helderen. Door middel van kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR), western blotting, CRISPR/Cas9-genbewerking en co-cultuursystemen, demonstreert dit protocol de dubbele botbeschermende werking van CLCF1 via STAT1-gemedieerde osteoclastremming en STAT3-gemedieerde osteoblastpromotie. De beschreven methoden maken een uitgebreide beoordeling van CLCF1-expressiepatronen, correlatieanalyses met botmineraaldichtheidsparameters en mechanistische evaluatie van mogelijke inspanningsmimetische behandelingsinterventies mogelijk. In tegenstelling tot traditionele antiresorptieve therapieën die voornamelijk gericht zijn op osteoclasten, kunnen op CLCF1 gebaseerde interventies het unieke voordeel bieden dat ze tegelijkertijd de botvorming bevorderen en tegelijkertijd de resorptie remmen. Dit protocol biedt onderzoekers gestandaardiseerde procedures om door inspanning geïnduceerde cytokine-gemedieerde regulatie van het botmetabolisme te onderzoeken en vergemakkelijkt de ontwikkeling van gerichte therapeutische interventies voor leeftijdsgebonden botaandoeningen.

Inleiding

Postmenopauzale osteoporose (PMOP) is een paradigmatisch voorbeeld van leeftijdsgebonden musculoskeletale achteruitgang waarbij ontregeling van het immuunsysteem pathologisch botverlies versnelt 1,2,3. Hoewel lichaamsbeweging algemeen wordt erkend als de meest effectieve niet-farmacologische interventie om leeftijdsgebonden botachteruitgang te voorkomen, zijn de precieze moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan door inspanning geïnduceerde botbescherming tot voor kort ongrijpbaar gebleven4. Het hedendaagse begrip van botmetabolisme is geëvolueerd buiten de traditionele endocrinologische kaders en omvat complexe osteo-immuuninteracties en door inspanning geïnduceerde myokines die de skelethomeostase regelen5.

De recente identificatie van cardiotrofine-achtige cytokinefactor 1 (CLCF1) als een door inspanning geïnduceerde factor die leeftijdsgebonden musculoskeletale achteruitgang bestrijdt, vertegenwoordigt een paradigmaverschuiving in het begrijpen van bot-spieroverspraak6. Deze baanbrekende ontdekking verklaart de gevestigde botbeschermende effecten van inspanning via een voorheen onbekend moleculair mechanisme, waardoor CLCF1 wordt gepositioneerd als de belangrijkste bemiddelaar van door inspanning geïnduceerd osteoanabolisme7. Transgene muizen met CLCF1 tot overexpressie vertoonden verbeterde botvorming, verbeterde glucosetolerantie en superieure fysieke prestaties in vergelijking met wildtype controles6, wat suggereert dat CLCF1-suppletie mogelijk inspanningsvoordelen zou kunnen nabootsen bij sedentaire of mobiliteitsbeperkte populaties.

Inspanningsmimetische behandeling wordt gedefinieerd als farmacologische interventies die door inspanning geïnduceerde CLCF1-kinetiek repliceren, waardoor therapeutische voordelen worden geboden die vergelijkbaar zijn met fysieke activiteit via moleculaire routes8. Cardiotrofine-achtige cytokine factor 1 (CLCF1), ook wel aangeduid als neurotrofine-1 (NNT-1) of B-cel stimulerende factor-3 (BSF-3), behoort tot de interleukine-6 (IL-6) cytokine-superfamilie en vertoont pleiotrope biologische functies8. Oorspronkelijk gekarakteriseerd vanwege zijn neurotrofe eigenschappen bij de overleving en ontwikkeling van spinale motorneuronen, is de rol van CLCF1 als een door inspanning geïnduceerde myokine naar voren gekomen als een belangrijk onderzoeksgebied. Recente klinische studies hebben CLCF1 gevalideerd als een biomarker voor de gezondheidstoestand van de botten, wat aantoont dat de CLCF1-eiwitspiegels in perifere mononucleaire bloedcellen significant zijn verlaagd bij postmenopauzale vrouwen met osteoporose in vergelijking met gezonde controles9. Deze studies toonden positieve correlaties aan tussen CLCF1-expressie en botmineraaldichtheid op meerdere skeletplaatsen, wat klinische validatie biedt die het translationele potentieel van CLCF1-gerichte therapeutische interventies versterkt.

De cytokinen werken via heteromere receptorcomplexen, waaronder oplosbare ciliaire neurotrofe factorreceptoren (sCNTFR) en cytokinereceptorachtige factor-1 (CRLF-1), om diverse cellulaire reacties te orkestreren10,11. Recente mechanistische studies hebben het dubbele signaleringsparadigma opgehelderd waarbij CLCF1 tegelijkertijd de botresorptie remt en de botvorming bevordert 2,6,7,9. Deze dubbele werking vindt plaats door activering van de differentiële signaaltransducer en activator van transcriptie (STAT) route: STAT1-fosforylering bemiddelt osteoclastonderdrukking door interfereren met de receptoractivator van de nucleaire factor-κB-ligand (RANKL)-geïnduceerde nucleaire factor-κB (NF-κB) signalering, terwijl STAT3-activering in osteoblasten de expressie van botvormingsmarkers bevordert, waaronder alkalische fosfatase en osteocalcine.

Begrijpen hoe acute inspanningsreacties zich vertalen in chronische botaanpassingen blijft van cruciaal belang voor de therapeutische ontwikkeling13. Hoewel acute CLCF1-verhoging na enkele trainingsperiodes mechanistische inzichten biedt, kunnen herhaalde acute reacties gedurende weken tot maanden leiden tot aanhoudende botbeschermende effecten door cumulatieve signalering en cellulaire aanpassingen14.

De grondgedachte voor het onderzoeken van CLCF1 in de osteo-immune pathofysiologie komt voort uit de gevestigde rol ervan bij de regulatie van B-lymfocyten en de erkenning dat B-cellen significante producenten zijn van zowel RANKL als osteoprotegerine (OPG)12,13. De receptoractivator van de nucleaire factor-κB-ligand (RANKL)/osteoprotegerine (OPG)-as dient als het centrale regulerende mechanisme voor osteoclastdifferentiatie en botresorptie14,15. In tegenstelling tot andere IL-6-familieleden die hebben aangetoond dat ze regulerende controle hebben over de homeostase van het skelet door middel van botremodelleringsmodulatie, biedt het unieke dubbele botbeschermingsmechanisme van CLCF1 een superieur therapeutisch potentieel 16,17,18.

De voordelen van dit protocol ten opzichte van bestaande methodologieën zijn onder meer de alomvattende benadering van osteo-immuunonderzoek, waarbij zowel klinische correlatieanalyse als mechanistische cellulaire studies worden opgenomen om translationele inzichten te verschaffen in CLCF1-gemedieerde regulering van het botmetabolisme. De klinische relevantie van dit protocol wordt verder versterkt door opkomend bewijs dat CLCF1-niveaus kunnen worden gemoduleerd door middel van leefstijlinterventies, waardoor het wordt gepositioneerd als een bruikbaar therapeutisch doelwit voor leeftijdsgebonden botaandoeningen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol is goedgekeurd door de institutionele ethische commissie voor onderzoek (Protocol #2024-CHSD-0156) en voldoet aan de principes van de Verklaring van Helsinki. Alle dierprocedures voldeden aan de richtlijnen van de institutionele commissie voor dierenverzorging en -gebruik (Protocol #2024-037). Alle deelnemers gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming.

1. Klinische monsterafname en beoordeling van inspanningsinterventies

  1. Werving van deelnemers en evaluatie van de trainingsgeschiedenis
    1. Rekruteer postmenopauzale vrouwen van 55-75 jaar met een minimale postmenopauzale duur van 1 jaar.
    2. Beoordeel de gedetailleerde trainingsgeschiedenis, inclusief frequentie, intensiteit, type en duur van fysieke activiteit in de afgelopen 6 maanden met behulp van gestandaardiseerde vragenlijsten over fysieke activiteit.
    3. Categoriseer deelnemers in sedentaire (< 150 min/week), matig actieve (150-300 min/week) en zeer actieve (> 300 min/week) groepen op basis van de WHO-trainingsrichtlijnen.
    4. Voer een uitgebreide beoordeling van de medische geschiedenis en lichamelijk onderzoek uit, inclusief medicatiebeoordeling en comorbiditeitsscreening.
    5. Verkrijg dual-energy röntgenabsorptiometrie (DXA)-metingen met behulp van Hologic Discovery A-densitometer met APEX-software v4.5. Voer dagelijkse kalibratie uit met het wervelkolomfantoom. Plaats de patiënt in rugligging met de benen omhoog op een positioneringsblok volgens de richtlijnen van de International Society for Clinical Densitometry (ISCD).
    6. Classificeer deelnemers volgens de osteoporosecriteria van de Wereldgezondheidsorganisatie (T-score ≤ -2,5 SD).
    7. Uitsluitingscriteria toepassen: Voorafgaande anti-osteoporotische therapie binnen 12 maanden, immunosuppressieve behandelingen, metabole botziekten, secundaire osteoporose of contra-indicaties voor inspanningstesten.
  2. Door inspanning geïnduceerde CLCF1-responsbeoordeling
    1. Verzamel baseline bloedmonsters tussen 8:00-10:00 uur na 12 uur 's nachts vasten in EDTA-buisjes.
    2. Implementeer een gestandaardiseerd protocol voor acute inspanning: 45 minuten wandelen met matige intensiteit met een maximale hartslag van 65-70%. Bereken de maximale hartslag met behulp van de Karvonen-formule (220 jaar)19. Voer oefeningen uit op een gemotoriseerde loopband met continue hartslagmeting via een borstbandmonitor. Houd de loopsnelheid aan op 3,5-4,5 km/u met hellingsaanpassing om de doelhartslag te bereiken.
    3. Verzamel bloedmonsters na het sporten op tijdstippen van 1 uur, 4 uur en 24 uur om de CLCF1-kinetiek te beoordelen, met behoud van consistente verzamelomstandigheden.
    4. Bewaar serumaliquots bij -80 °C voor latere CLCF1-kwantificering. Gebruik Human CLCF1 ELISA Kit met een detectiebereik van 31,2-2000 pg/ml. Verdun de monsters 1:2 in analyseverdunningsmiddel. Bereid een 7-punts standaardcurve voor met behulp van 2-voudige seriële verdunningen. Voer voorbeelden in tweevoud uit. Lees platen af bij 450 nm met 540 nm golflengtecorrectie. Aanvaard de variatiecoëfficiënt (CV) < 20 % tussen duplicaten.
  3. Interventieprotocol voor longitudinale inspanning
    1. Ontwerp een progressief oefenprogramma van 12 weken met drie sessies per week.
    2. Verzamel bloedmonsters bij baseline, 4, 8 en 12 weken voor CLCF1-trajectanalyse.
    3. Beoordeel conditieverbeteringen met behulp van VO2 max-testen bij baseline en eindpunt.
    4. Correleer CLCF1-veranderingen met BMD-verbeteringen gemeten door DXA na 12 weken.
    5. Documenteer trainingsaanpassingen, waaronder inspanningstolerantie en herstelpatronen.

2. Verbeterde isolatie en verwerking van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC)

  1. Geoptimaliseerde PBMC-isolatie voor CLCF1-analyse
    1. Verzamel 20 ml veneuze bloedmonsters in EDTA-bevattende buisjes (5 ml EDTA per buisje) onder steriele omstandigheden.
    2. Verwerk monsters binnen 2 uur na afname voor optimale levensvatbaarheid van de cellen en behoud van CLCF1-expressie.
      1. Verdun bloedmonsters 1:1 met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij kamertemperatuur. Meng 20 ml bloed met 20 ml PBS.
      2. Breng verdund bloed aan op een dichtheidsgradiëntmedium in conische buisjes van 50 ml. Gebruik 15 ml dichtheidsgradiëntmedium per 20 ml verdund bloed (verhouding 1:1,33).
    3. Centrifugeer bij 400 × g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur zonder rem.
    4. Zuig de PBMC-laag op het grensvlak tussen plasma en Ficoll voorzichtig op met behulp van een steriele pasteurpipet.
    5. Was de cellen twee keer met PBS met 2% foetaal runderserum (FBS) door centrifugatie bij 300 × g gedurende 10 minuten.
  2. Beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen en CLCF1-nulmeting
    1. Bepaal de levensvatbaarheid van cellen met behulp van de trypanblauw-uitsluitingsmethode (streefdoel > 95% levensvatbaarheid)20.
    2. Beoordeel de baseline intracellulaire CLCF1-expressie onmiddellijk na isolatie.
    3. Stel de celconcentratie in op 1 × 106 cellen/ml in het juiste medium.
    4. Wijs cellen toe voor downstreamtoepassingen of sla ze op in vloeibare stikstof. Vries PBMC's in een vriesmedium in met 90% FBS + 10% DMSO. Gebruik een vriescontainer met gecontroleerde snelheid bij -1 °C/min tot -80 °C. Bewaar 1 ml aliquots (5 × 106 cellen/injectieflacon) in cryovials.

3. Uitgebreide kwantitatieve analyse van genexpressie

  1. RNA-extractie en -zuivering met CLCF1-specifieke overwegingen
    1. Lyse 1 × 106 PBMC's in 1 ml RNA-lysisreagens binnen 1 uur isolatie.
    2. Voeg 200 μL chloroform toe, draai krachtig en incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Centrifugeer bij 12.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C om fasescheiding te bereiken.
    4. Breng de waterige fase over naar een verse buis, voeg een gelijk volume isopropanol toe.
    5. Neerslaan RNA door centrifugeren bij 12.000 g × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    6. Was de RNA-pellet met 75% ethanol, laat aan de lucht drogen en los op in nucleasevrij water.
    7. Beoordeel de RNA-integriteit met behulp van agarosegelelektroforese of bioanalyzer (doel-RIN >7.0).
  2. Reverse transcriptie en kwantitatieve PCR met bijgewerkte primersets
    1. Kwantificeer de RNA-concentratie met behulp van spectrofotometrische analyse (doel A260/A280-verhouding 1,8-2,2).
    2. Voer omgekeerde transcriptie uit met behulp van 1 μg totaal RNA met de reverse transcriptiereagenskit.
    3. Bereid qPCR-reacties voor: Bereid 20 μL-reacties met 10 μL Master Mix, 0,8 μL van elke primer (10 μM voorraad, laatste 400 nM), 2 μL cDNA-sjabloon (50 ng), 6,4 μL nucleasevrij water. Ren drievouden. Gebruik een real-time PCR-systeem.
    4. Gebruik gevalideerde primersequenties:
      1. CLCF1 vooruit: 5'-CCTCCTGCTTCTTGCCTACC-3',
        achteruit: 5'-TGCCACCATGTTTGTTTCCT-3'
      2. CRLF1 vooruit: 5'-TGAAGCTCATCCTGCAGTTC-3',
        keerzijde: 5'-CAGCATCTCCTCCTTGATGC-3'
      3. STAT1 vooruit: 5'-CAGCTTCAGCAGCTTGACTC-3',
        keerzijde: 5'-AAGGTCAGCGATGTCTTCAG-3'
      4. STAT3 vooruit: 5'-CAGCAGCTTGACACACGGTA-3',
        achteruit: 5'-AAACACCAAAGTGGCATGTGA-3'
    5. Voer het qPCR-protocol uit: 95 °C gedurende 10 min, gevolgd door 40 cycli van 95 °C gedurende 15 s en 60 °C gedurende 1 min.
    6. Analyseer de resultaten met behulp van de 2(-ΔΔCt) -methode met normalisatie van β-actine21.
  3. Analyse van genenpanels met inspanningsrespons
    1. Inclusief inspanningsresponsieve genen: IL-6, TNF-α, IL-1β, BDNF, IGF-1 en myostatine.
    2. Gebruik gevalideerde primersequenties:
      1. IL-6 vooruit: 5'-AGCCACTCACCTCTTCAGAAC-3',
        keerzijde: 5'-GCCTCTTTGCTGCTTTCACAC-3';
      2. TNF-α vooruit: 5'-CCCAGGGACCTCTCTCTCTCTC-3',
        achterkant: 5'-ATGGGCTACAGGCTTGTCACT-3';
      3. IL-1β vooruit: 5'-ACAGATGAAGTGCTCCTTCCA-3',
        achterkant: 5'-GTCGGAGATTCGTAGCTGGAT-3';
      4. BDNF vooruit: 5'-TAACATGGCTGCGCGTGTGTGT-3',
        keerzijde: 5'-CGAGTGGGTCACAGCGGCAG-3';
      5. IGF-1 vooruit: 5'-GCTCTTCAGTTCGTGTGTGGA-3',
        achterkant: 5'-GCCTCCTTAGATCACAGCTCC-3';
      6. Myostatine vooruit: 5'-AGTGACGGGCTCTTTGGAAGA-3',
        keerzijde: 5'-GTTTCAGAGGCCGGTCAAGT-3'.
    3. Correleer door inspanning geïnduceerde veranderingen in CLCF1 met andere myokine-expressiepatronen.
    4. Beoordeel CLCF1/CRLF1 co-expressieratio's als indicatoren van functionele cytokinecomplexvorming.

4. Verbeterde eiwitexpressieanalyse met focus op de STAT-route

  1. Eiwitextractie en kwantificering voor STAT-analyse
    1. Lyse PBMC's in lysisbuffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholaat, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8,0) aangevuld met protease- en fosfataseremmercocktails.
    2. Voeg vlak voor gebruik enkele specifieke fosfataseremmers toe: natriumorthovanadaat (1 mM) en natriumfluoride (50 mM).
    3. Incubeer lysaten op ijs gedurende 30 minuten met periodieke vortex op gemiddelde snelheid om de 10 minuten.
    4. Centrifugeer bij 12.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C om celresten te verwijderen.
    5. Kwantificeer de eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-test of BCA-methode22.
    6. Pas de eiwitconcentratie aan tot 2 μg/μL in een monsterbuffer en bewaar bij -80 °C tot verdere analyse voor western blotting-toepassingen.
  2. Uitgebreide western blot-analyse met focus op STAT-signalering
    1. Bereid 10 ml 10% SDS-PAGE-gels met standaard acrylamide/bisacrylamide-oplossingen.
    2. Laad 20 μg eiwit per baan naast voorgekleurde molecuulgewichtmarkers en los op bij 120 V gedurende 90 min.
    3. Breng eiwitten over naar PVDF-membranen bij 100 V gedurende 2 uur bij 4 °C met behulp van transferbuffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% methanol).
    4. Blokkeer membranen met 50 ml 5% magere droge melk in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween-20 (TBST).
    5. Incubeer met primaire antilichamen 's nachts bij 4 °C: Anti-CLCF1 (1:1.000); Anti-CRLF1 (1:1.000); Anti-OPG (1:1.000); Anti-RANKL (1:1.000); Anti-JAK2 (1:1.000); Anti-fosfo-JAK2 (Tyr1007/1008, 1:1.000); Anti-STAT1 (1:1.000); Anti-fosfo-STAT1 (Tyr701, 1:1.000); Anti-STAT3 (1:1.000); Anti-fosfo-STAT3 (Tyr705, 1:1.000); Anti-β-actine (1:1.000)
    6. Was de membranen 3 keer gedurende 10 minuten elk met 15 ml TBST. Incubeer met geschikte secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    7. Detecteer eiwitbanden met behulp van verbeterd chemiluminescentiesubstraat. Beeld met behulp van een chemiluminescentiebeeldvormingssysteem met automatische belichtingsoptimalisatie. Kwantificeer met behulp van densitometrische analyse met de ImageJ v1.53 gelanalysetool.
  3. STAT1/STAT3 analyse van dubbele routes
    1. Bereken de fosfo-STAT1/totaal STAT1- en fosfo-STAT3/totaal STAT3-verhoudingen met behulp van ImageJ/Fiji-softwareversie 1.54f.
    2. Beoordeel de activeringsbalans van STAT1/STAT3 als indicator van functionele activiteit van CLCF1.
    3. Correleer STAT-activeringspatronen met RANKL/OPG-expressieverhoudingen.
    4. Beoordeel STAT1/STAT3-fosforylering via Western blot 0, 15, 30, 60, 120 en 240 minuten na CLCF1-behandeling. Normaliseer fosfo-eiwit naar totale eiwitniveaus met behulp van densitometrie.

5. Geavanceerde CRISPR/Cas9-gemedieerde genknock-out met validatie

  1. Verbeterde lentivirale vectorconstructie
    1. Ontwerp single-guide RNA (sgRNA) gericht op CLCF1-gensequentie:
      TTGAAGTCTGGCTCGTTGAA-3'.
    2. Voeg extra sgRNA-sequenties toe voor een betere knock-outefficiëntie:
      GCTTGAACGAGCCAGACTTC-3".
    3. Kloon sgRNA's in lentivirale vector met behulp van standaard moleculaire kloontechnieken.
    4. Controleer de integriteit van het construct door middel van DNA-sequencing-analyse.
    5. Beoordeel de efficiëntie van sgRNA-snijden met behulp van de T7 endonuclease I-test23.
    6. Voeg validatie van de specificiteit van de route toe met behulp van remmers: AG490 (JAK2, 50 μM), fludarabine (STAT1, 10 μM) en stattic (STAT3, 5 μM).
    7. Voer reddingsexperimenten uit met behulp van constitutief actieve STAT-constructies om de noodzaak van het pad te valideren.
  2. Geoptimaliseerd lentiviraal transductieprotocol
    1. Kweek Raji cellen in RPMI-1640 medium (500 ml) aangevuld met 10% FBS. Houd alle celculturen in een bevochtigde broedstoof op 37 °C met 5% CO2 . Breng de kweekmedia ten minste 30 minuten voor gebruik in evenwicht.
    2. Behandel de cellen voor met polybreen (8 μg/ml) om de transductie-efficiëntie te verbeteren.
    3. Produceer lentivirus met behulp van HEK293T cellen met verpakking en envelopplasmiden via calciumfosfaattransfectie. Bepaal de titer met p24 ELISA (> 108 TU/ml vereist). Volg BSL-2 inperkingsprocedures23.
    4. Transduceer cellen met lentivirus met een multipliciteit van infectie (MOI) van 100. Verander de media 24 uur na de transductie. Selecteer getransduceerde cellen met behulp van puromycine (4 μg/ml) gedurende 7 dagen en amplificeer vervolgens een gebied van 500 bp dat de doellocatie overspant met behulp van de volgende PCR-omstandigheden: eerste denaturatie bij 95 °C gedurende 3 minuten, gevolgd door 35 cycli van denaturatie bij 95 °C gedurende 30 s, gloeien bij 60 °C gedurende 30 s en verlenging bij 72 °C gedurende 30 s, met een laatste verlenging bij 72 °C gedurende 5 min. Voor de T7-endonuclelease-test, denatureer en hergloei de PCR-producten met T7E1-endonuclease gedurende 30 minuten bij 37 °C en analyseer de producten vervolgens op een agarosegel met 2%.
    5. Valideer de efficiëntie van het gen knock-out door middel van western blotting en Sanger-sequencing24,25.
    6. Voer een off-target analyse uit met behulp van GUIDE-seq of een vergelijkbare methodologie26.
      OPMERKING: Recent bewijs toont aan dat de secretie-efficiëntie van CLCF1 co-expressie met CRLF1-chaperonne-eiwit vereist. Overweeg dubbele knock-outbenaderingen voor volledige functionele ablatie27.

6. Uitgebreid co-cultuursysteem met bewegingsmimetica

OPMERKING: Voor translationele validatie aanpassen aan ovariëctomische muismodellen door rhCLCF1 dagelijks gedurende 4 weken toe te dienen met 10 μg/kg i.p., waarbij de BMD wordt beoordeeld via micro-CT.

  1. Geavanceerde Raji-MG-63 co-cultuur opstelling
    1. Zaad MG-63 osteoblastachtige cellen in onderste kamers met 24 putjes in een dichtheid van 2 × 104 cellen/putje in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2 en 95% vochtigheid. Breng de media 30 minuten voor gebruik in de broedmachine. Voor verbeterde translatie, vervangen door primaire humane osteoblasten (dichtheid 1 × 104/put) uit commerciële bronnen.
    2. Plaats membraaninzetstukken met een poriegrootte van 0,4 μm in putjes die MG-63-cellen bevatten.
    3. Zaad Raji-cellen (wildtype, CLCF1-knockout of CLCF1-overexpressie) in de bovenste kamers met een dichtheid van 1 × 105 cellen/putje.
    4. Behoud co-culturen in volledig RPMI-1640-medium (2 ml in de onderste kamer, 1,5 ml in de bovenste kamer) gedurende gespecificeerde experimentele perioden (7, 14, 21 dagen) bij 37 °C met 5% CO2.
    5. Neem recombinante CLCF1 (5-10 ng/ml) behandelingsgroepen op om dosis-responsrelaties te beoordelen.
  2. Inspannings-mimetisch CLCF1 behandelprotocol
    1. Behandel co-cultuursystemen met fysiologische concentraties van recombinant CLCF1 (5-10 ng/ml) op basis van door inspanning geïnduceerde niveaus.
    2. Breng pulserend CLCF1-behandelingsregime toe: Breng CLCF1 aan gedurende 2 uur pulsen om 0, 8 en 16 uur op dag 1, gevolgd door continue blootstelling gedurende 24 uur en herhaal vervolgens de cyclus. Totale behandelingsduur: 7 dagen met in totaal 9 pulsen.
    3. Beoordeel tijdsafhankelijke effecten 1 uur, 4 uur, 24 uur en 7 dagen na de behandeling.
    4. Monitor de STAT1/STAT3-fosforyleringskinetiek in beide celpopulaties via Western blot op 0, 15, 30, 60 min. Lyseer cellen in buffer (500 μL) met remmers, normaliseren naar totaal STAT1/3 en β-actine.
  3. Verbeterde osteogene differentiatiebeoordeling
    1. Induceer osteogene differentiatie met behulp van standaard osteogeen medium dat ascorbinezuur (50 μg/ml), β-glycerofosfaat (10 mM) en dexamethason (10 nM) bevat. Vervang het osteogene medium elke 3 dagen (2 ml onderste kamer, 1,5 ml bovenste kamer). Bereid voor elke verandering een verse ascorbinezuuroplossing; β-glycerofosfaat en dexamethason blijven stabiel.
    2. Beoordeel de activiteit van alkalische fosfatase (ALP) met behulp van een colorimetrische enzymtest op dag 7, 14 en21 28. Gebruik 500 μL extractievolume. Afgelezen bij 405 nm. Normaliseren naar totaal eiwitgehalte. Verwacht kleurenbereik: lichtgeel (laag) tot donkergeel (hoog).
    3. Evalueer de calciumafzetting door middel van Alizarin Red S-kleuring en kwantificering op dag 21. Extract met 500 μL cetylpyridiniumchloride, afgelezen bij 540 nm, verwacht kleurbereik: lichtroze (lage mineralisatie) tot donkerrood (hoge mineralisatie).
    4. Kwantificeer de mineralisatie door de extinctie te meten bij 540 nm na extractie van cetylpyridiniumchloride.
    5. Analyseer osteogene genexpressie: RUNX2, ALP, COL1A1, OCN en OPG met behulp van qPCR-protocollen beschreven in stap 3.2.
    6. Beoordeel osteoclast-gerelateerde markers: TRAP, cathepsine K en RANKL in MG-63-cellen.

7. Geavanceerde statistische analyse en gegevensinterpretatie

  1. Uitgebreide statistische methodologie
    1. Voer normaliteitstests uit met behulp van de Shapiro-Wilk-test voor alle continue variabelen29. Gebruik niet-parametrische tests wanneer normaliteitsaannames worden geschonden (p < 0,05).
    2. Pas de Mann-Whitney U-test toe voor niet-parametrische vergelijkingen tussen groepen30.
    3. Voer Spearman-correlatieanalyse uit voor associatiestudies tussen CLCF1-niveaus en klinische parameters31.
    4. Voer meervoudige regressieanalyse uit om onafhankelijke voorspellers van BMD te beoordelen.
    5. Gebruik herhaalde maatregelen ANOVA voor oefeninterventie tijd-verloop analyse32.
    6. Pas Bonferroni-correctie toe voor meerdere vergelijkingen33.
    7. Stel de statistische significantiedrempel in op p < 0,05 voor alle analyses.
  2. Verbeterde presentatie en analyse van gegevens
    1. Presenteer continue gegevens als gemiddelde ± standaarddeviatie of mediaan met interkwartielbereik.
    2. Maak correlatiegrafieken voor CLCF1-expressie versus BMD, aantal lymfocyten en trainingsparameters met behulp van GraphPad Prism v9 voor statistieken, ImageJ v1.53 voor densitometrie. Er zijn geen aangepaste scripts nodig. Genereer ROC via de ingebouwde tool van Prism; correlaties via Spearman in Prism.
    3. Genereer tijdverloopgrafieken voor door inspanning geïnduceerde CLCF1-responskinetiek.
    4. Ontwikkel operationele karakteristieken (ROC) voor CLCF1 als een biomarker voor osteoporose.
      OPMERKING: Representatieve western blot-beelden zijn gemaakt met behulp van kwantitatieve densitometrische analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Implementatie van dit protocol toont met succes de regulerende rol van CLCF1 in het immuungemedieerde botmetabolisme aan met behulp van meerdere experimentele benaderingen. De klinische validatiestudies tonen een significante neerwaartse regulatie van CLCF1-expressie bij PPOP-patiënten in vergelijking met gezonde controles, zoals aangetoond in figuur 1A, kwantitatieve PCR-analyse van perifere mononucleaire bloedcellen toonde ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het hierin beschreven protocol biedt een uitgebreid methodologisch kader voor het onderzoeken van de rol van CLCF1 als door inspanning geïnduceerde bemiddelaar van botbescherming door middel van een systematische analyse van de RANKL/OPG-as. Recent baanbrekend onderzoek heeft CLCF1 geïdentificeerd als een door inspanning geïnduceerde factor die leeftijdsgebonden musculoskeletale achteruitgang bestrijdt, waardoor het wordt gepositioneerd als een centrale bemiddelaar van door inspanning ge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

De auteurs erkennen de deelnemers die zich vrijwillig hebben aangemeld voor deze studie en de klinische staf van het Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University voor hun hulp bij het werven van patiënten en het verzamelen van monsters. We danken de laboranten voor hun ondersteuning bij celkweek- en moleculair-biologische experimenten. H.Z. bedacht en ontwierp het onderzoek, voerde de experimenten uit, analyseerde de gegevens en schreef het manuscript. H.L. droeg bij aan experimenteel ontwerp, gegevensverzameling en revisie van manuscripten. Y.S. begeleidde het project, gaf kritische feedback en redigeerde het manuscript. Alle auteurs hebben het definitieve manuscript beoordeeld en goedgekeurd voor inzending.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Celcultuurmedia & Reagentia
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650Purpose_Application:  Component van cryoconserveringsmedium
Specificaties_Opmerkingen: Moleculaire biologie kwaliteit, sterieel gefilterd
DMEM-mediumThermo Fisher Scientific11965092Purpose_Application:  MG-63 osteoblasten kweekmedium
Specificaties_Opmerkingen: Hoge glucose formulering met L-glutamine
Fetaal bovien serum (FBS)Thermo Fisher Scientific16000044Purpose_Application:  Celcultuursupplement (hitte-geïnactiveerd)
Specificaties_Opmerkingen: Geïnactiveerd door hitte bij 56°C gedurende 30 min
Penicilline-streptomycineThermo Fisher Scientific15140122Purpose_Application:  Antibiotisch supplement voor steriele kweek
Specificaties_Opmerkingen: 100X stock, uiteindelijke concentratie 1%
Polybren (Hexadimethrine broomide)Santa Cruz Biotechnologysc-134220Purpose_Application:  Lentivirale transductie-versterker
Specificaties_Opmerkingen: 8 μg/mL werkconcentratie
Puromycine dihydrochlorideInvivoGenant-pr-1Purpose_Application:  Selectie-antibioticum voor getransduceerde cellen
Specificaties_Opmerkingen: 4 μg/mL selectieconcentratie gedurende 7 dagen
RPMI-1640 mediumThermo Fisher Scientific11875093Purpose_Application:  Raji B-lymfocyt kweekmedium
Specificaties_Opmerkingen: Met L-glutamine, zonder fenolrood bij voorkeur
Trypaanblauw oplossingThermo Fisher Scientific15250061Purpose_Application:  Celviabiliteitsbeoordeling
Specificaties_Opmerkingen: 0,4% oplossing voor exclusietest
Gecontroleerd koelcontainerThermo Fisher Scientific5100-0001Purpose_Application:  Gecontroleerde celbevriezing (-1°C/min)
Specificaties_Opmerkingen: Mr. Frosty of equivalent voor -1°C/min koeling
EDTA BloedopvangbuisjesBD Biosciences366643Purpose_Application:  Veneuze bloedafname met anticoagulant
Specificaties_Opmerkingen: 10-20 mL capaciteit, paarse doppen
Ficoll-Paque PLUS DichtheidsgradiëntCytiva (GE Healthcare)17144003Purpose_Application:  PBMC isolatie via dichtheidscentrifugering
Specificaties_Opmerkingen: Sterieel, endotoxine getest voor celscheiding
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)Thermo Fisher Scientific14190144Purpose_Application:  Celwassing en verdunningsbuffer
Specificaties_Opmerkingen: Sterieel, celcultuurkwaliteit
RNA-extractie & qPCR
Chloroform (ACS-kwaliteit)Sigma-AldrichC2432Purpose_Application:  Fasescheiding bij RNA-extractie
Specificaties_Opmerkingen: ACS reagentenkwaliteit, ≥99% zuiverheid
Ethanol (75%, moleculaire kwaliteit)Sigma-AldrichE7023Purpose_Application:  RNA pellet wassing
Specificaties_Opmerkingen: Moleculaire biologie kwaliteit, vers bereiden
Isopropanol (moleculaire kwaliteit)Sigma-AldrichI9516Purpose_Application:  RNA precipitatie
Specificaties_Opmerkingen: Moleculaire biologie kwaliteit, ≥99,5% zuiverheid
Nuclease-vrij waterThermo Fisher ScientificAM9930Purpose_Application:  PCR reactievoorbereiding
Specificaties_Opmerkingen: DNase/RNase-vrij, getest voor PCR toepassingen
Optische kleeffolieThermo Fisher Scientific4311971Purpose_Application:  Optische verzegeling voor qPCR platen
Specificaties_Opmerkingen: Optische kwaliteit voor qPCR toepassingen
PCR platen (96-well)Thermo Fisher ScientificN8010560Purpose_Application:  96-well formaat voor hoogdoorvoer qPCR
Specificaties_Opmerkingen: Wit, doorzichtige bodem voor optische detectie
PCR buisjesstripsThermo Fisher ScientificAB0451Purpose_Application:  Kleine volume PCR reacties
Specificaties_Opmerkingen: Strips met 8 buisjes met individuele doppen
PrimeScript RT Reagens KitTakara BioRR037APurpose_Application:  Omgekeerde transcriptie van RNA naar cDNA
Specificaties_Opmerkingen: Met gDNA Eraser voor verwijdering van genomisch DNA
SYBR Green Master MixApplied Biosystems4309155Purpose_Application:  Real-time PCR versterking en detectie
Specificaties_Opmerkingen: Met ROX referentiekleurstof voor normalisatie
TRIzol Reagens (RNA Lysis)Thermo Fisher Scientific15596026Purpose_Application:  Cellysis en RNA-extractie
Specificaties_Opmerkingen: Bewaren bij 4°C, gebruik binnen 6 maanden
Eiwitanalyse - Western Blot
Acrylamid/Bis-acrylamide (29:1)Bio-Rad1610146Purpose_Application:  SDS-PAGE gel polymerisatie
Specificaties_Opmerkingen: 30% acrylamide stockoplossing
BCA Eiwit Assay KitThermo Fisher Scientific23225Purpose_Application:  Eiwitconcentratie kwantificering
Specificaties_Opmerkingen: Reduce-compatibel voor nauwkeurige kwantificering
Enhanced Chemiluminescence (ECL) SubstraatThermo Fisher Scientific32106Purpose_Application:  Chemiluminescente eiwitdetectie
Specificaties_Opmerkingen: Femtogramgevoelige detectie
Vetvrije Droge MelkLab Scientific170-6404Purpose_Application:  Western blot blokkeermiddel
Specificaties_Opmerkingen: Blokkerende kwaliteit, lage achtergrond
Fos

Referenties

  1. Rachner, T. D., Khosla, S., Hofbauer, L. C. Osteoporosis: now and the future. Lancet. 377 (9773), 1276-1287 (2011).
  2. Chen, X., et al. Association of cardiotrophin-like cytokine factor 1 levels in peripheral blood mononuclear cells with bone mineral density and osteoporosis in postmenopausal women. BMC Musculoskelet Disord. 22 (1), 62(2021).
  3. Ilesanmi-Oyelere, B. L., et al. Inflammatory markers and bone health in postmenopausal women: a cross-sectional overview. Immun Ageing. 16, 15(2019).
  4. Ahn, N., Kim, K. Effects of 12-week exercise training on osteocalcin, high-sensitivity C-reactive protein concentrations, and insulin resistance in elderly females with osteoporosis. J Phys Ther Sci. 28 (8), 2227-2231 (2016).
  5. Graves, D. T., Li, J., Cochran, D. L. Inflammation and uncoupling as mechanisms of periodontal bone loss. J Dent Res. 90 (2), 143-153 (2011).
  6. Kang, J. S., et al. Exercise-induced CLCF1 attenuates age-related muscle and bone decline in mice. Nat Commun. 16 (1), 4743(2025).
  7. Sims, N. A. Cardiotrophin-like cytokine factor 1 (CLCF1) and neuropoietin (NP) signalling and their roles in development, adulthood, cancer and degenerative disorders. Cytokine Growth Factor Rev. 26 (5), 517-522 (2015).
  8. Oliveira, M. C., Vullings, J., van de Loo, F. A. J. Osteoporosis and osteoarthritis are two sides of the same coin paid for obesity. Nutrition. 70, 110486(2020).
  9. Yokota, S., et al. Cardiotrophin-like cytokine factor 1 alleviates bone loss in osteoporosis mouse models by suppressing osteoclast differentiation through activating interferon signaling and repressing the nuclear factor-κB signaling pathway. Bone. 153, 116140(2021).
  10. Ponzetti, M., Rucci, N. Updates on osteoimmunology: what's new on the cross-talk between bone and immune system. Front Endocrinol (Lausanne). 10, 236(2019).
  11. Larsen, J. V., et al. Cytokine-like factor 1, an essential facilitator of cardiotrophin-like cytokine:ciliary neurotrophic factor receptor α signaling and sorLA-mediated turnover. Mol Cell Biol. 36 (8), 1272-1286 (2016).
  12. de Vries, T. J., et al. What are the peripheral blood determinants for increased osteoclast formation in the various inflammatory diseases associated with bone loss. Front Immunol. 10, 505(2019).
  13. Weitzmann, M. N. The role of inflammatory cytokines, the RANKL/OPG axis, and the immunoskeletal interface in physiological bone turnover and osteoporosis. Scientifica (Cairo). 2013, 125705(2013).
  14. Srivastava, R. K., Dar, H. Y., Mishra, P. K. Immunoporosis: immunology of osteoporosis-role of T cells. Front Immunol. 9, 657(2018).
  15. Ming, J., Cronin, S. J. F., Penninger, J. M. Targeting the RANKL/RANK/OPG axis for cancer therapy. Front Oncol. 10, 1283(2020).
  16. Sobacchi, C., Menale, C., Villa, A. The RANKL-RANK axis: a bone to thymus round trip. Front Immunol. 10, 629(2019).
  17. Wang, T., He, C. TNF-α and IL-6: the link between immune and bone system. Curr Drug Targets. 21 (3), 213-227 (2020).
  18. Jones, S. A., Jenkins, B. J. Recent insights into targeting the IL-6 cytokine family in inflammatory diseases and cancer. Nat Rev Immunol. 18 (12), 773-789 (2018).
  19. Villafaina, S., Biehl-Printes, C., Parraca, J. A., de Oliveira Brauner, F., Tomas-Carus, P. What mathematical models are accurate for prescribing aerobic exercise in women with fibromyalgia. Biology (Basel). 11 (5), 704(2022).
  20. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  21. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(−ΔΔC(T)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  22. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Bradford assay for determining protein concentration. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (4), 102269(2020).
  23. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing. Sci Rep. 8 (1), 888(2018).
  24. Mousavi Kahaki, S. A., Ebrahimzadeh, N., Fahimi, H., Moshiri, A. Development of an optimized protocol for generating knockout cancer cell lines using the CRISPR/Cas9 system, with emphasis on transient transfection. PLoS One. 19 (11), e0310368(2024).
  25. Eren, K., Taktakoğlu, N., Pirim, I. DNA sequencing methods: from past to present. Eurasian J Med. 54 (Suppl1), 47-56 (2022).
  26. Wienert, B., Wyman, S. K., Yeh, C. D., Conklin, B. R., Corn, J. E. CRISPR off-target detection with DISCOVER-seq. Nat Protoc. 15 (5), 1775-1799 (2020).
  27. Crisponi, L., Buers, I., Rutsch, F. CRLF1 and CLCF1 in development, health and disease. Int J Mol Sci. 23 (2), 992(2022).
  28. Ansari, S., Ito, K., Hofmann, S. Alkaline phosphatase activity of serum affects osteogenic differentiation cultures. ACS Omega. 7 (15), 12724-12733 (2022).
  29. Ghasemi, A., Zahediasl, S. Normality tests for statistical analysis: a guide for non-statisticians. Int J Endocrinol Metab. 10 (2), 486-489 (2012).
  30. Rousseaux, C. G., Gad, S. C. Haschek and Rousseaux's handbook of toxicologic pathology. , 3rd ed, Academic Press. (2013).
  31. Spiegelman, D. Commentary: some remarks on the seminal 1904 paper of Charles Spearman: the proof and measurement of association between two things. Int J Epidemiol. 39 (5), 1156-1159 (2010).
  32. Cleophas, T. J., Zwinderman, A. H., van Ouwerkerk, B. M. Methods for analyzing cardiovascular studies with repeated measures. Neth Heart J. 17 (11), 429-433 (2009).
  33. Haynes, W. Encyclopedia of systems biology. , Springer. New York. (2013).
  34. Kang, J. S., et al. Exercise-induced CLCF1 attenuates age-related muscle and bone decline in mice. Nat Commun. 16 (1), 4743(2025).
  35. Zhao, C., Gong, Y., Zheng, L., Zhao, M. Untargeted metabolomic reveals changes in muscle metabolites of mice during exercise recovery and mechanisms of whey protein and whey protein hydrolysate in promoting muscle repair. Food Res Int. 184, 114261(2024).
  36. Koltun, K. J., et al. Effect of acute resistance exercise on bone turnover in young adults before and after concurrent resistance and interval training. Physiol Rep. 12 (3), e15906(2024).
  37. Li, J. JAK-STAT and bone metabolism. JAK-STAT. 2 (3), e23930(2013).
  38. Sims, N. A. The JAK1/STAT3/SOCS3 axis in bone development, physiology, and pathology. Exp Mol Med. 52 (8), 1185-1197 (2020).
  39. Zhao, X., et al. Puerarin alleviates osteoporosis in rats by targeting the JAK2/STAT3 signaling pathway. Biomol Biomed. 24 (6), 1651-1661 (2024).
  40. Terpos, E., Ntanasis-Stathopoulos, I., Gavriatopoulou, M., Dimopoulos, M. A. Pathogenesis of bone disease in multiple myeloma: from bench to bedside. Blood Cancer J. 8 (1), (2018).
  41. Okamoto, K., et al. Osteoimmunology: the conceptual framework unifying the immune and skeletal systems. Physiol Rev. 97 (4), 1295-1349 (2017).
  42. Sims, N. A. Influences of the IL-6 cytokine family on bone structure and function. Cytokine. 146, 155655(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

CLCF1 myokinedoor inspanning ge nduceerd cytokineRANKL OPG signaleringimmuun bot interactieqPCR analyseWestern blottingCRISPR genbewerkingosteoclastremming
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.