Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Onderzoeksartikel

Micro-letsel van de pees-botovergang veroorzaakt door acute uitputtende inspanning bij ratten: ultrastructurele veranderingen en mechanisme

354 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69184

⸱

14 november 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Rehabilitation, Sichuan college of traditional Chinese medicine, 2Department of Rehabilitation, Mian-yang Orthopedic hospital, 3Sports Medicine Center, West China Hospital, Sichuan University, 4Department of Orthopedics and Orthopedic Research Institute, West China Hospital, 5Department of Geriatric Medicine, Mian-yang hospital of traditional Chinese medicine, 6Department of Rehabilitation Medicine, Sichuan Provincial Orthopedic Hospital

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie had tot doel de ultrastructurele veranderingen en mechanismen bij de pees-botovergang te onderzoeken als gevolg van acute uitputtende inspanning. Acute uitputtende inspanning induceert microletsel bij de pees-botovergang, waardoor ER-stress en de gemedieerde apoptotische signaalroutes tijdelijk worden geactiveerd. Desalniettemin kunnen deze microblessures en SEH-stress na het sporten geleidelijk worden hersteld.

Samenvatting

Door inspanning veroorzaakte microblessures bij de pees-botovergang (enthesis) kunnen leiden tot tendinopathie. Het onderzoeken van de ultrastructurele veranderingen en mechanismen binnen de enthesis na acute uitputtende inspanning kan ons begrip van tendinopathie verbeteren en klinische behandelingen begeleiden. In deze studie werden zesendertig mannelijke Sprague-Dawley-ratten willekeurig toegewezen aan twee groepen: controle en uitputtende oefening. De uitputtende oefengroep werd verder onderverdeeld in vijf subgroepen op basis van de tijd na de oefening: 0 uur, 6 uur, 12 uur, 24 uur en 48 uur. Hematoxyline-eosinekleuring en elektronenmicroscopie werden gebruikt om veranderingen in de calcaneale pees-botovergang te onderzoeken. De expressie van endoplasmatisch reticulumstress (ERS)-gerelateerde eiwitten GRP78, CHOP en Caspase-12 bij de pees-botovergang werd gekwantificeerd met behulp van immunohistochemie (IHC). Na acute uitputtende inspanning vertoonden de pees-botverbindingen van ratten die uitputtende inspanning ondergingen significante structurele veranderingen. Chondrocyten en collageenvezels vertoonden opmerkelijke ultrastructurele veranderingen die wijzen op ERS. Het ERS-eiwitgehalte steeg onmiddellijk na de inspanning, met een piek na 6 uur. Deze eiwitniveaus begonnen 12 uur na de training te dalen en keerden na 48 uur terug naar de basislijn. Concluderend kan worden gesteld dat acute uitputtende inspanning microschade en endoplasmatisch reticulumspanning veroorzaakt bij de pees-botovergang bij ratten, maar er volgt geen onomkeerbare schade. Tijdige behandeling en herstel van deze microletsels kan overmatige schade en de ontwikkeling van tendinopathie voorkomen.

Inleiding

Achillespeesontsteking is een veel voorkomende klinische aandoening die wordt veroorzaakt door frequente overbelastingsblessures aan de enkel. Deze aandoening wordt gekenmerkt door zwelling van de pees, pijn en disfunctie. Het komt vaker voor bij oudere personen en atleten, met name hardlopers en springers. Achilles tendinopathie wordt onderverdeeld in niet-insertionele en insertionele tendinopathie. Niet-insertionele tendinopathie beïnvloedt de pees 2 tot 6 cm boven de botaanhechting, terwijl insertionele tendinopathie de pees-botovergang1 aantast. Bovendien komt niet-insertionele tendinopathie meestal voor bij personen met overgewicht, oudere en minder actieve personen, terwijl insertionele tendinopathie meestal voorkomt bij actievere personen1.

De pees-botovergang, waar de pees in het bot wordt ingebracht, omvat een geleidelijke overgang van peesweefsel naar botweefsel, inclusief niet-verkalkt vezelkraakbeen en verkalkt vezelkraakbeen2. Deze verandering zorgt voor een overgang van een zacht en flexibel peesweefsel naar hard bot. In technische termen dient dit gebied als een ankerpunt en brengt het spierkracht over om gewrichtsbeweging te vergemakkelijken 3,4. Daarom is deze regio een plaats van stressconcentratie en wordt het vaak blootgesteld aan overbelastingsblessures in de sport.

Klinisch onderzoek heeft zich voornamelijk gericht op niet-insertionele tendinopathie, met minder aandacht voor insertionele tendinopathie ter hoogte van de pees-botovergang2. Onderzoek wijst uit dat overmatig gebruik desorganisatie en fragmentatie van het collageen, infiltratie van vetweefsel en neovascularisatie in de pees bevordert. Het leidt ook tot hyperplasie van fibrochondrocyten, endochondrale ossificatie en botsporen in zowel de niet-verkalkte als de verkalkte fibrokraakbeenregio's5. Recente studies suggereren echter dat spiercontractiepatronen een belangrijkere rol kunnen spelen dan de hoeveelheid lichaamsbeweging bij insertionele tendinopathie 6,7. Daarom is verder onderzoek nodig om de impact van overmatig gebruik op pees-botverbindingen te begrijpen. Eerdere studies hebben de effecten van overmatig gebruik, zoals langdurig springen of rennen, op deze kruispunten onderzocht. Weinigen hebben echter de impact van acute uitputtende inspanning onderzocht. Een recente studie suggereert dat acute inspanning endoplasmatisch reticulumstress in de nieren van ratten induceert, wat wijst op een opregulatie van IL-6-signalering en heat shock-eiwitten (HSP's) en een afname van mitochondriaal respiratoir complex mRNA8. Of dergelijke veranderingen optreden in pees-botverbindingen is niet gerapporteerd. Deze studie richt zich op de pees-botovergang (enthesis) om de veranderingen en onderliggende mechanismen op te helderen die worden veroorzaakt door acute uitputtende inspanning. De bevindingen zijn bedoeld om bij te dragen aan de ontwikkeling van preventieve strategieën voor insertionele tendinopathie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische normen voor proefdieren die zijn opgesteld door de afdeling Wetenschap en Technologie van het Sichuan Hoger Instituut voor Traditionele Chinese Geneeskunde (Goedkeuring nr: 2023DS01). De gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Experimenteel ontwerp en procedure

  1. Dieren
    Zesendertig mannelijke, 12 weken oude CD-Sprague-Dawley-ratten werden gehuisvest en gedurende de experimentele periode voorzien van ad libitum voeding. De omgeving werd op een temperatuur van 20-25 °C en een luchtvochtigheid van 50%-60% gehouden, met een licht/donkercyclus van 12 uur.
  2. Ontwerp van de groep
    Na een week adaptieve voeding werden de ratten willekeurig toegewezen aan een controlegroep (Con, n = 6) of een uitputtende oefengroep (EE, n = 30). De ratten in de EE-groep ondergingen aanpassingstraining door gedurende drie dagen met een snelheid van 10 m/min 15 minuten op een bergopwaartse loopband met een helling van 10 graden te rennen. Na de adaptieve training werd de EE-groep verder onderverdeeld in vijf tijdsubgroepen: 0 uur, 6 uur, 12 uur, 24 uur en 48 uur na uitputtende oefening.
  3. Interventie procedure
    Ratten in de controlegroep oefenden niet, terwijl die in de EE-groep uitputtend renden op een bergopwaartse loopband met een helling van 10 graden (Figuur 1A). Volgens het Bedford-protocol9 werd de trainingsbelasting verdeeld in drie niveaus: niveau 1 met 10 m/min gedurende 15 minuten, niveau 2 met 15 m/min gedurende 15 minuten en niveau 3 met 20 m/min tot uitputting (Figuur 1B). Uitputting werd vastgesteld wanneer een rat niet meer kon rennen en binnen een periode van minder dan 1 minuut10 drie keer op de baan bleef steken, ondanks herhaalde elektrische (150 V, 0,5 mA wisselstroom) en geluidsstimulatie met lage intensiteit (70 dB).

De ratten werden geofferd via overmatige intraperitoneale injectie van 3% natriumpentobarbital (200 mg/kg) op de gespecificeerde tijdstippen (0 uur, 6 uur, 12 uur, 24 uur en 48 uur na uitputtingsinspanning). De huid en het onderhuidse weefsel van de calcaneus werden zorgvuldig ontleed en de achillespees werd 2 cm boven de calcaneus afgesneden met een oogheelkundige schaar. De rechter calcaneus (inclusief de aangehechte achillespees) werd geconserveerd in 4% paraformaldehyde voor histopathologisch onderzoek en immunohistochemisch onderzoek. Bovendien werden drie willekeurige monsters van de linkerkant opgeslagen in 2% paraformaldehyde-2,5% glutaaraldehyde-oplossing voor elektronenmicroscopie om ultrastructurele veranderingen te bestuderen ( Figuur 1C).

2. Histologie van pees-botovergang

De monsters werden gedurende 48 uur gefixeerd in 4% paraformaldehyde en gedurende 4 weken bij kamertemperatuur (20-25 °C) ontkalkt met 15% EDTA, waarbij de oplossing dagelijks werd ververst. Het ontkalkingsproces eindigde toen het bot gemakkelijk met een naald kon worden doorboord zonder enige kracht uit te oefenen. Na ontkalking ondergingen de monsters dehydratatie via een geautomatiseerd proces met een gesorteerde reeks ethanol en xyleen, gevolgd door drie wasbeurten met PBS. De monsters werden sagittaal ingebed in paraffine en doorgesneden bij 5 μm. Hematoxyline-eosinekleuring werd uitgevoerd volgens standaardprocedures en beelden werden vastgelegd met een digitaal trioculair microcamerasysteem van Panthera met een vergroting van 20× en 40×.

3. Elektronenmicroscopie scan

De linkermonsters werden gedurende 48 uur voorafgegaan door 2% paraformaldehyde-2,5% glutaaraldehyde, vervolgens gedehydrateerd in een reeks acetonoplossingen, geïnfiltreerd in een epoxy-uithardingsanalysator en sagittaal ingebed. Halfdunne secties werden gekleurd met methyleenblauw om het pees-botovergangsgebied te identificeren. Ultradunne secties, ongeveer 60-90 nm dik, werden gesneden met een diamantmes. Deze secties werden gedurende 10-15 minuten gekleurd met uranylacetaat, gevolgd door loodcitraat gedurende 1-2 minuten. De secties werden onderzocht onder een transmissie-elektronenmicroscoop bij vergrotingen van 6000×, 12000× en 25000×.

4. Immunohistochemische test

De pees-botovergang werd routinematig ontkalkt en doorgesneden zoals eerder beschreven. Na incubatie met een oplossing voor het ophalen van citraatbufferantigeen gedurende 10 minuten, werden de monsters gedurende 10 minuten behandeld met 3% H2O2 om de endogene peroxidaseactiviteit te blokkeren, gevolgd door blokkering met normaal geitenserum gedurende 20 minuten bij 25 °C. De secties werden vervolgens een nacht bij 4 °C geïncubeerd met primaire antilichamen, waaronder GRP78 (1:100), CHOP (1:100 ) en Caspase-12 (1:100). Vervolgens werden de monsters gedurende 2 uur bij 25 °C geïncubeerd met secundaire antilichamen. Kleurontwikkeling werd bereikt met DAB gedurende 8 minuten bij 25 °C, wat resulteerde in een bruingeel positief signaal. De kernen werden gedurende 3 minuten opnieuw gekleurd met hematoxyline. Image-Pro Plus 6.0-software werd gebruikt om de gemiddelde dichtheid te analyseren. Drie interessegebieden van het pees-botovergangsgebied (pees, fibrokraakbeen en gemineraliseerd fibrokraakbeen) werden geselecteerd voor analyse en de gemiddelde waarde werd berekend.

5. Statistische analyse

GraphPad Prism 8 werd gebruikt om de gegevens te analyseren en grafieken te genereren. Alle gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie. Vergelijkingen tussen verschillende groepen werden gemaakt met behulp van eenrichtings-ANOVA, en de Least Significant Difference (LSD)-test werd gebruikt voor paarsgewijze vergelijkingen. Een P-waarde van < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Zoals te zien is in figuur 2A, zijn in de controlegroep de chondrocyten en collageenfibrocyten in de pees-botovergang regelmatig gerangschikt en is er een vloeiende blauwe lijn tussen het fibrokraakbeen en het gemineraliseerde fibrokraakbeen, bekend als de getijdenmarkering (gele pijlen). In de uitputtende oefengroepen traden ultrastructurele veranderingen op bij de pees-botovergang. De veranderingen omvatten een toename van ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De pees-botovergang, ook bekend als entheses of insertieplaatsen, maakt het mogelijk om pezen in het bot aan te brengen en is een plaats van stressconcentratie waar ligamenten en pezen aan bot4 hechten. Als ankerpunt vergemakkelijkt het de enkelbeweging, brengt het de kracht van de samentrekking van de kuitspier over op de voetligamenten en pezen en neemt het deel aan enkel- en voetbeweging2. De pees-botovergang bestaat uit vier opeenvolgen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen hun oprechte dankbaarheid uitspreken voor de steun die ze hebben ontvangen van de Natural Science Foundation (Grant No. 23ZRYB03), Research and Innovation Team Project (TD-2022-04), de Clinical Medicine Science and Education Innovation Group en van Sichuan College of Traditional Chinese Medicine, evenals het onderzoeksproject van 2025 (25MSZX329) gefinancierd door de Sichuan Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2% Paraformaldehyde-2.5% glutaraldehyde oplossingMKBio,ChinaMM1515, Elektronenmicroscopie Scan
Anti-Caspase12AntibodyHangzhou Huaan Biotechnology Co., Ltd.HA500144Immunohistochemische assay
Anti-CHOP AntilichaamHangzhou Huaan Biotechnology Co., Ltd.ET1703-05Immunohistochemische assay
Anti-GRP78 AntilichaamHangzhou Huaan Biotechnology Co., Ltd.ER1706-50Immunohistochemische assay
BiomicroscopieMotic Industrial Group Co., Ltd.CHINABA210DigitalBiomicroscopie voor Pees-bot verbinding histologie Immunohistochemische assay
CD-Sprague-Dawley rattenBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.SCXK2021-0007 CD
Citraat buffer antigeen retrievaal oplossingZSGB-Bio,ChinaZLI-9065, Immunohistochemische assay
DAB  ZSGB-Bio,ChinaZLI-9018 Immunohistochemische assay
EDTASinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.10009717Hematoxyline-eosine kleuring 
Epox 812Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.XW00000020Elektronenmicroscopie Scan
Ethanol Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.10009218Hematoxyline-eosine kleuring 
GraphPad Prism 8 GraphPad Software, Inc. GraphPad Prism 8 Statistische analyse
H2O2 Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.011092708Immunohistochemische assay
Image-Pro Plus 6.0Media Cybernetics Co., Ltd. USAImage-Pro Plus 6.0Immunohistochemische assay
Paraformaldehyde Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.20230408Hematoxyline-eosine kleuring  Immunohistochemische assay
PBSZSGB-Bio,ChinaZLI-9062Elektronenmicroscopie Scan
Transmissie elektronenmicroscoopJAPAN ELECTRON OPTICS LABORATORY CO., LTDJEM-1400Flash, JapanElektronenmicroscopie Scan
Loopband voor Rat & MuisBioMed Easy Technologies Co., Ltd  CHINASA101Uitgevoerd uitputtend oefening op de loopband
xyleenSinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.10023418Hematoxyline-eosine kleuring 

Referenties

  1. Li, H. Y., Hua, Y. H. Achilles tendinopathy: Current concepts about the basic science and clinical treatments. Biomed Res Int. 2016, 6492597(2016).
  2. Tits, A., et al. Local anisotropy in mineralized fibrocartilage and subchondral bone beneath the tendon-bone interface. Sci Rep. 11 (1), 16534(2021).
  3. Doschak, M. R., Zernicke, R. F. Structure, function and adaptation of bone-tendon and bone-ligament complexes. J Musculoskelet Neuronal Interact. 5 (1), 35-40 (2025).
  4. Benjamin, M., et al. Where tendons and ligaments meet bone: attachment sites ('entheses') in relation to exercise and/or mechanical load. J Anat. 208 (4), 471-490 (2006).
  5. Warden, S. J. Animal models for the study of tendinopathy. Br J Sports Med. 41 (4), 232-240 (2007).
  6. Ozone, K., et al. Structural and pathological changes in the enthesis are influenced by the muscle contraction type during exercise. J Orthop Res. 40 (9), 2076-2088 (2022).
  7. Ozone, K., et al. Eccentric contraction-dominant exercise leads to molecular biological changes in enthesis and enthesopathy-like morphological changes. J Orthop Res. 41 (3), 511-523 (2023).
  8. da Silva, A. S. R., et al. Interleukin-6 modulates endoplasmic reticulum stress signaling and mitochondrial protein complexes in the kidney following acute exhaustive exercise. Cell Stress Chaperones. 30 (5), 100111(2025).
  9. Wang, Y., et al. Effect of one-time high load exercise on skeletal muscle injury in rats of different genders: oxidative stress and mitochondrial responses. Acta Cir Bras. 37 (8), e370805(2022).
  10. Świątkiewicz, M., et al. Increases in brain 1 H-MR glutamine and glutamate signals following acute exhaustive endurance exercise in the rat. Front Physiol. 8, 19(2017).
  11. Sun, Y., et al. Reconstruction of large chronic rotator cuff tear can benefit from the bone-tendon composite autograft to restore the native bone-tendon interface. J Orthop Translat. 24, 175-182 (2020).
  12. Gögele, C., Hahn, J., Schulze-Tanzil, G. anatomical tissue engineering of the anterior cruciate ligament entheses. Int J Mol Sci. 24 (11), 9745(2023).
  13. Sartori, J., et al. Three-dimensional imaging of the fibrous microstructure of Achilles tendon entheses in Mus musculus. J Anat. 233 (3), 370-380 (2018).
  14. Wang, L., et al. VEGF and BFGF expression and histological characteristics of the bone-tendon junction during acute injury healing. J Sports Sci Med. 13 (1), 15-21 (2014).
  15. Benjamin, M., Rufai, A., Ralphs, J. R. The mechanism of formation of bony spurs (enthesophytes) in the Achilles tendon. Arthritis Rheum. 43 (3), 576-583 (2000).
  16. Luo, J., et al. Animal model for tendinopathy. J Orthop Translat. 42, 43-56 (2023).
  17. Cook, J. L., et al. Revisiting the continuum model of tendon pathology: What is its merit in clinical practice and research. Br J Sports Med. 50 (19), 1187-1191 (2016).
  18. Yu, C., et al. Exercise effects on the biomechanical properties of the Achilles tendon: A narrative review. Biology (Basel). 11 (2), 172-184 (2022).
  19. Lu, H., et al. Treadmill running initiation times and bone-tendon interface repair in a murine rotator cuff repair model. J Orthop Res. 39 (9), 2017-2027 (2021).
  20. Schwarz, D. S., Blower, M. D. The endoplasmic reticulum: Structure, function and response to cellular signaling. Cell Mol Life Sci. 73 (1), 79-94 (2016).
  21. Oakes, S. A., Papa, F. R. The role of endoplasmic reticulum stress in human pathology. Annu Rev Pathol. 10, 173-194 (2015).
  22. Celik, C., Lee, S. Y. T., Yap, W. S., Thibault, G. Endoplasmic reticulum stress and lipids in health and diseases. Prog Lipid Res. 89, 101198(2023).
  23. Almanza, A., et al. Endoplasmic reticulum stress signaling - from basic mechanisms to clinical applications. FEBS J. 286 (2), 241-278 (2019).
  24. Huang, J., et al. Endoplasmic reticulum stress associates with the development of intervertebral disc degeneration. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1094394(2023).
  25. Murata, N., et al. Insulin reduces endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis by decreasing mitochondrial hyperpolarization and caspase-12 in INS-1 pancreatic β-cells. Physiol Rep. 12 (12), e16106(2024).
  26. Chen, Y., et al. Single-cell integration analysis of heterotopic ossification and fibrocartilage developmental lineage: Endoplasmic Reticulum Stress Effector Xbp1 transcriptionally regulates the notch signaling pathway to mediate fibrocartilage differentiation. Oxid Med Cell Longev. 2021, 7663366(2021).
  27. Yao, Z., et al. Hydroxycamptothecin inhibits peritendinous adhesion via the endoplasmic reticulum stress-dependent apoptosis. Front Pharmacol. 10, 967(2019).
  28. Yao, Z., et al. Hydroxycamptothecin prevents fibrotic pathways in fibroblasts in vitro. IUBMB Life. 71 (5), 653-662 (2019).
  29. Li, J., et al. Extracellular vesicles from hydroxycamptothecin primed umbilical cord stem cells enhance anti-adhesion potential for treatment of tendon injury. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 500(2020).
  30. Liu, Y. C., et al. Alda-1, an activator of ALDH2, ameliorates Achilles tendinopathy in cellular and mouse models. Biochem Pharmacol. 175, 113919(2020).
  31. Liu, C., et al. Tendon microstructural disruption promotes tendon-derived stem cells to express chondrogenic genes by activating endoplasmic reticulum stress. J Orthop Res. 41 (2), 290-299 (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Stress van het endoplasmatisch reticulumratmodelhematoxyline eosin kleuringelektronenmicroscopieimmunohistochemieultrastructuur van chondrocytenveranderingen in collageenvezels
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.