Shrinky-Dink Opknoping Drops: een eenvoudige manier om vorm en cultuur Embryoid Bodies

Samenvatting

We tonen een eenvoudige en snelle methode om vooraf gedefinieerde aantallen cellen te laden in microfabricated putten en te onderhouden voor embryoid lichaam ontwikkeling.

Samenvatting

Embryoid organen (EB) zijn aggregaten van embryonale stamcellen. De meest voorkomende manier van het creëren van deze aggregaten is de opknoping neerzetten, een moeizame aanpak van het pipetteren een willekeurig aantal cellen in well platen. De interacties tussen de stamcellen gedwongen in de nabijheid van elkaar bevordert de generatie van de EBS. Omdat de media in elk van de putten moet handmatig worden uitgewisseld elke dag, deze aanpak wordt met de hand intensief.

Bovendien, omdat de milieu-parameters zoals cel-cel, cel-oplosbare factor interacties, pH en beschikbaarheid van zuurstof kan worden functies van EB grootte, kan celpopulaties verkregen uit de traditionele opknoping daalt ook sterk variëren indien gekweekt onder identieke omstandigheden. Recente studies hebben inderdaad aangetoond dat het aanvankelijke aantal cellen die het aggregaat kan aanzienlijke gevolgen stamcellen differentiatie. We hebben een eenvoudige, snelle en schaalbare methode om cultuur vooraf gedefinieerde aantallen cellen te laden in microfabricated putten en te onderhouden voor embryoid lichaam ontwikkeling. Tot slot, deze cellen zijn gemakkelijk toegankelijk voor verdere analyse en experimenten. Deze methode is vatbaar voor een lab en vereist geen speciale apparatuur. Laten we zien deze methode door het creëren van embryoid lichamen met behulp van een rode fluorescerende muizen cellijn (129S6B6-F1).

Protocol

1. Het maken van Shrinky-Dink Mold

1. Druk het gewenste patroon op Shrinky-dink vel met behulp van een goede definitie printer.
2. Bak Shrinky-dink vel bij 163 ° C gedurende ongeveer 10 minuten, of totdat ze volledig zijn gekrompen en de verwerving van een regelmatige vorm.
3. Na Shrinky-dink mal is afgekoeld, ondergedompeld in een bad met isopropanol totdat het gehele oppervlak is nauwelijks bedekt.
4. Zorgvuldig, spuit wat aceton op de mal en schud de verpakking een paar keer. Voeg meer isopropanol uit te spoelen aceton eigen risico en deze stap enkele keren herhalen totdat Shrinky-mould ziet er schoon.
5. Dompel schimmel in gedestilleerd water gedurende 10 minuten te wassen alle resterende organische oplosmiddelen.
6. Lucht schoon Shrinky-mal. Het opnieuw vuur ongeveer 5 minuten op 163 ° C. Dit zal compacte inkt en verdampen van de resterende oplosmiddel.

2. Het maken van PDMS microwells

1. Maak een 10:01 PDMS / verharder mengsel, en schud krachtig gedurende enkele minuten.
2. Plaats Shrinky-Dink schimmel in een petrischaaltje. Giet PDMS mengsel tot hij ongeveer 1 / 2 cm boven de mal oppervlak.
3. Plaats schaaltje onder vacuüm bel om alle bubbels te elimineren uit PDMS mengsel.
4. Plaats schotel in de oven op 70 ° C, 's nachts.
5. Afgesneden solide PDMS van schimmel en bind het aan een glasplaatje alleen door druk uit te oefenen.
6. Gooi eerste microwell-chip, want het heeft inktresten ingelegd tussen PDMS.
7. Herhaal deze procedure om een ​​tweede chip die is inkt-vrij en heeft een meer gedefinieerde vorm te produceren.
8. Schone microwell-chip met behulp van 70% ethanol oplossing. Plaats het onder UV-licht bron gedurende 10 minuten om het te steriliseren.

3. Trapping cellen in microwells

1. Tellen cellen en verdun ze in cultuur media tot de gewenste concentratie (afhankelijk van het aantal cellen in de eerste bronnen u wilt). Bijvoorbeeld, om circa 10-15 cellen per well (gemiddelde = 11, SD = 5,4, densiteit = 93%) te krijgen, gebruikten we een concentratie van 8 × 10 ⁴ cellen / ml. Voor een concentratie van 17 × 10 ⁴ cellen / ml, kunnen we betrouwbaar te krijgen tussen de 25 en 35 cellen per well (gemiddelde = 27,17857 SD = 7,7, densiteit = 100%).
2. Plaats voorzichtig microwell chip in een centrifugebuis van 50 ml bevat een gestolde PDMS basis.
3. Voeg ongeveer 2JDP ml van de cel oplossing.
4. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 760 rpm en 4 ° C.
5. Pipet uit overtollige oplossing en zorgvuldig microwell wassen met PBS 1X oplossing.
6. Plaats microwell in een kleine Petry schotel, en let tijdens het gebruik van de chip uit de centrifugebuis.
7. Was de cel overschot met behulp van een X PBS-oplossing.
8. Plaats microwell chip onder een omgekeerde microscoop om beoogde aantal cellen per putje te controleren.
9. Incubeer microwell met cellen in normale omstandigheden.
   
   

4. Cel incubatie

1. Volg de normale EB-protocol in het lab.
2. Verander het medium langzaam van de kant van de kamer, niet te storen de cel in de microwell.

Discussie

We hebben een eenvoudige, snelle en schaalbare methode om cultuur vooraf gedefinieerde aantallen cellen te laden in microfabricated putten (gevormd uit Shrinky-Dinks) en te onderhouden voor embryoid lichaam ontwikkeling. Tot slot, deze cellen zijn gemakkelijk toegankelijk voor verdere analyse en experimenten. Deze methode is vatbaar voor een lab en vereist geen speciale apparatuur, omdat wij overbodig fotolithografie. We kunnen variëren van de grootte van de microwells evenals de concentratie van cellen / putten om het aantal en de grootte ...

Materialen

Voor de Mesc media (McCloskey lab protocol): (voor geprepareerde media totaal: 50 ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: 0,5 ml; 1 ml 2 mM L-glutamine: 0,5 ml, 1 ml NEAA: 0,5 ml; 1 ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul Verwaterde BME:. 50ul; 100ul (Voeg 35ul van steriel gefiltreerd BMT aan 5 ml PBS en spuitfilter steriliseren Gooi na 2 weken. uiteindelijke concentratie in de oplossing is 0,1 mM)