Vasculaire reconstructies bij ontvangers, waaronder de suprahepatische inferieure vena cava (SHIVC), poortader en infrahepatische inferieure vena cava (IHIVC), zijn de belangrijkste procedures voor succesvolle orthotope levertransplantatie bij muizen. Hierin geven we hechttechnieken en tips voor SHIVC- en IHIVC-reconstructie in het levertransplantatiemodel van muizen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Hechttechnieken voor vasculaire reconstructie bij orthotope levertransplantatie bij muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Translationeel onderzoek met behulp van diermodellen is essentieel voor het aanpakken van de klinische problemen bij orgaantransplantaties. Hoewel orthotope levertransplantatie (LT) bij muizen een nuttig hulpmiddel is voor het onderzoeken van de mechanismen van leverregeneratie, ischemie-reperfusieschade en immuunresponsen na LT, beperken technische uitdagingen in deze procedure de haalbaarheid ervan. De belangrijkste aspecten voor succesvolle orthotope LT bij muizen zijn vasculaire reconstructie bij ontvangers, waaronder de suprahepatische inferieure vena cava (SHIVC), poortader (PV) en infrahepatische inferieure vena cava (IHIVC). Naast de technische moeilijkheden bij het reconstrueren van deze vaten, maakt de tijdsbeperking van de anhepatische fase tot binnen 20 minuten deze procedure uitdagender. Hoewel een manchettechniek kan worden gebruikt voor PV-reconstructie, is een veilige en snelle hechttechniek vereist om de SHIVC tijdens de anhepatische fase te reconstrueren. Voor IHIVC-reconstructie zijn zowel manchet- als hechttechnieken van toepassing, maar de hechttechniek leidt tot een kortere operatietijd bij donorchirurgie en voorbereiding van de rugtafel en kan een groter vasculaire lumen behouden dan de manchettechniek. Hierin geven we richtlijnen voor SHIVC- en IHIVC-reconstructie met behulp van een hechttechniek om orthotope LT van de muis te vergemakkelijken.
Inleiding
Met de vooruitgang in chirurgische technieken, immunosuppressiva en intensive care-geneeskunde is orgaantransplantatie uitgegroeid tot een standaardtherapie voor orgaanziekten in het eindstadium. Levertransplantatie (LT) is momenteel de enige curatieve behandeling voor leverziekte in het eindstadium en bepaalde levermaligniteiten. Translationeel onderzoek met behulp van diermodellen is essentieel om klinische problemen bij LT aan te pakken. Aangezien er verschillende genetisch gemodificeerde dieren beschikbaar zijn in muismodellen, is orthotope LT bij muizen een belangrijk hulpmiddel om mechanistische inzichten in leverregeneratie, ischemie-reperfusieschade en immuunresponsen na LT1 te onderzoeken. Omdat de technische uitdagingen in deze procedure de haalbaarheid ervan beperken, zijn onderzoeksgroepen die aan dit model werken echter beperkt tot 2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Muis orthotope LT werd voor het eerst beschreven door Qian et al. in 19912. De chirurgische ingreep, ontwikkeld door orthotope LT-technieken toe te passen bij de ratten, bestaat uit drie stappen: donoroperatie, voorbereiding van de achtertafel van het levertransplantaat en ontvangeroperatie6. De technisch uitdagende onderdelen van LT bij muizen zijn gal- en vasculaire reconstructie bij ontvangers, waaronder de suprahepatische inferieure vena cava (SHIVC), poortader (PV) en infrahepatische inferieure vena cava (IHIVC). Naast de chirurgische technieken moet de anhepatische fase van het klemmen tot het loslaten van de PV-stroom binnen 20 minuten zijn voor succesvolle orthotope LT 2,6,11 bij de muis. Bovendien is onze ervaring dat de totale reperfusietijd van PV-klemming tot IHIVC-release binnen 30 minuten moet zijn om op lange termijn te overleven in muis LT. Dit komt overeen met het vorige rapport voor LT bij ratten, waarin de voorkeurstijd van onstabiele systemische hemodynamische toestand werd beschreven als binnen ongeveer 30 minuten12. Technische problemen en tijdsbeperkingen in muis LT maken deze procedure dus uitdagender.
Hoewel de cuff-techniek kan worden gebruikt voor PV-reconstructie, is een hechttechniek nodig om de SHIVC tijdens de anhepatische fase te reconstrueren. Daarom is een veilige en snelle hechttechniek essentieel bij SHIVC-anastomose. Hoewel zowel manchet- als hechttechnieken van toepassing zijn op IHIVC-reconstructie, hebben de meeste eerdere studies een manchettechniek 5,6,7,11,13 gebruikt. Het gebruik van een manchettechniek bij IHIVC-reconstructie leidt echter tot een langere operatietijd bij donor- en rugtafeloperaties. Bovendien kan het inbrengen van een manchet moeilijker zijn dan hechten voor beginners vanwege de korte marge van de inferieure vena cava (IVC)13.
Hierin geven we richtlijnen voor succesvolle SHIVC- en IHIVC-reconstructie met behulp van een hechttechniek in orthotope LT bij muizen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven zijn goedgekeurd door het Kyoto University Animal Experimentation Committee en uitgevoerd in overeenstemming met de Kyoto University Animal Protection Guidelines. Muizenoperaties werden uitgevoerd onder algemene anesthesie met behulp van isofluraaninhalatie. De verdamper werd ingesteld op 3% isofluraan met 1 l/min zuurstof om anesthesie op te wekken. Na laparotomie werd isofluraan teruggebracht tot 1% om de anesthesie te behouden. De microchirurgische instrumenten die in dit protocol worden gebruikt, inclusief de instrumenten die worden gebruikt in ons eerder gepubliceerde vasculaire reconstructieprotocol13, worden vermeld in de materiaaltabel. Een microscoop was nodig om muis orthotope LT13 uit te voeren. Een verwarmingskussen werd gebruikt om de lichaamstemperatuur van de muis op peil te houden13.
1. Dieren
- Gebruik een muis met een gewicht van 25-30 g.
OPMERKING: Hoewel muizen met een gewicht van 20-35 g kunnen worden gebruikt, zijn muizen van ongeveer 25 g geschikt voor zowel donoren als ontvangers. Aangezien leeftijd en leversteatose de LT-uitkomsten beïnvloeden, moeten geschikte muizen worden geselecteerd voor elk doel van de experimenten.
2. Dissectie van de IHIVC in de donorlever
- Isoleer de IHIVC van het omringende weefsel. Dicht de lumbale aders af met een elektrocauterisatie indien nodig.
- Verwijder het vet van IHIVC om de vaatwand bloot te leggen.
- Ontleed de IHIVC boven de rechter nierslagader en -ader (Figuur 1).
OPMERKING: Als de hechttechniek wordt gebruikt voor de IHIVC-reconstructie, is dissectie van de rechter nierader op de donorplaats niet nodig. Donorchirurgie duurt meestal minder dan 30 minuten bij het toepassen van de hechttechniek voor IHIVC-reconstructie.
3. Dissectie van de SHIVC in de donorlever
- Na perfusie van de bewaaroplossing uit de PV worden de voor- en achterwanden van de SHIVC doorgesneden (Figuur 1).
OPMERKING: Isolatie van de SHIVC-achterwand van de diepwandcrus is cruciaal om voldoende marge voor reconstructie te verkrijgen.
4. Achtertafelbereiding van het levertransplantaat
- Bevestig een manchet aan de PV, zoals eerder beschreven13.
- Bevestig een klemclip aan de IHIVC.
- Draai de lever ondersteboven en leg de stomp van SHIVC bloot.
- Plaats een steunhechtdraad met 10-0 nylon aan beide randen van de SHIVC en houd deze vast met bulldog klemmen.
OPMERKING: De voorbereiding van de achtertafel duurt ongeveer 10 minuten zonder manchetbevestiging aan IHIVC.
5. Reconstructie van de SHIVC in de ontvanger
- Omcirkel de SHIVC met 4-0 zijde om de lever naar beneden terug te trekken.
- Verlaag de concentratie isofluraan tot 0,3-0,5% vóór de anhepatische fase.
- Klem de IHIVC boven de rechter nierader met behulp van een microserrefine.
- Klem de PV vast met een Pean-tang13.
- Klem de SHIVC vast met het middenrif met behulp van een bulldogklem terwijl u de lever naar beneden terugtrekt.
- Snijd de voorwand van de SHIVC af en snijd vervolgens de achterwand af (Figuur 1).
OPMERKING: Isolatie van de SHIVC-achterwand van de middenrif bij de ontvanger en donoren is cruciaal om voldoende marge voor de reconstructie te verkrijgen. - Nadat PV en IHIVC dicht bij de lever van de ontvanger zijn ontleed, verwijdert u de lever van de ontvanger (Figuur 1).
- Plaats het voorbereide levertransplantaat in de buikholte van de ontvanger en plaats de lever op de juiste manier.
- Plaats en lig een steunhechtdraad aan het rechteruiteinde van de SHIVC en houd deze vast met een bulldogklem om de hechtdraad naar de ventrale zijde van de ontvanger te trekken (Figuur 2A).
LET OP: De rechterkant van de SHIVC ligt diep in de buikholte. Trek de rechterkant van de SHIVC naar buiten zodat de achterwand aan de voorkant komt te liggen. - Plaats en lig een steunhechtdraad aan het linkeruiteinde van de SHIVC.
- Begin met continu hechten met een intraluminale methode op de achterwand van de SHIVC vanaf de linkerkant (Figuur 2A).
- Wanneer u het rechteruiteinde van de achterwand van de SHIVC bereikt, draait u de operatietafel 90° tegen de klok in.
NOTITIE: Draai de operatietafel 90° met de klok mee voor linkshandige chirurgen. Als alternatief kunnen chirurgen de voorwand van voren naar achteren hechten zonder te draaien. - Ga verder met de hechting met een over-en-over hechting op de voorwand van de SHIVC vanaf de rechterkant (Figuur 2A).
OPMERKING: Er zijn ongeveer zes tot acht steken nodig voor de achterwand en acht tot tien steken voor de voorwand. De hechting aan de linkerkant van de voorwand is belangrijk om bloedingen te voorkomen. - Na het spoelen van de lucht in de SHIVC, ligate de continue hechting met de steunhechtdraad aan de linkerkant van de SHIVC.
- Draai de operatietafel 90° met de klok mee om de positie van de ontvanger terug te zetten naar de oorspronkelijke positie.
- Na de reconstructie en reperfusie van de PV maakt u de SHIVC los.
LET OP: Het duurt 10-15 minuten voor de SHIVC-reconstructie. Aangezien de PV-klemtijd van invloed kan zijn op de LT-resultaten, moet de anhepatische tijd (van PV-klemming tot PV-ontklemming) worden vastgesteld op maximaal 20 minuten op basis van de vaardigheid van de chirurg. Na PV-reperfusie wordt isofluraan teruggezet naar 1% om de anesthesie te behouden.
6. Reconstructie van de IHIVC bij de ontvanger
- Plaats en ligate hechtingen met 10-0 nylon aan beide uiteinden van de IHIVC.
- Houd de steunpennen vast met bulldogklemmen om naar beide kanten te trekken, zodat de IHIVC-stronk breed en recht wordt.
- Begin met het continu hechten met een intraluminale methode aan de linkerkant van de achterwand (Figuur 2B).
- Nadat u de rechterkant hebt bereikt, gaat u door met het keer op keer hechten op de voorwand vanaf de rechterkant van de ontvanger (Figuur 2B).
OPMERKING: Rotatie van de operatietafel is niet vereist voor IHIVC-reconstructie. Ongeveer zes tot acht hechtingen voor elke achter- en voorwand zijn voldoende. - Spoel de lucht in de IHIVC.
- Koppel de IHIVC-clips los van de transplantaatzijde en vervolgens aan de ontvangerszijde.
OPMERKING: Ligatie van de doorlopende hechtdraad met de steunhechtdraad aan de linkerkant van de IHIVC is niet nodig. Het duurt 8-10 minuten voor de IHIVC-reconstructie. De totale reperfusietijd van PV-klemming tot IHIVC-vrijgave moet binnen 30 minuten zijn.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een gebruiker van een muis herstelde binnen 30 minuten van anesthesie toen een succesvolle vasculaire reconstructie werd uitgevoerd met behulp van een normaal levertransplantaat zonder een langere koude ischemische tijd. Een slagingspercentage van >90% kan als bekwaam worden beschouwd voor deze procedure. We onderzochten de leercurves bij één chirurg voor post-LT herstelpercentages (herstel van anesthesie), anhepatische tijd (van klemmen tot loslaten van de PV-stroom) en totale reperfusi...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit artikel documenteerde de gedetailleerde technieken voor de reconstructie van de SHIVC en IHIVC met een hechttechniek in orthotope LT bij muizen. Vasculaire reconstructie, met name SHIVC-anastomose, waarvoor een hechttechniek nodig is tijdens de anhepatische fase, is een cruciale vaardigheid voor succesvolle LT bij muizen. Naast de veilige en zekere hechttechniek is snel hechten nodig om de anhepatische fase binnen 20 minuten te houden voor reproduceerbare resultaten in orthotope LT
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Japan Society for the Promotion of Science (subsidienummer: 24K19356).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 10-0 Micro suture | AROSurgical Instruments Corporation | T4A10N07 | |
| 16 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF2032 | IHIVC cuff |
| 20 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF1651 | PV cuff |
| 8-0 braid silk | Natsume Seisakusho | CR9-80B2 | 8-0 silk |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Astellas | orgaanbehoudsvloeistof | |
| Bulldog clamp | B BRAUN | FB329R | Bulldog clamp |
| Bulldog clamps | Natsume Seisakusho | C-42-S-2 | Voor SHIVC klemmen |
| C57BL/6 muizen | Oriental Bio Service | ||
| Pincet | Fine Science Tools | 11231-30 | |
| Isofluraane inhalatieoplossing | Viatris | Anesthesie | |
| Micro Blunted Tips 0.1 mm x 0.06 mm | Fine Science Tools | 11253-20 | Rechte microforceps |
| Micro schaar | Muranaka Medical Instruments | 451-609-13 | |
| Micro serrefine | Fine Science Tools | 18055-03 | Voor IHIVC klemmen |
| Micro serrefine | Fine Science Tools | 18055-04 | Voor PV klemmen |
| Micro Serrefine Clamp Applicator met vergrendeling | Fine Science Tools | 18056-14 | Vessel clip applicator |
| Micro Serrefines | Fine Science Tools | 18055-4 | Vessel clip |
| Micro suture foeceps | Aesculap | FD281R | |
| Micro-serrefine klamp applicator | Fine Science Tools | 18056-14 | |
| Naaldhouder | Aesculap | FD231R | |
| Nr.11 Reserve messen | FEATHER Veiligheidsscheermes | 11 | Messen |
| Oogheelkundige schaar, ronde greep | B BRAUN | FD103R | Microschaar |
| Kunststof rechthoekige container | Daiso | 10 cm lang, 15 cm breed en 6 cm hoog | |
| SuperGrip Tips | Fine Science Tools | 00649-11 | Gebogen microforceps |
| SZX7 | Olympus | SZX7 | Microscoop |
| Vannas schaar | World Precision Instruments | 501232 | |
| Vascular clip | BEAR Medic Corporation | TKF-1-30 | Voor IHIVC klemmen op de levertransplantaat |
Referenties
- Yokota, S., Yoshida, O., Ono, Y., Geller, D. A., Thomson, A. W. Liver transplantation in the mouse: Insights into liver immunobiology, tissue injury, and allograft tolerance. Liver Transpl. 22 (4), 536-546 (2016).
- Qian, S. G., Fung, J. J., Demetris, A. V., Ildstad, S. T., Starzl, T. E. Orthotopic liver transplantation in the mouse. Transplantation. 52 (3), 562-564 (1991).
- Tian, Y., Rudiger, H. A., Jochum, W., Clavien, P. A. Comparison of arterialized and nonarterialized orthotopic liver transplantation in mice: Prowess or relevant model. Transplantation. 74 (9), 1242-1246 (2002).
- Steger, U., Sawitzki, B., Gassel, A. M., Gassel, H. J., Wood, K. J. Impact of hepatic rearterialization on reperfusion injury and outcome after mouse liver transplantation. Transplantation. 76 (2), 327-332 (2003).
- Klein, I., Gassel, H. J., Thiede, A., Crispe, I. N., Steger, U. A microsurgical approach to hepatic and extrahepatic antigen presentation and its effects on the migration pattern of activated CD8(+) T cells. Microsurgery. 27 (4), 289-294 (2007).
- Yokota, S., et al. Orthotopic mouse liver transplantation to study liver biology and allograft tolerance. Nat Protoc. 11 (7), 1163-1174 (2016).
- Li, T., Hu, Z., Wang, L., Lv, G. Y. Details determining the success in establishing a mouse orthotopic liver transplantation model. World J Gastroenterol. 26 (27), 3889-3898 (2020).
- Kageyama, S., et al. Ischemia-reperfusion injury in allogeneic liver transplantation: A role of CD4 T cells in early allograft injury. Transplantation. 105 (9), 1989-1997 (2021).
- Kojima, H., et al. T cell CEACAM1-TIM-3 crosstalk alleviates liver transplant injury in mice and humans. Gastroenterology. 165 (5), 1233-1248.e9 (2023).
- Tanaka, K., et al. Recipient toll-like receptor 4 determines the outcome of ischemia-reperfusion injury in steatotic liver transplantation in mice. Am J Transplant. 25 (6), 1168-1179 (2025).
- Chen, J., et al. A review of various techniques of mouse liver transplantation. Transplant Proc. 45 (6), 2517-2521 (2013).
- Hori, T., et al. Comprehensive and innovative techniques for liver transplantation in rats: A surgical guide. World J Gastroenterol. 16 (25), 3120-3132 (2010).
- Tanaka, K., et al. Vascular reconstruction with the cuff technique in mouse orthotopic liver transplantation. J Vis Exp. (202), e66215(2023).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
