Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Remming van osteoclastogenese door LY90009 door middel van Notch-signaleringsmodulatie in osteolytische ziektemodellen

502 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69178

⸱

7 oktober 2025

 ,  , 
1Department of Rheumatology, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University, 2Department of Geriatrics, Feicheng People's Hospital, 3Department of Trauma Center, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om de remmende effecten van de γ-secretaseremmer LY900009 op RANKL-geïnduceerde osteoclastogenese in beenmerg-afgeleide macrofagen te evalueren. Het protocol omvat cytotoxiciteitsbeoordeling, functionele testen, moleculaire analyses en in vivo validatie in een osteolytisch model van muizen, met toepassingen in de therapeutische ontwikkeling van osteolytische aandoeningen.

Samenvatting

Ontregelde osteoclastactiviteit draagt in hoge mate bij tot de progressie van osteolytische aandoeningen, maar de omvang van therapeutische interventiemodaliteiten wordt beperkt door nadelige effecten. Deze studie onderzocht LY900009, een γ-secretaseremmer, en het vermogen om RANKL-geïnduceerde osteoclastogenese te onderdrukken door modulatie van Notch-signalering. Met behulp van beenmerg-afgeleide macrofagen hebben we uitgebreide in vitro evaluaties uitgevoerd van cytotoxiciteit, differentiatie en functionele assays. Gen- en eiwitexpressieanalyses met behulp van qPCR en western blotting werden gebruikt om de onderliggende moleculaire mechanismen op te helderen. De in vivo werkzaamheid werd bevestigd met behulp van een muizen lipopolysaccharide-geïnduceerd botresorptiemodel. LY900009 remde de door RANKL geïnduceerde osteoclastvorming en resorptieve functie op een dosisafhankelijke manier zonder cytotoxiciteit bij therapeutische concentraties. Deze behandeling verminderde het aantal TRAP-positieve osteoclasten aanzienlijk, verminderde de vorming van de actinegordel en onderdrukte de afbraak van de botmatrix. De expressie van osteoclastmarkers, waaronder NFATc1, c-Fos, cathepsine K en TRAP, was duidelijk verlaagd. Mechanistisch gezien verstoorde LY900009 de Notch-signalering en de stroomafwaartse MAPK/Akt-routes. In vivo toediening verminderde de door LPS geïnduceerde botafbraak aanzienlijk, waardoor de botparameters verbeterden en de aanwezigheid van osteoclasten werd verminderd. Deze bevindingen tonen aan dat LY900009 osteoclastogenese en botresorptie effectief remt door de Notch/MAPK/Akt-signaleringsas te moduleren, waardoor het een veelbelovende therapeutische kandidaat is voor osteolytische aandoeningen.

Inleiding

Bothomeostase vormt een prachtig georkestreerd fysiologisch paradigma bij gewervelde dieren, geharmoniseerd door het delicate evenwicht tussen osteoblast-gemedieerde botvorming en osteoclast-gedreven botresorptie1. Deze ingewikkelde balans behoudt de integriteit van het skelet, de biomechanische veerkracht en de metabole getrouwheid gedurende het hele leven, en reageert dynamisch op mechanische eisen, endocriene verstoringen en pathologische uitdagingen2. De botremodelleringscyclus omvat opeenvolgende fasen van activering, resorptie, overgang, vorming en beëindiging, elk beheerst door ingewikkelde moleculaire cascades die zorgen voor de spatiotemporele synchronisatie van cellulaire activiteiten3.

Verstoring van dit homeostatische mechanisme, met name door overmatige osteoclastactiviteit of ontoereikende osteoblastfunctie, versnelt pathologisch botverlies, kenmerkend voor talrijke osteolytische aandoeningen 4,5. Deze aandoeningen omvatten een breed spectrum van ziekten, waaronder postmenopauzale en senescente osteoporose, reumatoïde artritis, inflammatoire artritis, neoplastische botbetrokkenheid, de ziekte van Paget en parodontitis6. De klinische manifestaties van overmatige botresorptie omvatten een verhoogd risico op fracturen, skeletmisvorming, chronische pijn, functionele beperkingen en een aanzienlijke zorglast 6,7. Hedendaagse epidemiologische statistieken geven aan dat osteoporose alleen al wereldwijd meer dan 200 miljoen mensen treft, met bijbehorende fracturen die resulteren in aanzienlijke morbiditeit, mortaliteit en economische kosten van meer dan miljarden dollars per jaar 7,8.

Osteoclasten manifesteren zich als zeer gespecialiseerde meerkernige reuzencellen afgeleid van hematopoëtische voorlopers van de mononucleaire fagocytenlijn, met name van beenmerg afgeleide macrofagen9. Hun vorming vertegenwoordigt een complex proces in meerdere stappen dat de nauwkeurige coördinatie van extracellulaire signalen, intracellulaire signaalcascades en transcriptieprogramma's vereist10. De essentiële cytokinen die osteoclastogenese regelen, zijn onder meer receptoractivator van nucleaire factor κB-ligand (RANKL) en macrofaagkoloniestimulerende factor (M-CSF), die binden aan hun respectievelijke receptoren RANK en c-Fms om differentiatieprogramma's te starten11. RANKL-RANK-interactie activeert de activering van meerdere stroomafwaartse signaalroutes, waaronder mitogeen-geactiveerde eiwitkinasen (MAPK's), nucleaire factor κB (NF-κB), fosfoinositide-3-kinase/eiwitkinase B (PI3K/Akt) en calcium/calcineurine-routes, die samenkomen op de nucleaire factor van geactiveerde T-cellen cytoplasmatisch 1 (NFATc1), de belangrijkste transcriptionele regulator van osteoclastogenese 10,11,12.

Onder de verschillende regulerende mechanismen die de biologie van osteoclasten beheersen, is Notch-signalering naar voren gekomen als een kritische modulator met complexe en contextafhankelijke functies13. De Notch-route is een evolutionair geconserveerd cel-celcommunicatiesysteem dat de bepaling, differentiatie, proliferatie en apoptose van cellen in verschillende weefsels en ontwikkelingsstadia regelt14. Bij zoogdieren interageren vier Notch-receptoren (Notch1-4) met vijf canonieke liganden (Delta-like 1, 3 en 4, en Jagged 1 en 2) om intercellulaire signalering te mediëren. Activering van de route omvat ligandbinding, conformationele veranderingen en sequentiële proteolytische splitsing door ADAM-metallotolose en het γ-secretasecomplex, dat uiteindelijk het intracellulaire domein Notch (NICD) vrijgeeft voor de nucleaire translocatie en transcriptionele regulatie van doelgenen, waaronder de families Hes en Hey 14,15. De rol van Notch-signalering bij osteoclastogenese blijft controversieel en lijkt sterk contextafhankelijk te zijn, waarbij studies zowel stimulerende als remmende effecten rapporteren, afhankelijk van de specifieke receptorsubtypes, ligandbeschikbaarheid, cellulaire micro-omgeving en experimentele omstandigheden 16,17,18.

De heersende therapeutische benaderingen voor osteolytische aandoeningen zijn voornamelijk gericht op anti-resorptieve strategieën, waaronder bisfosfonaten, denosumab (RANKL-remmer), selectieve oestrogeenreceptormodulatoren en calcitonine 7,8,19. Hoewel deze behandelingen botresorptie en het risico op fracturen effectief verminderen, gaan ze gepaard met aanzienlijke beperkingen, waaronder gastro-intestinale toxiciteit, osteonecrose van de kaak, atypische fracturen, verhoogd infectierisico en bezorgdheid over de veiligheid op de lange termijn. Bovendien kunnen deze middelen de botomzetting overmatig onderdrukken, waardoor de botkwaliteit en herstelmechanismen in gevaar kunnen komen. Bijgevolg is er een dringende klinische behoefte aan nieuwe therapeutische middelen die selectief de pathologische osteoclastactiviteit kunnen remmen, terwijl de nadelige effecten tot een minimum worden beperkt en de fysiologische botremodelleringscapaciteit behouden blijft 8,14.

γ-secretaseremmers vertegenwoordigen een veelbelovende klasse van verbindingen met potentiële toepassingen bij osteolytische aandoeningen door modulatie van Notch-signalering14,20. Deze middelen zijn uitgebreid bestudeerd in onderzoek naar oncologie en neurodegeneratieve ziekten, waarbij verschillende verbindingen zijn gevorderd tot klinische proeven voor de ziekte van Alzheimer en verschillende vormen van kanker. LY900009, een krachtige en selectieve γ-secretaseremmer, heeft in voorlopige studies gunstige farmacologische eigenschappen aangetoond, waaronder een hoge specificiteit, biologische beschikbaarheid en een beheersbaar veiligheidsprofiel21,22. De specifieke effecten ervan op door RANKL geïnduceerde osteoclastogenese en het potentiële therapeutische nut bij osteolytische aandoeningen blijven echter onvolledig gekarakteriseerd. Deze studie was opgezet om te evalueren of LY900009 osteoclastogenese zou kunnen remmen door de verstoring van Notch-signalering, wat mogelijk een nieuwe therapeutische benadering voor osteolytische aandoeningen biedt. We hebben uitgebreide protocollen ontwikkeld om hun effecten op de vorming van osteoclasten, botresorptieactiviteit, signaalroutes en in vivo werkzaamheid in inflammatoire botverliesmodellen te beoordelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen en werden goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee van het Central Hospital verbonden aan de Shandong First Medical University (goedkeuringsnummer IACUC-2024-015). De studie hield zich aan de gevestigde ethische principes voor dieronderzoek en ARRIVE-richtlijnen, waaronder dierenhuisvesting in standaardkooien (5 muizen/kooi, 12-uurs licht/donkercyclus, ad libitum voedsel/water) en randomisatie naar groepen

1. Isolatie en cultuur van macrofagen uit het beenmerg

  1. Euthanaseer 5 weken oude mannelijke C57BL/6-muizen (n=5 per isolatie) door ze gedurende 5 minuten in een CO2 -kamer te plaatsen met een stroomsnelheid van 30% kamervolume per minuut. Bevestig overlijden door cervicale dislocatie.
  2. Spuit de muis in met 70% ethanol. Maak een incisie in de middellijn van het schaambeen tot het borstbeen met behulp van een steriele schaar. Verwijder dijbenen en scheenbeen aseptisch. Plaats botten in steriel PBS op ijs.
  3. Reinig botten van zacht weefsel met behulp van steriel gaas. Knip beide uiteinden van de botten af met een steriele schaar. Spoel het merg weg met een naald van 25 G met 10 ml koude α-MEM per muis. Leid de celsuspensie door een celzeef van 70 μm.
  4. Centrifugeer 5 minuten bij 300 x g bij 4 °C. Resuspendeer de pellet in α-MEM met 10% FBS en 33,3 ng/ml m-CSF. Tel cellen met behulp van een hemocytometer met trypanblauwe uitsluiting. Plaat op 2 x 106 cellen/ml in T75 kolven.
  5. Houd culturen op 37 °C in een atmosfeer van 5% CO2 met mediumwisselingen om de 48 uur.
  6. Oogst 1x 106 cellen. Wassen met PBS met 2% FBS. Incubeer met anti-CD11b-FITC (1:100) en anti-F4/80-PE (1:100) gedurende 30 minuten bij 4 °C in het donker. Analyseer door middel van flowcytometrie met behulp van de volgende gating-strategie: Ten eerste, poortcellen op basis van voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijverstrooiing (SSC) om puin uit te sluiten en levensvatbare cellen te selecteren. Ten tweede, gate CD11b-positieve cellen uit de levensvatbare celpopulatie. Ten derde, van CD11b-positieve cellen, gate F4/80-positieve cellen om CD11b+/F4/80+ dubbelpositieve macrofagen te identificeren. Stel poorten in op basis van onbevlekte bedieningselementen en eenkleurige bedieningselementen. Ga alleen verder als >95% cellen CD11b+/F4/80+ zijn.

2. Beoordeling van de cytotoxiciteit

  1. Zaad van beenmerg afgeleide macrofagen (BMM's) met 1 x 104 cellen per putje in platen met 96 putjes met 100 μL medium per putje. Laat de cellen 4 uur hechten bij 37 °C.
  2. Bereid LY900009 verdunningen in volledig medium: 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2, 6,4, 12,8, 25,6 μM. Verwijder het oude medium. Voeg 100 μL behandelingsmedium toe per putje. Bereid drievouden voor elke concentratie.
  3. Incubeer gedurende 24 uur, 48 uur of 96 uur. Verwijder de voedingsbodem volledig. Voeg 100 μl vers medium toe dat 10% CCK-8-reagens bevat (10 μl CCK-8 in 90 μl medium). Incubeer gedurende precies 2 uur bij 37 °C. Gebruik een microplaatlezer om de extinctie te meten bij 450 nm met een referentie bij 650 nm.
  4. Bereken IC50 met behulp van GraphPad Prism. Open software, inputconcentratie (X-as) en levensvatbaarheidspercentage (Y-as). Selecteer Analyseer > Niet-lineaire regressie > Dosis-respons > remming > log(remmer) versus respons met variabele helling. Stel beperkingen in: Bottom=0, Top=100. Registreer IC50 met een betrouwbaarheidsinterval van 95%.

3. Osteoclastdifferentiatie en TRAP-kleuring

  1. Zaad van beenmerg afgeleide macrofagen (BMM's) met 1 x 104 cellen per putje in platen met 96 putjes. Kweek 's nachts in α-MEM met 10% FBS en 33,3 ng/ml m-CSF.
  2. Vervang het medium door 100 μL differentiatiemedium: α-MEM met 10% FBS, 33,3 ng/ml m-CSF, 100 ng/ml RANKL en LY900009 (0, 100, 200, 400 nM). Bereid quadruplicates voor elke aandoening voor.
  3. Vervang het medium elke 48 uur door een vers differentiatiemedium. Ga 6 dagen door. Controleer dagelijks met een omgekeerde microscoop op 100x op osteoclastvorming.
  4. Verwijder al het medium door aspiratie. Eenmaal wassen met 200 μL PBS. Voeg 100 μL 4% paraformaldehyde toe aan PBS. Incubeer precies 15 minuten bij kamertemperatuur. Fixeermiddel verwijderen. Was 3x met 200 μL PBS.
  5. Bereid de TRAP-kleurstofoplossing voor: Meng 50 ml 0,1 M natriumacetaatbuffer (pH 5,0), 10 ml 50 mM natriumtartraat, 1 ml 5 mg/ml naftol AS-MX-fosfaat in dimethylformamide en 0,5 ml 11 mg/ml Fast Red Violet LB-zout. Filter door een filter van 0,22 μm. Breng 200 μL per putje aan. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten in het donker. Stop de reactie door 3x te wassen met gedestilleerd water.
  6. Identificeer osteoclasten als TRAP-positieve cellen (paars/rood) die drie of meer kernen bevatten. Tel met een omgekeerde microscoop met een vergroting van 100x. Fotografeer vijf willekeurige velden per put.
  7. Kwantificeren met behulp van ImageJ. Klik op afbeelding > Converteren naar 8-bits (afbeelding > Type > 8-bits) > Drempel instellen (Afbeelding > > drempel aanpassen) > TRAP-positieve gebieden selecteren > Deeltjes analyseren (Deeltjes analyseren > analyseren: grootte 100-oneindig μm2, circulariteit 0-1,0) > Resultaten exporteren naar Excel 23.

4. Functionele botresorptietest

  1. Kweek BMM's in platen met zes putjes (2 x 105 cellen/putje) met M-CSF gedurende 24 uur. Voeg RANKL (100 ng/ml) toe om pre-osteoclastvorming gedurende 3 dagen te induceren.
  2. Oogst cellen met 0,25% trypsine-EDTA gedurende 5 minuten bij 37 °C. Neutraliseer met volledig medium. Tel levensvatbare cellen met behulp van trypanblauw.
  3. Zaai 1 x 104 pre-osteoclasten per putje op met hydroxyapatiet beklede platen met 96 putjes. Laat de bevestiging 4 uur toe.
  4. Behandel met M-CSF (33,3 ng/ml), RANKL (100 ng/ml) en LY900009 (0, 100, 200, 400 nM) gedurende 4 dagen. Wissel het medium elke 2 dagen.
  5. Verwijder de cellen met 10% bleekmiddel gedurende 10 minuten. Was 5x met gedestilleerd water. Volledig aan de lucht laten drogen.
  6. Visualiseer resorptieputten met behulp van een geautomatiseerde beeldlezer met een vergroting van 4x. Leg het hele putgebied vast. Kwantificeer het geresorbeerde gebied als een percentage van het totale gebied met behulp van ImageJ.

5. Immunofluorescentie microscopie

  1. Kweek osteoclasten op glazen dekglaasjes in platen met 24 putjes gedurende 5-7 dagen, zoals beschreven in stap 3.
  2. Fixeer met 4% paraformaldehyde gedurende 15 min. Permeabiliseren met 0,1% Triton X-100 in PBS gedurende 10 min. Blokkeer met 1% BSA in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  3. Incubeer met rhodamine-falloïdine (1:200) in een blokkeerbuffer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Tegenkleuring van kernen met DAPI (1 μg/ml) gedurende 10 min.
  4. Monteer dekglaasjes op dia's met behulp van anti-fade montagemedium. Onderzoek met een fluorescentiemicroscoop met een vergroting van 200x. Meet het gebied van de actinering met behulp van ImageJ.

6. Kwantitatieve real-time PCR-analyse

  1. Extraheer totaal RNA uit 2 x 106 cellen met behulp van een RNA-extractiereagens. Homogeniseren door pipetteren. Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur.
  2. Voeg 200 μL chloroform toe. Schud krachtig gedurende 15 s. Incubeer 3 min. Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
  3. Breng de waterige fase over naar een nieuwe buis. Voeg 500 μL isopropanol toe. Meng voorzichtig. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  4. Was de pellet met 1 ml 75% ethanol. Laat 10 minuten aan de lucht drogen. Los op in 30 μL RNasevrij water. Meet de concentratie met behulp van een spectrofotometer (vereist een A260/A280-verhouding >1,8).
  5. Synthese van cDNA met behulp van 1 μg RNA met de reverse transcriptiekit volgens het protocol van de fabrikant.
  6. Bereid qPCR-reacties voor: 10 μL Master Mix, 1 μL cDNA, 0,5 μL van elke primer (10 μM), 8 μL water. Draai op een real-time PCR-systeem: 95 °C gedurende 10 min, daarna 40 cycli van 95°C gedurende 15 s en 60 °C gedurende 60 s. Bereken relatieve expressie met behulp van de 2-ΔΔCt-methode met GAPDH als referentiegen.

7. Analyse van de westerse vlek

  1. Lyseer de cellen in de LIPA-buffer met protease en fosfataseremmers op ijs gedurende 30 minuten. Centrifugeer bij 14.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
  2. Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van de BCA-test volgens de instructies van de fabrikant. Bereid 30 μg eiwitmonsters voor in een laadbuffer. Kook gedurende 5 min.
  3. Laad monsters op 10% SDS-PAGE-gels. Draai 30 minuten op 80 V en vervolgens 90 minuten op 120 V. Overbrengen naar PVDF-membranen bij 100 V gedurende 90 minuten in koude overdrachtsbuffer.
  4. Blokkeer membranen met 5% magere melk in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween-20 (TBST) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met zacht schommelen.
  5. Incubeer met primaire antilichamen die zijn beschreven in de materiaaltabel (1:1000) 's nachts bij 4 °C en schud zachtjes. Was 3x met TBST gedurende 10 minuten elk.
  6. Incubeer met HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen (1:5000) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was 3x met TBST.
  7. Detecteer het gebruik van ECL-reagens volgens de instructies van de fabrikant. Leg beelden vast met behulp van een infraroodbeeldvormingssysteem. Kwantificeer de bandintensiteit met behulp van ImageJ.

8. In vivo LPS-geïnduceerd botresorptiemodel

  1. Bereken de steekproefomvang met behulp van G*Power 3.1 (effectgrootte = 0,8, α=0,05, power = 0,80, wat n=5/groep oplevert). Wijs willekeurig 7-8 weken oude mannelijke C57BL/6-muizen toe aan groepen met behulp van een generator voor willekeurige getallen. Huisvest 5 muizen per kooi met een licht/donkercyclus van 12 uur, temperatuur 22 ± 2 °C, luchtvochtigheid 55% ± 10%, ad libitum toegang tot standaard voer en water.
  2. Verdoof muizen met behulp van intraperitoneale injectie van pentobarbitalnatrium (50 mg/kg). Bevestig de anesthesie door middel van een teenknijpreflex.
  3. Voertuigbesturing voorbereiden: PBS met 1% DMSO. Bereid LY900009: Lage dosis (2,5 mg/kg) en hoge dosis (5 mg/kg) in het vehiculum. Injecteer 100 μL subcutaan over de calvaria met een naald van 27 G dagelijks gedurende 14 dagen. Injecteer LPS (10 mg/kg) op dag 1 en 8.
  4. Controleer muizen 2x per dag op tekenen van angst. Definieer humane eindpunten: gewichtsverlies >20%, onvermogen om te lopen, gebogen houding, verminderde verzorging. Euthanaseer onmiddellijk als eindpunten zijn bereikt.
  5. Euthanaseer op dag 15 met een overdosis pentobarbital (100 mg/kg intraperitoneaal). Oogst calvariae. Fixeer 4% paraformaldehyde gedurende 48 uur bij 4 °C.

9. Micro-CT en histologische analyse

  1. Scan vaste calvariae met behulp van een micro-CT-scanner met de volgende parameters: 70 kV, 114 μA, 0,5 mm aluminium filter, 9 μm resolutie, 180° rotatie met stappen van 0,4°.
  2. Reconstrueer afbeeldingen met behulp van NRecon-software. Analyseer met behulp van CTAn-software. Definieer het interessegebied als een gebied van 3 x 3 mm gecentreerd op de sagittale hechting. Bereken BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Th.
  3. Ontkalk monsters in 10% EDTA (pH 7,4) gedurende 14 dagen met dagelijkse verversingen. Voltooiing van de ontkalkingstest met behulp van de calciumoxalaattest24.
  4. Proces voor paraffine-inbedding: dehydrateren door gesorteerde alcohol, helder in xyleen, infiltreren met paraffine. Doorsnede met een dikte van 4 μm met behulp van microtoom.
  5. Zorg voor verblinding: Codeer alle monsters met willekeurige driecijferige getallen. Laat een collega de codesleutel onderhouden. Voer alle analyses uit zonder kennis van behandelgroepen. Decodeer pas nadat het verzamelen van de gegevens is voltooid.
  6. Voer H&E-kleuring uit: deparaffiniseren, rehydrateren, 5 minuten kleuren met hematoxyline, differentiëren in zure alcohol, 2 minuten kleuren met eosine, uitdrogen en opstijgen.
  7. Voer TRAP-kleuring uit zoals in stap 3.5. Tel TRAP-positieve meerkernige cellen langs het botoppervlak. Uitgedrukt als een getal per mm botomtrek.

10. Statistische analyse

  1. Bereken de vereiste steekproefomvang met behulp van G*Power 3.1: Invoereffectgrootte f=0,8, α=0,05, power=0,80, aantal groepen. Noteer het minimum n per groep.
  2. Test normaliteit met behulp van de Shapiro-Wilk-test in SPSS 28.0. Beschouw p > 0,05 als normaal verdeeld. Test de homogeniteit van de variantie met behulp van de test van Levene. Beschouw p > 0,05 als gelijke varianties.
  3. Pas de juiste tests toe op basis van verdeling: Gebruik parametrische tests voor normale gegevens met gelijke varianties. Pas voor de twee groepen de ongepaarde Student's t-toets toe. Gebruik voor meerdere groepen eenrichtings-ANOVA.
  4. Voer post-hocanalyse uit: Voor significante ANOVA (p<0,05) past u de eerlijk significante verschiltest van Tukey toe voor alle paarsgewijze vergelijkingen.
  5. Gebruik niet-parametrische alternatieven voor niet-normale gegevens: Pas de Mann-Whitney U-test toe voor twee groepen en Kruskal-Wallis met Dunn's post hoc voor meerdere groepen.
  6. Bereken effectgroottes: Cohen's d voor t-tests, gedeeltelijke eta in het kwadraat voor ANOVA.
  7. Rapporteer exacte p-waarden tot op drie decimalen en 95% betrouwbaarheidsintervallen. Presenteer normale gegevens als gemiddelde ± standaarddeviatie, niet-normaal als mediaan (interkwartielbereik).
  8. Beschouw p < 0,05 als statistisch significant. Pas de Bonferroni-correctie toe wanneer er meerdere vergelijkingen worden uitgevoerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De succesvolle implementatie van dit protocol toonde aan dat LY900009 krachtige remmende effecten uitoefenden op de vorming en functie van osteoclasten via meerdere onderling verbonden mechanismen. Een eerste cytotoxiciteitsbeoordeling in van beenmerg afgeleide macrofagen toonde tijdsafhankelijke verhogingen van de toxiciteit aan, met berekende IC50-waarden van respectievelijk 4,44 μM, 3,66 μM en 2,93 μM na 24 uur, 48 uur en 96 uur (Figuur 1A,B

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het huidige onderzoek levert overtuigend bewijs dat LY900009 een veelbelovend therapeutisch middel is voor osteolytische aandoeningen door zijn krachtige en selectieve remming van osteoclastogenese, in overeenstemming met de groeiende belangstelling voor γ-secretaseremmers voor botgerelateerde aandoeningen 14,20,21. De bevindingen tonen aan dat deze γ-secretaseremmer de door RANKL geïnduceerde o...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige financiële belangen of belangenconflicten. Geen enkele auteur heeft enige financiële relatie met de commerciële entiteiten die in dit werk worden genoemd. Alle auteurs hebben de ICMJE-openbaarmakingsformulieren ingevuld.

Dankbetuigingen

De auteurs willen het personeel van het Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University en Feicheng People's Hospital bedanken voor hun technische ondersteuning en hulp in de loop van dit onderzoek. We waarderen ook de bijdragen van onze laboratoriumcollega's voor hun waardevolle discussies en hulp bij dierproeven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
24-well cell culture platesCorning3524Immunofluorescence microscopie
6-well cell culture platesCorning3516Celcultuur en western blot
70% EthanolSigma-AldrichE7023Sterilisation en desinfectie
75% EthanolSigma-AldrichE7148RNA wasbuffer
96-well cell culture platesCorning3596Celcultuur en assays
Aluminum filter (0.5 mm)BrukerN/AMicro-CT scanfilter
Anti-CD11b-FITC antibodyBioLegend101206Flowcytometrie - macrofaagmarker
Anti-cleaved Notch1 antibody (rabbit monoclonal)Cell Signaling Technology4147SWestern blot - Notch signaling
Anti-F4/80-PE antibodyBioLegend123108Flowcytometrie - macrofaagmarker
Anti-fade mounting mediumVector LaboratoriesH-1000Fluorescentiemicroscopie montage
Anti-Hes1 antibody (rabbit monoclonal)Cell Signaling Technology11988SWestern blot - Notch downstream target
Anti-NFATc1 antibody (mouse monoclonal)Santa Cruz Biotechnologysc-7294Western blot - osteoclast master regulator
Anti-phospho-Akt (Ser473) antibodyCell Signaling Technology4060SWestern blot - PI3K/Akt signaling
Anti-phospho-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) antibodyCell Signaling Technology4370SWestern blot - MAPK signaling
Anti-phospho-NF-κB p65 (Ser536) antibodyCell Signaling Technology3033SWestern blot - NF-κB signaling
Anti-phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) antibodyCell Signaling Technology4511SWestern blot - p38 MAPK signaling
Anti-β-actin antibody (mouse monoclonal)Cell Signaling Technology4970SWestern blot loading control
Automated imaging readerMolecular DevicesImageXpress MicroReabsorptieputjes kwantificering
BCA Protein Assay KitPierce/Thermo Fisher23225Eiwitconcentratiebepaling
Bleach (10% sodium hypochlorite)Sigma-Aldrich425044Celverwijdering van resorptieplaten
BSA (Bovine Serum Albumin)Sigma-AldrichA7906Blocking buffer voor immunofluorescence
C57BL/6 muizen (man, 5-8 weken oud)Charles River Laboratories27In vitro BMM isolatie en in vivo studies
Calcium oxalate testreagensSigma-AldrichC0350Decalcificatie voltooiingstest
CCK-8 reagens (Cell Counting Kit-8)Dojindo Molecular TechnologiesCK04Celviabiliteitsbeoordeling
Cell strainer (70 μm)BD Falcon352350Beenmergcelfiltratie
Centrifuge (gekoeld)Eppendorf5424RCel- en monstervoorbereiding
ChloroformSigma-AldrichC2432RNA extractie fasescheiding
CO2 kamerEuthanex CorpEX-075Diereneuthanasie
CTAn softwareBrukerVersie 1.20Micro-CT beeldanalyse
DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindol)Sigma-AldrichD9542Nucleaire contrakleuring
Dimethylformamide (DMF)Sigma-AldrichD4551TRAP kleuring oplosmiddel
DMSO (Dimethyl sulfoxide)Sigma-AldrichD2650Voertuigcontrole voorbereiding
ECL Western Blotting SubstraatPierce/Thermo Fisher32106Eiwitdetectie in western blot
EDTA (10%, pH 7.4)Sigma-AldrichE6758Decalcificatie oplossing
Eosin YSigma-AldrichE4009H&E histologische kleuring
Fast Red Violet LB zoutSigma-AldrichF3381TRAP kleuring chromagen
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco/Thermo Fisher16140-071Celcultuursupplement
Flow cytometerBD BiosciencesFACSCaliburBMM karakterisering
Fluorescentie microscoopOlympusIX73Immunofluorescence beeldvorming
G*Power softwareHeinrich Heine UniversityVersie 3.1Statistische machtsanalyse
Glas coverslipjes (22 × 22 mm)Fisher Scientific12-541-BImmunofluorescence microscopie
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersie 9.0IC50 berekening en grafiek
HematoxylineSigma-AldrichH3136H&E histologische kleuring
HemocytometerHausser Scientific3200Celtelling
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitApplied Biosystems4368814cDNA synthese uit RNA
HRP-geconjugeerd anti-muis IgGCell Signaling Technology7076SWestern blot secundaire antilichaam
HRP-geconjugeerd anti-konijn IgGCell Signaling Technology7074SWestern blot secundaire antilichaam
Hydroxyapatiet-gecoate 96-well platenCorning BioCoat354651Botresorptie functionele assay
ImageJNIHVersie 1.53eBeeldanalyse en kwantificering
Incubator (CO2)Thermo Fisher51033058Celcultuur onderhoud
Infrarood beeldvormingssysteemBio-RadChemiDoc MPWestern blot detectie
Omgekeerde microscoopOlympusCKX41Celcultuur monitoring, TRAP telling
IsopropanolSigma-AldrichI9516RNA precipitatie
LPS (Lipopolysacharide uit E. coli)Sigma-AldrichL4391In vivo inflammatoire botresorptie
LY900009 (γ-secretase remmer)Selleck ChemicalsS7999Testverbinding - osteoclast remmer
M-CSF (Macrophage Colony-Stimulating Factor)R&D Systems416-ML-010Macrofaag overleving en osteoclast differentiatie
Micro-CT scannerBrukerSkyScan 1272Botmicroarchitectuur analyse
Microplate reader

Referenties

  1. Langdahl, B., Ferrari, S., Dempster, D. W. Bone modeling and remodeling: potential as therapeutic targets for the treatment of osteoporosis. Ther Adv Musculoskeletal Dis. 8 (6), 225-235 (2016).
  2. Shah, M. A. A., et al. Functional morphology of trabecular system in human proximal femur: a perspective from P45 sectional plastination and 3D reconstruction finite element analysis. J Ortho Surg Res. 20 (1), (2025).
  3. Shah, M. A. A., et al. Microvasculature and trabecular bone in beagle proximal femur: Microstructural insights. Ann Anatomy. 258, 152368(2025).
  4. Mukherjee, K., Chattopadhyay, N. Pharmacological inhibition of cathepsin K: A promising novel approach for postmenopausal osteoporosis therapy. Biochem Pharmacol. 117, 10-19 (2016).
  5. Bertuglia, A., et al. Osteoclasts are recruited to the subchondral bone in naturally occurring post-traumatic equine carpal osteoarthritis and may contribute to cartilage degradation. Osteoarth Cartilage. 24 (3), 555-566 (2016).
  6. Alami, S., Hervouet, L., Poiraudeau, S., Briot, K., Roux, C. Barriers to Effective Postmenopausal Osteoporosis Treatment: A Qualitative Study of Patients' and Practitioners' Views. PLoS One. 11 (6), e0158365(2016).
  7. Hiligsmann, M., et al. A Systematic Review of Cost-Effectiveness Analyses of Drugs for Postmenopausal Osteoporosis. PharmacoEconomics. 33 (3), 205-224 (2014).
  8. Hadji, P., et al. Persistence, adherence, and medication-taking behavior in women with postmenopausal osteoporosis receiving denosumab in routine practice in Germany, Austria, Greece, and Belgium: 12-month results from a European non-interventional study. Osteoporosis Int. 26 (10), 2479-2489 (2015).
  9. Udagawa, N., et al. Osteoblasts/stromal cells stimulate osteoclast activation through expression of osteoclast differentiation factor/RANKL but not macrophage colony-stimulating factor. Bone. 25 (5), 517-523 (1999).
  10. Lee, K., et al. Selective Regulation of MAPK Signaling Mediates RANKL-dependent Osteoclast Differentiation. Int J Biol Sci. 12 (2), 235-245 (2016).
  11. Huang, H., et al. Osteoclast differentiation requires TAK1 and MKK6 for NFATc1 induction and NF-κB transactivation by RANKL. Cell Death Diff. 13 (11), 1879-1891 (2006).
  12. Matsumoto, Y., et al. RANKL coordinates multiple osteoclastogenic pathways by regulating expression of ubiquitin ligase RNF146. J Clin Investigat. 127 (4), 1303-1315 (2017).
  13. Lai, E. C. Notch signaling: control of cell communication and cell fate. Development. 131 (5), 965-973 (2004).
  14. Chen, X., et al. LY411575, a potent γ-secretase inhibitor, suppresses osteoclastogenesis in vitro and LPS-induced calvarial osteolysis in vivo. J Cellular Physiol. 234 (11), 20944-20956 (2019).
  15. Chen, S., Lee, B. H., Bae, Y. Notch Signaling in Skeletal Stem Cells. Calcified Tiss Int. 94 (1), 68-77 (2013).
  16. Sekine, C., et al. Differential regulation of osteoclastogenesis by Notch2/Delta-like 1 and Notch1/Jagged1 axes. Arthritis Res Ther. 14 (2), (2012).
  17. Duan, L. Notch is activated in RANKL-induced osteoclast differentiation and resorption. Front Biosci. (13), 7064(2008).
  18. Ashley, J. W., Ahn, J., Hankenson, K. D. Notch Signaling Promotes Osteoclast Maturation and Resorptive Activity. J Cell Biochem. 116 (11), 2598-2609 (2015).
  19. Hough, F. S., et al. The safety of osteoporosis medication. South African Med J. 104 (4), 279(2013).
  20. Espinosa, L. S., Inglés-Esteve, J., Robert-Moreno, A., Bigas, A. IκBα and p65 Regulate the Cytoplasmic Shuttling of Nuclear Corepressors: Cross-talk between Notch and NFκB Pathways. Mol Biol Cell. 14 (2), 491-502 (2003).
  21. Wang, Z., Li, Y., Sarkar, F. Notch Signaling Proteins: Legitimate Targets for Cancer Therapy. Curr Prot Peptide Sci. 11 (6), 398-408 (2010).
  22. Zhou, Z., et al. PP121 suppresses RANKL-Induced osteoclast formation in vitro and LPS-Induced bone resorption in vivo. Exp Cell Res. 388 (2), 111857(2020).
  23. Shah, M. A. A., et al. Regional distribution of microvasculature within the canine femoral head: a study of plastinated tissue histology and 3D reconstruction. J Ortho Surg Res. 20 (1), (2025).
  24. Clayden, E. C. Practical Section Cutting and Staining. , Churchill. (1955).
  25. McHorney, C. A., Schousboe, J. T., Cline, R. R., Weiss, T. W. The impact of osteoporosis medication beliefs and side-effect experiences on non-adherence to oral bisphosphonates ates. Curr Med Res Opin. 24 (3), 707-708 (2008).
  26. Canalis, E. Notch in skeletal physiology and disease. Osteoporosis Int. 29 (12), 2611-2621 (2018).
  27. Zanotti, S., Canalis, E. Notch Signaling and the Skeleton. Endocrine Rev. 37 (3), 223-253 (2016).
  28. Grevers, L. C., et al. Immune complex-induced inhibition of osteoclastogenesis is mediated via activating but not inhibitory Fcγ receptors on myeloid precursor cells. Ann Rheumatic Dis. 72 (2), 278-285 (2013).
  29. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
  30. Weber, J. M., Calvi, L. M. Notch signaling and the bone marrow hematopoietic stem cell niche. Bone. 46 (2), 281-285 (2010).
  31. Kovtonyuk, L. V., Fritsch, K., Feng, X., Manz, M. G., Takizawa, H. Inflamm-Aging of Hematopoiesis, Hematopoietic Stem Cells, and the Bone Marrow Microenvironment. Front Immunol. 7, (2016).
  32. Khosla, S., Hofbauer, L. C. Osteoporosis treatment: recent developments and ongoing challenges. Lancet Diabet Endocrinol. 5 (11), 898-907 (2017).
  33. Reid, I. R. Efficacy, effectiveness and side effects of medications used to prevent fractures. J Inter Med. 277 (6), 690-706 (2015).
  34. Cosman, F., et al. Clinician's Guide to Prevention and Treatment of Osteoporosis. Osteoporosis Int. 25 (10), 2359-2381 (2014).
  35. Chen, Y. H., et al. Melatonin protects against lipopolysaccharide-induced intra-uterine fetal death and growth retardation in mice. J Pineal Res. 40 (1), 40-47 (2005).
  36. Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor. J Clin Investigat. 100 (6), 1557-1565 (1997).
  37. Black, D. M., Rosen, C. J. Postmenopausal Osteoporosis. New Engl J Med. 374 (3), 254-262 (2016).
  38. Eastell, R., et al. Pharmacological Management of Osteoporosis in Postmenopausal Women: An Endocrine Society Clinical Practice Guideline. J Clin Endocrinol Metabol. 104 (5), 1595-1622 (2019).
  39. Leder, B. Z. Optimizing Sequential and Combined Anabolic and Antiresorptive Osteoporosis Therapy. JBMR Plus. 2 (2), 62-66 (2018).
  40. Grey, A., Bolland, M., Cundy, T. Maintaining Order in Osteoporosis Treatments. Journal of Bone Miner Res. 32 (5), 1147-1147 (2017).
  41. McClung, M. R. Role of bone-forming agents in the management of osteoporosis. Aging Clin Exp Re. 33 (4), 775-791 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Remming van de osteoclastogeneseLY900009RANKL-geïnduceerde osteoclastenbotresorptiebeenmergmactrofagenWestern blotTRAP-kleuringMAPK Akt-signaalroute
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.