Methodenartikel

Een neonataal muismodel van necrotiserende enterocolitis en lamina propria-isolatie voor profilering van immuuncellen

DOI:

10.3791/69233

⸱

19 september 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Division of Pediatric Gastroenterology, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol schetst een neonataal muismodel van necrotiserende enterocolitis (NEC) en daaropvolgende isolatie van lamina propria-immuuncellen uit de neonatale muizendunne darm.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Necrotiserende enterocolitis (NEC) is een ernstige ontstekingsziekte van de neonatale darm, die vooral te vroeg geboren baby's treft. NEC wordt gekenmerkt door epitheelletsel, microbiële dysbiose en een ontregelde immuunrespons, vaak resulterend in darmnecrose en systemische ontsteking. Experimentele muismodellen die de belangrijkste aspecten van ziekten bij de mens samenvatten, zijn essentieel geweest bij het vergroten van ons begrip van de mechanismen die ziekte veroorzaken en de therapeutische ontwikkeling informeren. Dit protocol beschrijft een gerenommeerd neonataal muismodel van necrotiserende enterocolitis (NEC) met behulp van flesvoeding, intermitterende hypoxie, orale toediening van lipopolysaccharide (LPS) en darmbacteriën gekweekt van een baby met NEC. Deze combinatie induceert op betrouwbare wijze histologische, transcriptionele en immunologische kenmerken die consistent zijn met NEC bij menselijke zuigelingen en is fundamenteel geweest voor meerdere belangrijke ontdekkingen in het veld. Bovendien beschrijft dit protocol de isolatie van immuuncellen uit de dunne darmlamina propria van neonatale muizen. Lamina propria celisolatie maakt gedetailleerde profilering van immuuncellen mogelijk via flowcytometrie, waardoor de analyse van zowel aangeboren als adaptieve celpopulaties in de darm wordt vergemakkelijkt.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Necrotiserende enterocolitis (NEC) is een ernstige ontstekingsziekte van de darm die bijna uitsluitend premature pasgeborenen treft. Ongeveer 7%-8% van de baby's met een zeer laag geboortegewicht (<1500 g) zal worden getroffen door NEC, en de sterftecijfers die verband houden met de ziekte kunnen 50% naderen bij pasgeborenen die chirurgische ingreep nodig hebben1. De pathogenese van NEC blijft onvolledig begrepen; het huidige bewijs suggereert echter dat NEC voortkomt uit de samenloop van meerdere factoren, waaronder een onrijpe darmbarrière, ontregelde immuunsignalering en een dysbiotisch microbioom 2,3,4. De convergentie van deze factoren kan ontstekingsreacties in de darm initiëren en verergeren, met name door de activering van toll-like receptor 4 (TLR4), wat resulteert in epitheelschade en verschillende soorten celdood, waaronder apoptose en necrose 5,6. Het doel van dit protocol is om een reproduceerbaar en fysiologisch relevant muismodel van NEC te presenteren dat de darmontsteking en pneumatose intestinalis (gas in de darmwand) recapituleert die zijn waargenomen bij menselijke pasgeborenen, waardoor mechanistisch onderzoek naar de pathogenese van de ziekte mogelijk wordt. Bovendien beschrijft dit protocol de isolatie van immuuncellen uit de dunne darmlamina propria van neonatale muizen, waardoor onderzoekers immuuncelprofilering kunnen uitvoeren via flowcytometrie.

Vergeleken met grotere diermodellen, zoals neonatale ratten of biggen 7,8, bieden neonatale muismodellen verschillende duidelijke voordelen, waaronder lagere kosten, betere toegang tot transgene dieren en de mogelijkheid om experimenten uit te voeren op grotere cohorten. Muizen NEC-modellen maken voornamelijk gebruik van een combinatie van flesvoeding, koudestress en hypoxie om de complexe pathofysiologie van NEC te simuleren die wordt waargenomen bij menselijke patiënten 7,8,9. Veel muizenmodellen van NEC worden echter beperkt door hun afhankelijkheid van brede microbiële stressoren of kunstmatige veranderingen van de microbiota, wat hun klinische relevantie in gevaar kan brengen. Daarentegen overwint het model dat in dit protocol wordt beschreven deze beperkingen door verschillende sleutelfactoren te integreren die betrokken zijn bij de pathogenese van NEC bij menselijke zuigelingen10,11. Concreet combineert dit model hypoxische stress, die betrokken is bij het verstoren van de integriteit van de darmbarrière 3,12, met orale toediening van zuigelingenvoeding aangevuld met lipopolysaccharide (LPS), een goed gekarakteriseerd TLR4-ligand dat darmontsteking induceert, evenals klinisch relevant dysbiotisch microbioom met darmbacteriën gekweekt van een patiënt met NEC totalis, de meest ernstige vorm van de ziekte, gekenmerkt door pannecrose van de darm10,13. Door deze klinisch relevante en ziektespecifieke stressoren te integreren, weerspiegelt ons model nauwkeurig de klinische en moleculaire kenmerken van NEC. Om onderzoekers een kader te bieden om de immuungemedieerde mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathogenese van NEC te ondervragen, schetst dit protocol bovendien de isolatie van lamina propria-cellen uit de neonatale dunne darm van muizen voor flowcytometrie-analyse. Als de belangrijkste plaats van immuunactiviteit van het darmslijmvlies bevat de lamina propria een dynamisch repertoire van residente en infiltrerende immuuncellen die een centrale rol spelen bij NEC-geassocieerde ontsteking14. Flowcytometrie biedt een robuust en schaalbaar platform voor het karakteriseren van deze immuuncelpopulaties met hoge resolutie, waardoor gedetailleerde analyse van cellulaire fenotypes, kwantificering van immuunresponsen en identificatie van immunologische handtekeningen die betrokken zijn bij de pathogenese van NECmogelijk is 15.

Het muizen NEC-model dat in dit protocol wordt beschreven, vormt een aanvulling op in vitro-modellen door de studie van gastheer-microbioominteracties, immuunresponsen en ontstekingssignalering binnen de complexe omgeving van de neonatale darm mogelijk te maken. Het reproduceert belangrijke aspecten van de pathogenese van NEC die niet in vitro kunnen worden gemodelleerd, waardoor het een waardevol hulpmiddel is voor het ophelderen van ziektemechanismen en het beoordelen van therapeutische strategieën. Hoewel soortspecifieke verschillen een beperking blijven, biedt dit model een robuust en toegankelijk platform om ons begrip van NEC te vergroten en de ontwikkeling van gerichte interventies te versnellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle methoden werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische richtlijnen van de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van North Carolina aan de Chapel Hill School of Medicine. Muizen werden gefokt, onderhouden en gehuisvest volgens de procedures beschreven in de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren onder een studievoorstel dat is goedgekeurd door de IACUC (protocol nr. 24-114) van de Universiteit van North Carolina aan de Chapel Hill School of Medicine. C57BL/6J-muizen werden gebruikt voor alle experimenten die in deze studie worden beschreven. Pups werden gestart in het model op postnatale dag 4, met een gewicht tussen 1,8-2,3 g; Dieren buiten dit gewichtsbereik werden uitgesloten. De experimentele cohorten hadden een evenwichtige geslachtsverdeling, waarbij mannetjes en vrouwtjes elk ongeveer 50% van de behandelde dieren uitmaakten. De gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Muizen NEC-model

OPMERKING: Enterische bacteriële voorraad wordt geproduceerd door de enterische inhoud te verkrijgen van een baby met de meest ernstige vorm van NEC, NEC totalis13,16. De enterische inhoud wordt 's nachts gekweekt bij 1 x g gedurende 16 uur bij 37 °C, gecentrifugeerd bij 3000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en opnieuw gesuspendeerd in 50% glycerol. 20 μL aliquots worden in cryovials gepipetteerd en opgeslagen bij -80 °C voor langdurige opslag. De geselecteerde kweektijden in dit protocol zijn gekozen voor de efficiëntie van de workflow. Deze tijdstippen kunnen naar behoefte worden aangepast aan individuele laboratoriumschema's zonder dat dit gevolgen heeft voor het algehele model. Bovendien is dit protocol geoptimaliseerd voor een maximale capaciteit van 40 muizen, maar kan het naar behoefte worden opgeschaald.

  1. Bereiding van bacteriecultuur
    1. Voeg op experimentele dag 0 om 15:00 uur een aliquot van 20 μl darmbacteriën gekweekt van een zuigeling met NEC totalis toe aan een kweekbuis van 15 ml met 2 ml Luria-Bertani (LB) bouillon. Incubeer de bacteriecultuur met het buisdeksel in de geventileerde positie in een orbitale schudder bij 37°C, 1 x g, een nacht gedurende 16 uur, en incubeer een kweekbuis die slechts 2 ml LB-bouillon bevat, gelijktijdig als controle om te beoordelen op eventuele LB-besmetting.
      1. Bevestig de nachtelijke cultuur visueel door de troebelheid tussen de bacteriecultuur en de duidelijke controle met alleen LB te vergelijken; Ga alleen verder als de bacteriecultuur troebel lijkt en de controle vrij blijft.
    2. Op experimentele dag 1, om 07.00 uur, wordt 125 μl van de geënte nachtcultuur in een T75-celkweekkolf met een geventileerd deksel met 25 ml LB-bouillon aangebracht. Bereid in totaal vier T75-kolven voor en broed ze rechtop in een orbitale schudder bij 37°C, 1 x g, gedurende 2 uur om de bacteriecultuur uit te breiden.
      OPMERKING: Overnachtculturen worden bereid op experimentele dagen 0, 1 en 2 van het NEC-model.
  2. Pups indelen in experimentele groepen
    1. Op experimentele dag 1 om 07:00 uur postnatale dag 4 pups wegen.
      OPMERKING: Het optimale gewichtsbereik ligt tussen 1,8-2,3 g en uitschieters moeten uit het experiment worden verwijderd.
    2. Groepeer de experimentele muizen in cohorten die flesvoeding en dammen krijgen en bereken het gemiddelde gewicht van de muizen die flesvoeding krijgen. Scheid de aangewezen kunstvoeding gevoede muizen van het moederdier en plaats ze in een nieuwe kooi in een couveuse voor zuigelingen die is voorverwarmd tot 37 °C. Houd de met de dam gevoede pups in de originele kooi met de moeder.
      OPMERKING: Neonatale muizen zijn bijzonder gevoelig voor veranderingen in de omgevingstemperatuur. Om een consistente temperatuurregeling te behouden na scheiding van het moederdier, worden flesvoeding gevoede jongen gehouden in een temperatuurgecontroleerde couveuse voor baby's die is ingesteld op 37 °C. Deze aanpak is in overeenstemming met gevestigde NEC-protocollen die de fysiologische temperatuur behouden zonder het gebruik van aanvullende thermische interventies 11,17,18,19.
    3. Herhaal dit op experimentele dag 2 en 3, weeg de muizen die flesvoeding krijgen en bereken dagelijks het gemiddelde gewicht vóór het voedertijdstip van 07:00 uur.
  3. Het meten van optische dichtheid (OD) van bacteriecultuur
    1. Verwijder na 2 uur incubatie bij 37 °C en 1 x g de vier T75-kolven met geëxpandeerde cultuur uit de orbitale schudder op de experimentele dagen 1, 2 en 3. Combineer de inhoud van de vier T75-kolven, meng goed en pipetteer 1 ml van de bacteriecultuur in een cuvet.
      1. Bereid een blanco oplossing door 1 ml steriele LB-bouillon toe te voegen aan een cuvet. Meet de optische dichtheid van de bacteriecultuur bij 600 nm (OD600 nm) met een spectrofotometer.
        OPMERKING: De beoogde OD600nm is 0,6 ± 0,02. Als de OD600nm van de bacteriecultuur onder de streefwaarde ligt, ga dan door met incuberen zoals beschreven in stap 1.3.1. totdat de beoogde OD600nm van 0,6 ± 0,02 is bereikt. Als de OD600nm hoger is dan 0,6, verdun dan de bacteriecultuur met steriele LB-bouillon.
    2. Breng 80 ml van de bacteriecultuur over in twee centrifugebuisjes van 50 ml en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 3000 x g bij 4 °C. Bevestig een succesvolle kweek door te controleren of er een zichtbare korrel op de bodem van elke buis zit.
  4. Formule voorbereiding
    1. Begin met de bereiding van de formule om 09:00 uur op experimentele dag 1, 2 en 3. Combineer 16 ml zuigelingenvoeding en 8 ml puppymelk in een verhouding van 2:1 in een steriele centrifugebuis van 50 ml.
    2. Verwijder het bovenstaande uit de twee centrifugebuisjes van 50 ml die de gepelleteerde bacteriecultuur bevatten (stap 1.3.2).
    3. Resuspendeer elk van de twee pellets grondig in 2 ml van de formulemix en breng de resuspensie over naar de formulemix om 24 ml van de NEC-formule te maken.
      OPMERKING: De uiteindelijke bacterieconcentratie in de NEC-formule moet tussen 4 en 5 x 109 CFU/ml liggen.
    4. Etiketteer zes centrifugebuisjes van 50 ml voor elk van de zes voertijdstippen (10:00, 13:00, 16:00, 19:00, 22:00, 07:00).
    5. Pipetteer 4 ml van de NEC-formule in elke gelabelde buis.
    6. Bereid zes aliquots voor eenmalig gebruik van LPS (5 mg/ml) bouillon en bewaar ze in microbuisjes met een lage binding bij -20°C. Voeg LPS (zie OPMERKING voor concentratie) toe aan de NEC-formule onmiddellijk voor het voeren op elk tijdstip.
      OPMERKING: De hoeveelheid LPS die aan de NEC-formule wordt toegevoegd, is gebaseerd op het gemiddelde lichaamsgewicht van de flesvoeding pups, berekend om 07:00 uur per dag, met een dosering van 5 μg LPS per gram van het lichaamsgewicht van de pups. De uiteindelijke LPS-concentratie varieert met het lichaamsgewicht. Bijvoorbeeld, met een voedingsvolume van 80 μL en een gemiddeld cohortgewicht van de jongen van 2 gram, zou de LPS-concentratie in de formule 0,125 mg/ml zijn.
  5. Voederen
    OPMERKING: Op experimentele dag 1 worden muizen die in het NEC-model worden geplaatst, 3 uur nuchter na scheiding van hun moeder. De eerste NEC-flesvoeding is om 10:00 uur en gaat elke 3 uur door tot 22:00 uur. Op experimentele dag 2 en 3 worden de muizen gevoerd om 07:00, 10:00, 13:00, 16:00, 19:00 en 22:00 uur. Muizen worden niet gevoerd op experimentele dag 4.
    1. Onmiddellijk voorafgaand aan het voeren van muizen, dooi en vortex één aliquot LPS gedurende 15 s. Voeg de juiste hoeveelheid LPS op basis van het gemiddelde gewicht van de muizen toe aan de 4 ml bereide tube NEC-formule (zie stap 1.4.6 voor de berekening) en meng grondig door te pipetteren.
    2. Vul een spuit van 1 ml met NEC-formule en bevestig een neonatale perifeer ingebrachte centrale katheter (PICC). Zorg ervoor dat er geen luchtbellen of lucht in de spuit of de PICC-lijn zitten.
    3. Dien de NEC-formule toe aan de pups via een maagsonde met de PICC-lijn.
      1. Houd elke pup voorzichtig in bedwang bij de losse huid aan de basis van zijn nek en houd de muis rechtop. Leid met een tang het distale uiteinde van de PICC-lijn in de orofarynx en de slokdarm, waarbij u de punt van de PICC-lijn in de maag plaatst.
        OPMERKING: De inbrengafstand van de PICC-lijn is gelijk aan de afstand van de mondhoek tot de bovenkant van de melkvlek in de maag. Het optimale invoegpunt moet dan duidelijk op de PICC-lijn worden gemarkeerd met behulp van een permanente marker.
      2. Als er aanzienlijke weerstand wordt gevoeld tijdens het inbrengen van de PICC-lijn, verwijdert u de PICC-lijn, verplaatst u deze en probeert u deze voorzichtig opnieuw in te brengen.
      3. Breng 8 μL NEC-formule langzaam aan in de maag en controleer de pup tijdens het voeren nauwlettend op tekenen van aspiratie. Let op het verschijnen van een witte melkvlek om een succesvolle maagbevalling te bevestigen.
      4. Verwijder de PICC-lijn. Observeer de pup op moeizame ademhaling of braken. Als de pup formule uitbraakt, dep dan de mond en neus af met een pluisarm laboratoriumdoekje.
    4. Herhaal dit proces op elk voedertijdstip.
    5. Stel de pups tweemaal daags bloot aan hypoxie gedurende 10 minuten onmiddellijk na de voedertijden van 13:00 en 19:00 uur.
      1. Plaats de pups na twee voedingen per dag in een hypoxiekamer die is aangesloten op een gastank met 95% stikstof en 5% zuurstof. Open de tankklep en bewaak het zuurstofgehalte in de afgesloten hypoxiekamer met behulp van een draagbare monitor. Zodra de hypoxiekamer 5%± 0,5% zuurstof bereikt, houdt u de pups gedurende 10 minuten op dit zuurstofniveau.
        OPMERKING: Het debiet moet worden geoptimaliseerd om te dalen van 20% naar 5% zuurstof met een constante, gecontroleerde snelheid gedurende een periode van 2 minuten.
    6. Let op de muizenpups tussen de voedingen door op tekenen van ademnood, bleke verkleuring of apneu. Als deze tekenen aanwezig zijn, verwijder dan de aangetaste pup uit de hypoxiekamer, let zorgvuldig op herstel en euthanaseer de pups indien nodig in overeenstemming met het IACUC-beleid.
    7. Ga door met orale maagvoeding en blootstelling aan hypoxie op geplande tijdstippen gedurende de volledige duur van 72 uur van het NEC-model.
      OPMERKING: Als experimentele dag 1 maandag om 10:00 uur begint, vindt het 72-uurs eindpunt op donderdag om 10:00 uur plaats. Dit wordt aangeduid als dag 4 van het model. Muizen worden niet gevoed om 07:00 uur op dag 4 van het model en worden geëuthanaseerd op dit laatste tijdstip van 10:00 uur voor weefselverzameling.
  6. Dieren euthanaseren en weefsel verzamelen
    1. Op de ochtend van dag 4 van het model, weeg en registreer het geslacht van elke pup en euthanaseer vervolgens in overeenstemming met de IACUC-richtlijnen.
    2. Verzamel na euthanasie bloed van elke pup in een serumseparatorbuisje met een stolselactivator en gel.
    3. Centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C om het serum te scheiden. Pipetteer het serum in gelabelde buisjes van 1,7 ml en bewaar bij -80 °C.
    4. Maak een incisie van 1-2 cm in de middellijn door de buikwand en het buikvlies om het maagdarmkanaal bloot te leggen. Inspecteer de blootgestelde darm op kenmerkende kenmerken van NEC, waaronder uitzetting, erytheem, gasophoping in de darmwand (pneumatosis intestinalis) en zichtbare luchtbellen.
    5. Identificeer en verwijder de twaalfvingerige darm door het distale rectum. Leg de tissue in een petrischaaltje op ijs. Gebruik ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om de darm te spoelen.
    6. Identificeer de blindedarm en snijd proximaal door om de blindedarm en de dikke darm van de dunne darm te scheiden. Snijd stukken af, beginnend bij het distale ileum en werkend naar het jejunum toe. Plaats een stuk van 1 cm in een buisje met RNA-lysisbuffer en 1,5 mm zirkoniumoxidekorrels op ijs voor transcriptieanalyse.
      1. Spoel een stuk van 1,5 cm met een injectiespuit met PBS die is bevestigd aan een naald van 24 g met stomp uiteinde en plaats deze vervolgens in een microcentrifugebuisje met 1 ml 4% paraformaldehyde (PFA). Vries een stuk darm van 1 cm in en bewaar het bij -80 °C voor eiwitanalyse. Vries een stuk darm van 1 cm in en bewaar het bij -80 °C voor eventuele extra testen.
    7. Verwerk weefsel dat is verzameld in RNA-lysisbuffer in een kralenklopper (5,50 m/s, 1,0 min., cyclus = 1,0, pauzeverblijf: 10 s, 4 °C) om het weefsel te homogeniseren en vervolgens op te slaan bij -80 °C.
  7. Weefsel fixatie
    1. Plaats de stukjes weefsel die zijn verzameld in 4% PFA op een tuimelschakelaar bij 4 °C om gedurende 24 uur te fixeren. Verwijder na 24 uur 4% PFA uit elke tube en vervang deze door 1 ml PBS om de tissue te wassen. Plaats de buizen terug in de tuimelschakelaar bij 4 °C gedurende 15 min. Herhaal de PBS-wasbeurt één keer.
      1. Verwijder de PBS en voeg 1 ml 50% ethanol toe aan elke buis en plaats de buizen terug in de tuimelschakelaar bij 4 °C gedurende 15 minuten. Verwijder de 50% ethanol en voeg 1 ml 70% ethanol toe, en bewaar bij 4 °C totdat weefsel kan worden verwerkt tot paraffinehistologieblokken.
        OPMERKING: Indien nodig kunnen extra darmsegmenten of ontlastingsmonsters worden verzameld voor verdere analyse.

2. Lamina propria isolatie van immuuncellen

OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor de isolatie van lamina propria-cellen van neonatale muizen op een leeftijd van ongeveer een week. Als er referentiemonsters nodig zijn voor spectrale flowcytometrie, kunnen gespeende jongen (postnatale week 3-4) worden gebruikt. Verdubbel voor speenmonsters alle reagensvolumes die in het protocol zijn gespecificeerd.

  1. Reagentia voorbereiden
    1. Bereid 1x Hank's uitgebalanceerde zoutoplossing zonder Ca2+ en Mg2+ (HBSS W/O) met 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) en bewaar bij kamertemperatuur.
    2. Bereid een buffer voor fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) voor door 5% boviene serumalbumine (BSA) op te lossen in PBS + 5 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) en bewaar bij 4 °C.
    3. De dag voordat u lamina propria-celisolatie uitvoert, bereidt u een oplossing voor de spijsvertering door 5 mM EDTA, 5% foetaal runderserum (FBS) en 1 mM dithiothreitol (DTT) toe te voegen aan HBSS W/O.
    4. Bereid de digestieoplossing onmiddellijk voor het uitvoeren van lamina propria-celisolatie door Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) aan te vullen met 10% FBS en mg/ml collagenase IV.
      OPMERKING: HBSS W/O kan van tevoren worden bereid en bij kamertemperatuur worden bewaard. De FACS-buffer moet van tevoren worden voorbereid en bij 4 °C worden bewaard. Voorvergisting en verteringsoplossingen moeten vers worden bereid onmiddellijk vóór het uitvoeren van lamina propria-isolatie en op ijs worden bewaard.
  2. Darmweefsel verzamelen en voorbereiden voor de spijsvertering
    1. Zoek de blindedarm en transecteer proximaal om de blindedarm en de dikke darm te verwijderen. Snijd 2-3 cm distale dunne darm (ileum) weg en leg deze op ijskoude HBSS W/O in een petrischaaltje (hervat vanaf stap 1.6.5).
    2. Gebruik een naald van 24 G met stomp uiteinde die aan een spuit is bevestigd, spoel het darmlumen volledig met ijskoude HBSS W/O terwijl het weefsel met een tang wordt gestabiliseerd. Controleer visueel of het darmlumen na het spoelen vrij is van ontlasting.
    3. Verwijder voorzichtig het resterende bindweefsel uit het darmsegment met een fijne tang of schaar.
    4. Snijd de darm in de lengterichting om te openen en snijd vervolgens dwars in segmenten van 1-1. cm.
  3. Lamina propria dissociatie
    1. Breng de darmsegmenten over in een centrifugebuis van 1 ml met 1 ml voorvergistingsoplossing die op ijs is afgekoeld.
    2. Incubeer het monster gedurende 20 minuten bij 37 °C met continue rotatie om de weefseldissociatie te vergemakkelijken.
    3. Draai de buis voorzichtig rond en giet de inhoud vervolgens door een celzeef van 10 μm die over een centrifugebuis van 5 ml is geplaatst.
      OPMERKING: Het filtraat dat via de 10 μm-zeef wordt verzameld, bevat intra-epitheliale lymfocyten (IEL's) en kan desgewenst worden gebruikt voor stroomafwaartse analyse.
    4. Breng weefselfragmenten over in een nieuwe centrifugebuis van 15 ml met 10 ml voorverwarmde tot 37 °C vergistingsoplossing. Incubeer het monster vervolgens gedurende 40 minuten bij 37 °C met continue rotatie.
    5. Breng het volledige monster over in een geautomatiseerde weefseldissociatiebuis en voer het dissociatieprogramma uit dat bestaat uit vier rotatiecycli van elk 15 s, afwisselend met de klok mee en tegen de klok in.
      OPMERKING: Een alternatief voor een geautomatiseerde weefseldissociator is het handmatig slijpen van het darmweefsel met behulp van de matte uiteinden van twee microscoopglaasjes. Als u deze methode gebruikt, oefen dan zachte, gelijkmatige druk uit om overmatige mechanische belasting te voorkomen, omdat dit de levensvatbaarheid van de cellen aanzienlijk kan verminderen.
    6. Draai de celsuspensie voorzichtig voort en centrifugeer de monsters vervolgens in de weefseldissociatiebuis bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    7. Zuig het bovenstaande voorzichtig op zonder de pellet te verstoren en suspendeer de cellen vervolgens in ml ijskoude FACS-buffer.
    8. Plaats een celzeef van 10 μm op een centrifugebuis van 5 ml. Breng de geresuspendeerde celsuspensie door het filter en was het filter vervolgens met een extra ml ijskoude FACS-buffer.
    9. Tel cellen en beoordeel de levensvatbaarheid met behulp van trypanblauw of een kleurstof voor de levensvatbaarheid. Centrifugeer het volume dat nodig is voor flowcytometrie bij 30 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gebruik cellen onmiddellijk voor downstreamtoepassingen om de levensvatbaarheid en markeringsexpressie te behouden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het neonatale muizenmodel van NEC dat in dit protocol wordt beschreven, repliceert de belangrijkste kenmerken van de ziekte. Kaplan-Meier-overlevingsanalyse (Figuur 1A) toonde een significante vermindering van de overleving in de NEC-behandelingsgroep in vergelijking met de door de dam gevoede controles (9/21 vs. 8/8; p = 0,0063). Grove inspectie van de darmen van de muizen die aan het model werden onderworpen (Figuur 1B

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol integreert een fysiologisch relevant neonataal muizenmodel van NEC met lamina propria immuuncelisolatie, en biedt een uitgebreid platform om mucosale immuunresponsen tijdens darmontsteking te onderzoeken. Door klinisch relevante blootstellingen te combineren, zoals enterisch microbioom van menselijke NEC-gevallen, hypoxische stress en flesvoeding, recapituleert dit model de complexe en multifactoriële pathogenese die wordt waargenomen bij ziekten bij de mens

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflict met betrekking tot dit manuscript.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit manuscript werd ondersteund door R01DK124614, R01HD105301, DP1DK140012, de Chan Zuckerberg Initiative Grant nummer 2022-316749, de Yang Biomedical Scholar Award en de University of North Carolina in Chapel Hill Department of Pediatrics.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 mL Syringe-Tuberculin Slip TipBecton Dickinson309659Spuit voor flesvoeding
1.5 mL semi-micro Disposable CuvettesBRAND GMBH + CO KG759085D
1.7 ml Microtubes ClearAxygen - Corning Inc.MCT-175-CNonpryogenic & Rnase-/Dnase-vrij
5% Oxygen, Balance Nitrogen Certified Reference Material, Size 200 High Pressure Steel Cylinger, CGA 580AirgasX02NI95C2003186
Anti-Mo CD16/CD32 Purified Clone: 93eBioscience Inc. 14-0161-85
Anti-Mouse CD16/CD32 Purified Clone: 93eBioscience Inc. 14-0161-86
APC anti-mouse Ly-6C Clone: HK1.4 Isotype: Rat IgGcBioLegend128015
autoMACS Rinsing SolutionMiltenyi Biotec130-091-222
BB515 Rat Anti-CD11b Clone: M1/70BD Biosciences564455
BB700 Rat Anti-Mouse CD4 Clone: RM4-5BD Biosciences566408
BD Microtainer SSTBecton Dickinson365867Serumbuis
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p1200Fisher Scientific12-111-365
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p20Fisher Scientific12-111-366
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p200Fisher Scientific12-111-362
Brilliant Stain BufferBD Biosciences563795
BUV615 Rat Anti-Mouse Ly-6G Clone: 1A8BD Biosciences751263
BV650 Rat Anti-Mouse I-A/I-E Clone: M5/114.15.2BD Biosciences563415
C57BL/6J Neonatal MiceThe Jackson Laboratory000664
CD45-VioGreen mouseMiltenyi Biotec 130-102-412
CD64 Antibody, anti-mouse, PE-Vio 770, REAfinity Clone REA286Miltenyi Biotec 130-119-659
CFX Opus Real-Time PC Systems Bio-Rad12011319
Collagenase Type 4Worthington Biochemical Corporation LS004188
DL-dithiothreitol SigmaD9779-5g
eBioscience FOXP3/Transcription Factor Staining Buffer SetLife Technologies Corp. 00-5523-00
EDTA (0.5M), pH 8.0Quality Biological Inc351-027-721
Esbilac Puppy Milk ReplacerPet-Ag, Inc.99502-1Puppy Milk
Fisherbrand Disposable CuvettesFisher Scientific14-955-127
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 10mLFisher Scientific13-678-11E
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 25mLFisher Scientific13-678-11
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 50mLFisher Scientific13-678-11F
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 5mLFisher Scientific13-678-11D
Genie Temp-Shaker 300USA Scientific, Inc.SI-G1600
gentleMACS Dissociator (protocol; m_intestine-01)Miltenyi Biotec 130-093-235
gentleMACS  C TubesMiltenyi Biotec 130096334
Ghost Dye Red 780 Viability DyeTonbo Biosciences13-0865-T100
Glycerol ReagentPlusSigma-AldrichG7757-500ML
GraphPad Prims Software, Version 10.0GraphPadN/A
Greiner Bio-One Round Bottom Polypropylene Culture Tube with Two-Position Vent StopperFisher Scientific07-000-212
Handi+ Oxygen analyzerMaxtecN/A
Hanks' Balanced Salt SolutionGibco141650-095
HEPES BufferMediatech, Inc. 25-060-CI
Hypoxia ChamberBillups-Rothenburg, Inc.N/A
ImageJSchneider et al., 2012N/A
Integra Miltex MeisterHand Iris Scissors, 10.2cmFisher Scientific12-460-655
Integra Miltex MeisterHand Iris Scissors, 9cmFisher Scientific12-460-598
Integra Miltex™ Swiss Jeweler-Style ForcepsFisher Scientific12-460-110
Isolette Infant IncubatorAir-Shields VickersC100-200-2 Series 02Incubator voor muizen
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task WipesKimberly-Clark34120
LPSSigma-AldrichL3129-10mg
Luria Broth Broth, Miller Molecular Genetics PowderFisher ScientificBP1426-500
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec 130-091-376
MACSmix Tube RotatorMiltenyi Biotec 130-090-753
Microcentrifuge TubesThermo Scientific34511.5 ml, clear, graduated, sterile
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermoFisher ScientificND-ONEC-W
Ohaus scout portable balanceFisher Scientific30253024
Paraformaldehyde

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. Global incidence of necrotizing enterocolitis: A systematic review and meta-analysis. BMC Pediatr. 20 (1), 344(2020).
  2. Warner, B. B., Tarr, P. I. Necrotizing enterocolitis and preterm infant gut bacteria. Semin Fetal Neonatal Med. 21 (6), 394-399 (2016).
  3. Rose, A. T., Patel, R. M. A critical analysis of risk factors for necrotizing enterocolitis. Semin Fetal Neonatal Med. 23 (6), 374-379 (2018).
  4. Tanner, S. M., et al. Pathogenesis of necrotizing enterocolitis: Modeling the innate immune response. Am J Pathol. 185 (1), 4-16 (2015).
  5. Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair1. J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).
  6. Hackam, D. J., Sodhi, C. P. Toll-like receptor-mediated intestinal inflammatory imbalance in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 6 (2), 229-238.e1 (2018).
  7. Sulistyo, A., Rahman, A., Biouss, G., Antounians, L., Zani, A. Animal models of necrotizing enterocolitis: Review of the literature and state of the art. Innov Surg Sci. 3 (2), 87-92 (2018).
  8. Lopez, C. M., et al. Models of necrotizing enterocolitis. Semin Perinatol. 47 (1), 151695(2023).
  9. Jilling, T., et al. The roles of bacteria and TLR4 in rat and murine models of necrotizing enterocolitis. J Immunol. 177 (5), 3273-3282 (2006).
  10. Mihi, B., Lanik, W. E., Gong, Q., Good, M. A mouse model of necrotizing enterocolitis. Methods Mol Biol. 2321, 101-110 (2021).
  11. Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protoc. 2 (4), 100951(2021).
  12. Kaplina, A., et al. Necrotizing enterocolitis: The role of hypoxia, gut microbiome, and microbial metabolites. Int J Mol Sci. 24 (3), 2471(2023).
  13. Good, M., et al. Lactobacillus rhamnosus hn001 decreases the severity of necrotizing enterocolitis in neonatal mice and preterm piglets: Evidence in mice for a role of TLR9. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 306 (11), G1021-G1032 (2014).
  14. Denning, T. L., Bhatia, A. M., Kane, A. F., Patel, R. M., Denning, P. W. Pathogenesis of nec: Role of the innate and adaptive immune response. Semin Perinatol. 41 (1), 15-28 (2017).
  15. Yu, Y. -R. A., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLOS ONE. 11 (3), e0150606(2016).
  16. Mihi, B., et al. Interleukin-22 signaling attenuates necrotizing enterocolitis by promoting epithelial cell regeneration. Cell Rep Med. 2 (6), 100320(2021).
  17. Bautista, G. M., Cera, A. J., Chaaban, H., Mcelroy, S. J. State-of-the-art review and update of in vivo models of necrotizing enterocolitis. Front Pediatr. 11, 1161342(2023).
  18. Sodhi, C. P., et al. The human milk oligosaccharides 2'-fucosyllactose and 6'-sialyllactose protect against the development of necrotizing enterocolitis by inhibiting toll-like receptor 4 signaling. Pediatr Res. 89 (1), 91-101 (2021).
  19. Blum, L., Vincent, D., Boettcher, M., Knopf, J. Immunological aspects of necrotizing enterocolitis models: A review. Front Immunol. 15, 1434281(2024).
  20. Nolan, L. S., et al. Indole-3-carbinol-dependent aryl hydrocarbon receptor signaling attenuates the inflammatory response in experimental necrotizing enterocolitis. Immunohorizons. 5 (4), 193-209 (2021).
  21. Valle-Noguera, A., Gómez-Sánchez, M. J., Girard-Madoux, M. J. H., Cruz-Adalia, A. Optimized protocol for characterization of mouse gut innate lymphoid cells. Front Immunol. 11, 563414(2020).
  22. Booth, J. S., et al. Characterization and functional properties of gastric tissue-resident memory T cells from children, adults, and the elderly. Front Immunol. 5, 294(2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Darmontstekingflowcytometrieisolatie van immuuncellenepitheliale beschadigingmicrobi le dysbioseadaptieve immuuncellen

Gerelateerde artikelen